CN105524609A - 一种荧光探针gh及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

一种荧光探针GH及其制备和应用。本发明提供了一种可用于选择性检测细胞内碱性磷酸酶的荧光探针。主要合成方法为在碱性磷酸酶类似底物小分子5’磷酸核糖鸟苷(简称GMP)上引入2’2羟苯基苯并噻唑(HBT)生成结构为

Description

一种荧光探针GH及其制备和应用

技术领域

本发明涉及荧光探针领域，具体涉及一种可用于选择性检测碱性磷酸酶的荧光探针。在细胞内常见的小分子5’磷酸核糖鸟苷(简称GMP)上引入荧光团2’2羟苯基苯并噻唑(HBT)，与碱性磷酸酶作用后，利用反应物与产物的荧光差别实现选择性地检测活细胞中的碱性磷酸酶。

背景技术

碱性磷酸酶(ALP,ALKP,ALPase,AlkPhos)(EC3.1.3.1)是广泛分布于人体各脏器器官中，其中以肝脏为最多，其次为肾脏，骨骼、肠、和胎盘等组织。ALP能介导蛋白质，核酸，及生物碱类等生物大分子的去磷酸化。该去磷酸化作用与激酶的磷酸化作用密切相关，是生物体内物质代谢、物质转运、信号转导等生命活动中必要的调节过程。目前公认的碱性磷酸酶偏高与肝脏疾病，肝肠循环，骨骼疾病密切相关。人血清的碱性磷酸酶广泛用于疾病的指示，当ALP产生过多或排泄受阻时，均可使血中ALP水平发生变化。但是其水平调控的内在机制并不清楚。因此，开发能够实时检测细胞中碱性磷酸酶的探针具有重要意义。

荧光探针是有效检测生命体内碱性磷酸酶的手段之一，相比吸光度法具有检测灵敏的优势。一个具有应用前景的荧光探针应具有作用前后荧光变化明显、对目标分子响应快、选择性好、合成简单等优点。目前应用于检测碱性磷酸酶的方法主要集中于血清碱性磷酸酶水平的检测，检测细胞中碱性磷酸酶的重要性并未受到太多重视。检测方法最广泛应用的还是405nm下检测pnpp(磷酸对硝基酚)的去磷酸化产物的吸收光谱，检测碱性磷酸酶的荧光探针虽然有一些新的发展，但是选择性好的荧光探针仍寥寥无几。尤其碱性磷酸酶，酸性磷酸酶，磷酸二酯酶，腺苷酸环化酶对于去磷酸化的作用有很多底物交叉现象，开发对其有选择性的探针具有很大挑战性。

发明内容

本发明就是针对上述问题，提供了一种可用于选择性检测细胞内碱性磷酸酶的荧光探针，此探针可以在生理条件下选择性地与碱性磷酸酶作用，作用后荧光显著增强。

本发明采用如下技术方案：采用2’2羟苯基苯并噻唑(HBT)作为荧光母体，在体内普遍存在的小分子5’磷酸核糖鸟苷(简称GMP)上引入HBT，利用反应物与产物的荧光差别实现选择性地检测碱性磷酸酶，尤其是可以应用于检测活细胞中的碱性磷酸酶。合成的探针化合物的结构用代号GH表示。

所述的荧光探针GH的结构如结构式Ⅰ所示。

所述的荧光探针的制备方法为：以2’2羟苯基苯并噻唑(HBT)作为荧光母体，在体内普遍存在的小分子5’磷酸核糖鸟苷(简称GMP)上引入HBT；具体制备步骤如下，

1)三氯氧磷与HBT于溶剂中搅拌反应后，真空下70℃加热蒸干；

2)步骤1)中得到的产物冷却后，加入溶剂，搅拌后，加入2’3’-O-isopropygμanosine，室温下搅拌反应10h后，真空下70℃加热蒸干；

3)向步骤2)中得到的产物中加入蒸馏水，搅拌1h后抽滤出固体，甲醇洗涤三次所得固体，红外烘干；

4)取步骤3)所得产物溶于醋酸和水中，冷凝回流，之后与正丁醇80℃下共沸旋干，甲醇洗涤产物三次，得到最终产物GH。

步骤1)中所述的HBT与三氯氧磷的加入量为1：3-10；步骤2)中2’3’-O-isopropygμanosine的加入量为第一步中HBT加入量的1.2-1.5倍；步骤4)中加入的醋酸和水的量为4:1，冷凝回流的温度为100℃，时间为2h。

