CN108707644A - 一种基于dna模板化铜簇探针检测焦磷酸根及碱性磷酸水解酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于DNA模板化的铜簇探针检测焦磷酸根离子及碱性磷酸水解酶的方法，属于纳米生物传感技术领域。该方法包括：使用DNA为模板合成发出红色荧光的铜簇探针，再通过Cr3+离子引发的荧光铜簇纳米开关来实现对焦磷酸根离子和碱性磷酸水解酶的高灵敏度和高选择性检测。此外，该荧光纳米探针还能够在复杂体系中实现对焦磷酸根离子和碱性磷酸水解酶的检测。本发明中DNA模板化的铜簇探针合成条件温和、合成步骤简单、荧光稳定且生物相容性高，而且该探针对焦磷酸根离子和碱性磷酸水解酶的检测具有快速、选择性好和灵敏度高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于DNA模板化的铜簇探针检测焦磷酸根离子及碱性磷酸水解酶的方法，属于生物传感技术领域。
背景技术
金属纳米簇是一种新型的荧光纳米材料，它是由几个到几百个金属原子组成的、尺寸小于2nm的分子聚集体。目前，已报道具有荧光性质的金属纳米簇包括Au NCs、Ag NCs、Cu NCs、Pt NCs以及两种金属原子构成的合金纳米簇。近些年来，M NCs由于其独特的化学、物理性质而引起了广泛的关注。
制备稳定性好、强荧光的M NCs仍是当前相关研究的热点和难点，由于M NCs的粒径非常小，一般小于2nm，表面能非常大，易团聚成不发光的大颗粒。常用的方法是利用模板分子的包覆作用来合成结构、性能稳定的M NCs，已报道的模板有蛋白质、聚合物、多肽、寡核苷酸DNA等。其中DNA不仅能与阳离子结合，可有效阻止M NCs团聚成更大的颗粒，还具有良好的生物相容性、较低的毒性、可调的序列和长度以及多样的二级结构等优点，因此DNA成为最具特色的制备M NCs的模板。而DNA模板化的M NCs由于具有超小的粒径、可调的荧光光谱、强的荧光发射、较低的毒性、良好的光化学稳定性以及简便的合成方法等优点,已成为诊断和治疗应用新型探针，在生物分析、生物成像、治疗应用等领域有广泛的应用前景。因此，研究DNA-M NCs的制备及其应用具有重要的意义。
环境变化会引起DNA二级结构的变化，从而导致DNA-M NCs的荧光激发、发射波长发生位移或荧光增强、淬灭。这种性质使DNA-M NCs已被广泛应用于生物小分子、金属离子、阴离子、蛋白质等的检测以及生物标记和成像等领域。基于荧光淬灭、荧光增强，已实现了DNA-M NCs对Hg2+、Ag+、Cu2+等金属离子，生物硫醇、腺苷、三磷酸腺苷等有机小分子以及某些核酸和蛋白质分子的检测。如Deng等报道了一种用FAM标记的ssDNA作为模板合成DNA-AgNCs的方法，并将其应用于选择性地检测和定量环境和生物样品中的Hg2+。Martinez等合成了一种内在荧光识别配体，将高强度荧光的DNA-Ag NCs与凝血酶适体结合起来，用于靶蛋白识别，具有强的灵敏度与选择性。DNA模板化的金属纳米簇潜在的应用正不断被开发出来。目前，DNA-M NCs的研究主要集中于DNA-Ag NCs上，关于DNA-Cu NCs的报道还比较少。
