CN106350069A - 一种双发射比率荧光探针的构建方法及其应用 - Google Patents

一种双发射比率荧光探针的构建方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种双发射比率荧光探针的构建方法，该方法通过将BPEI‑CQDs碳量子点修饰在二氧化硅球上，操作简单、不需要复杂设备，所制备的双发射荧光探针(CdTe/CdS@SiO2@BPEI‑CQDs)在苛刻条件下稳定性高；所建立的测定人体尿液中和血浆中微量Cu2+的方法选择性好、灵敏度高、可视化。

Description

一种双发射比率荧光探针的构建方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物样品检测领域，特别地，涉及一种双发射比率荧光探针的构建方法及其应用。
背景技术
铜离子在化学、电学、生物等众多领域都具有很重要的应用。铜的几个尤其重要的作用包括作为很多生理反应中酶的辅因子，以及威尔森氏病、阿兹海默症等疾病的诊断标准。然而，铜离子浓度很高时会造成婴儿的肝损伤及儿童的肝硬化等，对人体健康具有危害性。随着工业对铜的广泛使用，铜含量对人类健康的影响及其检测方法引起了人们越来越多的关注。
目前，测定铜离子的方法主要有原子吸收光谱、电感耦合等离子体原子发射光谱、电化学等方法。近年来，荧光化学传感器由于其高灵敏度、高选择性、操作简单等优点日益受到人们关注。然而，大多数荧光化学传感器随着铜离子的加入伴随荧光信号的单一增强或减弱，这种单一的以强度变化来检测铜离子的方法通常会受到传感器浓度(物质)、检测器或光源的稳定性、复杂样品基质中共存组分等一系列因素的干扰或者影响。
双发射比率荧光通过将两种不同的荧光类物质结合在一种纳米材料上，一个荧光发射光谱作为信号参考，另一个荧光发射光谱作为信号输出，通过比率荧光的方法来检测目标物则可避免上述问题的影响。然而受限于不同种类的荧光类物质的寻找及设计，该类探针的报道相对较少。
近年来，碳量子点由于其良好的水溶性、光稳定性、生物相容性、低毒等优点而备受人们瞩目。碳量子点由于具备分子识别作用而被用于化学传感器，但是将碳量子点用于比率荧光探针的构建并进一步用于生物样品检测方面的研究并不是很多。与有机荧光类物质相比，碳量子点用于比率荧光探针的构建则不需要复杂的合成过程。Zhou等提出了碳量子点为荧光输出信号的双发射荧光探针检测Cu2+，但是由于该碳量子点对Cu2+没有识别作用，所以需要修饰一种对Cu2+有识别作用的有机分子来检测，该探针制备过程复杂。
因此，构建对Cu2+有选择性识别作用的一种新型双发射比率荧光探针并在此基础上建立了选择性好、灵敏高的可用于人体尿液及血浆中Cu2+的可视化新方法十分必要。
发明内容
本发明目的在于提供一种对Cu2+有选择性识别作用的一种新型双发射比率荧光探针的构建方法。在此基础上，通过Cu2+与聚乙烯亚胺碳量子点(BPEI-CQDs)发生作用导致其荧光淬灭的现象，建立了选择性好、灵敏高的可用于人体尿液及血浆中Cu2+的可视化新方法，以解决技术问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种双发射比率荧光探针的构建方法及其应用。
一种双发射比率荧光探针的构建方法，包括以下步骤：
A、CdTe/CdS红光量子点的合成：将巯基丙酸加入到氯化镉溶液中，搅拌使混匀，将柠檬酸钠加入到上述混合溶液中，搅拌8-15min后，用0.1mol/L的氢氧化钠调节溶液pH为11-12，随后加入碲酸钠和硼氢化钠搅拌，缓慢加热到90℃，冷却至室温并用乙醇离心反复洗涤，收集下层固体分散于5mL乙醇中备用，得到CdTe/CdS量子点溶液。
B、CdTe/CdS@SiO2的合成：移取CdTe/CdS量子点溶液分散于水和乙醇混合液中(水：乙醇的质量比＝1：4)，超声至分散均匀，40℃下加入浓氨水，硅酸乙酯，恒温加热2-4小时，冷却后离心分离，用乙醇水交替洗，得到肉粉色的CdTe/CdS@SiO2材料自然晾干备用；
C、BPEI-CQDs的合成：将聚乙烯亚胺及柠檬酸溶解于超纯水中，慢慢加热至200℃，加热20min后，大部分水被蒸干出现淡黄色，继续加入水，重复操作8-12次，溶液颜色变为橘黄色，即形成了BPEI-CQDs，用超纯水稀释，0.01mol/L的盐酸过柱子纯化，得到的BPEI-CQDs溶液减压蒸馏，得到胶状BPEI-CQDs，于真空干燥箱40℃烘干；
