CN104677897B - 基于纳米金催化显色体系的pH及尿素的测定方法 - Google Patents

基于纳米金催化显色体系的pH及尿素的测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种基于纳米金催化显色体系的pH及尿素的测定方法，其特征是利用纳米金催化过氧化氢氧化3,3',5,5'‑四甲基联苯胺盐酸盐显色体系在不同pH条件下的显色差异，从而表现出溶液颜色和紫外吸收光谱特征随pH值的变化，直接用于pH测定；通过纳米金催化过氧化氢氧化3,3',5,5'‑四甲基联苯胺盐酸盐显色体系与脲酶催化尿素水解反应体系耦合，从而表现出溶液颜色和紫外吸收光谱特征随尿素浓度的变化，用于尿素含量的测定。在pH 6.40~6.60范围内吸光度值A450与pH值呈线性关系；在0.02~0.4 mmoL/L范围内，显色体系的A450值与尿素浓度呈线性关系，检测限为0.005 mmoL/L。本发明操作简便、灵敏度高、特异性好。

Description

基于纳米金催化显色体系的pH及尿素的测定方法
技术领域
本发明涉及纳米金催化过氧化氢氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系的pH响应及其用于pH值和尿素测定的方法，属于分析化学和纳米技术领域。
背景技术
pH值是化学和生物系统中常用的一项重要指标，其影响着其许多化学反应和生化反应。医学上，体内pH值的改变伴随着很多疾病的发生发展。因此，pH值的测定在化学和生物领域具有重要的意义。目前，pH的测量方法主要分为指示剂法、金属电极法（氢电极法，醌氢醌电极法，锑电极法）和玻璃电极法等。发展新的溶液pH的测定方法仍然十分重要。
尿素是人体蛋白质代谢的终产物，由肝脏产生，经血液运输至肾脏以尿液形式排出。尿素的生成量取决于蛋白质的摄入量、组织蛋白质的分解代谢以及肝功能状况。尿素是临床及生物化学一个重要的目标分析物，它是评价尿毒症毒素水平、肾脏及肝脏细胞功能的重要标志。目前，尿素的测定方法包括：氨电极法、脲酶-波氏法，脲酶-谷氨酸脱氢酶偶联法，脲酶-亮氨酸脱氢酶偶联法等。
可提供肉眼识别信号的比色法检测，具有简单，快速，适用于实时和现场检测等优点。基于纳米金的色度传感器近年来得到了广泛关注，其中的大部分均是基于纳米金聚集或聚集再分散过程中的等离子体耦合而产生的颜色变化。纳米金已越来越多地应用于比色法检测细胞、蛋白质、DNA、金属离子和小分子等。
本发明利用纳米金催化过氧化氢氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系在不同pH条件下的显色差异，构建了一种简便、灵敏的pH值测定新方法。将该体系与脲酶催化尿素水解体系结合，建立了尿素检测的新方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于纳米金催化过氧化氢氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系的pH及尿素的测定方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：本发明所述的基于纳米金催化显色体系的pH或尿素的测定方法，其特征是利用纳米金催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系在不同pH条件下的显色差异，从而表现出溶液颜色和紫外吸收光谱特征随pH值的变化，能直接用于pH值测定；或者通过纳米金催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系与脲酶催化尿素水解反应体系耦合，从而表现出溶液颜色和紫外吸收光谱特征随尿素浓度的变化，能用于尿素含量的测定。
上述所使用的纳米金采用柠檬酸三钠还原法制得：1毫升0.1 g/L的氯金酸溶液溶解于100毫升水中，回流加热煮沸后迅速加入3毫升0.1 g/L的柠檬酸三钠溶液，反应溶液由从浅黄色变成酒红色，继续回流15分钟后，将反应溶液慢慢冷却至室温，所得的纳米金粒径为13 nm，浓度为3.1 nmoL/L，4 °C保存。
