TWI628435B - 穀胱甘肽的檢測方法及其套組 - Google Patents

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陳貞文
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Abstract

一種穀胱甘肽的檢測方法，係包含：提供一待測樣品，該待測樣品含有穀胱甘肽；以9-溴甲基丫啶作為一衍生試劑，混合該待測樣品、該衍生試劑及一衍生溶媒以得一待反應混合液，以使該衍生試劑與該待測樣品所含有之穀胱甘肽進行一衍生反應而得一衍生溶液，該衍生溶液含有一穀胱甘肽衍生物；以一陽離子界面活性劑作為一萃取試劑，以萃取該衍生溶液中的穀胱甘肽衍生物並獲得一萃取液；及以該萃取液作為一待測溶液，偵測該待測溶液中的穀胱甘肽衍生物，以獲得一穀胱甘肽強度值。本發明另提供應用於實施前述之穀胱甘肽的檢測方法的檢測套組。

Description

穀胱甘肽的檢測方法及其套組
本發明係關於一種檢測方法，特別關於一種穀胱甘肽的檢測方法，本發明另關於應用於該檢測方法的套組。
穀胱甘肽(glutathione)為動物、植物、真菌及某些細菌、古細菌內的重要抗氧化劑，可以防止自由基、過氧化物及重金屬等活性氧化物質對細胞的重要成分造成損害。請參照第1a及1b圖所示，穀胱甘肽存在有還原型(reduced glutathione，簡稱GSH)及氧化型(oxidized glutathione，簡稱GSSG)的兩種型態，當生物體內的氧化壓力(oxidative stress)增加時，還原型穀胱甘肽會受到穀胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase)的催化而轉變為氧化型穀胱甘肽，是以藉由監測生物體內還原型穀胱甘肽與氧化型穀胱甘肽的含量比，有助於評斷生物體內氧化壓力的大小，進而可以應用於糖尿病、帕金森氏症及老化等疾病的早期診斷。
習用之穀胱甘肽的檢測方法中，為了提升檢測的靈敏度，會使穀胱甘肽的硫醇基(thiol group)與一衍生試劑進行一衍生反應；舉例而言，N-乙基順丁烯二酰亞胺(N-ethylmaleimide，簡稱NEM)及5,5二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid)，簡稱DTNB)雖都可以作為與穀胱甘肽進行該衍生反應之衍生試劑，惟前者所形成之衍生物的安定性不佳，後者的衍生效率不佳，均影響後續的檢測分析效益，因而習用之穀胱甘肽的檢測方法仍有加以改善之必要。
為解決上述問題，本發明提供一種穀胱甘肽的檢測方法，係可以使穀胱甘肽有效地形成安定性良好的穀胱甘肽衍生物，以利於後續檢測分析者。
本發明更提供一種穀胱甘肽的檢測套組，係能夠應用於實施前述之穀胱甘肽的檢測方法者。
本發明之穀胱甘肽的檢測方法，係包含：提供一待測樣品，該待測樣品含有穀胱甘肽；以9-溴甲基丫啶作為一衍生試劑，混合該待測樣品、該衍生試劑及一衍生溶媒以得一待反應混合液，以使該衍生試劑與該待測樣品所含有之穀胱甘肽進行一衍生反應而得一衍生溶液，該衍生溶液含有一穀胱甘肽衍生物，該穀胱甘肽衍生物為硫醇基上置換有一標記之穀胱甘肽，該衍生溶媒為可溶解該衍生試劑及穀胱甘肽之一溶媒；於該衍生溶液中加入一移除干擾溶媒以移除該衍生溶液中多餘的衍生試劑，經由震盪及離心以獲得一水層溶液，該移除干擾溶媒為與該待反應混合液不互溶之一溶媒，該移除干擾溶媒之Log P值介於0.5~2.0之間；及以該水層溶液作為一待測溶液，以紫外光光譜法、螢光光譜法、液相層析法或質譜分析法偵測該待測溶液中的穀胱甘肽衍生物，以獲得一穀胱甘肽強度值；較佳係選擇丙酮、乙腈或二甲基亞碸作為該衍生溶媒；如此藉由以9-溴甲基丫啶作為該衍生試劑，能夠與穀胱甘肽有效地共同形成安定性良好的穀胱甘肽衍生物，進而可以被各種習知方法(例如，紫外光光譜法、螢光光譜法、液相層析法或質譜分析法)偵測其存在，因此本發明之穀胱甘肽的檢測方法具有良好的靈敏度，能夠降低該待測樣品的使用量，為本發明之功效。
本發明之穀胱甘肽的檢測方法，其中，混合該待測樣品、該衍生試劑、該衍生溶媒及一鹼催化劑以得該待反應混合液，以使該衍生試 劑與該待測樣品所含有之穀胱甘肽進行該衍生反應；較佳係選擇氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸氫鈉或碳酸氫鉀作為該鹼催化劑；如此藉由該鹼催化劑所提供的鹼性環境，可以加速穀胱甘肽之硫醇基的去質子化反應，進一步促進該衍生反應的進行。
