CN101467045A - 通过测定结合和未结合的标记增加分析物检测的专一性 - Google Patents

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Abstract

本发明描述在包括分析物标记的分析技术(例如SERRS)中提供内参照用于分析物检测，特别是样品中生物分子的检测，具有改善的准确度。

Description

通过测定结合和未结合的标记增加分析物检测的专一性
技术领域
本发明涉及通过包括分析物标记的分析技术用于分析物特别是样品中的生物分子的检测的方法，其中测定的准确度和/或可靠性是重要的。
背景技术
低浓度生物分子例如蛋白质、肽、寡核苷酸、核酸、脂质、多糖、激素、神经递质、代谢物等的灵敏和准确的定性或者定量检测已经被证实是难以实现的目标，所述检测在医学诊断、病理学、毒理学、流行病学、生物战争、环境取样、法医学和许多其他领域具有广泛的潜在用途。
特别的例子是DNA检测，例如在医学诊断学(传染原例如致病细菌和病毒的检测，遗传性和获得性遗传疾病的诊断等等)中，在作为犯罪调查的一部分的法医试验中，在亲子鉴定中，在全基因组测序中等等。
虽然纯化样品的鉴定和/或定量有时可基于分析物本身的理化性质来进行，但许多检测测定使用“探针”，其为具有强亲和力并优选地还对分析物具有高度专一性的已知分子。当分析物是蛋白质或肽的时，这些测定被称为配体结合测定。最通用配体的结合测定中的一种是免疫测定。免疫测定典型地采用抗体，其专一性地结合分析物中的抗原，形成抗体-抗原复合物。配体结合测定与医学诊断学特别相关。在现代医学实践中，配体结合测定日常应用于患者血液、尿液、唾液等，以测定抗体、抗原、激素、药物、毒物、毒素、非法药物等的存在或水平。配体结合测定还被用于监测地下水污染、食物中的毒素和农药、工业生物过程以及许多生物研究领域。
DNA检测典型地采用作为靶DNA专一性的核苷酸序列的“探针”的杂交。这些测定通常用在活性传染原的专一性检测，用于法医分析中的DNA鉴定和遗传缺陷的鉴定。
这些检测测定的共同特征常常是以可追踪的物质标记分析物专一性的探针。与分析物结合的可追踪的物质(此后称为标记)的检测指示样品中分析物的量。标记的测定可根据所采用的标记的性质使用各种不同技术中的一种保证。目前的检测方法典型地包括可与分析物或者靶生物分子结合的荧光标记的抗体或寡核苷酸探针的检测。交叉反应和非专一性结合可使复杂样品中的生物分子的荧光检测变得复杂。即使在得到高探针专一性时，荧光检测的灵敏度常常也不足以鉴定低浓度的生物分子。当待测生物分子在其他分子的复杂混合物中以低浓度存在时这尤其真实，在所述混合物中干扰、荧光猝灭和高背景荧光都可遮蔽或者减弱来自靶生物分子的信号。
表面增强(共振)拉曼光谱或SE(R)RS是这样的技术：由于其高度的灵敏度而迅速赶上用于检测的荧光。拉曼光谱利用拉曼散射现象。当光通过光学透明的样品时，部分光向所有方向被散射。大多数散射光子与入射光的波长相同。这被称作瑞利散射。但是，小部分散射光具有不同波长和相位的轻微随机变化。Stokes(反Stokes)拉曼发射光谱转变成与激发波长相比更长(或更短)的波长。拉曼光谱是样品中的化学成分和光吸收分子的结构的特性，而拉曼散射的强度取决于这些分子的浓度。当化合物被吸附在粗糙的金属(例如金、银、铜和一些其他金属的纳米粒子)表面上或其附近时，固有的弱拉曼散射可增强到高达108倍甚至更高。与这种现象有关的技术被称为表面增强拉曼散射(SERS)。分析物距离“活性”表面越近，检测灵敏度的增加越显著。最佳位置在围绕表面的第一分子层，即表面的大约30nm以内。这可通过例如中和核酸上的净电荷从而使分子可非常接近银表面的精胺来实现。
灵敏度进一步的103-105倍的增加可通过在分析物的共振频率下操作得到，或者如同更通常进行的那样，使用与分析物连接的“SERS活性”物质或者染料(当适当照射时能够产生SE(R)RS光谱)，并在染料的共振频率下操作得到。这被称为“共振拉曼散射”光谱。表面增强效应与共振效应的结合，提供“表面增强共振拉曼散射”或者SERRS，强烈地增加了灵敏度。与荧光相比，SERRS信号可更容易与污染和背景区别开来。
SE(R)RS的另一个关键优点为使用单一激发波长的复用的可能性。用作标记的各个SE(R)RS提供唯一的指纹，所述指纹可在染料混合物中被识别而无需如同对于荧光光谱法所必须的那样进行分离。大约有50种专门设计的用于SE(R)RS的染料，它们中的每一种都提供独特的光谱。因此SE(R)RS是用于生物分子检测的高灵敏度和专一性的方法，提供足够的灵敏度以检测低浓度的生物分子。使用SE(R)RS的生物分析技术已经被证明允许检测阿摩尔(attomole)(10-18mol)量的蛋白质或者DNA下至飞摩尔(femtomole)(10-15mol在400μl中)的浓度。已报道关于罗丹明6G、腺嘌呤、结晶紫以及其他SERRS活性分子的单分子检出限。拉曼光谱应用非常广泛，从在物理学中的材料分析到在生物学中的非常广泛的各种应用。
尽管非常灵敏的检测方法例如SE(R)RS是可利用的，准确的定量分析仍是一个挑战。每种方法典型地要求试剂的生产和提供特定检测条件，它们的差异性可影响检测的准确度。
而且对于基于SE(R)RS的检测方法来说，已经报道了影响检测的可靠性和准确度的各种因素。SE(R)RS活性表面具有复杂结构和动力学，使得难于以可再现的方式来制造它们。此外，SE(R)RS增强强烈地依赖于分析物和SE(R)RS活性表面之间的距离。此外，SE(R)RS增强的变化随着分析物在SE(R)RS活性表面上的表面覆盖度而发生(与SE(R)RS活性热点的分布有关)。另外，使用光学方法(包括SE(R)RS以及普通Raman或者荧光)的定量浓度测定必须克服由激发、收集效率或者两者的变化所产生的强度变化。
在本领域，对于所述变化的校正最通常使用内部和/或外部标准来校准光学信号和感兴趣的分析物的浓度(或量)之间的关系来解决。已经建议通过使用由自组装膜(self-assembled monolayer，SAM)产生的SE(R)RS信号作为内标来改善SE(R)RS(胶体)定量的准确度。使用这种方法，假定SAM的高覆盖度以防止分析物化学吸附到SE(R)RS活性表面上并由此以提高再现性。但是，发现这种方法具有许多固有的局限性，导致当使用这种SAM内标方法时观察到比较大的预测误差(对于0.1-5M的样品的均根预测误差为0.5M)。
已经建议通过确保分析物和内标分子具有实质上相同的化学性质，它们的相对SE(R)RS强度对逐批胶体溶液的变化和光学激发和/收集参数远不敏感。这会允许在宽的浓度范围内以改善的准确度和再现性来改善定量SE(R)RS测定的准确度。
发明概述
本发明的目的是提供通过包括分析物标记的检测技术用于分析物的检测例如定性或定量检测的替代或者改进的方法。所述方法的优点是改善的测定可靠性和/或准确度。
