CN103512855A

CN103512855A - 还原型谷胱甘肽的检测方法

Info

Publication number: CN103512855A
Application number: CN201310449795.XA
Authority: CN
Inventors: 赖萃; 曾光明; 黄丹莲; 晏铭; 赵美花; 许飘; 黄超; 李宁杰; 危臻; 张辰; 李雪; 徐娟娟
Original assignee: Hunan University
Current assignee: Hunan University
Priority date: 2013-09-27
Filing date: 2013-09-27
Publication date: 2014-01-15
Anticipated expiration: 2033-09-27
Also published as: CN103512855B

Abstract

本发明公开了一种还原型谷胱甘肽的检测方法，包括以下步骤：将含纳米金颗粒的溶液和氯金酸溶液分别用缓冲溶液稀释后再混合，然后加入表面活性剂溶液混匀，向所得混合溶液中加入待测溶液，静置5min～10min后，再加入H₂O₂水溶液形成反应体系并启动反应，反应完成后，对所得产物体系的紫外可见吸收光谱进行检测，根据检测所得产物体系的紫外可见吸收光谱中520nm处的吸光度变化定性判断待测溶液中是否含有还原型谷胱甘肽，通过已测定的线性回归方程定量检测待测溶液中还原型谷胱甘肽的含量。本发明的检测方法灵敏度高、简单方便、且成本低廉。

Description

还原型谷胱甘肽的检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域中测定氨基酸的方法，尤其涉及一种还原型谷胱甘肽的检测方法。

背景技术

谷胱甘肽（glutathiose,r-glutamyl cysteingl+glycine,GSH）是一种含γ-酰胺键和巯基的三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成，存在于几乎身体的每一个细胞。谷胱甘肽有还原型（GSH）和氧化型（GSSG）两种形式；还原型谷胱甘肽（Glutathione,GSH）是生物体内的主要抗氧化剂，能抵抗氧化剂对硫氢基的破坏作用，保护细胞膜中含硫氢基的蛋白质和酶不被氧化。当细胞内生成少量H₂O₂时，GSH在谷胱甘肽过氧化物酶的作用下，把H₂O₂还原成水，其自身被氧化成氧化型谷胱甘肽（GSSG）。有报道称儿童自闭症的发展与体内氧化应激水平有关，而多种人体疾病以及衰老也被指与体内氧化应激水平有明显关联。因此生物体内氧化应激水平在疾病预防等领域成为一项关键检测指标，而由于谷胱甘肽特殊的生物学功能，其含量成为细胞体内氧化应激水平的指示剂。因此，建立一种能快速高效检测谷胱甘肽含量的方法显得尤为重要。

目前，对于还原型谷胱甘肽的检测方法有酶法、荧光法、电化学测定方法、高效液相色谱法、红外检测分析法等。较常用的方法是基于Ellman试剂（5,5’-二硫代双（2-硝基苯甲酸），DTNB）与巯基反应的DTNB检测方法，但是该方法由于测定误差使精确度受限，基于该方法建立的谷胱甘肽还原酶循环法需要使用价格昂贵的辅酶，应用也有所限制。荧光法的反应速度快、灵敏度高，但容易受干扰亦有其局限；电化学测定方法也有电极制作成本较高等限制。因此，虽然已建立了多种测定还原型谷胱甘肽的方法，但是研究一种灵敏度高、简单、成本低廉的测定还原型谷胱甘肽的方法仍具有较高科学价值和实用价值，也成为了本领域的研究热点之一。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种灵敏度高、简单方便、成本低廉的还原型谷胱甘肽的检测方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为一种还原型谷胱甘肽的检测方法，包括以下步骤：

将含纳米金颗粒的溶液和氯金酸溶液分别用缓冲溶液稀释后再混合，然后加入表面活性剂溶液混匀，向所得混合溶液中加入待测溶液，静置5min～10min后，再加入H₂O₂水溶液形成反应体系并启动反应，反应完成后，对所得产物体系的紫外可见吸收光谱进行检测，根据检测所得产物体系的紫外可见吸收光谱中520nm处的吸光度变化定性判断待测溶液中是否含有还原型谷胱甘肽，通过已测定的线性回归方程定量检测待测溶液中还原型谷胱甘肽的含量。

上述的检测方法中，所述线性回归方程为y=-0.0002x+0.3967，其中，y为所述产物体系的紫外可见吸收光谱中520nm处的吸光度，x为所述待测溶液中还原型谷胱甘肽的含量，单位为nM。