焦磷酸盐是三磷酸腺苷在细胞条件下水解的产物，在代谢酶促反应和生理能量传递等多种生物学过程中起着至关重要的作用，它是一种生物学上重要的靶向目标，其检测已成为研究实时DNA测序的方法。此外，PPi与许多疾病有关，如焦磷酸钙脱水晶体和软骨珊瑚虫病。因此，PPi的基于荧光的化学传感一直是传感研究中的主要焦点之一。对于生物系统中的应用，在磷酸盐、5'-单磷酸腺苷、二磷酸腺苷和ATP存在下，PPi传感通常需要高度选择性。迄今为止，PPi受体设计中最成功的策略是在体系中加入金属离子形成配合物，因为金属离子与PPi之间有很强的结合亲和力，基于此可以检测到PPi。I.Ravikumar等研究了在生理条件下的锌离子和PPi选择性荧光OFF-ON-OFF功能的化学传感器。基于喹啉的化学传感器处于OFF状态，通过荧光增强选择性地检测Zn2+，随后在相对于其他竞争性阴离子如Pi、AMP和ATP等，PPi表现出在缓冲溶液中的选择性荧光猝灭，实现了对PPi的选择性检测。
碱性磷酸水解酶是诊断的重要生物标志物。血清中ALP的水平异常与前列腺癌、骨病、肝功能障碍和糖尿病等多种疾病密切相关。此外，由于其具有高度的催化活性，广泛的底物特异性，容易与抗体结合，温和的反应条件和良好的稳定性等优点，ALP被广泛用作酶联免疫吸附测定中的标记酶，以产生可检测信号。因此，实现对ALP活性的高灵敏度和高选择性检测，对于ALP相关疾病的诊断和基于ALP的ELISA平台的开发具有重要意义。迄今为止，已开发出大量用于ALP活性检测的分析方法，包括比色法、荧光分析法、化学发光法、表面增强拉曼散射法、电化学法和色谱法。其中，荧光分析法由于其高灵敏度、低成本效益和高便利性而引发广泛的关注。Chen等提出了一种基于钙黄绿素-Ce3+复合物的磷酸盐触发的荧光增强型检测ALP的方法。与传统的ALP测定法相比，该方法简单易行、经济有效，且显示出更高的灵敏度。它还为药物中痕量ALP抑制剂筛选提供了一个潜在的平台。
这里我们将合成条件温和、合成步骤简单、荧光稳定且生物相容性高的DNA模板化的铜簇构建纳米荧光开关探针，并成功实现在同一体系中相继对焦磷酸根离子及碱性磷酸水解酶的检测，该检测方法兼具有效、快速、选择性好和灵敏度高的优点。
发明内容
本发明的目的在于，为了克服现有技术的不足，提出一种DNA模板化的铜簇探针检测焦磷酸根离子及碱性磷酸水解酶的方法。所述方法可以通过温和的合成条件、简单的合成步骤、便宜的合成原料制备出发射出稳定且强的红色荧光的DNA模板化的铜簇探针，所述的铜簇探针能有效、快速地实现对焦磷酸根离子及碱性磷酸水解酶的高选择性和高灵敏度检测。
本发明的技术方案之一是，基于DNA模板化的铜簇探针检测焦磷酸根离子的方法，其特征在于：在MOPS缓冲溶液中制备铜簇探针，向制备好的铜簇探针中加入Cr3+离子，使铜簇探针荧光淬灭，再加入焦磷酸根离子，使铜簇探针荧光恢复。并且随着Cr3+离子浓度的增加铜簇探针荧光逐渐增强。
以下对本发明做出进一步说明。
基于DNA模板化的铜簇探针检测焦磷酸根离子的方法时，所述MOPS缓冲溶液的pH为7.8，MOPS的浓度为10mM，NaCl的浓度为50mM；
取500μL制备好的铜簇探针，分别加入200μM的Cr3+离子，震荡摇匀，反应1min后，再依次加入0-200μM的不同浓度的焦磷酸根离子溶液，震荡摇匀，反应1min后，通过荧光光谱仪测量绘制荧光强度图，记录加焦磷酸根离子前后荧光强度变化情况。
本发明的技术方案之二是，基于DNA模板化的铜簇探针检测碱性磷酸水解酶的方法，其特征在于：在MOPS缓冲溶液中制备铜簇探针，向制备好的铜簇探针中加入Cr3+离子，再加入焦磷酸根离子与碱性磷酸水解酶孵化后的反应液，使铜簇探针产生荧光淬灭的现象。
以下对本发明做出进一步说明。