在本发明的一个方面，内标被包括以借此确保改善的检测可靠性和准确度。更特别地，这通过引入另外的测定来实现，所述测定通过样品中分析物的存在和/或量同样地确定，并因此可用作用于所述分析物的直接检测的内标。当使用预定量的标记工作时，未结合的标记部分的检测和/或定量提供对分析物的直接检测/定量的内标，所述直接检测/定量基于与分析物结合的标记部分的测定。
本发明因此提供用于检测和任选地定量样品中分析物的存在的方法，其包括下列步骤：a)使可能包含所述分析物的样品和预定量的能够与所述分析物结合的标记接触；b)检测与所述分析物结合的标记部分，借此与所述分析物结合的标记的量指示所述样品中所述分析物的存在(并任选地指示其量)；并且还包括步骤(c)检测未与所述分析物结合的标记部分，借此未与所述分析物结合的标记的量提供间接指示存在(并任选地间接指示样品中分析物的量)的内参照，其中所述(b)和(c)中的检测步骤使用光学检测方法来保证。
根据一个实施方案，与分析物结合的标记部分和未与分析物结合的标记部分的检测是在没有事先分离的情况下即在同一样品中进行的。这可通过例如使用可以以结合的或未结合的状态区别地得到检测的标记来实现。所使用的标记是光学标记。根据特别的实施方案，使用的标记是荧光和/或SE(R)RS活性标记，当所述荧光和/或SE(R)RS活性标记与所述SE(R)RS活性表面缔合时，其最大吸收频率从第一频率转变至第二频率。或者，使用具有分子信标(molecular beacon)的标记，以保证当标记与分析物结合和当未与分析物结合时的不同信号。
根据另一个实施方案，本发明的方法还包括在步骤(b)之前的分离步骤，借此将与所述分析物结合的标记部分和未与所述分析物结合的标记部分分离。该分离步骤可包括将一个或者两个部分从样品中移出或者可以是所述部分在一个样品中的物理分离。
根据一个实施方案，这可通过在基板上捕获结合的标记部分并从样品中物理移出所述基板或者未结合的标记部分来实现。结合的标记部分可通过捕获探针在基板上捕获，所述探针可在基板上捕获分析物。根据一个实施方案，所述捕获探针为分析物专一性的捕获探针。或者，分析物与基板的结合通过所述分析物上的与所述基板上的链霉亲和素标记接触的生物素标记发生。所述生物素标记可通过PCR扩增引入到分析物中。
本发明的另一特别的实施方案涉及这样的方法，其中结合的和未结合的标记部分的分离通过使所述结合部分与对物理或化学力反应的基板或者标记结合来保证，所述物理或化学力(例如重力、磁场等)的施加被用于移出所述结合部分。
本发明的方法适用于基本上任何类型的分析物的检测，例如但不限于核酸、蛋白质、碳水化合物、脂质、化学物质、抗体、微生物或者真核细胞。本发明的方法的特别的实施方案涉及核酸序列例如DNA的检测和/或定量。
最特别地，本发明的方法是这样的方法，其中上述的检测步骤(b)和(c)使用光学检测方法来保证。最特别地，本发明的方法的检测步骤(b)和(c)使用SE(R)RS来保证，其中所述标记为SE(R)RS活性标记。在特别的实施方案中，该方法因此还包括在步骤(b)和(c)之前的包括使与所述分析物结合的标记部分和未与所述分析物结合的标记部分和SE(R)RS活性表面接触的步骤。当结合的和未结合的标记的检测在同一样品中进行时，通过向所述样品中加入SE(R)RS活性表面，使所述结合和未结合的标记同时与所述SE(R)RS活性表面接触。在特别的实施方案中，在本发明的方法中使用的SE(R)RS活性表面是银或金的纳米粒子的胶体悬浮液，或者是它们的聚集的胶体(aggregated colloids)。
典型地，当使用其中分析物不以纯化形式存在的样品(即其中存在其他成分的样品)工作时，在本发明的方法中使用的标记为分析物专一性标记，即其能够与分析物专一性地结合。然而，也包括当分析物以纯化形式存在并且本发明的方法用于定量目的时，标记与分析物的结合是足够的。
在本发明的方法中使用的标记是分析物专一性标记的情况下，这可通过使用与标记结合的分析物专一性探针来保证。典型地，在所述分析物为核苷酸序列的情况下，所述分析物专一性探针可以是互补寡核苷酸序列。
本发明还提供用于检测和/或定量样品中分析物的存在的系统，其包含：
a)用于使可能包含所述分析物的所述样品和预定量的能够与所述分析物结合的标记接触的装置；
b)用于检测与所述分析物结合的标记部分的装置；借此与所述分析物结合的标记的量指示所述样品中分析物的存在并任选地指示其量；和
c)用于检测未与所述分析物结合的标记部分的装置；借此从所述预定量的标记中扣除的未与所述分析物结合的标记的量提供指示所述样品中分析物的存在并任选地指示其量的内参照。
所述系统可用于分析物的分析，例如用于分子诊断。
本发明的上述和其他特性、特征和优点通过下列结合附图的详细描述将变得显而易见，所述附图通过例子说明本发明的原理。该描述仅仅为了例证而给出，而不是限制本发明的范围。下面引用的参考图形指的是附图。
附图简要说明
图1是本发明的检测方法的特别实施方案测定结合分析物的和未结合的标记的示意图。
图2是应用于样品中DNA的SE(R)RS检测的本发明的方法的实施方案的示意图。
图3A是根据本发明的一个实施方案的结合分析物的和未结合的标记的SE(R)RS光谱的例子。所述光谱的对比给出了有关所述分析物浓度的额外信息。
图3B是根据本发明的一个实施方案的结合分析物的和未结合的标记的光谱的荧光光谱的例子。所述光谱的对比给出了有关所述分析物浓度的额外信息。
图4A和B是根据本发明的不同实施方案的系统的示意图。
发明详述
在本文中使用的术语“分析物”指的是测试样品中待使用本发明检测的物质。本发明所包括的分析物的非限制性列举在本说明书中提供。
在本文中使用的术语“标记”指的是能够产生可检测的信号的分子或者物质。所包括的用于本发明的方法的标记的非限制性的列举在本说明书中提供。
在本文中使用的术语“结合的标记部分”指的是当将预定量的标记加入到样品中时与分析物结合的那些标记。
在本文中使用的术语“未结合的标记部分”指的是当将预定量的标记加入到样品中时未与分析物结合的那些标记。
应当理解，在本发明的方法中，提及结合和未结合的标记部分与当检测时在相关部分中是否检测到任何标记无关。
在本文中使用的“分析物专一性探针”是能够与所述分析物专一性地结合并且标记可与其连接的探针。所述探针与所述分析物的结合可基于任何类型的相互作用，包括但不限于互补核酸序列、抗原/抗体相互作用、配体/受体结合、酶/底物相互作用等等。
在本文中使用的“分析物专一性标记”指的是通过其固有特性或者由于所述标记与分析物专一性探针连接而能够与所述分析物专一性结合的标记。
在本文中使用的“捕获探针”指的是能够使分子或者分子复合物与基板结合分子。
在本文中使用的“基板”指的是分子或分子复合物能与其结合并且可被处理的材料。基板的典型实例包括但不限于微孔板、小珠、芯片等等。
在本文中使用的“SE(R)RS活性表面”指的是这样的金属表面，当分析物被吸附到所述表面或者与其非常接近时，所述表面有助于强烈增强拉曼散射。所述表面例如可以是蚀刻或粗糙的金属表面、金属溶胶或者金属胶体粒子的聚集体。SE(R)RS活性表面的更广泛列举可见于下面的说明书中。
