CN107084954A

CN107084954A - 一种荧光传感器的制备方法、一种检测酪氨酸酶的方法

Info

Publication number: CN107084954A
Application number: CN201710299516.4A
Authority: CN
Inventors: 王广凤; 万靖
Original assignee: Anhui Normal University
Current assignee: Wuhan Ruiqi Bioengineering Co ltd
Priority date: 2017-05-02
Filing date: 2017-05-02
Publication date: 2017-08-22
Anticipated expiration: 2037-05-02
Also published as: CN107084954B

Abstract

本发明提供了一种荧光传感器的制备方法、一种检测酪氨酸酶的方法，与现有技术相比，本发明利用DNA 1和DNA 2碱基互补配对，DNA1和DNA2的DNA设计中，都包含一段含有30个T的碱基。该聚30T的碱基可以使Cu²⁺还原为Cu⁰，使之产生荧光。然后，加入抗坏血酸钠和硫酸铜，制备得到TTE DNA铜纳米粒子，具有荧光性能，利用酪氨酸酶可以快速有效的猝灭TTE DNA铜纳米粒子荧光的原理，来达到定量检测酪氨酸酶的目的。使用的试剂是低成本，不需要复杂的有机荧光化合物的合成，传感器设计过程非常简单，无需任何标记和修饰探针。检测准确度高、灵敏、检测限低。

Description

一种荧光传感器的制备方法、一种检测酪氨酸酶的方法

技术领域

本发明属于荧光传感器技术领域，具体涉及一种荧光传感器的制备方法、一种检测酪氨酸酶的方法。利用TTE DNA(聚T两头被系住的DNA)铜纳米粒子的优越荧光性能，基于酪氨酸酶能猝灭TTE DNA铜纳米粒子溶液的事实，构建TTE DNA水凝胶可携带的可视化的检测酪氨酸酶。

背景技术

酪氨酸酶是一种典型的多酚氧化酶，是一种含铜酶，广泛分布于各种类型的生物体如：植物，动物组织和真菌中。酪氨酸酶能够催化酚类底物羟基化为邻苯二酚的衍生物，进一步氧化成邻醌类产品。该反应已被公认为是一些天然色素合成的关键过程，因此，酪氨酸酶是被认为是治疗一些色素减退相关问题的核心。此外，因为其对多巴胺神经毒性，酪氨酸酶的紊乱也可能导致帕金森病与神经的变性。更重要的是，生物体内中酪氨酸酶的反应会导致严重的皮肤病，如I型自身白化病，并且酪氨酸酶的累计被认为是黑素瘤癌症的生物标志。因此，灵敏的检测酪氨酸酶活性为生物医学提供可靠的诊断是非常紧迫的。

水凝胶是一种交联的亲水聚合物，并且它可以表现出特殊的性质和一些独特的特征。详细地说，凝胶属于一种特殊的软物质并由双连续部分组成：最小的组件是三维网络，主要部分是水性介质。这种网络对包裹试剂和固定探针是十分理想的。包裹的探针可以在水凝胶中保持其天然的结构和功能。由于水凝胶的多孔性质，外部目标或刺激都可以通过多孔接近内部探针。另外，因为水凝胶是透明的且背景低，有少干扰光学检测。由于水凝胶的优越性能，已被发展在生物化学的领域。

贵金属纳米团簇作为新一代荧光探针因为它们的高光稳定性，耐光性，和超小尺寸引起了相当大的关注。包括：DNA模板的金纳米粒子-银纳米粒子-铜纳米粒子。特别地，对于DNA为模板的制备的铜纳米粒子，由于其制备简单以及在温和环境条件下快速高效制备和环境友好性，受到了广泛的关注。虽然已经有课题组制备出了DNA铜纳米粒子的水凝胶，但是将DNA铜纳米粒子制作水凝胶中便携可视化的检测生物物质的报道并不多。