基于DNA模板化的铜簇探针检测碱性磷酸水解酶的方法时，所述MOPS缓冲溶液的pH为7.8，MOPS的浓度为10mM，NaCl的浓度为50mM；
于37℃条件下，将不同浓度的碱性磷酸水解酶与一定浓度的焦磷酸根离子孵化反应30min。取500μL制备好的铜簇探针，分别加入200μM的Cr3+离子，震荡摇匀，反应1min后，再依次加入0–125μg/mL的不同浓度的碱性磷酸水解酶与固定浓度为200μM的焦磷酸根离子孵化后的反应液，震荡摇匀，反应1min后，通过荧光光谱仪测量绘制荧光强度图，记录加碱性磷酸水解酶与焦磷酸根离子的反应液前后荧光强度变化情况。
本发明的技术方案之三是，基于DNA模板化的铜簇探针在复杂环境体系中检测焦磷酸根离子的方法，其特征在于：在MOPS缓冲溶液中加入一定量的人体血清，再制备铜簇探针。向制备好的铜簇探针中加入Cr3+离子，使铜簇探针荧光淬灭，再加入焦磷酸根离子，铜簇探针荧光恢复。
以下对本发明做出进一步说明。
基于DNA模板化的铜簇探针检测焦磷酸根离子的方法时，所述MOPS缓冲溶液的pH为7.8，MOPS的浓度为10mM，NaCl的浓度为50mM；
在MOPS缓冲溶液中加入1％的人体血清，再制备铜簇探针。取500μL制备好的铜簇探针，分别加入200μM的Cr3+离子，震荡摇匀，反应1min后，再依次加入0–400μM的不同浓度的焦磷酸根离子溶液，震荡摇匀，反应1min后，通过荧光光谱仪测量绘制荧光强度图，记录加焦磷酸根离子前后荧光强度变化情况。
本发明的技术方案之四是，基于DNA模板化的铜簇探针在复杂环境体系中检测碱性磷酸水解酶的方法，在MOPS缓冲溶液中加入一定量的人体血清后制备铜簇探针。向制备好的铜簇探针中加入Cr3+离子，再加入焦磷酸根离子与碱性磷酸水解酶孵化后的反应液，使铜簇探针荧光淬灭。
以下对本发明做出进一步说明。
基于DNA模板化的铜簇探针检测焦磷酸根离子的方法时，所述MOPS缓冲溶液的pH为7.8，MOPS的浓度为10mM，NaCl的浓度为50mM；
于37℃条件下，将不同浓度的碱性磷酸水解酶与一定浓度的焦磷酸根离子孵化反应30min。在MOPS缓冲溶液中加入1％的人体血清，再制备铜簇探针。取500μL制备好的铜簇探针，分别加入200μM的Cr3+离子，震荡摇匀，反应1min后，再依次加入0–125μg/mL的不同浓度的碱性磷酸水解酶与固定浓度为200μM的焦磷酸根离子孵化后的反应液，震荡摇匀，反应1min后，通过荧光光谱仪测量绘制荧光强度图，记录加碱性磷酸水解酶与焦磷酸根离子的反应液前后荧光强度变化情况。
本发明的有益效果：
本发明的方法为使用DNA为模板合成发出红色荧光的铜簇探针后，向铜簇探针溶液中加入Cr3+离子，使铜簇探针荧光淬灭。如果在铜簇探针与Cr3+离子的混合液中加入焦磷酸根离子，则铜簇探针荧光恢复；如果在铜簇探针与Cr3+离子的混合液中加入焦磷酸根离子与碱性磷酸水解酶孵化后的反应液，则无法使铜簇探针的荧光恢复。从而通过Cr3+引发的荧光铜簇纳米开关实现了对焦磷酸根离子和碱性磷酸水解酶的高灵敏度和高选择性检测。此外，该荧光纳米探针还能够在复杂环境体系中实现对焦磷酸根离子和碱性磷酸水解酶的检测。本发明中DNA模板化的铜簇探针合成条件温和、合成步骤简单、荧光稳定和生物相容性高，而且该探针对焦磷酸根离子和碱性磷酸水解酶的检测有效、快速、选择性好和灵敏度高等优点。这些研究为焦磷酸根离子和碱性磷酸水解酶的高灵敏度和高选择性检测的实现提供了新的方法。
附图说明
下面结合附图对本发明的实施例作进一步说明。