将参照特别的实施方案并参照某些附图对本发明进行描述，但本发明并不限于此，而是仅仅由权利要求书来限定。权利要求书中的参照标记不应解释为对其范围的限制。所描述的附图仅仅是示意性的而非限制性的。在附图中，出于说明的目的，一些元件的尺寸可能被夸大而不是按比例绘制。当本说明书和权利要求书中使用术语“包括”时，并不排除其他元件或步骤。在英文中，当在涉及单数名词时使用不定冠词或定冠词时，例如“a”或者“an”、“the”，除非另有特别说明，均包括该名词的复数。
根据第一方面，本发明提供了基于分析物标记的用于检测和/或定量样品中所述分析物的分析技术，其中预定量的标记与所述样品接触，并且除了检测和/或定量结合的标记之外，还定量未结合的标记部分。因此，根据一个实施方案，本发明的方法包括下列步骤(图1)：
-使怀疑含有分析物的样品与预定量的能够与所述分析物结合的标记接触，和
-检测和/或定量与所述分析物结合的标记部分(结合的标记部分)和
-检测和/或定量未与所述分析物结合的标记部分(未结合的标记部分)。
本发明基于这样的概念，即，当使用预定量的标记(总标记或者100％)工作时，所述结合的标记部分的检测提供了有关所述分析物的存在和/或浓度(总标记的x或者a％)的直接信息，同时所述未结合的标记部分(总标记的y或者b％)的检测应当间接地提供相同的信息(总标记-y＝x；或者100％-b％＝a％)，并因此可用作内标或者内参照。
根据本发明的方法的内标的引入保证分析物的检测更准确、更可靠。
本发明的方法在理论上可应用于任何分析检测技术，其中检测基于标记与分析物的结合以及结合分析物的标记的检测。最特别地，本发明的方法适用于允许准确地定量检测宽的浓度范围的标记的检测方法。典型地，基于使用标记的检测的检测方法要求将过量的标记加入到样品中以保证准确检测。根据样品中分析物的量，未结合的标记部分从非常大(即接近或者与加入的过量标记的预定量相同)到非常小不等。典型地，当使用DNA探针工作时，使用10-6M-10-9M的标记浓度。
本发明的方法是包括分析物的检测的方法。待测分析物的性质对于本发明来说不是关键的，而且可以是用于检测的任何感兴趣的分子或者分子的聚集体。分析物的非穷举的列表包括蛋白质、多肽、肽、氨基酸、核酸、寡核苷酸、核苷酸、核苷、碳水化合物、多糖、脂多糖、糖蛋白、脂蛋白、核蛋白、脂质、激素、类固醇、生长因子、细胞因子、神经递质、受体、酶、抗原、变应原、抗体、代谢物、辅因子、营养素、毒素、毒物、药物、生物战试剂、生物危害性试剂、传染原、朊病毒、维生素、免疫球蛋白、清蛋白、血红蛋白、凝血因子、白细胞介素、干扰素、细胞因子、包含肿瘤特异性表位的肽以及上述任何物质的抗体。分析物可包含一种或多种复合聚集体，例如但不限于病毒、细菌、真菌、微生物例如沙门菌属、链球菌属、军团菌属、大肠杆菌、贾第虫属、隐孢子虫属、立克次体属、孢子、霉菌、酵母、藻类、阿米巴、腰鞭毛虫、单细胞生物、病原体或细胞，以及细胞表面分子、片段、部分、组分、产物、小有机分子、核酸和寡核苷酸以及微生物代谢产物。
根据特别的实施方案，分析物为DNA，例如基因、病毒DNA、细菌DNA、真菌DNA、哺乳动物DNA或者DNA片段。分析物还可以是RNA，例如病毒RNA、mRNA、rRNA。分析物还可以是cDNA、寡核苷酸，或者是合成的DNA、RNA、PNA、合成的寡核苷酸、修饰的寡核苷酸或者其他的核酸类似物。它可以包含单链和双链核酸。它可在检测之前接受处理，例如使用限制性内切酶消化、通过核酸聚合酶复制、剪切或超声处理，从而允许断裂发生。
本发明特别适用于这样的检测方法，其包括通过使用标记的检测，所述标记例如但不限于荧光、发色或化学发光染料、放射性同位素、金属和/或磁纳米粒子等。
因此，在本发明的方法中所进行的检测步骤由使用的标记来确定，并且包括但不限于荧光、比色法、吸收、反射、极化、折射、电化学、化学发光、瑞利散射和拉曼散射、SE(R)RS、共振光散射、光栅偶联表面等离子共振(grating-coupled surface plasmon resonance)、闪烁计数、磁传感器、电化学检测(例如阳极溶出伏安法(anode stripping voltametry))等等。
在不同检测方法中使用的合适标记数目众多并在本领域中广泛描述。荧光标记包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)、羧基荧光素，例如四甲基罗丹明(TMR)、羧基四甲基罗丹明(TAMRA)、羧基-X-罗丹明(ROX)，磺酰罗丹明101(sulforhodamine 101)(Texas redTM)、Atto染料(SigmaAldrich)、荧光红(Fluorescent Red)、荧光橙(Fluorescent Orange)、藻红蛋白、藻蓝蛋白和Crypto-FluorTM染料。最常用的放射性同位素包括β-发射体例如3H和14C，以及γ-发射体例如碘-125(125I)。其他描述的用于定量和定性测定的标记包括但不限于树枝状聚合物(dendrimers)、量子点(quantum dots)、上转换无机发光材料(up-converting phosphors)和纳米粒子。
本发明的方法特别适用于基于表面增强(共振)的拉曼光谱(SE(R)RS)的检测方法，其允许在宽的浓度范围内进行灵敏的定量检测。
当本发明的方法中分析物的检测基于SE(R)RS时，标记是SE(R)RS活性材料，即所述材料在被适当照射时能够产生SERS或者SERRS光谱，其在本文中也称为SE(R)RS活性标记或染料。SE(R)RS-活性标记的非限制性的实例包括荧光素染料，例如5-(和6-)羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素、5-羧基-2’，4’，5’，7’-四氯荧光素和5-羧基荧光素；罗丹明染料，例如5-(和6-)羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明和6-羧基罗丹明X，酞菁例如甲基、亚硝酰基、磺酰基和氨基酞菁，偶氮染料例如在美国专利6127120中列举的那些，偶氮甲碱、花青和黄嘌呤例如甲基、硝基、硫烷基(sulphano)和氨基衍生物，以及琥珀酰荧光素。这些中的每个都可以以任何常规方式被取代，产生大量的有用标记。
根据特别的实施方案，SE(R)RS活性标记是羧基罗丹明、FAM或者TET。已经证实用羧基罗丹明R6G标记的寡核苷酸的校准曲线达到1.05×10-12M的检出限(考虑到稀释效应，其对应于样品体积中0.5飞摩尔的标记的寡核苷酸的检测)。同时，已表明R6G的校准曲线(以及FAM和TET的)在10-7M-10-11M的范围内为线性(LGC‘Evaluation of the sensitivity ofSERRS-based DNA detection，January 2004，LGC/Mfb/2004/02，可在-http://www.sfbprog.org.uk/themes/theme_publications_item.asp？intThemeID＝10&intPublicationID＝865得到)。