D、CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs的合成：将CdTe/CdS@SiO2溶解于乙醇中，加入BPEI-CQDs至上述溶液中，加热至60℃，加入硅酸乙酯和异腈酸酯，60℃恒温5-7小时，冷却后离心，用乙醇和超纯水交替洗，自然晾干，即可。
优选的，将双发射比率荧光探针应用于测定生物样品中Cu2+的浓度。
一种双发射比率荧光探针应用于测定生物样品中Cu2+的浓度的方法，包括以下步骤：取待检测液体，加入浓硝酸酸化，10000-12500rpm离心8-15min，取1.0mL上清用超纯水稀释至50mL；依次加入2.47mL磷酸盐缓冲液，20μL探针储备液，10μL二价铜离子储备液于比色池中混匀，反应2min后在荧光仪上测定该溶液荧光光谱，根据预先测定的不同浓度Cu2+存在时探针的工作曲线，得到Cu2+的浓度。
优选的，所述的待测液体为尿液或血浆。
优选的，当血浆是从冰箱中取出时，应先在室温下解冻，再做后续处理。
优选的，所述的磷酸盐缓冲液的浓度为10mmol/L，pH为7.4。
优选的，所述的探针储备液为50mg/mL的CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs溶液。
本构建方法操作简单、不需要复杂设备，所制备的双发射荧光探针(CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs)在苛刻条件下稳定性高；所建立的测定人体尿液中和血浆中微量Cu2+的方法选择性好、灵敏度高、可视化。
附图说明
图1：CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs双发射比率荧光探针对Cu2+的检测原理图。
图2：CdTe/CdS@SiO2(A)及CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs(B)的透射电镜图。
图3：CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs纳米荧光探针的XPS图(A)，C1s(B)，N1s(C)，O1s(D)的高分辨XPS图。
图4：CdTe/CdS(右上线),CdTe/CdS@SiO2(右中线),及双发射硅纳米颗粒(右下线)的荧光发射光谱图。
图5：BPEI-CQDs(a),CdTe/CdS@SiO2(b),CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs(c)的红外光谱图。
图6：pH值对淬灭效率的影响图
图7：NaCl浓度(a)、365nm光照时间(b)对F450/F650比值的影响图。
图8：金属离子(a)、氨基酸(b)对F450/F650比值的影响图(灰色为60μM Cu2+存在时)。
图9：不同浓度Cu2+存在时探针的荧光谱图(a)，工作曲线图(b)，对应于(b)图的探针溶液的颜色变化图(c)。
具体实施方式
实施例1
一种双发射比率荧光探针的构建方法，包括以下步骤：
A.CdTe/CdS红光量子点的合成
74μL巯基丙酸加入至100mL的氯化镉溶液中(0.5mmol)，搅拌使混匀。称取20mg柠檬酸钠加入到上述混合溶液中。搅拌10min后，用0.1mol/L的氢氧化钠调节溶液pH为11.2，随后加入4.4mg碲酸钠及20mg硼氢化钠搅拌。缓慢加热到90℃，加热时间不同可以得到不同发射波长(475-810nm)的CdTe/CdS量子点，通过控制反应时间反应到所需波长后，冷却至室温并用乙醇离心反复洗涤，收集下层固体分散于5mL乙醇中备用；
B.CdTe/CdS@SiO2的合成
移取2mL CdTe/CdS量子点溶液分散于100mL水和乙醇混合液中(水：乙醇的质量比＝1：4)，超声至分散均匀，40℃下加入4.6mL浓氨水，460μL硅酸乙酯，恒温加热3小时，冷却后离心分离，用乙醇水交替洗，得到肉粉色的CdTe/CdS@SiO2材料自然晾干备用；
C.BPEI-CQDs的合成
将0.5g聚乙烯亚胺及1.0g柠檬酸溶解于10mL超纯水中，于25mL烧杯中慢慢加热至接近200℃，加热20min后，大部分水被蒸干出现淡黄色，继续加入1mL水，重复操作10次，溶液颜色变为橘黄色，即形成了BPEI-CQDs，用超纯水稀释至10mL，0.01mol/L的盐酸过柱子纯化，得到的BPEI-CQDs溶液减压蒸馏，得到胶状BPEI-CQDs于真空干燥箱40℃烘干；
D.CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs的合成