发明内容

本发明的目的在于提供一种荧光传感器的制备方法，利用TTE DNA(聚T两头被系住的DNA)模板制备出荧光性能更好的铜纳米粒子作为传感器。

本发明还提供了一种检测酪氨酸酶的方法，利用酪氨酸酶可以快速有效的猝灭TTE DNA铜纳米粒子荧光的原理，来达到定量检测酪氨酸酶的目的。

本发明提供的一种荧光传感器的制备方法，包括以下步骤：

1)DNA 1和DNA2分别用缓冲溶液稀释，分别得到DNA 1溶液和DNA 2溶液，待用；

2)混合稀释后的DNA 1溶液和DNA2溶液，培养，使DNA 1和DNA 2碱基互补配对；

3)培养结束后，加入抗坏血酸钠溶液和CuSO₄溶液，得到TTE DNA铜纳米粒子，荧光传感器制备完成。

步骤1)中所述缓冲液为10mM MOPS(3-(N-吗啉基)丙磺酸)PH＝7.6的缓冲溶液。

步骤1)具体为：分别将DNA 1和DNA 2用10mM PH＝7.6的MOPS的缓冲溶液稀释到100μM，得到DNA 1溶液和DNA2溶液；

DNA 1序列：GCAGAGTTGAGACCAT30TCAGAAGGCAAAAAA；

DNA 2序列：TTTTTTGCCTTCTGAT30TGGTCTCAACTCTGC；

优选的，制备的得到DNA 1溶液和DNA 2溶液储存在4℃中至少24小时后可用。

步骤2)中所述培养是指：在室温条件下培养15-30min。优选的，在均匀摇速下培养。

步骤2)具体为：将步骤1)制备的100μM DNA 1溶液和100μM的DNA 2溶液各取1μL，混合，室温下培养15-30min。

步骤3)具体为：将培养后的混合溶液置于240μL的MOPS缓冲溶液中，然后加入16μL100mM的抗坏血酸钠和8μL10mM的CuSO₄溶液，室温下反应10-20min，即可。

进一步的，在步骤3)加入抗坏血酸钠溶液和CuSO₄溶液之前加入琼脂糖溶液，即可制备得到凝胶状荧光传感器。

进一步的，步骤3)中所述凝胶状荧光传感器的制备方法为：

DNA 1溶液和DNA 2溶液培养结束后，加入琼脂糖溶液，混合；然后，加入抗坏血酸钠，混匀后，加热融化琼脂糖粉末，凝固前置于容器中，室温下冷却，得到TTE DNA水凝胶，将CuSO₄溶液注射到TTE DNA水凝胶中，反应后，即凝胶状荧光传感器。

所述琼脂糖溶液的制备方法为：将0.15g琼脂糖粉末加入到240μL的MOPS缓冲溶液中，即可。

具体的，所述凝胶状荧光传感器的制备方法为：

将制备的100μM DNA 1溶液和100μM的DNA2溶液各取1μL，混合，室温下培养15-30min，然后，将0.15g琼脂糖粉末加入到240μL的MOPS缓冲溶液中得到的琼脂糖溶液加入其中，混匀后，加入16μL 100mM的抗坏血酸钠溶液，混合均匀后，用微波炉加热融化琼脂糖粉末，没有凝固前倒入容器中，室温下冷却即TTE DNA水凝胶，然后注射80μL 10mM的CuSO₄溶液在制备好的TTE DNA水凝胶中，反应10min，即得凝胶状荧光传感器。

一种检测酪氨酸酶的方法，检测方法为：

向制备的荧光传感器中加入不同浓度的酪氨酸酶溶液，3min后用荧光仪记录体系的荧光强度，根据不同浓度的酪氨酸酶溶液猝灭TTE DNA铜纳米粒子程度不同，构建荧光强度与酪氨酸酶溶液的线性关系，即可定量检测酪氨酸酶。

利用凝胶状荧光传感器检测酪氨酸酶的方法，检测方法为：

向制备的凝胶状荧光传感器注射不同浓度的酪氨酸酶溶液，20min后通过数码相机记录，据不同浓度的酪氨酸酶溶液猝灭TTE DNA铜纳米粒子程度不同，可视化检测酪氨酸酶。

制备的TTE DNA水凝胶可回收再利用的研究：

将TTE DNA水凝胶放置不同的时间段后分别加入Cu²⁺，制备荧光TTE DNA铜纳米粒子，并记录它们的紫外灯下的发光情况。检测发现，放置时间长后失水，无法制备得到荧光TTE DNA铜纳米粒子，无法作为荧光传感器使用。但是，将失水的水凝胶浸泡在MOPS缓冲液中(10mM MOPS，150mM NaCl，3mM抗坏血酸，pH＝7.8)30min后，水凝胶吸水恢复其功能性，可制备出荧光Cu NPs，可再次用于检测酪氨酸酶。

水凝胶干燥和再吸水处理：首先，一块TTE DNA水凝胶在烘箱中在50℃下干燥1.5小时，然后将干燥的水凝胶转移到MOPS缓冲液(10mM MOPS，150mM NaCl，3mM抗坏血酸，pH7.6)中，并浸泡25min，再脱水后，水凝胶用于制备荧光Cu NPs，可检测酪氨酸酶。