应当注意，标记的选择可受到例如标记的共振频率、样品中存在的其他分子的共振频率等的因素的影响。用于检测生物分子的SE(R)RS活性标记在本领域例如在美国专利US5306403、US6002471和US6174667中有描述。
通过表面增强光谱例如表面增强(共振)拉曼光谱(SE(R)RS)的检测基于所观察到的吸附在粗糙金属表面(其可以是胶体)上的分析物的拉曼散射的强烈增强。因此，这要求标记的检测在适当的‘SE(R)RS活性表面’存在下进行。典型地，所述表面为贵金属(Au、Ag、Cu)或者碱金属(Li、Na、K)表面。所述金属表面例如可以是蚀刻或者粗糙的金属表面、金属溶胶，或者根据特别的实施方案为金属胶体粒子的聚集体，因为后者导致拉曼散射的大于108-1012的SERRS增强。在本发明的检测方法中构成SE(R)RS活性表面的金属纳米粒子还可设置成金属纳米粒子岛状膜、金属包被的纳米粒子系基板、具有植入的金属纳米粒子的聚合物膜等等。所述金属表面可以是裸露的金属或者可包括在金属表面上的金属氧化物层。它可包括有机涂层例如柠檬酸盐或者合适的聚合物例如聚赖氨酸或者多酚以增强其吸附能力。
根据本发明特别的实施方案，构成SE(R)RS活性表面的金属胶体粒子是以控制的方式聚集的纳米粒子或者胶体纳米粒子，例如在US20050130163A1中描述的那些。制备纳米粒子的替代方法是已知的(例如美国专利6054495、6127120、6149868)。纳米粒子还可通过商业来源得到(例如Nanoprobes Inc.，Yaphank，N.Y.；Polysciences，Inc.，Warrington，Pa.)。金属粒子可以为任何尺寸，只要它们引起SE(R)RS效应。典型地，它们具有大约4-50nm的直径，非常特别地为25-40nm，这取决于金属的类型。
在本发明的使用SE(R)RS检测方法的检测和/或定量方法中，包括(至少)一种所使用的成分或者它们的组合即标记、探针、标记的探针、分析物或者标记结合的分析物被吸附到金属表面上。所述吸附可通过直接结合或者接头化合物包括非共价或者共价连接来介导。吸附的各种选择和模式在本领域是已知的，并在例如美国专利6127120和6972173中描述。典型地对金属SE(R)RS活性表面的吸附可通过加入单体或者聚合的多胺更特别地是短链脂族多胺例如精胺来保证。因此，根据一个实施方案，本发明的方法包括在检测之前将多胺加入到待通过SE(R)RS检测的样品中。
替代或者附加地，分析物专一性探针被修饰以促进或者帮助化学吸附到SE(R)RS活性表面。这可通过至少部分地减少分析物专一性探针的总负电荷来保证。更特别地，当所述分析物专一性探针为核苷酸时，这可通过向核酸或者核酸单元引入一个或多个包括路易斯碱的官能团，例如氨基来保证，如美国专利6127120所述。
根据另一实施方案，在SE(R)RS活性标记上提供官能团(例如路易斯碱)，以促进或者帮助化学吸附到所述SE(R)RS活性表面上。任选地，SE(R)RS活性标记或者染料和金属粒子被俘获在如US2005、0130163所述的聚合物小珠中，所述小珠可任选地还包括磁性粒子，使小珠具有在分离中有意义的磁性(见下述)。
当一个或多个标记、探针或者标记的探针被吸附到SE(R)RS活性表面时，结合和未结合的标记的检测都可以相同方式保证。
根据本发明的替代实施方案，分析物例如通过使用上述化学修饰或者专门的接头被吸附到金属SE(R)RS活性表面。根据该实施方案，未结合的标记在与结合标记分离时不与SE(R)RS活性表面接触。为了确保未结合标记的检测，其可与金属SE(R)RS活性表面接触。任选地，这可通过使探针与金属SE(R)RS活性表面(或者已经与金属SE(R)RS活性表面结合的过量分析物)接触来保证。
本发明的方法包括与分析物结合的标记部分(结合标记部分)和未与分析物结合的标记部分(未结合的标记部分)的检测。根据本发明的一个实施方案，结合和未结合标记部分使用相同的检测方法来测定。因此，根据该实施方案，结合和未结合标记部分都使用例如SE(R)RS或者荧光检测(图3a和3b)。但作为替代，包括结合和未结合标记部分可使用不同检测方法测定。根据后一实施方案，结合标记可例如使用SE(R)RS测定，而未结合标记可基于另一种检测方法例如荧光测定。应当理解，这要求使用可以两种不同方法检测的标记或者使用双标记。由于染料的SE(R)RS光谱是分子专一性的，大多数荧光染料理论上也可基于它们的SE(R)RS光谱来检测。在本发明的方法中，用于检测结合和未结合标记部分的不同检测方法的使用在例如SE(R)RS活性表面与分析物结合的情况下是有意义的(见上述)。
如上所述，本发明的方法可应用在包括通过与标记结合的分析物检测的任何方法中。虽然标记与分析物的结合是关键的，但包括这种结合不一定需要是分析物专一性的。在本发明的方法用于纯净分析物的定量检测时，标记能够与所述分析物结合(只要不与在测定中使用的任何材料例如样品容器发生结合)实际上就足够了。标记与分析物结合的能力可基于所述标记与所述分析物的固有结合，例如在双链DNA之间的随机引入染料。
但是，典型地，在需要检测样品中的分析物的情况下，标记与分析物的结合应当是通过使用分析物专一性标记的专一性结合。根据一个实施方案，这通过将标记连接到分析物专一性“探针”来保证。分析物专一性探针的性质由待测分析物的性质确定。最通常地，探针根据与分析物的专一性相互作用例如但不限于抗原-抗体结合、互补核苷酸序列、碳水化合物-植物凝集素、互补肽序列、配体-受体、辅酶-酶、酶抑制剂-酶等而开发，与标记连接的分析物专一性探针形成“分析物专一性标记”，根据本发明的这一实施方案，其为能够与分析物专一性结合的标记。
根据本发明特别的实施方案，感兴趣的分析物是寡核苷酸，并且分析物专一性探针为寡核苷酸探针，其序列与感兴趣的分析物互补。该寡核苷酸探针与标记结合以得到分析物专一性标记。
用于制备标记的核苷酸和将它们引入到核酸中的方法在本领域中有描述(例如美国专利US4962037；US5405747；US6236543；US6210896)。
在本发明特别的实施方案中，使用SE(R)RS活性标记，其直接或通过接头化合物与寡核苷酸探针连接。含有设计的与其他分子例如核苷酸或者核酸共价反应的反应基团的SE(R)RS活性标记是可商购的(例如MolecularProbes，Eugene，Oreg.)。与核苷酸前体共价连接的SE(R)RS活性标记可通过标准商业来源购买(例如Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，Ind.；Promega Corp.，Madison，Wis.；Ambion，Inc.，Austin，Tex.；AmershamPharmacia Biotech，Piscataway，N.J.)。
在分析物为核苷酸序列的情况下，分析物专一性标记可以是可通过所述分析物专一性探针与所述分析物杂交而用于所述分析物专一性检测以及可用于本发明的结合和未结合的标记的检测的探针。作为替代，本发明的方法可包括使用例如PCR的分析物扩增，借此分析物专一性标记被引入到PCR产物中。根据本发明的方法，使用预定量的分析物专一性标记(或标记的引物)，并且引入的分析物专一性标记和未结合的分析物专一性标记(的量)被测定。