步骤1)和步骤2)中，所述的所用的溶剂为无水吡啶；步骤1)—4)中所述的搅拌方式为磁力搅拌。

所述的荧光探针可以用于碱性磷酸酶的定性或定量检测；所述的荧光探针和碱性磷酸酶的作用模型符合双位点酶动力学。

所述的荧光探针应用于检测碱性磷酸酶时，其是生成具有结构II的化合物，从而导致荧光变化，结构II的名称为2’2羟苯基苯并噻唑(HBT)。

所述的荧光探针在定量检测碱性磷酸酶中，与碱性磷酸酶作用后，512nm处检测得的荧光强度正比于碱性磷酸酶的活性。

所述的荧光探针可用于细胞内碱性磷酸酶的检测，实现细胞内碱性磷酸酶的荧光成像。

本发明的有益效果：该化合物在碱性磷酸酶存在下荧光发生显著改变，可用于高选择性、高灵敏性地检测碱性磷酸酶。尤其是，该化合物可用于细胞内中的碱性磷酸酶检测，这对于深入研究碱性磷酸酶在生物体内生理和病理过程的动力学机理具有重要意义。

附图说明

图1实施例1中本发明提供的荧光探针GH的合成路线图；

图2本发明提供的荧光探针GH检测碱性磷酸酶的原理示意图；

图3本发明提供的探针GH的¹HNMR(a)，¹³CNMR(b)，³²PNMR(c)谱图；

图4实施例2中荧光探针GH与荧光团HBT水溶液的紫外可见吸收光谱(a)、荧光激发光谱(b)、发射光谱(c)；

图5实施例3中荧光探针GH对碱性磷酸酶的选择性示意图；

图6实施例4中荧光探针GH对不同浓度的ALP响应的动力学示意图(a)及反应速率与酶浓度的线性关系(b)；

图7实施例5中荧光探针GH与碱性磷酸酶反应速率的的动力学示意图；

图8实施例6中荧光探针GH在碱性磷酸酶被抑制作用下示意图。

图9实施例7中荧光探针GH在Hela细胞中成像示意图。

具体实施方式

实施例用于进一步说明本发明，但本发明不限于实施例。

实施例1(探针的合成)：

如图1所示，GH的合成：50mL两口烧瓶真空/氮气置换三次，加入20mL的干燥吡啶和2mL的干燥三氯氧磷，缓慢加入HBT1.81g，室温下搅拌1h。1h后，真空下70℃加热蒸干，得到浅绿色固体。停止加热待冷却后，重新连接真空/氮气置换三次，再次加入吡啶20mL，使涡旋，使浅绿色沉淀全部溶解，加入2.58g2’3’-O-isopropyguanosine(2',3'-O-异亚丙基鸟苷)，搅拌，室温反应10h。10h后真空下70℃加热旋干。加入20mL蒸馏水，搅拌1h，抽滤，红外烘干，得到固体2.05g。将所得固体经甲醇洗三次(每次50mL)得化合物2’3’-O-isopropyguanosine5’(HBT-phosphate)(白色固体)。取该化合物500mg，溶于4.8mL醋酸和1.2mL水中，100℃冷凝回流2h。反应结束后，与10mL正丁醇80℃共沸真空旋干。用甲醇洗三次，每次20mL。最终得到目标化合物GH(白色固体)。¹HNMR(400MHz,DimethylsuLfoxide-d6)δ(ppm):δ＝10.66(s,1H),8.39(d,1H,J＝7.64Hz),8.25(s,1H),8.05(t,2H),7.91(s,1H),7.75(d,1H,J＝8.2Hz),7.52(d,1H,J＝7.44Hz),7.43(t,1H,J＝6.6Hz),7.40(t,1H,J＝7.0Hz),7.20(t,1H,J＝7.52Hz),6.6(s,2H),5.72(d,1H,J＝6.0Hz),4.53(t,1H,J＝5.24Hz),4.0-4.2(m,4H).¹³CNMR(DimethylsuLfoxide-d6,100MHz)δ(ppm):162.92,156.87,154.87,154.61,154.32,152.08,151.64,136.15,132.03,128.98,126.58,125.31,123.65,123.25,122.88,122.21,120.50,116.27,87.13,83.92,73.88,70.88,71.08,66.43.³²PNMR(DimethylsuLfoxide-d6,100MHz)δ＝0.04(s)