与现有技术相比，本发明利用DNA 1和DNA2碱基互补配对，DNA1和DNA2的DNA设计中，都包含一段含有30个T的碱基。该聚30T的碱基可以使Cu²⁺还原为Cu⁰，使之产生荧光。然后加入抗坏血酸钠和硫酸铜，制备得到TTE DNA铜纳米粒子，具有荧光性能，利用酪氨酸酶可以快速有效的猝灭TTE DNA铜纳米粒子荧光的原理，来达到定量检测酪氨酸酶的目的。使用的试剂是低成本，不需要复杂的有机荧光化合物的合成，传感器设计过程非常简单，无需任何标记和修饰探针。检测准确度高、灵敏、检测限低。

由于本发明中TTE DNA铜纳米粒子与琼脂糖不反应，因此，利用琼脂糖制备得到凝胶状荧光传感器，可视化检测酪氨酸酶，而且使用功能化水凝胶信号响应非常快只有几十分钟，所以功能水凝胶可作为携带器件可视化的检测酪氨酸酶。该功能水凝胶的可以实现高的信号输出。而且基于水凝胶的装置可以保护探针免受环境的干扰，具有良好的恒定性和可恢复功能，使得可在复杂的环境中检测样品。即使脱水，也可以通过浸泡在缓冲溶液中的方法恢复其传感器功能。

附图说明

图1为溶液状态和水凝胶状态的TTE DNA铜纳米粒子，在紫外灯下发射的荧光和荧光被猝灭的过程示意图；

图2为TTE DNA-Cu NPs的透射电镜表征图；

图3为TTE DNA-Cu NPs的荧光激发/发射,及紫外吸收光谱图；a为TTE DNA-Cu NPs的紫外吸收光谱；b为TTE DNA-Cu NP的荧光激发光谱；c为TTE DNA-Cu NPs的荧光发射光谱；

图4为溶液状态下的荧光光谱图；a为寡TTE DNA-Cu NPs；b为TTE DNA-Cu NPs中加入酪氨酸酶,c为寡酪氨酸酶；插图是凝胶状态下，在紫外灯照射下的图；a’为寡TTE DNA-CuNPs，b’为TTE DNA-Cu NPs中加入酪氨酸酶,c’为寡酪氨酸酶；

图5为在溶液状态下的TTE DNA-Cu NPs和酪氨酸酶的相互培育时间对TTE DNA-CuNPs荧光的影响；

图6为在溶液状态下的MOPS缓冲溶液的pH对TTE DNA-Cu NPs荧光的影响；

图7为在凝胶状态下的TTE DNA-Cu NPs和酪氨酸酶的相互培育时间对TTE DNA-CuNPs荧光的影响；

图8将TTE DNA水凝胶在空气中放置一段时间，失水后的凝胶加入Cu²⁺(图中a)和再加入酪氨酸酶(图中a')在紫外灯下的发光图；失水后的TTE DNA水凝胶在MOPS缓冲液中浸泡30分钟，回收的水凝胶加入Cu²⁺(图中b)，和再加入酪氨酸酶(图中b')在紫外灯下的发光图；将TTE DNA水凝胶在烘箱中在50℃下干燥1.5小时后，在MOPS缓冲液中浸泡30分钟，回收的水凝胶加入Cu²⁺(图中c)，和再加入酪氨酸酶(图中c')在紫外灯下的发光图；

图9为TTE DNA水凝胶对Cu²⁺的响应后，加入不同浓度的酪氨酸酶溶液在紫外灯照射下的发光图；从做到右酪氨酸酶溶液溶度依次为0，0.006，0.01，0.06，0.1，0.6，1，2，3unit/mL；

图10为TTE DNA-CuNPs溶液中加入不同浓度的酪氨酸酶溶液在荧光仪记录下的光谱图；

图11为TTE DNA-CuNPs的荧光强度和酪氨酸酶的线性关系；从上到下浓度依次是：0.0005，0.001，0.002，0.004，0.006，0.01，0.02，0.04，0.06，0.1，0.2，0.4，0.6，1，2，3unit/mL；

图12为溶液TTE DNA-Cu NPs在3unit/mL酪氨酸酶或200μM其他分析物存在下的荧光信号强度柱状图，其中，F₀和F分别为不存在和存在酪氨酸酶和其他分析物时TTE DNA-CuNPs的荧光强度，误差棒表示三次测量的标准偏差。

具体实施方式

实施例1

一种荧光传感器的制备方法，包括以下步骤：

1)DNA 1和DNA2用10mM MOPS(3-(N-吗啉基)丙磺酸)PH＝7.6的缓冲溶液，稀释到100μM，储存在4℃中至少24小时后可用。实验过程中所用的稀释液都为MOPS缓冲溶液。