本发明所述的基于纳米金催化显色体系的pH测定方法，其特征是将不同pH的浓度为10 mmoL/L的磷酸缓冲液、质量分数为30%的过氧化氢、浓度为16 mmoL/L的 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐与纳米金溶液按体积比为13：4：1：2混合，37°C温浴10分钟后，立即加入0.2 mL、体积分数为 20%的硫酸溶液终止上述反应，目视观察颜色特征或测定吸光度值A450，当目视观察颜色特征时，随着pH的增大，显色体系的颜色逐渐由深黄色变为淡黄色；当测定吸光度值A450时，随着pH的增大而吸光度值A450逐渐减小，在6.40~6.60 范围内吸光度值A450与pH呈线性关系；所使用的纳米金采用柠檬酸三钠还原法制得：1毫升0.1 g/L的氯金酸溶液溶解于100毫升水中，回流加热煮沸后迅速加入3毫升0.1 g/L的柠檬酸三钠溶液，反应溶液由从浅黄色变成酒红色，继续回流15分钟后，将反应溶液慢慢冷却至室温，所得的纳米金粒径为13 nm，浓度为3.1 nmoL/L，4 °C保存。
所述磷酸缓冲液、过氧化氢、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐与纳米金溶液混合后的总体积为1 mL。
本发明所述的基于纳米金催化显色体系的尿素测定方法，其特征是将脲酶溶液加入到0.6 mL其含不同浓度尿素的浓度为10 mmoL/L，pH=6.40的磷酸缓冲液中，摇匀后37°C温浴30分钟，反应结束后，加入0.2 mL质量分数为 30%的过氧化氢溶液、0.05 mL浓度为16mmoL/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和0.10 mL纳米金溶液，混合均匀后37°C温浴10分钟，立即加入0.2 mL 体积分数为20%的硫酸溶液终止反应，测定吸光度值A450，随着尿素浓度的增大显色体系的A450值逐渐减小，在0.02~0.4 mmoL/L范围内，显色体系的A450值与尿素浓度呈线性关系，检测限为0.005 mmoL/L；所使用的纳米金采用柠檬酸三钠还原法制得：1毫升0.1 g/L的氯金酸溶液溶解于100毫升水中，回流加热煮沸后迅速加入3毫升0.1g/L的柠檬酸三钠溶液，反应溶液由从浅黄色变成酒红色，继续回流15分钟后，将反应溶液慢慢冷却至室温，所得的纳米金粒径为13 nm，浓度为3.1 nmoL/L，4 °C保存。
所使用的脲酶溶液的体积为0.05 mL，浓度为18 U/mL。
本发明所述基于纳米金催化显色体系的人尿液中尿素测定方法，包括如下步骤：取新鲜人尿液，调节pH至6.40后，用10 mmoL/L，pH=6.40的磷酸缓冲液稀释400倍，取0.1 mL稀释液加入到0.5 mL浓度为10 mmoL/L，pH=6.40的磷酸缓冲液中，再加入0.05 mL 18 U/mL的脲酶溶液，摇匀后37°C温浴30分钟，反应结束后，加入0.2 mL质量分数为 30%的过氧化氢溶液、0.05 mL浓度为16 mmoL/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和0.10 mL纳米金溶液，混合均匀后37°C温浴10分钟，立即加入0.2 mL体积分数为 20%的硫酸溶液终止反应，测定吸光度值A450，通过标准曲线进行定量，获得尿液中的尿素含量。
所使用的纳米金采用柠檬酸三钠还原法制得：1毫升0.1 g/L的氯金酸溶液溶解于100毫升水中，回流加热煮沸后迅速加入3毫升0.1 g/L的柠檬酸三钠溶液，反应溶液由从浅黄色变成酒红色，继续回流15分钟后，将反应溶液慢慢冷却至室温，所得的纳米金粒径为13nm，浓度为3.1 nmoL/L，4 °C保存。
具体地说，本发明采用的技术方案为：
（一）纳米金的制备
以下过程中使用的所有玻璃器皿均经过王水浸泡，并用双蒸水彻底清洗，晾干。纳米金的制备：1毫升0.1 g/L的氯金酸溶液溶解于100毫升水中，回流加热煮沸后迅速加入3毫升0.1 g/L的柠檬酸三钠溶液，反应溶液由从浅黄色变成酒红色，继续回流15分钟后，将反应溶液慢慢冷却至室温。所得的纳米金粒径为13 nm，浓度为3.1 nmoL/L，4 °C保存。
（二）pH的测定