上述的检测方法中，所述线性回归方程中还原型谷胱甘肽的检测范围为13nM～1333nM。

上述的检测方法中，所述纳米金颗粒主要由以下方法制备得到：所述纳米金颗粒主要由以下方法制备得到：将质量分数为0.01%～0.02%的氯金酸溶液加热至沸腾并保持沸腾状态2min～5min，然后一边搅拌沸腾的氯金酸溶液一边快速加入柠檬酸钠溶液，搅拌速度为1000r/min～1500r/min，搅拌过程中持续加热并保持搅拌速度不变，直至所得溶液颜色由初始的淡黄色转为橘红色时停止加热，继续搅拌15min～20min，制得含纳米金颗粒的溶液。

上述的检测方法中，优选的，所述反应体系的初始成分中，所述氯金酸的摩尔浓度为20μM～500μM，所述纳米金颗粒的摩尔浓度为0.005875nM～0.0235nM，所述H₂O₂的摩尔浓度为100μM～400μM。

上述的检测方法中，优选的，所述反应体系的初始成分中，所述氯金酸、纳米金颗粒、H₂O₂的摩尔比为1∶1.175×10^-7∶2。

上述的检测方法中，所述表面活性剂优选十六烷基三甲基氯化铵，所述表面活性剂的摩尔浓度优选1μM～3μM。

上述的检测方法中，所述反应的条件优选为：反应温度25℃～35℃，pH值6.5～7.0，反应时间20min～25min。

上述的检测方法中，优选的，所述缓冲溶液为PBS缓冲溶液，所述PBS缓冲溶液的浓度优选0.5mM～1mM。

上述的检测方法中，优选的，所述纳米金颗粒的粒径为15nm～45nm，所述纳米金颗粒的Zeta电位为-30mV～-40mV。

在本发明中，检测GSH的方法主要是基于GSH对纳米金颗粒的催化扩增反应的干扰。纳米金颗粒能作为催化剂促进H₂O₂与氯金酸之间的氧化还原反应，反应结果是氯金酸被还原出新的纳米金颗粒，增加了体系中原有的纳米金颗粒的粒径，从而改变了其表面等离子体共振吸收。而GSH的特殊结构使其可通过–SH以及–COO^-等多种基团与纳米金颗粒或氯金酸配位螯合，且GSH的结构使其具有强大的空间位阻效应干扰上述反应，使得纳米金颗粒催化扩增反应后的表面等离子体共振吸收峰520nm处强度随体系中的GSH浓度发生相应的变化，从而达到检测目的。

在上述初始反应液中，原料摩尔用量的确定是通过以下各组反复的优化实验进行确定的。

纳米金颗粒用量的优化：取不同摩尔浓度的含纳米金颗粒的溶液各1mL，分别加入1mL氯金酸溶液，混匀后再加入0.6mL的10μM十六烷基三甲基氯化铵（CTAC）溶液，向所得混合溶液中加入0.2mL含还原型谷胱甘肽的溶液，静置5min后再加入0.2mL H₂O₂水溶液形成反应体系并启动反应，反应20min后，用紫外分光光度计检测加入不同摩尔浓度纳米金颗粒得到的各产物体系的紫外可见吸收光谱。在前述反应体系的初始成分中，氯金酸的浓度为20μM，CTAC的浓度为2μM，H₂O₂的浓度为200μM，还原型谷胱甘肽的浓度为6660nM。用PBS缓冲溶液代替前述检测步骤中的含还原型谷胱甘肽的溶液重复前述过程，得到空白对照检测结果。如图1～图5所示，C1～C6为反应体系初始成分中纳米金颗粒的浓度C_Au，分别为：0.001469、0.002938、0.005875、0.01175、0.0235、0.047nM。由图1～图4可以看出，随着溶液体系中纳米金颗粒浓度的增加，空白对照及含还原型谷胱甘肽的溶液体系的紫外可见吸收光谱中520nm处的吸光度均逐渐增强，然而由于GSH与纳米金、金离子的螯合及其空间位阻效应，不同纳米金颗粒浓度下的520nm处吸光度均小于空白对照体系。但是从图5可看出，在纳米金颗粒浓度逐渐增加的同时，空白对照体系与含GSH的溶液体系的520nm处吸光度差值在C4（即纳米金颗粒浓度达到0.01175nM）时达到最大值，之后逐渐下降。这说明在该纳米金颗粒浓度下反应完全，过少的纳米金颗粒浓度没有完全催化反应，使得空白对照体系与含GSH体系差值不明显；过高的纳米金颗粒浓度会打破原有含GSH体系中GSH对纳米金颗粒的螯合及其空间位阻效应，使含GSH体系520nm处吸光度增高，从而造成空白对照体系与含GSH体系差值变小。由于本发明的原理是基于GSH对纳米金颗粒催化扩增反应的干扰，所以，至加入H₂O₂溶液后的反应体系初始成分中优选0.005875nM～0.0235nM纳米金颗粒进行后续实验，其中0.01175nM纳米金颗粒浓度为最优选。