2)将步骤1)制备的100μM DNA 1溶液和100μM的DNA2溶液各取1μL，混合，室温下在均匀的摇速下培养20min。

3)将培养后的混合溶液置于240μL的MOPS缓冲溶液中，然后加入16μL 100mM的抗坏血酸钠和8μL10mM的CuSO₄溶液，室温下反应10min，得到TTE DNA铜纳米粒子，荧光传感器制备完成。

实施例2

一种凝胶状荧光传感器的制备方法为：

1)DNA 1和DNA2用10mM MOPS(3-(N-吗啉基)丙磺酸)PH＝7.6的缓冲溶液，稀释到100μM，储存在4℃中至少24小时后可用；

2)在离心管内分别加入1μL的上述制备的100μM DNA 1溶液和100μM DNA 2溶液，混合，在均匀的摇速下培养20min，然后，在小烧杯中通过加入0.15g琼脂糖粉末在240μL的MOPS缓冲溶液中中获得琼脂糖溶液。将DNA 1和DNA 2的混合溶液移入小烧杯中，与琼脂糖溶液充分混合后，加入16μL100mM的抗坏血酸钠溶液。混合均匀后，用微波炉加热融化琼脂糖粉末，趁没有凝固前倒入自制的离心管盖中，最后，水凝胶在室温下冷却在管盖中形成胶状物，即TTE DNA水凝胶；注射80μL的CuSO₄溶液在制备好的水凝胶中，10min后，将水凝胶置于紫外等下进行观察，通过肉眼观察荧光信号。

实施例3

一种检测酪氨酸酶的方法，检测方法为：

向实施例1制备的荧光传感器中加入不同浓度的酪氨酸酶溶液，用荧光仪记录体系的荧光强度，根据不同浓度的酪氨酸酶溶液猝灭TTE DNA铜纳米粒子程度不同，构建荧光强度与酪氨酸酶溶液的线性关系如图9、图10所示，即可定量检测酪氨酸酶。

实施例4

利用凝胶状荧光传感器检测酪氨酸酶的方法，检测方法为：

向实施例2制备的凝胶状荧光传感器注射不同浓度的酪氨酸酶溶液，，通过数码相机记录，据不同浓度的酪氨酸酶溶液猝灭TTE DNA铜纳米粒子程度不同，可视化检测酪氨酸酶。

实施例5

利用与实施例3相同的方法分别检测酪氨酸酶、钾离子、钠离子、氯离子、乳糖、尿酸和赖氨酸，结果如图12，可见本方法选择性高。

Claims

1.一种荧光传感器的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

1)DNA 1和DNA 2分别用缓冲溶液稀释，分别得到DNA 1溶液和DNA 2溶液，待用；

2)混合稀释后的DNA 1溶液和DNA 2溶液，培养，使DNA 1和DNA 2碱基互补配对；

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述缓冲液为10mM MOPS(3-(N-吗啉基)丙磺酸)PH＝7.6的缓冲溶液。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，DNA 1序列：

GCAGAGTTGAGACCAT30TCAGAAGGCAAAAAA；DNA 2序列：

TTTTTTGCCTTCTGAT30TGGTCTCAACTCTGC。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述培养是指：在室温条件下培养15-30min。

5.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤3)具体为：将培养后的混合溶液置于240μL的MOPS缓冲溶液中，然后加入16μL 100mM的抗坏血酸钠和8μL 10mM的CuSO₄溶液，室温下反应10-20min，即可。

6.根据权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征在于，在步骤3)加入抗坏血酸钠溶液和CuSO₄溶液之前加入琼脂糖溶液，即可制备得到凝胶状荧光传感器。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，DNA 1溶液和DNA2溶液培养结束后，加入琼脂糖溶液，混合；然后，加入抗坏血酸钠，混匀后，加热融化琼脂糖粉末，凝固前置于容器中，室温下冷却，得到TTE DNA水凝胶，将CuSO₄溶液注射到TTE DNA水凝胶中，反应后，即凝胶状荧光传感器。

8.一种利用权利要求1-5任一项所制备的荧光传感器检测酪氨酸酶的方法，其特征在于，检测方法为：向制备的荧光传感器中加入不同浓度的酪氨酸酶溶液，3min后用荧光仪记录体系的荧光强度，根据不同浓度的酪氨酸酶溶液猝灭TTE DNA铜纳米粒子程度不同，构建荧光强度与酪氨酸酶溶液的线性关系，即可定量检测酪氨酸酶。

9.一种利用权利要求6-7任一项所制备的荧光传感器检测酪氨酸酶的方法，其特征在于，检测方法为：向制备的凝胶状荧光传感器注射不同浓度的酪氨酸酶溶液，20min后通过数码相机记录，据不同浓度的酪氨酸酶溶液猝灭TTE DNA铜纳米粒子程度不同，可视化检测酪氨酸酶。