将0.12g CdTe/CdS@SiO2溶解于120mL乙醇中，加入25.5mg BPEI-CQDs至上述溶液中，加热至60℃，加入225μL硅酸乙酯及225μL异腈酸酯，60℃恒温6小时，冷却后离心，用乙醇和超纯水交替洗，自然晾干。
实施例2
一种双发射比率荧光探针的构建方法，包括以下步骤：
A.CdTe/CdS红光量子点的合成
74μL巯基丙酸加入至100mL的氯化镉溶液中(0.5mmol)，搅拌使混匀。称取20mg柠檬酸钠加入到上述混合溶液中。搅拌15min后，用0.1mol/L的氢氧化钠调节溶液pH为11.2，随后加入4.4mg碲酸钠及20mg硼氢化钠搅拌。缓慢加热到90℃，加热时间不同可以得到不同发射波长(475-810nm)的CdTe/CdS量子点，通过控制反应时间反应到所需波长后，冷却至室温并用乙醇离心反复洗涤，收集下层固体分散于5mL乙醇中备用；
B.CdTe/CdS@SiO2的合成
移取2mL CdTe/CdS量子点溶液分散于100mL水和乙醇混合液中(水：乙醇的质量比＝1：4)，超声至分散均匀，40℃下加入4.6mL浓氨水，460μL硅酸乙酯，恒温加热2小时，冷却后离心分离，用乙醇水交替洗，得到肉粉色的CdTe/CdS@SiO2材料自然晾干备用；
C.BPEI-CQDs的合成
将0.5g聚乙烯亚胺及1.0g柠檬酸溶解于10mL超纯水中，于25mL烧杯中慢慢加热至接近200℃，加热20min后，大部分水被蒸干出现淡黄色，继续加入1mL水，重复操作12次，溶液颜色变为橘黄色，即形成了BPEI-CQDs，用超纯水稀释至10mL，0.01mol/L的盐酸过柱子纯化，得到的BPEI-CQDs溶液减压蒸馏，得到胶状BPEI-CQDs于真空干燥箱40℃烘干；
D.CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs的合成
将0.12g CdTe/CdS@SiO2溶解于120mL乙醇中，加入25.5mg BPEI-CQDs至上述溶液中，加热至60℃，加入225μL硅酸乙酯及225μL异腈酸酯，60℃恒温5小时，冷却后离心，用乙醇和超纯水交替洗，自然晾干。
实施例3
一种双发射比率荧光探针的构建方法，包括以下步骤：
A.CdTe/CdS红光量子点的合成
74μL巯基丙酸加入至100mL的氯化镉溶液中(0.5mmol)，搅拌使混匀。称取20mg柠檬酸钠加入到上述混合溶液中。搅拌8min后，用0.1mol/L的氢氧化钠调节溶液pH为11.2，随后加入4.4mg碲酸钠及20mg硼氢化钠搅拌。缓慢加热到90℃，加热时间不同可以得到不同发射波长(475-810nm)的CdTe/CdS量子点，通过控制反应时间反应到所需波长后，冷却至室温并用乙醇离心反复洗涤，收集下层固体分散于5mL乙醇中备用；
B.CdTe/CdS@SiO2的合成
移取2mL CdTe/CdS量子点溶液分散于100mL水和乙醇混合液中(水：乙醇的质量比＝1：4)，超声至分散均匀，40℃下加入4.6mL浓氨水，460μL硅酸乙酯，恒温加热4小时，冷却后离心分离，用乙醇水交替洗，得到肉粉色的CdTe/CdS@SiO2材料自然晾干备用；
C.BPEI-CQDs的合成
将0.5g聚乙烯亚胺及1.0g柠檬酸溶解于10mL超纯水中，于25mL烧杯中慢慢加热至接近200℃，加热20min后，大部分水被蒸干出现淡黄色，继续加入1mL水，重复操作8次，溶液颜色变为橘黄色，即形成了BPEI-CQDs，用超纯水稀释至10mL，0.01mol/L的盐酸过柱子纯化，得到的BPEI-CQDs溶液减压蒸馏，得到胶状BPEI-CQDs于真空干燥箱40℃烘干；
D.CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs的合成
将0.12g CdTe/CdS@SiO2溶解于120mL乙醇中，加入25.5mg BPEI-CQDs至上述溶液中，加热至60℃，加入225μL硅酸乙酯及225μL异腈酸酯，60℃恒温7小时，冷却后离心，用乙醇和超纯水交替洗，自然晾干。
用TEM、XPS、荧光发射光谱、FT-IR等手段对其结构和形貌进行了表征。
由图2-5可以知道，BPEI-CQDs碳量子点被成功修饰在二氧化硅球上。
实施例4
取尿液1.0mL，加入0.1mL浓HNO3酸化，12000rpm离心10min，取1.0mL上清用超纯水稀释至50mL。
从冰箱中取出血浆室温下解冻，按上述方法酸化，去蛋白处理后稀释。