图1为实施例1中制得的铜簇探针的荧光发射光谱图；
图2为实施例2中制得的铜簇探针中加入焦磷酸根离子后的荧光发射光谱图；
图3为实施例3中制得的铜簇探针中加入Cr3+离子后的荧光发射光谱图；
图4为实施例4中制得的铜簇探针中先加入Cr3+离子再加入焦磷酸根离子后的荧光发射光谱图；
图5为实施例5中制得的铜簇探针中先加入Cr3+离子再加入焦磷酸根离子与碱性磷酸水解酶孵化后的反应液后的荧光发射光谱图；
图6为实施例6中制得的铜簇探针中加入不同的金属离子后的荧光发射光谱图；
图7为实施例6中制得的铜簇探针中加入不同的金属离子后的荧光相对强度变化柱状图；
图8为实施例7中制得的铜簇探针中加入不同浓度的Cr3+离子后的荧光发射光谱图；
图9为实施例7中制得的铜簇探针中加入不同浓度的Cr3+离子后的荧光相对强度散点图；
图10为实施例7中制得的铜簇探针中加入不同浓度的Cr3+离子后的标准曲线图；
图11为实施例8中制得的铜簇探针中先加入Cr3+离子再加入不同的阴离子后的荧光发射光谱图；
图12为实施例8中制得的铜簇探针中先加入Cr3+离子再加入不同的阴离子后的荧光相对强度变化柱状图；
图13为实施例9中制得的铜簇探针中先加入Cr3+离子再加入不同浓度的焦磷酸根离子后的荧光发射光谱图；
图14为实施例9中制得的铜簇探针中先加入Cr3+离子再加入不同浓度的焦磷酸根离子后的荧光相对强度散点图；
图15为实施例9中制得的铜簇探针中先加入Cr3+离子再加入不同浓度的焦磷酸根离子后的标准曲线图；
图16为实施例10中制得的铜簇探针中先加入Cr3+离子再加入焦磷酸根离子与不同浓度的碱性磷酸水解酶孵化后的反应液后的荧光发射光谱图；
图17为实施例10中制得的铜簇探针中先加入Cr3+离子再加入焦磷酸根离子与不同浓度的碱性磷酸水解酶孵化后的反应液后的荧光相对强度散点图；
图18为实施例10中制得的铜簇探针中先加入Cr3+离子再加入焦磷酸根离子与不同浓度的碱性磷酸水解酶孵化后的反应液后的标准曲线图；
图19为实施例11中制得的铜簇探针中加入不同浓度的Cr3+离子后的荧光发射光谱图；
图20为实施例11中制得的铜簇探针中加入不同浓度的Cr3+离子后的荧光相对强度散点图；
图21为实施例11中制得的铜簇探针中加入不同浓度的Cr3+离子后的标准曲线图；
图22为实施例12中制得的铜簇探针中先加入Cr3+离子再加入不同浓度的焦磷酸根离子后的荧光发射光谱图；
图23为实施例12中制得的铜簇探针中先加入Cr3+离子再加入不同浓度的焦磷酸根离子后的荧光相对强度散点图；
图24为实施例12中制得的铜簇探针中先加入Cr3+离子再加入不同浓度的焦磷酸根离子后的标准曲线图；
图25为实施例13中制得的铜簇探针中先加入Cr3+离子再加入焦磷酸根离子与不同浓度的碱性磷酸水解酶孵化后的反应液后的荧光发射光谱图；
图26为实施例13中制得的铜簇探针中先加入Cr3+离子再加入焦磷酸根离子与不同浓度的碱性磷酸水解酶孵化后的反应液后的荧光相对强度散点图；
图27为实施例13中制得的铜簇探针中先加入Cr3+离子再加入焦磷酸根离子与不同浓度的碱性磷酸水解酶孵化后的反应液后的标准曲线图；
图28为Cr3+离子引发的荧光铜簇纳米开关检测焦磷酸根离子和碱性磷酸水解酶的示意图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述实施例。