将0.2 mL 30%（m/m）的过氧化氢溶液、0.05 ml浓度为16 mmoL/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐（TMB）溶液和0.10 mL步骤（一）制备的纳米金溶液加入到0.65 mL不同pH的磷酸缓冲溶液（10 mmoL/L）中，混合均匀后37°C温浴10分钟。立即加入0.2 mL 20%（V/V）的硫酸溶液终止上述反应，目视观察颜色的变化或测定450 nm波长处的吸光度值（A450）。根据溶液颜色与比色标准系列比较或通过吸光度值标准曲线进行pH测定。
（三）尿素的测定
将0.05 mL 18 U/mL的脲酶溶液加入到0.6 mL含不同浓度尿素的磷酸缓冲液中（10 mmoL/L，pH=6.40），摇匀后37°C温浴30分钟。反应结束后，加入0.2 mL 30%（m/m）的过氧化氢溶液、0.05 mL浓度为16 mmoL/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和0.10 mL步骤（一）制备的纳米金溶液，混合均匀后37°C温浴10分钟。立即加入0.2 mL 20%（V/V）的硫酸溶液终止反应，测定吸光度值A450。通过吸光度值标准曲线进行尿素含量测定。
本发明的优点：
（1）本发明利用纳米金催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系在不同pH条件下的显色差异，从而表现出溶液颜色和紫外吸收光谱特征随pH值的变化，可以直接用于pH值测定；通过纳米金催化过氧化氢氧化TMB显色体系与脲酶催化尿素水解反应体系耦合，从而表现出溶液颜色和紫外吸收光谱特征随溶液中尿素浓度的变化，可以用于尿素含量的测定。
（2）本方法所使用的纳米金直接由柠檬酸三钠还原氯金酸得到，无需进行进一步的修饰，制备过程简单快速。
（3）检测步骤简单，不涉及任何复杂、贵重的仪器，检测成本低。
（4）本发明对样品的处理要求低。
（5）本发明的检测灵敏度高，pH测定的响应区间仅为0.2个pH（6.40~6.60），分光光度法测定尿素的检测限为0.005 mmoL/L。
附图说明
图1为纳米金催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系在不同pH下的颜色变化外观图。
图2为纳米金催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系在不同pH条件下吸光度值A450的变化图。
图3为纳米金催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系的吸光度值A450与pH的线性关系图。
图4为纳米金催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系的吸光度值A450与随尿素浓度的变化图。
图5为纳米金催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系的吸光度值A450与尿素浓度的线性关系图。
图6为纳米金催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系与不同干扰物作用后的吸光度值A450变化图。
具体实施方式
实施例1：
1毫升0.1 g/L的氯金酸溶液溶解于100毫升水中，回流加热煮沸后迅速加入3毫升0.1 g/L的柠檬酸三钠溶液，反应溶液由从浅黄色变成酒红色，继续回流15分钟后，将反应溶液慢慢冷却至室温。所得的纳米金粒径为13 nm，浓度为3.1 nmoL/L，4 °C保存。以上过程中使用的所有玻璃器皿均经过王水浸泡，并用双蒸水彻底清洗，晾干。
实施例2：
将0.2 mL 30%（m/m）的过氧化氢溶液、0.05 ml浓度为16 mmoL/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和0.10 mL实施例1所制得的纳米金溶液加入到0.65 mL不同pH（6.30~6.75）的磷酸缓冲溶液（10 mmoL/L）中，混合均匀后37°C温浴10分钟。立即加入0.2mL 20%（V/V）的硫酸溶液终止上述反应，目视观察颜色的变化。如图1所示，随着pH值的增大显色体系的颜色由深黄色变为淡黄色。