氯金酸用量的优化：取不同摩尔浓度的氯金酸溶液各1mL，分别加入1mL纳米金颗粒溶液，混匀后再加入0.6mL的10μM CTAC溶液，向所得混合溶液中加入0.2mLGSH溶液，静置5min后加入0.2mL H₂O₂水溶液形成反应体系启动反应，反应20min后，用紫外分光光度计检测加入不同摩尔浓度氯金酸得到的各产物体系的紫外可见吸收光谱。在前述反应体系的初始成分中，纳米金颗粒的浓度为0.01175nM，CTAC的浓度为2μM，H₂O₂的浓度为200μM，GSH的浓度为6660nM。用PBS缓冲溶液代替前述检测步骤中的GSH溶液重复前述过程，得到空白对照检测结果。如图6～图10所示，C1～C6为反应体系初始成分中氯金酸的浓度（图中以CAuCl₄ ^-1代表），分别为：1、4、20、100、500、1000μM。由图6～图9可以看出，随着溶液体系中氯金酸浓度的增加，空白对照体系及含GSH体系的紫外可见吸收光谱中520nm处的吸光度都逐渐增强，然而由于GSH与氯金酸金离子也具有螯合及其空间位阻效应，不同氯金酸浓度下的520nm处吸光度均小于空白对照体系。但是从图10可看出，在氯金酸浓度逐渐增加的同时，空白对照体系与含GSH体系的520nm处吸光度差值在C4（即氯金酸浓度达到100μM）时达到最大值，之后逐渐下降，这说明在该氯金酸浓度下反应完全。作为纳米金催化扩增反应的主要反应物之一，与纳米金浓度对检测效果的影响一样，过少或过多的氯金酸都可能影响GSH对纳米金催化扩增反应的干扰效果，使得空白对照体系与含GSH体系差值不明显。因此，至加入H₂O₂溶液后的反应体系初始成分中优选20μM～500μM作为氯金酸浓度进行后续实验，其中最优选100μM作为氯金酸浓度。

H₂O₂用量的优化：取1mL纳米金颗粒溶液加入1mL氯金酸溶液，混匀后再加入0.6mL的10μM CTAC溶液，向所得混合溶液中加入0.2mL含GSH的溶液，静置5min后加入0.2mL不同摩尔浓度的H₂O₂水溶液形成反应体系并启动反应，反应20min后，用紫外分光光度计检测加入不同摩尔浓度H₂O₂得到的各产物体系的紫外可见吸收光谱。在前述反应体系的初始成分中，纳米金颗粒的浓度为0.01175nM，氯金酸的浓度为100μM，CTAC的浓度为2μM，GSH的浓度为6660nM。用PBS缓冲溶液代替前述检测步骤中的GSH溶液重复前述过程，得到空白对照检测结果。如图11～图15所示，C1～C6为溶液体系中H₂O₂的浓度（即CH₂O₂），分别为：40、80、100、200、400、1000μM。由图11～14可以看出，随着溶液体系中H₂O₂浓度的增加，空白对照体系及含GSH体系的紫外可见吸收光谱中520nm处的吸光度都逐渐增强。但是从图15可看出，在H₂O₂浓度逐渐增加的同时，空白对照体系与含GSH体系的520nm处吸光度差值在C4（即H₂O₂浓度达到200μM）时达到最大值，之后逐渐下降，这说明在该H₂O₂浓度下反应完全。作为纳米金催化扩增反应的主要反应物之一，与纳米金以及氯金酸浓度对检测效果的影响一样，过少或过多的H₂O₂都可能影响GSH对纳米金催化扩增反应的干扰效果，使得空白对照体系与含GSH体系差值不明显。因此，至加入H₂O₂溶液后的反应体系初始成分中优选100μM～400μM的H₂O₂浓度进行后续实验，其中最优选200μM作为H₂O₂浓度。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

本发明的检测方法灵敏度高、特异性强、简单、成本低廉，操作方便、不需要特殊的昂贵仪器、且具有对环境无害的特点。本发明的检测方法可有效应用于还原型谷胱甘肽的定量检测，拓宽了检测方法的选择范围。