实施例1：室温下，取500μL的MOPS缓冲溶液，加入1μM的T40、2mM的抗坏血酸、500μM的Cu2+离子，震荡摇匀，反应1min。在紫外灯照射情况下，观察到红色荧光，表示铜簇探针制备成功。通过荧光光谱仪对铜簇探针进行荧光强度检测，绘制荧光发射光谱图，如图1。
实施例2：室温下，取500μL的MOPS缓冲溶液，加入1μM的T40、2mM的抗坏血酸、500μM的Cu2+离子，震荡摇匀，反应1min。在紫外灯照射情况下，观察到红色荧光，表示铜簇探针制备成功。向制备好的铜簇探针中加入200μM的焦磷酸根离子，震荡摇匀，反应1min。通过荧光光谱仪对铜簇探针进行荧光强度检测，绘制荧光发射光谱图，如图2。
实施例3：室温下，取500μL的MOPS缓冲溶液，加入1μM的T40、2mM的抗坏血酸、500μM的Cu2+离子，震荡摇匀，反应1min。在紫外灯照射情况下，观察到红色荧光，表示铜簇探针制备成功。向制备好的铜簇探针中加入300μM的Cr3+离子，震荡摇匀，反应1min。通过荧光光谱仪对铜簇探针进行荧光强度检测，绘制荧光发射光谱图，如图3。
实施例4：室温下，取500μL的MOPS缓冲溶液，加入1μM的T40、2mM的抗坏血酸、500μM的Cu2+离子，震荡摇匀，反应1min。在紫外灯照射情况下，观察到红色荧光，表示铜簇探针制备成功。向制备好的铜簇探针中加入200μM的Cr3+离子，震荡摇匀，反应1min后，再加入200μM的焦磷酸根离子，震荡摇匀，反应1min。通过荧光光谱仪对铜簇探针进行荧光强度检测，绘制荧光发射光谱图，如图4。
实施例5：室温下，取500μL的MOPS缓冲溶液，加入1μM的T40、2mM的抗坏血酸、500μM的Cu2+离子，震荡摇匀，反应1min。在紫外灯照射情况下，观察到红色荧光，表示铜簇探针制备成功。向制备好的铜簇探针中加入200μM的Cr3+离子，震荡摇匀，反应1min后，再加入200μM的焦磷酸根离子与125μg/mL的碱性磷酸水解酶孵化后的反应液，震荡摇匀，反应1min。通过荧光光谱仪对铜簇探针进行荧光强度检测，绘制荧光发射光谱图，如图5。
实施例6：室温下，取500μL的MOPS缓冲溶液，加入1μM的T40、2mM的抗坏血酸、500μM的Cu2+离子，震荡摇匀，反应1min。在紫外灯照射情况下，观察到红色荧光，表示铜簇探针制备成功。在制备好的铜簇探针中，分别加入200μM的各类金属离子：1,Control；2,Cr3+；3,Ag+；4,Zn2+；5,Mn2+；6,Ca2+；7,Cd2+；8,Co2+；9,Al3+；10,Ni2+；11,Mg2+；12,Ba2+；13,K+；14,Fe2+；15,Fe3+；16,Pd2+；17,Hg2+and 18,Cu2+，震荡摇匀，反应1min。通过荧光光谱仪对铜簇探针进行荧光强度检测，绘制荧光发射光谱图和荧光相对强度柱状图，如图6和图7。
实施例7：室温下，取500μL的MOPS缓冲溶液，加入1μM的T40、2mM的抗坏血酸、500μM的Cu2+离子，震荡摇匀，反应1min。在紫外灯照射情况下，观察到红色荧光，表示铜簇探针制备成功。在制备好的铜簇探针中，分别加入0-300μM的不同浓度的Cr3+离子，震荡摇匀，反应1min。通过荧光光谱仪对铜簇探针进行荧光强度检测，绘制荧光发射光谱图、荧光相对强度散点图和标准曲线图，如图8、图9和图10。
