CN108489954B - 基于双发射荧光探针的碱性磷酸酶及砷酸根检测方法 - Google Patents

基于双发射荧光探针的碱性磷酸酶及砷酸根检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于双发射荧光探针的碱性磷酸酶及砷酸根检测方法，属于环境分析技术领域。制备双发射荧光探针luminol‑Tb‑GMP，当存在碱性磷酸酶(ALP)时，ALP特异性剪切GMP中的磷酸基团，破坏了luminol‑Tb‑GMP的结构，使得Tb3+的荧光猝灭，溶液中的luminol与Tb3+发生再配位而生成luminol‑Tb，使得luminol的荧光增强，建立基于Tb3+与luminol荧光信号比率的ALP检测方法。此外，随着ALP浓度的增加，Tb3+的绿色荧光减弱，而luminol的蓝色荧光增强，据此还可实现对ALP的可视化检测。进而，由于砷酸根(As(V))对ALP的强抑制作用，当存在As(V)时，ALP的活性下降，ALP对GMP的剪切作用减弱，使得Tb3+荧光信号增强而luminol荧光信号减弱，建立基于As(V)对ALP抑制作用的As(V)检测方法。本发明方法还可应用于环境水样中ALP和As(V)的灵敏检测。

Description

基于双发射荧光探针的碱性磷酸酶及砷酸根检测方法
技术领域
本发明涉及一种基于双发射荧光探针的碱性磷酸酶及砷酸根检测方法，属于环境分析技术领域。
背景技术
碱性磷酸酶(ALP)广泛分布于水体中，可非特异性催化磷酸化酯水解，水体中浮游生物可吸收被ALP水解得到的活性磷而发生激长，从而破坏水体生态平衡。因此，ALP的含量可作为水体生态系统富营养化程度的指标。目前报道的比色、电化学、化学发光和荧光等检测方法主要是基于ALP从底物中解离磷酸根而获得信号，其中，荧光法由于简单、灵敏而受到广泛关注。但是，常用的荧光法基于单一荧光强度的变化，因而易受光源或检测器漂移或者复杂样品环境等因素的影响，而比率荧光法可有效避免这些问题并在近年受到极大的关注(Stimulus Response of Au-NPs@GMP-Tb Core-Shell Nanoparticles:TowardColorimetric and Fluorescent Dual-Mode Sensing of Alkaline PhosphataseActivity in Algal Blooms ofa Freshwater Lake,Environmental ScienceTechnology,2016,50:847-855)。
砷是众所周知的有毒元素，无机砷酸根离子(As(V))对人类和动物的毒性更为显著。被污染的饮用水是人类接触无机砷的主要来源之一，地表水中砷的含量微少，这使得开发高灵敏度的水样中砷的监测方法至关重要。迄今为止，As(V)的检测方法主要有原子吸收/发射光谱法、电感耦合等离子质谱法、电化学法、拉曼散射法以及荧光法等(DNAAdsorption by Magnetic Iron Oxide Nanoparticles and Its Application forArsenate Detection,Chemical Communication,2014,50:8568-8570)，其中，基于荧光的分析方法在砷的检测应用方面展现出明显优势。然而，荧光探针上识别元件的设计和连接至关重要。两个发射峰分开的荧光探针的荧光强度的比值，可以消除内在干扰以及排除激发光强度的波动，因而可提高定量分析的精确度。所以，发展基于双发射荧光探针的ALP和As(V)检测方法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种基于双发射荧光探针的碱性磷酸酶及砷酸根检测方法，该方法制备得到的双发射荧光探针具有简单、快速、绿色的特点，且可实现对碱性磷酸酶的比率荧光法和可视化双检测，具有灵敏度高和选择性好的优点，还可通过对环境水样中碱性磷酸酶的检测判断水体富营养化的程度。此外，基于砷酸根对碱性磷酸酶活性的特异性抑制作用，该方法还可实现对砷酸根的定量检测，同样具有灵敏度高和选择性好的优点，还可用于环境水样中砷酸根的检测。