依次加入2.47mL磷酸盐缓冲(PBS，10mM，pH＝7.4)，20μL探针储备液(CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs，50mg/mL)，10μL不同浓度的二价铜离子储备液于比色池中混匀。反应2min后在荧光仪上测定该溶液荧光光谱，根据预先测定的不同浓度Cu2+存在时探针的工作曲线，得到Cu2+的浓度。
本发明中进一步考察了不同pH对该双发射荧光探针对Cu2+淬灭效率的影响。当溶液pH在4-6之间时，该体系荧光强度较强，当体系pH值过高或过低时，荧光强度均有所降低(图6)。图中灰色柱状表明，酸性条件下(pH≤3.0)Cu2+对荧光探针的淬灭作用很小。在碱性溶液中(pH＞7.0)淬灭效率仍然不高。pH4-7环境下，淬灭效率较高，且当溶液pH在5-7之间，该双发射荧光探针具有较好的稳定性。综合考虑pH对该探针检测Cu2+淬灭效率的影响及将该探针用于生物样品的检测，选择pH为7.4的PBS溶液作为缓冲。
图7为NaCl浓度(a)、365nm光照时间(b)对F450/F650比值的影响；
图8为金属离子(a)、氨基酸(b)对F450/F650比值的影响(灰色为60μM Cu2+存在时)；
图9为不同浓度Cu2+存在时探针的荧光谱图(a)，工作曲线(b)，对应于(b)图的探针溶液的颜色变化图(c)。
表1和表2为实施例4的分析
表1尿液分析结果
表2血浆分析结果
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种双发射比率荧光探针的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、CdTe/CdS红光量子点的合成：将巯基丙酸加入到氯化镉溶液中，搅拌使混匀，将柠檬酸钠加入到上述混合溶液中，搅拌8-15min后，用0.1mol/L的氢氧化钠调节溶液pH为11-12，随后加入碲酸钠和硼氢化钠搅拌，缓慢加热到90℃，冷却至室温并用乙醇离心反复洗涤，收集下层固体分散于5mL乙醇中备用，得到CdTe/CdS量子点溶液；
B、CdTe/CdS@SiO2的合成：移取CdTe/CdS量子点溶液分散于水和乙醇混合液中，超声至分散均匀，40℃下加入浓氨水，硅酸乙酯，恒温加热2-4小时，冷却后离心分离，用乙醇水交替洗，得到肉粉色的CdTe/CdS@SiO2材料自然晾干备用；
C、BPEI-CQDs的合成：将聚乙烯亚胺及柠檬酸溶解于超纯水中，慢慢加热至200℃，加热20min后，大部分水被蒸干出现淡黄色，继续加入水，重复操作8-12次，溶液颜色变为橘黄色，即形成了BPEI-CQDs，用超纯水稀释，0.01mol/L的盐酸过柱子纯化，得到的BPEI-CQDs溶液减压蒸馏，得到胶状BPEI-CQDs，于真空干燥箱40℃烘干；
D、CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs的合成：将CdTe/CdS@SiO2溶解于乙醇中，加入BPEI-CQDs至上述溶液中，加热至60℃，加入硅酸乙酯和异腈酸酯，60℃恒温5-7小时，冷却后离心，用乙醇和超纯水交替洗，自然晾干，即可。
2.如权利要求1所述的双发射比率荧光探针的构建方法，其特征在于，所述的步骤B中水和乙醇混合液中，水和乙醇的质量比为1：4。
3.一种双发射比率荧光探针的应用，其特征在于，将双发射比率荧光探针应用于测定生物样品中Cu2+的浓度。
4.如权利要求3所述的双发射比率荧光探针的应用，其特征在于，所述的将双发射比率荧光探针应用于测定生物样品中Cu2+的浓度的方法，包括以下步骤：取待检测液体，加入浓硝酸酸化，10000-12500rpm离心8-15min，取1.0mL上清用超纯水稀释至50mL；依次加入2.47mL磷酸盐缓冲液，20μL探针储备液，10μL二价铜离子储备液于比色池中混匀，反应2min后在荧光仪上测定该溶液荧光光谱，根据预先测定的不同浓度Cu2+存在时探针的工作曲线，得到Cu2+的浓度。
5.如权利要求4所述的双发射比率荧光探针的应用，其特征在于，所述的磷酸盐缓冲液的浓度为10mmol/L，pH为7.4。
6.如权利要求4所述的双发射比率荧光探针的应用，其特征在于，所述的探针储备液为50mg/mL的CdTe/CdS@SiO2@BPEI-CQDs溶液。
7.如权利要求4所述的双发射比率荧光探针的应用，其特征在于，所述的待测液体为尿液或血浆。
8.如权利要求5所述的双发射比率荧光探针的应用，其特征在于，当血浆是从冰箱中取出时，应先在室温下解冻，再做后续处理。
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