实施例8：室温下，取500μL的MOPS缓冲溶液，加入1μM的T40、2mM的抗坏血酸、500μM的Cu2+离子，震荡摇匀，反应1min。在紫外灯照射情况下，观察到红色荧光，表示铜簇探针制备成功。在制备好的铜簇探针中，分别加入200μM的Cr3+离子，震荡摇匀，反应1min后，再分别加入200μM的各类阴离子：1,Control；2,NO3-；3,Ac-；4,HCO3-；5,CO3 2-；6,PO4 3-；7,HPO4 2-；8,H2PO4 -；9,P2O7 4-；10,F-；11,Br-；12,I-；13,Cl-；14,SO3 2-；15,HS-；16,SO4 2-；17,SCN-和18,S2-，震荡摇匀，反应1min。通过荧光光谱仪对铜簇探针进行荧光强度检测，绘制荧光发射光谱图和荧光相对强度柱状图，如图11和图12。
实施例9：室温下，取500μL的MOPS缓冲溶液，加入1μM的T40、2mM的抗坏血酸、500μM的Cu2+离子，震荡摇匀，反应1min。在紫外灯照射情况下，观察到红色荧光，表示铜簇探针制备成功。在制备好的铜簇探针中，分别加入200μM的Cr3+离子，震荡摇匀，反应1min后，再分别加入0-200μM的不同浓度的焦磷酸根离子，震荡摇匀，反应1min。通过荧光光谱仪对铜簇探针进行荧光强度检测，绘制荧光发射光谱图、荧光相对强度散点图和标准曲线图，如图13、图14和图15。
实施例10：室温下，取500μL的MOPS缓冲溶液，加入1μM的T40、2mM的抗坏血酸、500μM的Cu2+离子，震荡摇匀，反应1min。在紫外灯照射情况下，观察到红色荧光，表示铜簇探针制备成功。于37℃条件下，将碱性磷酸水解酶与Na4P2O7孵化30min。在制备好的铜簇探针中，分别加入200μM的Cr3+离子，震荡摇匀，反应1min后，再分别加入0-125μg/mL的不同浓度的碱性磷酸水解酶与固定浓度为200μM的Na4P2O7孵化后的反应液，震荡摇匀，反应1min。通过荧光光谱仪对铜簇探针进行荧光强度检测，绘制荧光发射光谱图、荧光相对强度散点图和标准曲线图，如图16、图17和图18。
实施例11：室温下，取500μL的MOPS缓冲溶液，加入1％的人体血清，再加入1μM的T40、2mM的抗坏血酸、500μM的Cu2+离子，震荡摇匀，反应1min。在紫外灯照射情况下，观察到红色荧光，表示铜簇探针制备成功。在制备好的铜簇探针中，分别加入0-500μM的不同浓度的Cr3+离子，震荡摇匀，反应1min。通过荧光光谱仪对铜簇探针进行荧光强度检测，绘制荧光发射光谱图、荧光相对强度散点图和标准曲线图，如图19、图20和图21。
实施例12：室温下，取500μL的MOPS缓冲溶液，加入1％的人体血清，再加入1μM的T40、2mM的抗坏血酸、500μM的Cu2+离子，震荡摇匀，反应1min。在紫外灯照射情况下，观察到红色荧光，表示铜簇探针制备成功。在制备好的铜簇探针中，分别加入200μM的Cr3+离子，震荡摇匀，反应1min后，再分别加入0-400μM不同浓度的焦磷酸根离子，震荡摇匀，反应1min。通过荧光光谱仪对铜簇探针进行荧光强度检测，绘制荧光发射光谱图、荧光相对强度散点图和标准曲线图，如图22、图23和图24。
实施例13：室温下，取500μL的MOPS缓冲溶液，加入1％的人体血清，再加入1μM的T40、2mM的抗坏血酸、500μM的Cu2+离子，震荡摇匀，反应1min。在紫外灯照射情况下，观察到红色荧光，表示铜簇探针制备成功。于37℃条件下，将碱性磷酸水解酶与Na4P2O7孵化30min。在制备好的铜簇探针中，分别加入200μM的Cr3+离子，震荡摇匀，反应1min后，再分别加入0-125μg/mL的不同浓度的碱性磷酸水解酶与固定浓度为200μM的Na4P2O7孵化后的反应液，震荡摇匀，反应1min。通过荧光光谱仪对铜簇探针进行荧光强度检测，绘制荧光发射光谱图、荧光相对强度散点图和标准曲线图，如图25、图26和图27。