实施例3：
将0.2 mL 30%（m/m）的过氧化氢溶液、0.05 ml浓度为16 mmoL/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和0.10 mL实施例1所制得的纳米金溶液加入到0.65 mL不同pH（6.30~6.75）的磷酸缓冲溶液（10 mmoL/L）中，混合均匀后37°C温浴10分钟。立即加入0.2mL 20%（V/V）的硫酸溶液终止上述反应，测定吸光度值A450。随着pH的增大显色体系的A450值逐渐减小（见图2），在pH 6.40~6.60条件下，A450值与pH呈线性关系（见图3）。
实施例4：
将0.05 mL 18 U/mL的脲酶溶液加入到0.6 mL含不同浓度尿素（0.02~0.6 mmoL/L）的磷酸缓冲液中（10 mmoL/L，pH=6.40），摇匀后37°C温浴30分钟。反应结束后，加入0.2mL 30%（m/m）的过氧化氢溶液、0.05 mL浓度为16 mmoL/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和0.10 mL实施例1所制得的纳米金溶液，混合均匀后37°C温浴10分钟。立即加入0.2mL 20%（V/V）的硫酸溶液终止反应，测定吸光度值A450。随着尿素浓度的增大显色体系的A450值逐渐减小（见图4）。在0.02~0.4 mmoL/L范围内，显色体系的A450值与尿素浓度呈线性关系（见图5），检测限为0.005 mmoL/L。
实施例5：
将0.05 mL 18 U/mL的脲酶溶液加入到0.6 mL 0.2 mmoL/L尿素的磷酸缓冲液中（10 mmoL/L，pH=6.40），摇匀后37°C温浴30分钟。反应结束后，加入0.2 mL 30%（m/m）的过氧化氢溶液、0.05 mL浓度为16 mmoL/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和0.10 mL实施例1所制得的纳米金溶液，混合均匀后37°C温浴10分钟。立即加入0.2 mL 20%（V/V）的硫酸溶液终止反应，测定吸光度值A450。重复上述实验步骤6次，得相对标准偏差（RSD）为1.7%，表明本方法重现性良好。
实施例6：
将0.05 mL 18 U/mL的脲酶溶液加入到0.6 mL 含0.5 mmoL/L不同干扰物质的磷酸缓冲液中（10 mmoL/L，pH=6.40），摇匀后37°C温浴30分钟。反应结束后，加入0.2 mL 30%（m/m）的过氧化氢溶液、0.05 mL浓度为16 mmoL/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和0.10 mL实施例1所制得的纳米金溶液，混合均匀后37°C温浴10分钟。立即加入0.2 mL20%（V/V）的硫酸溶液终止反应，测定吸光度值A450。如图6所示，0~13依次为空白、尿素、氯化钾、磷酸二氢钠、氯化钙、氯化镁、硫酸锌、葡萄糖、乳糖、乙酰胆碱、肌酐、肌酸、苯丙氨酸、苏氨酸，结果表明本方法抗干扰能力强。
实施例7：
取新鲜人尿液，调节pH至6.40，然后用pH=6.40的磷酸盐缓冲液（10 mmoL/L，pH=6.40）稀释400倍，取0.1 mL稀释液加入到0.5 mL磷酸缓冲液（10 mmoL/L，pH=6.40）中，再加入0.05 mL 18 U/mL的脲酶溶液，摇匀后37°C温浴30分钟。反应结束后，加入0.2 mL 30%（m/m）的过氧化氢溶液、0.05 mL浓度为16 mmoL/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和0.10 mL实施例1所制得的纳米金溶液，混合均匀后37°C温浴10分钟。立即加入0.2 mL 20%（V/V）的硫酸溶液终止反应，测定吸光度值A450。通过标准曲线进行定量，获得尿样中的尿素含量。与二乙酰-肟法测定结果进行比较，结果表明本发明所使用的方法与标准方法测定结果吻合;
样品 本方法 (mM) 二乙酰-肟法(mM) 相对偏差(%)
1 222.3±6.1 215.7±2.0 3.06
2 425.4±4.6 397.8±3.9 6.94