实施例2

如图4所示，(荧光探针GH与荧光团HBT水溶液的紫外可见吸收光谱(a)、荧光激发光谱(b)、发射光谱(c))：

将GH溶于100mM的PB缓冲液中，配置成20μM的溶液。取3mL溶液加入1cmⅹ1cmⅹ4cm的比色皿中，测量该工作液的紫外可见吸收光谱(a)、GH与碱性磷酸酶作用后产生的荧光团HBT水溶液的荧光激发光谱(b)、发射光谱(c))；结果显示探针GH/HBT的最大激发波长为318nm/330nm。探针GH最大发射波长为370nm,荧光团HBT在水溶液中随浓度不同而有两个发射峰460nm/512nm。

实施例3(GH对碱性磷酸酶的选择性)：

配置碱性磷酸酶，酸性磷酸酶，腺苷酸环化酶，3’-5’磷酸二酯酶(四种酶浓度均为10μM)的水溶液，四种酶分别等分成若干份，每份的量相同，-20℃冷冻储存。使用前在冰上缓慢溶解，每份只用一次。配置GH(20mM)的DMSO溶液(重要的极性非质子溶剂)。每个反应在196μL100mM的PB缓冲液中加2μLGH(20mM)以及2μL酶，使用全波长扫描式多功能读数仪及96孔酶标板进行测量，探针和酶的终浓度分别为20μM和100nM。测量该工作液的荧光发射光谱，λex＝330nm，光栅宽度为5nm，λem＝512nm。

GH对碱性磷酸酶的选择性实验结果如图5所示，纵坐标表示波长为512nm处的荧光强度。图5表明GH对碱性磷酸酶具有较好的选择性，体系荧光显著增强。测定条件下，相比于碱性磷酸酶，相同浓度的腺苷酸环化酶，3’-5’磷酸二酯酶的作用可以忽略，酸性磷酸酶的催化效率为其1/3。

实施例4(GH对碱性磷酸酶的定量检测)：

将10μM的碱性磷酸酶储液浓度梯度稀释，每个反应在196μL的PB缓冲液(100mM)中加2μLGH(20mM)以及2μL不同浓度(10nM-250nM)的酶。使用全波长扫描式多功能读数仪及96孔酶标板进行测量。测量该工作液的荧光发射光谱，λex＝330nm，光栅宽度为5nm，λem＝512nm。结果显示：如图6，随酶浓度的增长，HBT的生成速率成比例增长。

实施例5(GH的酶学参数测定)：

配置GH的DMSO溶液(25mM)，并配置梯度稀释的储液。每个反应在196μL的PB缓冲液(100mM)中加2μLGH(10μM-25mM)以及2μL的酶(100nM)。使用全波长扫描式多功能读数仪及96孔酶标板进行测量。测量该工作液的荧光发射光谱，λex＝330nm，光栅宽度为5nm，λem＝512nm。结果显示：如图7，探针GH被碱性磷酸酶催化符合酶动力学中的双位点模型，具有两套km/vmax值，其中K_m1＝0.10μM，V_max1＝3.48*10⁵pmol/min/nmol；K_m2＝85.26μM，V_max2＝5.33*10⁶pmol/min/nmol。