本发明的不局限于上述实施例所述的具体技术方案，凡采用等同替换形成的技术方案均为本发明要求的保护范围。
Claims (8)
1.一种DNA模板化的铜簇探针的制备方法，其特征在于：以MOPS为缓冲溶液、poly-T类DNA为模板、Cu2+离子为前体、抗坏血酸为还原剂，于室温下合成稳定的、强荧光的铜簇探针，通过荧光光谱仪对合成的铜簇探针进行荧光强度检测。
2.根据权利要求1所述的DNA模板化的铜簇探针的制备方法，其特征在于：铜簇探针合成条件为：MOPS缓冲溶液的pH为7.8，MOPS的浓度为10mM，NaCl的浓度为50mM；T40的浓度为1μM；Cu2+离子的浓度为500μM；抗坏血酸的浓度为2mM，通过荧光光谱仪对合成的铜簇探针进行荧光强度检测。
3.根据权利要求2所述的基于DNA模板化的铜簇探针检测焦磷酸根离子的方法，其特征在于：在MOPS缓冲溶液中制备铜簇探针后，在制备好的铜簇探针中加入Cr3+离子，使铜簇探针产生荧光淬灭的现象，再加入焦磷酸根离子，使铜簇探针产生荧光恢复的现象。
4.根据权利要求3所述的基于DNA模板化的铜簇探针检测焦磷酸根离子的方法，其特征在于：所述MOPS缓冲溶液的pH为7.8，MOPS的浓度为10mM，NaCl的浓度为50mM；Cr3+离子浓度为200μM，焦磷酸根离子的浓度为200μM，探针与标志物的反应时间为1min。
5.根据权利要求1、2所述的基于DNA模板化的铜簇探针检测碱性磷酸水解酶的方法，其特征在于：在MOPS缓冲溶液中制备铜簇探针后，在制备好的铜簇探针中加入Cr3+离子，再加入焦磷酸根离子与碱性磷酸水解酶孵化后的反应液，使铜簇探针产生荧光淬灭的现象。
6.根据权利要求5所述的基于DNA模板化的铜簇探针检测碱性磷酸水解酶的方法，其特征在于：所述MOPS缓冲溶液的pH为7.8，MOPS的浓度为10mM，NaCl的浓度为50mM；Cr3+离子浓度为200μM，焦磷酸根离子的浓度为200μM，碱性磷酸水解酶的浓度为125μg/mL，探针与标志物的反应时间为1min，焦磷酸根离子与碱性磷酸水解酶的孵化温度为37℃，孵化时间为30min，孵化pH为9。
7.根据权利要求1、2、3和4所述的基于DNA模板化的铜簇探针检测焦磷酸根离子的方法，其特征在于：在复杂环境体系中制备出铜簇探针，向制备好的铜簇探针中加入Cr3+离子，使铜簇探针荧光淬灭，再加入焦磷酸根离子，铜簇探针的荧光强度会随着焦磷酸根离子浓度的增加而增强，从而实现在复杂环境体系中对焦磷酸根离子的检测。
8.根据权利要求1、2、5和6所述的基于DNA模板化的铜簇探针检测碱性磷酸水解酶的方法，其特征在于：在复杂环境体系中制备出铜簇探针，向制备好的铜簇探针中加入Cr3+离子，再加入焦磷酸根离子与碱性磷酸水解酶孵化后的反应液，铜簇探针的荧光会随着碱性磷酸水解酶浓度的增加而减弱，从而实现在复杂环境体系中对碱性磷酸水解酶的检测，所述复杂环境为人的血清。
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2018
- 2018-05-28 CN CN201810523133.5A patent/CN108707644B/zh active Active
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