本发明涉及基于标记与分析物结合的分析物检测和/或定量方法，其中通过使所述样品与预定量的标记接触并检测所述标记的结合部分和未结合部分来改善检测的准确度和可靠性。
根据本发明的一个实施方案，结合和未结合的标记部分可单独被检测和/或定量而不需要事先分离，即在同一样品中进行检测。根据本发明的一个实施方案，这可通过使用当与分析物结合时其信号发生变化的(分析物专一性)标记来实现。所述标记的实例是与分子信标结合的标记。例如，使用与靶序列互补的探针，在其两端的每一端用染料和猝灭剂(例如Dabcyl)双重标记。在其封闭状态下，染料的信号被猝灭剂猝灭。当互补序列与靶DNA杂交时，信标打开，信号可被检测。能够与分析物专一性结合并由此引起信号变化的标记的其他实例在WO2005/019812中提供用于SERRS。其中描述了SERRS信号，其为在其两端的每一端用不同染料双重标记的探针。第二种染料是专门设计的使其能够将寡核苷酸探针固定在合适的金属表面上。在不存在靶DNA时，信标以“封闭状态”固定在金属表面上，导致对应两种染料的SERRS光谱的检测。当互补序列与靶DNA杂交时，信标打开，一种染料从表面上除去。这引起SERRS信号发生变化。或者，可使用荧光标记的寡核苷酸探针，借此当与靶核酸结合时标记的荧光极化增加(Walker和Linn(1996)Clinical Chemistry.42：1604-1608)。在另一个实施方案中，使用SE(R)RS活性标记，根据被吸附到金属粒子表面上的染料分子的变化的吸收光谱，当所述标记与SE(R)RS活性金属表面缔合时，其最大吸收频率从第一频率转变至第二频率(如Franzen等(2002)J.Phys.Chem.106：6533-6540；Noginov等(2005)J.Opt.A：Pure Appl.Opt.7：S219-S229所述)。根据该实施方案，分析物与SE(R)RS活性金属表面缔合。当使SE(R)RS活性标记与样品接触时，与分析物专一性结合的SE(R)RS活性标记由此与金属表面缔合，并发出与在样品中保持未结合的SE(R)RS活性标记不同的光谱。例如，当与和银纳米粒子缔合的DNA片段杂交时，SE(R)RS活性标记的寡核苷酸探针可发生最大吸收频率的变化，并且因此可在同一样品中以其杂交的(结合的)和未杂交的(未结合的)形式被检测。
根据本发明的方法的另一个实施方案，标记的结合和未结合部分的检测要求这些部分事先分离。结合和未结合标记的分离可通过将未结合标记和/或与分析物结合的标记从样品中移出以允许对它们的单独检测的任何方法来实现。例举性的分离技术包括沉降、沉淀、离心、与基板专一性结合、凝胶电泳，包括但不限于等电聚焦和毛细管电泳；介电电泳；分选，包括但不限于荧光活化分选技术；色谱法，包括但不限于HPLC、FPLC、尺寸排阻(凝胶过滤)色谱法、亲和色谱法、离子交换色谱法、疏水作用色谱法、免疫亲和色谱法以及反向色谱法。分离技术的详细讨论可特别地见于Rapley；Sambrook等；Sambrook和Russell；Ausbel等；Molecular ProbesHandbook；Pierce Application Handbook；Capillary Electrophoresis：Theoryand Practice，P.Grossman和J.Colburn编著：Academic Press(1992)；Wenz和Schroth，PCT国际公布号WO 01/92579；M.Ladisch，BioseparationsEngineering：Principles，Practice，and Economics，John Wiley和Sons(2001)；以及Liebler，Introduction to Proteomics，Humana Press(2002)。
根据一个实施方案，结合和未结合标记的分离通过将分析物与基板结合来实现。典型地，这包括“捕获探针”，其与基板结合并能够专一性地结合抗原。在分析物为核苷酸序列的情况下，捕获探针典型地为与分析物中的区域互补的寡核苷酸。在标记也与探针结合的情况下，需要注意分析物专一性探针和捕获探针与分析物中的不同序列互补。或者，分析物具有允许将分析物(并因此将与分析物结合的标记)从样品中分离的标记。例如当使用标记的引物扩增靶核苷酸序列(分析物)时，这可被实现，其中所述标记允许与基板结合。根据特别的实施方案，使用具有生物素标记的引物将生物素标记引入到扩增的分析物中。在生物素-链霉亲和素捕获方法中，生物素化的分析物通过生物素分子与链霉亲和素包被的基板例如小珠或者微孔板的链霉亲和素包被的孔结合而被捕获。
或者，在分析物为蛋白质或者肽的情况下，捕获探针可以是与基板结合的分析物专一性抗体。分析物(且因此与分析物结合的标记)与基板的结合允许结合和未结合标记的物理分离。例如，在使用磁珠的情况下，可通过施加磁场将它们从样品中移出。或者，分析物可通过与固定到微孔板的固定化捕获探针结合而被捕获，之后可移出包含未结合标记的上清液。
根据本发明的再一个实施方案，检测基于SE(R)RS，并且结合和未结合标记部分的分离使用SE(R)RS活性表面和/或标记。更特别地，根据该实施方案，所述SE(R)RS活性表面和/或标记固有地充当或者具有可受到物理或者化学力作用的标记。例如，如US2005/0130163所述，SE(R)RS活性金属纳米粒子的重量可用在分离技术中。或者，所述SE(R)RS活性表面包含为磁性材料(例如SE(R)RS活性小珠中的磁性粒子)的标记，并且结合和未结合的标记部分的分离通过施加磁场或者在样品中引入磁性物体来保证。根据一个实施方案，与分析物专一性SE(R)RS活性标记结合的磁性SE(R)RS活性表面以预定量加入到样品中，随后磁性SE(R)RS表面/分析物专一性SE(R)RS活性标记与样品中的分析物结合。分析物通过捕获探针与基板结合。未结合的SE(R)RS活性标记部分可使用电磁铁移出并可被释放(通过除去磁性)到独立的小瓶中。在本发明的另一个实施方案中，与磁性SE(R)RS活性表面结合的分析物专一性SE(R)RS活性标记以及生物素化探针被用作用于分析物的PCR介导的DNA扩增的(例如正向和反向)引物。PCR产物被SE(R)RS和生物素两者标记。将被引入到含有PCR产物的微孔板小孔中的电磁铁接通，以从样品中收集所有的磁性探针(即引入到PCR产物中的和与SE(R)RS活性标记结合的未结合磁性表面)。然后将所述磁铁从样品中移出并浸到另一链霉亲和素包被小孔中。当所述磁铁断开时，还含有生物素标记的PCR产物被链霉亲和素捕获。未结合的磁性SE(R)RS活性标记可通过再次接通电磁铁而移出并转移到另一小瓶中用于根据本发明的检测。
根据再一个实施方案，本发明的方法的结合和未结合的标记部分的检测是在同一样品中进行的，即实际上不需要将样品中所述部分的任一部分移出，而是利用一个样品中不同的检测区。因此，根据该实施方案，结合和未结合部分的分离或物理运动在反应容器中保证。这种反应容器中的物理运动可通过使用分析物专一性标记探针或者具有可受到物理/化学力作用的标记且允许结合和/或未结合的探针运动的SE(R)RS活性表面来保证。所述力的实例包括磁力、电动力等。根据特别的实施方案，分析物专一性探针上的标记为铁磁粒子，当受到磁力时，其能够使探针沿着所述磁力的方向运动。