本发明通过如下方法实现：
基于双发射荧光探针对碱性磷酸酶的检测方法，其包括以下步骤：
(1)双发射荧光探针的制备：将40μL 10mM鲁米诺溶液与100μL 100mM单磷酸鸟苷溶液混合，搅拌30分钟，再加入100μL 100mM的Tb(NO3)3·6H2O溶液，搅拌反应30分钟，得到乳白色絮状沉淀，将沉淀分散于1mL超纯水中，制成双发射荧光探针溶液；
(2)基于双发射荧光探针检测碱性磷酸酶：将10μL双发射荧光探针溶液与40μL10mM Tris-HCl缓冲溶液与不同浓度的碱性磷酸酶溶液混合，用超纯水稀释溶液的总体积为200μL，在37℃孵育60分钟，采用荧光光谱仪测量在290nm激发波长下，双发射荧光探针中Tb3+和鲁米诺的荧光强度，随着碱性磷酸酶活性的增加，Tb3+荧光信号减弱而鲁米诺荧光信号增强，在549nm处的Tb3+荧光信号与在432nm处的鲁米诺荧光信号的比值(F549/F432)与碱性磷酸酶活性的对数呈反比，根据Tb3+荧光信号与鲁米诺荧光信号之间的比值(F549/F432)来判断碱性磷酸酶的活性；或在波长为253.7nm的紫外灯照射下，观察稀释后溶液颜色的变化来实现对碱性磷酸酶活性的快速可视化分析；
此外，基于双发射荧光探针对砷酸根的检测方法，其包括以下步骤：
(1)双发射荧光探针的制备：将40μL 10mM鲁米诺溶液与100μL 100mM单磷酸鸟苷溶液混合，搅拌30分钟，再加入100μL 100mM的Tb(NO3)3·6H2O溶液，搅拌反应30分钟，得到乳白色絮状沉淀，将沉淀分散于1mL超纯水中，制成双发射荧光探针溶液；
(2)基于双发射荧光探针检测砷酸根：将50μL 100U/L碱性磷酸酶溶液与50μL不同浓度的砷酸根溶液混合，在37℃反应20分钟，再加入10μL双发射荧光探针溶液和40μL 10mMTris-HCl缓冲溶液，用超纯水稀释溶液的总体积为200μL，在37℃反应60分钟，采用荧光光谱仪测量在290nm激发波长下，双发射荧光探针中Tb3+和鲁米诺的荧光强度，随着砷酸根浓度的增加，Tb3+荧光信号增强而鲁米诺荧光信号减弱，根据在549nm处的的Tb3+荧光信号与在432nm处的鲁米诺荧光信号之间的比值(F549/F432)与砷酸根浓度呈正比，根据Tb3+荧光信号与鲁米诺荧光信号的比值(F549/F432)来判断砷酸根的浓度。
上述基于双发射荧光探针的碱性磷酸酶及砷酸根检测方法中，所述Tris-HCl缓冲溶液的pH均为9；所述碱性磷酸酶的活性范围为0.05-100U/L；所述砷酸根的浓度范围为0.5-100ppb。
本发明是以稀土离子Tb3+为发光中心离子，以鲁米诺(luminol)和单磷酸鸟苷(GMP)为配体，制备可在单一激发波长下同时发射Tb3+荧光信号和luminol荧光信号的双发射荧光探针，将制得的双发射荧光探针与ALP混合，ALP特异性剪切GMP中的磷酸基团，破坏了双发射荧光探针的结构，使得Tb3+从双发射荧光探针中释放到溶液中而荧光猝灭，而溶液中游离的luminol与释放到溶液中的Tb3+发生再配位作用生成luminol-Tb，大大增强了luminol的荧光强度，随着ALP活性的增加，Tb3+在549nm处的荧光信号减弱，而luminol在432nm处的荧光信号增强，Tb3+荧光信号与luminol荧光信号的比值与ALP活性的对数呈反比，根据Tb3+荧光信号与luminol荧光信号的比值判断ALP的活性；随着ALP浓度的增加，Tb3+的绿色荧光减弱而luminol的蓝色荧光增强，据此还可实现对ALP的可视化检测。