附图说明

图1为本发明中加入不同摩尔浓度纳米金颗粒得到的空白对照体系的紫外可见吸收光谱。

图2为本发明中加入不同摩尔浓度纳米金颗粒得到的空白对照体系在520nm处的吸光度。

图3为本发明中加入不同摩尔浓度纳米金颗粒得到的含GSH产物体系的紫外可见吸收光谱。

图4为本发明中加入不同摩尔浓度纳米金颗粒的含GSH产物体系在520nm处的吸光度。

图5为本发明中加入不同摩尔浓度纳米金颗粒的空白对照体系与含GSH产物体系在520nm处吸光度的差值。

图6为本发明中加入不同摩尔浓度氯金酸的空白对照体系的紫外可见吸收光谱。

图7为本发明中加入不同摩尔浓度氯金酸的空白对照体系在520nm处的吸光度。

图8为本发明中加入不同摩尔浓度氯金酸的含GSH产物体系的紫外可见吸收光谱。

图9为本发明中加入不同摩尔浓度氯金酸的含GSH产物体系在520nm处的吸光度。

图10为本发明中加入不同摩尔浓度氯金酸的空白对照体系与含GSH产物体系在520nm处吸光度的差值。

图11为本发明中加入不同摩尔浓度H₂O₂的空白对照体系的紫外可见吸收光谱。

图12为本发明中加入不同摩尔浓度H₂O₂的空白对照体系在520nm处的吸光度。

图13为本发明中加入不同摩尔浓度H₂O₂的含GSH产物体系的紫外可见吸收光谱。

图14为本发明中加入不同摩尔浓度H₂O₂的含GSH产物体系在520nm处的吸光度。

图15为本发明中加入不同摩尔浓度H₂O₂的空白对照体系与含GSH产物体系在520nm处吸光度的差值。

图16为本发明实施例中建立线性回归方程时加入不同摩尔浓度GSH得到的各产物体系的紫外可见吸收光谱。

图17为本发明实施例中建立线性回归方程时GSH溶液中GSH的摩尔浓度与产物体系在520nm处吸光度的线性关系图。

图18为本发明实施例中加入不同种氨基酸的产物体系在520nm处的吸光度对比图，其中，A为空白对照样，B为丝氨酸溶液，C为缬氨酸溶液，D为天冬氨酸溶液，E为甘氨酸溶液，F为苏氨酸溶液，G为丙氨酸溶液，H为还原型谷胱甘肽溶液。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。

实施例：

一种本发明的还原型谷胱甘肽的检测方法，包括以下步骤：

（1）纳米金颗粒的制备：取0.1g/L的氯金酸溶液（溶剂为水）100mL于磁力搅拌器上加热至沸腾并保持沸腾状态2min，然后一边搅拌沸腾的氯金酸溶液一边快速加入质量浓度为10g/L的柠檬酸钠溶液6mL，搅拌速度为1000r/min，搅拌过程中持续加热并保持搅拌速度不变，直至所得溶液颜色由初始的淡黄色转为橘红色后停止加热，继续搅拌15min，在室温（一般指25℃～35℃）下冷却后，制得含纳米金颗粒的溶液。

（2）建立线性回归方程：用1mM的PBS缓冲溶液稀释上述制得的含纳米金颗粒的溶液，调节其浓度为0.03525nM；再用1mM的PBS缓冲溶液稀释氯金酸溶液，调节其浓度为300μM，将稀释后的含纳米金颗粒的溶液和稀释后的氯金酸溶液各取1mL混合后，再加入0.6mL摩尔浓度为10μM的CTAC溶液混匀，得到混合溶液，共制备8份同样的混合溶液。将还原型谷胱甘肽（购自Sigma-Aldrich）用1mM的PBS溶液进行稀释，得到摩尔浓度为10、13、33、67、133、333、667、1333、3333、6667nM的还原型谷胱甘肽溶液（GSH溶液）。向前述8份混合溶液中加入0.2mL前述不同摩尔浓度的GSH溶液，静置5min后加入0.2mL摩尔浓度为3000μM的H₂O₂水溶液形成反应体系并启动反应，在反应体系的初始成分中，氯金酸、纳米金颗粒、CTAC、H₂O₂的摩尔浓度分别为100μM、0.01175nM、2μM、200μM，反应20min后，检测各组产物体系的紫外可见吸收光谱。如图16所示，加入不同浓度GSH得到的产物体系在520nm处的吸光度随GSH浓度的增加，逐渐减小至稳定，也因此证实了可以使用产物体系的紫外可见吸收光谱在520nm处吸光度作为还原型谷胱甘肽的定量检测指标。如图17所示，通过测定一系列含不同摩尔浓度的GSH的产物体系的紫外可见吸收光谱，得出GSH溶液中GSH的摩尔浓度与产物体系在520nm处吸光度之间呈线性关系的范围为13nM～1333nM，线性回归方程为y=-0.0002x+0.3967；y为产物体系的紫外可见吸收光谱中520nm处的吸光度，x为GSH溶液中GSH的含量（即摩尔浓度，单位nM），相关系数为0.9853，并通过测量三次空白试验标准偏差计算得本检测方法的检出限为7nM。将检出限7nM代入上述线性回归方程中，得到溶液中GSH的含量在检出限时产物体系在520nm处的吸光度为0.3953，可根据该吸光度定性判断溶液中是否含有GSH。