本发明涉及用于分析物更特别地其是样品中的分析物的检测和/或定量的改进方法。虽然在本文中描述的方法通常提到“分析物”，但同样包括：本发明的方法可在使用不同的分析物专一性标记同时检测或者定量多种分析物的情况下应用。更特别地，可使用不同的分析物专一性标记，它们可使用相同的检测方法被区别地检测，例如但不限于不同的荧光标记(例如但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)；羧基荧光素(例如四甲基罗丹明(TMR)、羧基四甲基罗丹明(TAMRA)；羧基-X-罗丹明(ROX)；磺酰罗丹明101(Texas redTM))、Atto染料(Sigma Aldrich)；荧光红和荧光橙；藻红蛋白、藻蓝蛋白和Crypto-FluorTM染料)，量子点或者SE(R)RS活性染料。由于所述标记的每一种对不同的分析物是专一性的，所以能够测定每种标记的结合和未结合部分，以得到本发明的检测的内部验证。
本发明允许样品中一种或多种分析物检测和/或定量的准确度可靠性的提高。术语“样品”在本文中广义地使用，其意指宽范围的生物材料以及来自或者提取自所述生物材料的组合物。样品可以是其中有待检测的分析物的任何合适制剂。样品可包括例如身体组织或体液，例如但不限于血液(包括血浆和血小板部分)、脊髓液、粘液、痰、唾液、精液、粪便或者尿或者它们的任何部分。例举性的样品包括全血、红细胞、白细胞、血沉棕黄层、毛发、指甲和表皮材料、拭子包括但不限于颊拭子、喉拭子、阴道拭子、尿道拭子、子宫颈拭子、喉拭子、直肠拭子、损伤拭子、脓肿拭子、鼻咽拭子等、淋巴液、羊水、脑脊液、腹膜渗出物、胸腔积液、来自囊肿的液体、滑液、玻璃体液、房水、粘液囊液、洗眼液、眼吸出物、血浆、血清、肺馆洗液、肺吸出物、任何身体组织的活检材料。普通技术人员会理解，溶胞产物、提取物或者得自任何上述例举性生物样品的材料也可看作为样品。组织培养细胞包括外植材料、原代细胞、次级细胞系等，以及溶胞产物、提取物、悬液或得自细任何胞、组织或器官的上清液或材料也在本文所用的术语生物样品的含义中。包含微生物和病毒的样品也包括在使用本发明的方法的分析物检测的范围内。得自法医设置(forensicsettings)的材料也在术语样品的含义范围内。样品还可以包括食品和饮料、怀疑受到污染的水等。这些列举并非意在穷举。
在本发明的特别的实施方案中，样品被预处理以帮助使用检测方法检测所述样品。例如典型地，包括导致分析物半分离或者分离的或者确保分析物的扩增的样品预处理。许多方法和试剂盒可用于各种类型的样品预处理。
样品的制备或者预处理通过检测方法确定。例如，当包括使用SE(R)RS的检测时，样品可以是适当制备以能够记录其SE(R)RS光谱的任何合适的形式，例如固体、溶液或者悬浮液或者气体。检测样品可以在任何合适的pH。
根据本发明的特别的实施方案，分析物为核酸，例如基因组DNA序列或者来自病原微生物的核酸。多种方法可用于从样品中分离核酸。例举性的核酸分离技术包括(1)有机萃取后乙醇沉淀，例如使用苯酚/氯仿有机试剂(例如Ausbel等编著，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley和Sons，New York(1995，包括2003年6月的增刊)，优选使用自动化DNA萃取器，例如购自Applied Biosystems(Foster City，Calif.)的Model 341 DNAExtractor；(2)固定相吸附法(例如美国专利US5234809；Aalsh等，BioTechniques 10(4)：506-513(1991)；以及(3)盐诱导DNA沉淀法(例如Miller等，Nucl.Acids Res.，16(3)：9-10(1988))，所述沉淀法通常被称为“盐析”法。可使用商购的试剂盒以促进所述方法，例如Genomic DNAPurification Kit和Total RNA Isolation System(两者均购自Promega，Madison，Wvis.)。此外，通过使用例如ABI PRISM.TM.6700 AutomatedNucleic Acid Workstation(Applied Biosystems，FosterCity，Calif.)或者ABIPRISM.TM.6100Nucleic Acid Prepstation和相关实验方案例如NucPrep.TM.Chemistry：Isolation of Genomic DNA from Animal and Plant Tissue，Applied Biosystems Protocol 4333959 Rev.A(2002)；以及ABI PRISM.TM.CellLysis Control Kit，Applied Biosystems Protocol 4316607 Rev.C(2001)，所述方法已经是自动化或者半自动化的。
上述分离方法还可包括例如使用蛋白酶的消化的酶消化步骤和/或例如通过PCR的酶扩增步骤，和/或用于断裂的剪切/超声处理步骤。
如上所述，本发明的方法在基于表面增强(共振)拉曼光谱(SE(R)RS)的检测和/或定量方法中特别有意义。尽管在本文中一般参考SE(R)RS，但应当理解，也包括基于其他类型的光谱的检测方法，例如但不限于表面增强荧光、普通拉曼散射、共振拉曼散射、相干反Stokes拉曼光谱(CARS)、受激拉曼散射、反转拉曼光谱、受激增益拉曼光谱、超拉曼散射、分子光学激光检查仪(molecular optical laser examiner)(MOLE)或者拉曼微探针或者拉曼显微术(Raman microscopy)或者共焦拉曼显微光谱术(confocalRaman microspectrometry)、三维拉曼(three-dimensional Raman)或者扫描拉曼(scanning Raman)、拉曼饱和光谱、时间分辨共振拉曼(time resolvedresonance Raman)、拉曼解耦联光谱(Raman decoupling spectroscopy)或者UV拉曼显微术(UV-Raman microscopy)。
在本发明的特别的实施方案中，本发明的方法包括SERRS，因为在标记的共振频率下操作增加了灵敏度。在这种情况下，用于产生拉曼光谱的光源为相干光源，例如激光，其基本上被调谐至所使用的标记的最大吸收频率。该频率可在标记与SE(R)RS活性表面和分析物和/或分析物结合种类结合时轻微改变，但普通技术人员能够很好地调谐光源以适应这种情况。光源可被调谐至接近标记的最大吸收的频率，或者标记吸收波谱的第二峰值处或其附近的频率。或者，SERRS可包括在活性表面上的等离子的共振频率操作。