此外，由于As(V)对ALP具有强抑制作用，当存在As(V)时，ALP的活性下降，使得ALP对GMP的剪切作用减弱，导致Tb3+荧光信号增强而luminol荧光信号减弱，Tb3+荧光信号与luminol荧光信号的比值F549/F432与As(V)浓度呈正比，根据Tb3+荧光信号与luminol荧光信号的比值F549/F432判断As(V)的浓度。本发明方法还可应用于环境水样中ALP和As(V)的灵敏检测。将ALP与As(V)混合，再加入双发射荧光探针，此时，Tb3+荧光信号与luminol荧光信号的比值与As(V)的浓度呈正比，根据Tb3+荧光信号与luminol荧光信号的比值判断As(V)的浓度。
本发明相较于现有技术，其有益效果在于，以两个分开的发射峰的荧光强度来检测碱性磷酸酶及砷酸根，实现对碱性磷酸酶及砷酸根的比率荧光法和可视化双检测，精确度高，选择性好，具有灵敏度高和的优点，还可应用于环境水样中ALP和As(V)的灵敏检测。
附图说明
图1是荧光光谱图，(a)luminol，(b)双发射荧光探针存在ALP，(c)双发射荧光探针不存在ALP。
图2是实验条件优化：(A)luminol浓度和(B)检测溶液pH值。
图3是(A)双发射荧光探针对不同浓度ALP响应的荧光光谱图。(B)F549/F432对ALP的校准曲线。
图4是双发射荧光探针对ALP检测的选择性图。
图5是(A)双发射荧光探针对不同浓度As(V)响应的荧光光谱图。(B)F549/F432对As(V)的校准曲线。
图6是双发射荧光探针对As(V)检测的选择性图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于此；
实施例1
双发射荧光探针的制备：将40μL 10mM鲁米诺溶液与100μL 100mM单磷酸鸟苷溶液混合，搅拌30分钟，再加入100μL 100mM的Tb(NO3)3·6H2O溶液，搅拌反应30分钟，得到乳白色絮状沉淀，将沉淀分散于1mL超纯水中，制成双发射荧光探针溶液。
采用荧光光谱法分别对双发射荧光探针与ALP反应前后的荧光特性进行表征，结果如图1所示。其中，图1是双发射荧光探针与ALP反应前后的荧光光谱图。在290nm激发波长下，luminol溶液在430nm处有微弱的荧光(曲线a)；而双发射荧光探针则同时发射luminol和Tb3+的双荧光信号，其中，luminol的发射峰位于432nm，Tb3+的四个发射峰分别位于488nm、549nm、586nm和630nm(曲线b)；当向双发射荧光探针溶液中加入50U/L的ALP溶液时，ALP特异性剪切GMP中的磷酸基团，破坏了双发射荧光探针的结构，使得Tb3+从双发射荧光探针中释放到溶液中而荧光减小，此时，溶液中游离的luminol与释放到溶液中的Tb3+发生再配位作用生成luminol-Tb，大大增强了luminol的荧光强度，因此，当存在ALP时，双发射荧光探针的luminol在432nm处的荧光信号显著增强，Tb3+在488nm、549nm、586nm和630nm处的荧光信号均明显减弱(曲线c)。
实施例2
luminol浓度和检测溶液pH值优化
对制备的双发射荧光探针溶液中的luminol浓度和对ALP检测时的溶液pH值等实验条件进行了优化，结果如图2所示。由图2A可见，在290nm激发波长下，当不存在ALP时，luminol在432nm处的荧光强度随着双发射荧光探针溶液中的luminol浓度的增加而增强，Tb3+在549nm处的荧光强度与luminol在432nm处的荧光强度的比值F549/F432减小(曲线a)；当存在ALP时,Tb3+的荧光信号减弱而luminol的荧光信号增强，F549/F432逐渐减小(曲线b)，当双发射荧光探针溶液中的luminol浓度为0.4mM时，ALP存在与否时的F549/F432比值相差最大，且此时luminol在432nm处的荧光强度与Tb3+在549nm处的荧光强度的匹配程度最好，因此，制备的双发射荧光探针溶液中的luminol的最佳浓度为0.4mM。此外，对检测溶液的pH值进行了优化，结果如图2B所示。当不存在ALP时，在pH 7-11范围内，F549/F432的比值随着溶液pH的增加而缓慢增大(曲线a)，这是由于luminol的荧光强度随着溶液pH增加稍有减弱；当存在ALP时，在pH小于9时,F549/F432比值随着pH增加而减小，当pH大于9时逐渐增加(曲线b)，当pH为9时，ALP存在与否时的F549/F432比值相差最大，因此，选择pH 9为最优pH值。