当待测溶液（取代上述的还原型谷胱甘肽溶液）加入本发明的反应体系中，所得产物体系在520nm处的吸光度小于0.3953时即可定性判断待测溶液中含有GSH，将产物体系在520nm处的吸光度代入上述线性回归方程，即可计算得出待测溶液中还原型谷胱甘肽的含量。

（3）特异性测定：分别配制浓度为0.6mM的丝氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸溶液，用前述溶液替代上述步骤（2）中的GSH溶液，检测步骤和其它成分及浓度与上述步骤（2）所列条件均相同，反应完成后，检测各产物体系的紫外可见吸收光谱，以空白对照（用1mM PBS缓冲溶液替代GSH溶液）和加入3333nM GSH溶液的反应体系为对照。结果如图18所示，3333nM的GSH即可对纳米金颗粒催化扩增反应造成明显干扰，产物体系的紫外可见吸收光谱在520nm处吸光度明显下降，而其它氨基酸类物质在0.6mM的浓度下没有对纳米金颗粒催化扩增反应起明显干扰作用。由于其它氨基酸物质通常只通过单一的基团与金属原子螯合，而GSH的结构使其具有强大的空间位阻效应，使得GSH与其它物质相比，与金属原子之间的作用强度更大，对纳米金催化扩增反应的干扰也更强，因此本方法得以特异性检测GSH。

（4）精确度测定：配制已知浓度的GSH标准溶液，分别用上述本发明的方法测定该标准溶液加入反应体系后的紫外可见光吸收光谱，并由此计算标准溶液中的GSH浓度，与已知浓度进行比对，以此检测本方法的精确度。同时采用传统的DTNB方法做对比，检测及计算结果如表1所示：

表1还原型谷胱甘肽检测结果对比

从上述本实施例的测定结果也可以清楚地看出，本方法与传统DTNB测定方法相比，检测结果精确度更高，并且本方法操作简便，灵敏度高、简单、成本低廉，可特异性检测还原型谷胱甘肽，且具有对环境无害的特点，拓宽了其检测方法的选择范围。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应该指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下的改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种还原型谷胱甘肽的检测方法，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述线性回归方程为y=-0.0002x+0.3967，其中，y为所述产物体系的紫外可见吸收光谱中520nm处的吸光度，x为所述待测溶液中还原型谷胱甘肽的含量，单位为nM。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述线性回归方程中还原型谷胱甘肽的检测范围为13nM～1333nM。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述纳米金颗粒主要由以下方法制备得到：将质量分数为0.01%～0.02%的氯金酸溶液加热至沸腾并保持沸腾状态2min～5min，然后一边搅拌沸腾的氯金酸溶液一边快速加入柠檬酸钠溶液，搅拌速度为1000r/min～1500r/min，搅拌过程中持续加热并保持搅拌速度不变，直至所得溶液颜色由初始的淡黄色转为橘红色时停止加热，继续搅拌15min～20min，制得含纳米金颗粒的溶液。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述反应体系的初始成分中，所述氯金酸的摩尔浓度为20μM～500μM，所述纳米金颗粒的摩尔浓度为0.005875nM～0.0235nM，所述H₂O₂的摩尔浓度为100μM～400μM。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述反应体系的初始成分中，所述氯金酸、纳米金颗粒、H₂O₂的摩尔比为1∶1.175×10^-7∶2。

7.根据权利要求1～4中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述表面活性剂为十六烷基三甲基氯化铵，所述表面活性剂的摩尔浓度为1μM～3μM。

8.根据权利要求1～4中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述反应的条件为：反应温度25℃～35℃，pH值6.5～7.0，反应时间20min～25min。

9.根据权利要求1～4中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述缓冲溶液为PBS缓冲溶液，所述PBS缓冲溶液的浓度为0.5mM～1mM。

10.根据权利要求1～4中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述纳米金颗粒的粒径为15nm～45nm，所述纳米金颗粒的Zeta电位为-30mV～-40mV。