在本发明的基于SE(R)RS检测的方法中，典型地选择例如与标记的最大吸收对应的一个峰值用于激发，并且可在在“指纹”光谱的单个波长处进行检测。或者，特别是当使用不同SERRS标记同时对不同分析物进行检测时，为了鉴别每种标记，可检测整个“指纹”光谱。但是，也可在一个或多个选定光谱线频率处，用不同的标记(其中每种标记具有唯一的光谱线)检测信号强度。
典型地，SE(R)RS系的检测方法中的检测步骤可使用来自激光器的具有可见光谱内的频率的入射光进行。精确的频率选择可取决于标记、表面和分析物。大体上，在可见光光谱的红色区域内的频率易于引起更好的表面增强效应。但是，可包括可使用例如紫外或者近红外范围内的其他频率的情况。如果需要，具有适当的频率和能量的适当的光源的选择和调谐在本领域普通技术人员的能力范围之内，特别是在参照可利用的SE(R)RS文献的情况下。
用在SE(R)RS系检测方法中激发光源包括但不限于氮激光器、氦镉激光器、氩离子激光器、氪离子激光器等。多种激光器可提供激发波长(excitation lines)的广泛选择，这对于共振拉曼光谱来说是关键的。根据特别的实施方案，在514.5nm的激发的LabRam集成仪器(Jobin Yvon)中使用氩离子激光器。
可使用物镜将激发光束聚焦在基板上。通过使用全息分束器产生激发光束和发射的拉曼信号的直角几何形状，可将物镜用于激发样品和收集拉曼信号。拉曼信号的强度需要相对于来自激发光束的强背景进行测定。所述背景基本上为瑞利散射光和镜面反射，其可选择性地使用高效滤光器除去。例如，全息窄带带阻滤光片(holographic notch filter)可被用于减少瑞利散射线。
表面增强拉曼发射信号可通过拉曼检测器检测。各种可能用于拉曼光谱的检测单元在本领域是已知的，并且可使用任何已知的拉曼检测单元。拉曼检测单元的实例例如在美国专利US6002471中公开。可使用其他类型的检测器，例如具有红光增强的增强型电荷耦合器件(red-enhancedintensified charge-coupled device)(RE-ICCD)的电荷耦合器件(CCD)，硅光电二极管，或者单个或串联设置的用于信号的级联放大的光电倍增管。光子计数电子学可用于灵敏的检测。检测器的选择主要取决于进行特定测定所要求的检测灵敏度。几种装置适用于收集SE(R)RS信号，包括波长选择镜，用于散射光测定的全息光学元件和光纤波导。
用于获得和/或分析SE(R)RS光谱的设备可包括一些形式的数据处理器例如计算机。一旦SE(R)RS信号被适当的检测器捕获，其频率和强度数据通常会地被传送到计算机用于分析。可将指纹拉曼光谱与参考光谱比较以鉴别检测到的拉曼活性化合物或者测定频率处信号强度可被用于计算检测到的拉曼活性化合物的量。
本发明提供基于标记的分析物检测的改进方法。适应本发明的方法的应用的系统、试剂盒、试剂和工具都落入本发明的范围内，例如专门适应的基板(包括具有和不具有捕获探针的区域)等等。
图4A是根据本发明的实施方案的系统的示意图。用于检测和任选地定量样品中分析物的存在的系统(100)包括用于怀疑含有分析物的样品的源106和含有能够与所述分析物结合的标记的源108，以及用于将分析物和预定量的标记提供到装置102的装置110，所述装置102用于使包含所述分析物的样品与预定量的能够与所述分析物结合的标记接触。装置110可包括所述样品和/或分析物的重量分析供给，并且还可包括管/导管和阀(例如可选择和可控制的阀)的设置，以允许液体从源106、108提供到接触装置102。或者，所述液体可从源106、108泵到接触装置102。
接触装置102可包括用于根据上述任何方法将结合标记与未结合标记分离的装置。
可提供控制和分析电路112以控制装置110的操作。此外，还提供用于检测与分析物结合的标记部分和未与分析物结合的标记部分的装置104。装置104可在分析电路112的控制之下。代表检测的信号可被提供到控制和分析电路112，其可适于执行算法以检验未结合和结合的标记的检测是否彼此一致并在任何合适的显示装置114例如直观显示设备、绘图仪、打印机上显示结果。控制和分析电路112可具有与局域网或者广域网的连接以将结果传输到远程位置。控制和分析电路112可以任何合适的方式执行，例如专用硬件或者合适的按程序工作计算机，微控制器或者嵌入式处理器例如微处理器、可编程门阵列例如PAL、PLA或者FPGA或者相类似的。
图4B显示了根据本发明的系统的替代实施方案。具有与图4A中相同的附图标记的项目具有相同的功能。图4A和4B之间的主要差别在于检测装置104作为两个分别用于检测未结合和结合的标记的不同检测装置104A和104B来提供。上述任何检测方法都可由检测装置104A和/或104B来执行。
实施例
实施例1.在HIV检测中引入内标
在本实施例中，HIV的检测基于样品中gag基因(分析物)的存在进行(如Isola等，1998，Anal.Chem.70：1352-1356所述)。
将甲酚固紫(CFV)用作标记，其在使用已经用CFV标记的gag专一性寡核苷酸引物的PCR扩增过程中被引入到分析物中(如上述Isola等人所述)。
根据本发明，在PCR反应中使用预定量的CFV标记的gag专一性寡核苷酸。
设计捕获探针，其为对扩增的PCR产物序列中的gag基因专一的核苷酸序列，但与PCR引物的序列不同，并且其具有能够与固体载体例如衍生聚苯乙烯平板结合的接头(例如六碳5’-氨基接头)。然后，所述捕获探针被点样到所述载体上。
在封闭衍生平板上的未反应位点之后，PCR反应混合物中的双链PCR产物通过在水中沸腾5分钟而变性并在冰上迅速冷却以防止DNA复性。将混合物加到带有捕获探针的平板上并允许在杂交液存在下杂交。杂交后，小心除去平板上的缓冲液并将其转移到另一平板上。杂交平板用100μl缓冲液清洗，并且也将清洗液收集起来。
杂交后通过蒸发杂交平板和含有过量杂交液和清洗液的平板加入100
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的银层而加入SERS活性表面。
获取两种样品的SERS光谱。杂交平板的光谱提供了样品中gag DNA的量的直接指示。包含从加入到样品中的预定量CFV标记的gag专一性寡核苷酸中扣除的未结合CFV标记的gag专一性寡核苷酸部分的过量杂交液的光谱提供了样品中gag DNA的量的内参照。
实施例2.在衣原体检测中引入内标
在本实施例中，病原菌沙眼衣原体的检测基于样品中omp1基因序列(分析物)的存在来进行。
通过在第一孔中使用5’-末端用生物素标记的正向引物和反向引物进行的PCR扩增样品中的omp1基因。
17碱基的omp1专一性DNA寡核苷酸在5’-末端用取代的荧光素染料2，5，1′，3′，7′，9′-六氯-5-羧基荧光素(可商购，称为“HEX”)标记。所得的HEX标记的omp1专一性寡核苷酸(“HEX”探针)具有扩增的omp1PCR产物序列中的但与PCR引物的序列(嵌套)不同的序列，并且该标记与其中引入生物素化引物的链互补。
预定量的HEX探针被用于与第一孔中的omp1扩增的生物素化PCR产物杂交。