实施例3
双发射荧光探针对ALP的检测
在优化实验条件下，采用双发射荧光探针对ALP进行定量检测。将10μL双发射荧光探针溶液与40μL 10mM pH 9的Tris-HCl缓冲溶液与不同浓度的ALP溶液混合，用超纯水稀释溶液的总体积为200μL，在37℃孵育60分钟，采用荧光光谱仪测量激发波长为290nm时双发射荧光探针中Tb3+和luminol的荧光强度。由图3可见，随着ALP活性的增加，Tb3+荧光信号减弱而luminol荧光信号增强，且Tb3+荧光信号与luminol荧光信号的比值F549/F432与ALP活性的对数在0.05-100U/L范围内呈良好的线性关系，检测限为0.02U/L，比其他基于核苷酸的传感器对ALP的检测限低了一个数量级。此外，将双发射荧光探针溶液、10mMpH 9Tris-HCl缓冲溶液和不同浓度的ALP溶液混合，在37℃反应60分钟，在波长为253.7nm的紫外灯照射下，随着ALP浓度的增加，混合溶液中Tb3+的绿色荧光逐渐减弱，而luminol的蓝色荧光逐渐增强，根据溶液颜色变化可实现对ALP的快速可视化分析。
考察了双发射荧光探针对ALP检测的选择性，由图4可见，50U/L的ALP使得双发射荧光探针的F549/F432迅速减小，而500U/L的凝血酶(thrombin)、牛血清白蛋白(BSA)、免疫球蛋白G(IgG)、伴刀豆球蛋白A(ConA)、辣根过氧化物酶(HRP)、乙酰胆碱酯酶(AchE)、血红蛋白(Hb)、葡萄糖化酶(GA)、纤维素酶(celluase)以及脂肪酶(LP)等干扰物质均不影响ALP的检测，表明本发明方法制备的双发射荧光探针对ALP检测具有良好的选择性。
通过对水体中ALP含量的动态监测，考察本发明方法对环境水样中ALP的检测应用。取南昌大学润溪湖表面水样，用0.22μm醋酸纤维素滤膜过滤，滤去漂浮物。将2μL水样、10μL双发射荧光探针和40μL 10mM pH 9的Tris-HCl缓冲溶液混合，用超纯水稀释至溶液总体积为200μL，在37℃反应60分钟，测量激发波长为290nm时溶液的荧光光谱，计算水体中ALP的含量。结果表明，本发明方法对水样中ALP含量的测试结果与国家标准试纸法法测量得到的结果相一致，表明本发明方法能用于检测实际水样中的ALP。通过动态监测水样中ALP活性的分析表明，润溪湖水体富营养化情况不容乐观。
实施例4
双发射荧光探针对As(V)的检测
在优化实验条件下，采用双发射荧光探针对As(V)进行定量检测。将50μL 100U/L的ALP溶液与50μL不同浓度的As(V)溶液混合，在37℃反应20分钟，再加入10μL双发射荧光探针溶液和40μL 10mM pH 9的Tris-HCl缓冲溶液，用超纯水稀释溶液的总体积为200μL，在37℃反应60分钟，采用荧光光谱仪测量激发波长为290nm时双发射荧光探针中Tb3+和luminol的荧光强度。由图5可见，随着As(V)浓度的增加，Tb3+荧光信号增强而luminol荧光信号减弱，Tb3+荧光信号与luminol荧光信号的比值F549/F432与As(V)浓度在0.5-100ppb范围内呈良好的线性关系，检测限为0.18ppb。