实施例6(GH的抑制实验)：

配置碱性磷酸酶特异性抑制剂L-Phenylalanine(100mM)的PB溶液。每个反应在96μL的PB缓冲液(100mM)中加2μLGH(20mM)以及2μL的酶(100nM)以及100μLL-Phenylalanine(100mM)或100μL缓冲液(对照)。使用全波长扫描式多功能读数仪及96孔酶标板进行测量。测量该工作液的荧光发射光谱，λex＝330nm，光栅宽度为5nm，λem＝512nm。结果显示：如图8，GH被碱性磷酸酶的催化作用可以被碱性磷酸酶抑制剂完全抑制，再次证明GH是碱性磷酸酶的探针底物。

实施例7(探针GH用于HELA细胞中碱性磷酸酶的检测)：

如图9所示，HELA细胞按照AmericantypeTissueCuLtureCollection规定进行培养。接种于35mm×12mm的培养皿中培养24h使之贴壁。使用前将培养液弃去，用100mMPBS洗三次，加10μMGH的PBS溶液(PBS缓冲液浓度为100mM，pH7.4,138mMNaCl)，5min-30min内原位观察。抑制实验，加探针前要先用10mM的levamisole(碱性磷酸酶特异性抑制剂)的PBS溶液预孵育15min。使用共聚焦显微镜OlympusFV1000(Ex.405nm,Em.500-530nm)镜头(×40)进行观察以及图像采集。对照实验，HT-29cells同样按照AmericantypeTissueCuLtureCollection规定进行培养，加探针原位观察30min。结果显示：HELA细胞中，荧光图像亮度明显高于对照组。

Claims (9)

1.一种荧光探针GH，其特征在于：所述的荧光探针的结构为结构I所示，

结构代号：GH。

2.一种权利要求1所述的荧光探针GH的制备，其特征在于：所述的荧光探针为以2’2羟苯基苯并噻唑(HBT)作为荧光母体，在体内普遍存在的小分子5’磷酸核糖鸟苷(简称GMP)上引入HBT；具体制备步骤如下，

1)三氯氧磷与HBT于溶剂中搅拌反应后，真空下70℃加热蒸干；

2)步骤1)中得到的产物冷却后，加入溶剂，搅拌后，加入2’3’-O-isopropyguanosine，室温下搅拌反应10h后，真空下70℃加热蒸干；

3)向步骤2)中得到的产物中加入蒸馏水，搅拌1h后抽滤出固体，红外烘干，甲醇洗涤三次所得固体，红外烘干；

4)取步骤3)所得产物溶于醋酸和水中，冷凝回流，之后与正丁醇80℃下共沸旋干，甲醇洗涤产物三次，得到最终产物GH。

3.根据权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤1)中所述的HBT与三氯氧磷的加入量为1：3-10；步骤2)中2’3’-O-isopropyguanosine的加入量为第一步中HBT加入量的1.2-1.5倍；步骤4)中加入的醋酸和水的量为4:1，冷凝回流的温度为100℃，时间为2h。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1)和步骤2)中，所用的溶剂为无水吡啶；所述的步骤1)—4)中搅拌的方式为磁力搅拌。

5.一种权利要求1所述的荧光探针的应用，其特征在于：所述的荧光探针可以用于碱性磷酸酶的定性或定量检测。

6.根据权利要求5所述的荧光探针的应用，其特征在于：所述的荧光探针和碱性磷酸酶的作用模型符合双位点酶动力学。

7.根据权利要求5所述的荧光探针的应用，其特征在于：所述的荧光探针应用于检测碱性磷酸酶时，其是生成具有结构II的化合物，从而导致荧光变化；

结构名称：2’2羟苯基苯并噻唑(HBT)。

8.根据权利要求5所述的荧光探针的应用，其特征在于：在定量检测碱性磷酸酶中的应用，所述的荧光探针与碱性磷酸酶作用后，512nm处检测得的荧光强度正比于碱性磷酸酶的活性。

9.根据权利要求5所述的荧光探针的应用，其特征在于：所述的荧光探针可用于细胞内碱性磷酸酶的检测，实现细胞内碱性磷酸酶的荧光成像。