使用链霉亲和素包被的磁性小珠捕获生物素化的杂交复合物。将电磁场接通以收集所有磁性小珠。然后除去溶液中的电磁场并浸到用于检测的第二孔中。断开磁场以在第二孔中释放所有磁性小珠。以这种方式，所有未结合的HEX探针保留在第一孔中并且所有omp1结合的HEX探针被转移到第二孔中。后者通过在检测前加热从生物素化的杂交复合物中释放出来。也与链霉亲和素包被的小珠结合的PCR反应的过量生物素化的引物没有被HEX标记，因此不具有专一性的可检测的SERRS信号。
第一孔中未结合的HEX探针和第二孔中加热释放的HEX探针的检测如下进行。根据US6127120中描述的方法制备柠檬酸还原的银胶体。在蒸馏水中制备该胶体的溶液。将盐酸精胺的水溶液加入到两个孔中，接着将银胶体溶液等分。精胺会确保凝胶聚集体的形成，从而有助于SERRS增强，并且还会帮助将HEX探针吸附到银胶体上。两种胶体悬浮液都接受SERRS测定。
含有结合探针即在加热释放之前与omp1专一性结合的HEX探针部分的第二孔的光谱提供了样品中omp1 DNA的量的直接指示。含有从加入到样品中的预定量HEX探针中扣除时未结合探针部分的第一孔的光谱提供了样品中omp1 DNA的量的内参照。
实施例3.在素因性基因突变检测中引入内标
使用等位基因特异性寡核苷酸扩增从患者样品中提取的DNA。两个正向引物与一个反向引物一起使用。正向引物经5’-末端接头固定到包含SERRS活性标记和SERRS活性表面的SERRS活性小珠(如US2005/0130163所述)上。使用预定量的正向引物。反向引物经具有生物素的5’-末端固定。PCR产物引入SERRS活性小珠和生物素标记。
将PCR反应混合物点样到链霉亲和素包被的微孔板上。生物素化的PCR产物和生物素化的引物两者都被捕获在平板上。将过量液体从平板上移出并转移到未包被的平板。这包括与SERRS活性小珠连接的过量正向引物。
获取固定化的SERRS活性小珠和未结合的SERRS活性小珠的SERRS光谱。
SERRS的不需要分离就可识别不同标记的能力使使用具有不同标记的不同引物和在同一样品中鉴别相对于每种引物的PCR产物(以及未结合的正向引物)的存在成为可能。
实施例4.在真菌DNA检测中引入内标
细菌在细胞培养中经常作为污染被发现。研究已经证实被检查的细胞培养物的静态细菌污染的总发生率为6.5％。因此，许多细胞培养物缺乏细菌污染(常常由液体脱色指示)的视觉标志。而且，已经证明标准抗生素不仅对耐药细菌感染无效，而且对新陈代谢、细胞生长和分化具有很强的影响。
使用对真菌基因组中16S核糖体RNA编码区专一性的探针，能够检测在细胞培养物中遇到的作为空气传播的污染物的最常见的真菌种类。
SERRS检测的灵敏度使检测非常低浓度的DNA成为可能，并且因此使其在扩增步骤之前进行成为可能。
使细胞上清液样品与预定量的和Cy3SERRS标记连接的16S RNA专一性探针接触，并允许杂交。
将杂交混合物点样到与不同16S RNA专一性探针连接的平板上。在允许靶DNA与和Cy3标记连接的捕获探针杂交后，将液体移出并转移到第二平板。将该平板清洗，并且将清洗液也转移到第二平板。
杂交之后，通过蒸发加入100
Figure A200780022167D0025091414QIETU
银层而将SE(R)RS活性表面加入到第一平板。通过荧光法测定在第二板中的未结合的16S RNA专一性探针的存在。
实施例5.在夹心ELISA的hGH检测中引入内标
在37℃下孵育银电极，然后在抗人生长激素(hGH)的1％ NaHCO溶液中孵育(如美国专利5266498所述)。然后，电极用BSA溶液饱和。
在缓冲液中制备包含hGH的样品和hGH标准品的稀释范围(dilutionrange)，并将银膜用样品和标准品的不同浓度批次孵育。洗涤后，使膜与预定量的二氨基联苯胺(DAB)标记的抗-hGH(例如40μg/ml)接触并温育。将反应液除去并转移到检测瓶中。膜被进一步清洗。
获取电极的SERRS光谱。反应液中未结合的DAB标记的抗hGH的浓度基于与标准品的比较而酶法测定。
比较通过与银膜结合的DAB标记的抗-hGH的直接检测和未结合的DAB标记的抗-hGH的检测所得到的值以确定检测的可靠性。

Claims (13)

1、用于检测和/或定量样品中分析物的方法，其包括下列步骤：
a)使包含所述分析物的所述样品和预定量的能够与所述分析物结合的标记接触；
b)检测与所述分析物结合的标记部分；借此与所述分析物结合的标记的量指示所述样品中所述分析物的存在和/或量；并且
c)检测未与所述分析物结合的标记部分；借此从所述预定量的标记中扣除的未与所述分析物结合的标记的量提供指示所述样品中所述分析物的存在和/或量的内参照，
其中所述(b)和(c)中的检测步骤使用光学检测方法来保证。
2、权利要求1的方法，其中所述检测步骤(b)和所述检测步骤(c)在同一样品中进行。
3、权利要求1的方法，其中所述(b)和(c)中的检测步骤使用SE(R)RS来保证，并且其中所述标记为SE(R)RS活性标记。
4、权利要求3的方法，其还包括在步骤(b)和(c)之前，使所述与所述分析物结合的标记部分和所述未与所述分析物结合的标记部分和SE(R)RS活性表面接触。
5、权利要求1的方法，其中所述标记为分析物专一性标记。
6、权利要求1的方法，其中所述分析物专一性标记包括分析物专一性探针。
7、权利要求1的方法，其中所述分析物为核苷酸序列并且所述分析物专一性探针为具有与所述分析物中的序列互补的序列的寡核苷酸。
8、权利要求2的方法，其中使用标记，所述标记允许所述与所述分析物结合的标记和所述未与所述分析物结合的标记的区别的检测。
9、权利要求1的方法，其中所述标记为荧光和/或SE(R)RS活性标记，当所述荧光和/或SE(R)RS活性标记与所述SE(R)RS活性表面缔合时，其最大吸收频率从第一频率转变至第二频率。
10、权利要求1的方法，其还包括在步骤(b)之前的将与所述分析物结合的标记部分和未与所述分析物结合的标记部分分离的步骤。
11、权利要求10的方法，其中所述结合标记部分和所述未结合标记部分的所述分离通过使用具有可受到物理或化学力作用的标记的分析物专一性探针来保证。
12、权利要求10的方法，其中所述标记为SE(R)RS活性标记，其中在步骤(b)和(c)之前，使所述与所述分析物结合的标记部分和所述未与所述分析物结合的标记部分和SE(R)RS活性表面接触，并且其中所述分离通过使用充当或者具有可受到物理或化学力作用的标记的SE(R)RS活性表面来保证。
13、用于检测和/或定量样品中分析物的存在的系统，其包含：
a)用于使可能包含所述分析物的所述样品和预定量的能够与所述分析物结合的标记接触的装置；
b)用于检测与所述分析物结合的标记部分的装置；借此与所述分析物结合的标记的量指示所述样品中分析物的存在并任选地指示其量；和
c)用于检测未与所述分析物结合的标记部分的装置；借此从所述预定量的标记中扣除的未与所述分析物结合的标记的量提供指示所述样品中分析物的存在并任选地指示其量的内参照，
其中所述检测使用光学检测方法来保证。
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