考察了双发射荧光探针对As(V)的检测的选择性，由图6可见，50μM的As(V)使得双发射荧光探针的F430/F547迅速增大，而500μM其他金属离子(包括Ba2+,Mn2+,Zn2+,Cd2+,Pb2+,Hg2+,Ag+,As(III),Mg2+,Ca2+,PO4 3-,SO4 2-,NO3 -,VO4 3-)、乐果(dimethoate)、乙基砷(DMAA)以及甲基砷(MMAA)等均不干扰As(V)的检测，表明本发明方法对As(V)检测有良好的选择性。
采用标准加入法考察了双发射荧光探针对环境水样中的As(V)的检测应用。取自来水和赣江水，用0.22μm醋酸纤维素滤膜过滤，滤去漂浮物。将50μL 100U/L的ALP溶液与50μL水样混合，在37℃孵育20分钟，将10μL双发射荧光探针溶液与40μL 10mM pH 9的Tris-HCl缓冲溶液，用超纯水稀释溶液的总体积为200μL，在37℃反应60分钟，测量激发波长为290nm时溶液的荧光，计算As(V)含量。结果表明，本发明方法对水样中的As(V)的加标回收率为97％-105％，与电感耦合等离子体质谱法测量得到的结果相一致，表明本发明方法可用于检测实际水样中的As(V)，具有良好的应用价值。

Claims (7)

1.基于双发射荧光探针的碱性磷酸酶检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将40μL 10mM鲁米诺溶液与100μL 100mM单磷酸鸟苷溶液混合，搅拌30分钟，再加入100μL 100mM的Tb(NO3)3·6H2O溶液，搅拌反应30分钟，得到乳白色絮状沉淀，将沉淀分散于1mL超纯水中，制成双发射荧光探针溶液；
(2)将10μL双发射荧光探针溶液和40μL 10mM Tris-HCl缓冲溶液与不同浓度的碱性磷酸酶溶液混合，用超纯水稀释溶液的总体积为200μL，在37℃孵育60分钟，采用荧光光谱仪测量稀释后溶液中Tb3+和鲁米诺的荧光强度，根据不同浓度下的碱性磷酸酶对应的Tb3+荧光信号与鲁米诺荧光信号之间的比值的线性关系来判断碱性磷酸酶的活性；或在波长为253.7nm的紫外灯照射下，观察稀释后溶液颜色的变化来实现对碱性磷酸酶活性的快速可视化分析。
2.如权利要求1所述的基于双发射荧光探针的碱性磷酸酶检测方法，其特征在于，所述Tris-HCl缓冲溶液的pH为9。
3.如权利要求1所述的基于双发射荧光探针的碱性磷酸酶检测方法，其特征在于，所述碱性磷酸酶的活性范围为0.05-100U/L。
4.如权利要求1所述的基于双发射荧光探针的碱性磷酸酶检测方法，其特征在于，所述线性关系具体是在激发波长为290nm时，碱性磷酸酶活性的对数与该碱性磷酸酶浓度下对应的在549nm处的Tb3+的荧光强度及在432nm处的鲁米诺的荧光强度之间的比值。
5.基于双发射荧光探针的砷酸根的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将40μL 10mM鲁米诺溶液与100μL 100mM单磷酸鸟苷溶液混合，搅拌30分钟，再加入100μL 100mM的Tb(NO3)3·6H2O溶液，搅拌反应30分钟，得到乳白色絮状沉淀，将沉淀分散于1mL超纯水中，制成双发射荧光探针溶液；
(2)将50μL 100U/L碱性磷酸酶溶液与50μL不同浓度的砷酸根溶液混合，在37℃反应20分钟，再加入10μL双发射荧光探针溶液和40μL 10mM Tris-HCl缓冲溶液，用超纯水稀释溶液的总体积为200μL，在37℃反应60分钟，采用荧光光谱仪测量溶液中Tb3+和鲁米诺的荧光强度，根据不同浓度下的砷酸根对应的Tb3+荧光信号与鲁米诺荧光信号之间的比值来判断砷酸根的浓度。
6.如权利要求5所述的基于双发射荧光探针的砷酸根的 检测方法，其特征在于，所述Tris-HCl缓冲溶液的pH为9。
7.如权利要求5所述的基于双发射荧光探针的砷酸根的 检测方法，其特征在于，所述砷酸根的浓度范围为0.5-100ppb。
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