3 453.4±6.8 475.8±4.0 -4.71

Claims (6)

1.一种基于纳米金催化显色体系的pH测定方法，其特征是将不同pH的浓度为10 mmoL/L的磷酸缓冲液、质量分数为30%的过氧化氢、浓度为16 mmoL/L的 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐与纳米金溶液按体积比为13：4：1：2混合，37°C温浴10分钟后，立即加入0.2 mL、体积分数为 20%的硫酸溶液终止反应，目视观察颜色特征或测定吸光度值A450，当目视观察颜色特征时，随着pH的增大，显色体系的颜色逐渐由深黄色变为淡黄色；当测定吸光度值A450时，随着pH的增大而吸光度值A450逐渐减小，在6.40~6.60 的pH值范围内吸光度值A450与pH呈线性关系；所使用的纳米金采用柠檬酸三钠还原法制得：1毫升0.1 g/L的氯金酸溶液溶解于100毫升水中，回流加热煮沸后迅速加入3毫升0.1 g/L的柠檬酸三钠溶液，反应溶液由从浅黄色变成酒红色，继续回流15分钟后，将反应溶液慢慢冷却至室温，所得的纳米金粒径为13 nm，浓度为3.1 nmoL/L，4 °C保存。
2.根据权利要求1所述的基于纳米金催化显色体系的pH测定方法，其特征是所述磷酸缓冲液、过氧化氢、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐与纳米金溶液混合后的总体积为1 mL。
3.一种基于纳米金催化显色体系的尿素测定方法，其特征是将脲酶溶液加入到0.6 mL含不同浓度尿素的浓度为10 mmoL/L，pH=6.40的磷酸缓冲液中，摇匀后37°C温浴30分钟，反应结束后，加入0.2 mL质量分数为 30%的过氧化氢溶液、0.05 mL浓度为16 mmoL/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和0.10 mL纳米金溶液，混合均匀后37°C温浴10分钟，立即加入0.2 mL 体积分数为20%的硫酸溶液终止反应，测定吸光度值A450，随着尿素浓度的增大显色体系的A450值逐渐减小，在0.02~0.4 mmoL/L浓度范围内，显色体系的A450值与尿素浓度呈线性关系，检测限为0.005 mmoL/L；所使用的纳米金采用柠檬酸三钠还原法制得：1毫升0.1 g/L的氯金酸溶液溶解于100毫升水中，回流加热煮沸后迅速加入3毫升0.1 g/L的柠檬酸三钠溶液，反应溶液由从浅黄色变成酒红色，继续回流15分钟后，将反应溶液慢慢冷却至室温，所得的纳米金粒径为13 nm，浓度为3.1 nmoL/L，4 °C保存。
4.根据权利要求3所述的基于纳米金催化显色体系的尿素测定方法，其特征是所使用的脲酶溶液的体积为0.05 mL，浓度为18 U/mL。
5.一种基于纳米金催化显色体系的人尿液中尿素测定方法，包括如下步骤：取新鲜人尿液，调节pH至6.40后，用10 mmoL/L，pH=6.40的磷酸缓冲液稀释400倍，取0.1 mL稀释液加入到0.5 mL浓度为10 mmoL/L，pH=6.40的磷酸缓冲液中，再加入0.05 mL 18 U/mL的脲酶溶液，摇匀后37°C温浴30分钟，反应结束后，加入0.2 mL质量分数为 30%的过氧化氢溶液、0.05 mL浓度为16 mmoL/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和0.10 mL纳米金溶液，混合均匀后37°C温浴10分钟，立即加入0.2 mL体积分数为 20%的硫酸溶液终止反应，测定吸光度值A450，通过标准曲线进行定量，获得尿液中的尿素含量。
6.根据权利要求5所述的基于纳米金催化显色体系的人尿液中尿素测定方法，其特征是所使用的纳米金采用柠檬酸三钠还原法制得：1毫升0.1 g/L的氯金酸溶液溶解于100毫升水中，回流加热煮沸后迅速加入3毫升0.1 g/L的柠檬酸三钠溶液，反应溶液由从浅黄色变成酒红色，继续回流15分钟后，将反应溶液慢慢冷却至室温，所得的纳米金粒径为13 nm，浓度为3.1 nmoL/L，4 °C保存。
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