本發明之穀胱甘肽的檢測方法，其中，以一陽離子界面活性劑作為一萃取試劑，萃取該水層溶液中的穀胱甘肽衍生物並獲得一萃取液，續將該萃取液作為該待測溶液，以獲得該穀胱甘肽強度值；較佳係選擇乙酸乙酯、乙酸正丙酯或乙酸叔丁酯作為該移除干擾溶媒，且選擇三辛基甲基氯化銨、四庚基溴化銨或四辛基溴化銨作為該萃取試劑；如此藉由該移除干擾溶媒可以移除該衍生溶液中多餘的衍生試劑及該衍生試劑的水解產物，並藉由該萃取試劑富集該穀胱甘肽衍生物，而能夠使該穀胱甘肽衍生物更容易被偵測得到該穀胱甘肽強度值。
本發明之穀胱甘肽的檢測方法，其中，混合一血液樣品及一蛋白質沉澱劑，使該血液樣品中的蛋白質形成一蛋白質沉澱物，藉由離心去除該蛋白質沉澱物以獲得一上清液，該上清液即為該待測樣品；較佳係選擇丙酮或乙腈作為該蛋白質沉澱劑；如此藉由該蛋白質沉澱劑去除血液樣品中的蛋白質，可以避免蛋白質對後續衍生反應造成干擾，進而提升該衍生反應的效率。
本發明之穀胱甘肽的檢測方法，其中，混合一血液樣品及一還原試劑，使該還原試劑打斷該血液樣品中的穀胱甘肽的雙硫鍵結，再加入一蛋白質沉澱劑，使該血液樣品中的蛋白質形成一蛋白質沉澱物，藉由離心去除該蛋白質沉澱物以獲得一上清液，該上清液即為該待測樣品；較佳係選擇二硫蘇糖醇作為該還原試劑，且選擇丙酮或乙腈作為該蛋白質沉澱劑；如此不僅藉由該蛋白質沉澱劑去除血液樣品中的蛋白質，可以避免蛋白質對後續衍生反應造成干擾，進而提升該衍生反應的效率外，更藉由 該還原試劑打斷氧化型穀胱甘肽的雙硫鍵結，而使該穀胱甘肽的檢測方法能夠適用於檢測氧化型穀胱甘肽。
基於相同的技術概念下，本發明之穀胱甘肽的檢測套組，用以檢測一待測樣品是否包含穀胱甘肽，該穀胱甘肽的檢測套組係包含：一衍生試劑，該衍生試劑為9-溴甲基丫啶，且用以與該待測樣品中的穀胱甘肽進行一衍生反應以形成一穀胱甘肽衍生物，該穀胱甘肽衍生物為硫醇基上置換有一標記之穀胱甘肽；一衍生溶媒，用以與該待測樣品及該衍生試劑共同形成一待反應混合液，該衍生溶媒為可溶解該衍生試劑及穀胱甘肽之一溶媒；及一移除干擾溶媒，該移除干擾溶媒為與該待反應混合液不互溶之一溶媒，該移除干擾溶媒之Log P值介於0.5~2.0之間；該衍生溶媒較佳為丙酮、乙腈或二甲基亞碸；該移除干擾溶媒較佳為乙酸乙酯、乙酸正丙酯或乙酸叔丁酯；如此該檢測套組係能夠應用於實施前述之穀胱甘肽的檢測方法，有效地與穀胱甘肽共同形成安定性良好的穀胱甘肽衍生物，工者因而可以因應需求選用各種習知方法(例如，紫外光光譜法、螢光光譜法、液相層析法或質譜分析法)來偵測該穀胱甘肽衍生物，為本發明之功效。
本發明之穀胱甘肽的檢測套組，其中，該檢測套組另包含：一鹼催化劑，該鹼催化劑為可溶解於該衍生溶媒之鹼性化合物，且用以提供進行該衍生反應的一鹼性環境；該鹼催化劑較佳為氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸氫鈉或碳酸氫鉀；如此藉由該鹼催化劑所提供的鹼性環境，可以加速穀胱甘肽之硫醇基的去質子化反應，進一步促進該衍生反應的進行。
本發明之穀胱甘肽的檢測套組，其中，該檢測套組另包含：一萃取溶劑，該萃取溶劑為碳數25~32的一陽離子界面活性劑，且用以萃取該穀胱甘肽衍生物；該萃取試劑較佳為三辛基甲基氯化銨、四庚基溴化銨或四辛基溴化銨；如此藉由該移除干擾溶媒可以移除該衍生溶液中多餘 的衍生試劑及該衍生試劑的水解產物，並藉由該萃取試劑富集該穀胱甘肽衍生物，而能夠使該穀胱甘肽衍生物更容易被偵測得到該穀胱甘肽強度值。
〔本發明〕
S1‧‧‧樣品提供步驟
S2‧‧‧衍生步驟
S3‧‧‧移除干擾步驟
S4‧‧‧分析步驟
S5‧‧‧萃取步驟
第1a圖：還原型穀胱甘肽(reduced glutathione)的化學結構式。
第1b圖：氧化型穀胱甘肽(oxidized glutathione)的化學結構式。
第2圖：本發明第一實施例之穀胱甘肽的檢測方法之流程圖。
第3圖：還原型穀胱甘肽與9-溴甲基丫啶之衍生反應的化學方程式。
第4圖：本發明第二實施例之穀胱甘肽的檢測方法之流程圖。
第5圖：本發明第二實施例之穀胱甘肽的檢測方法之不同種類的衍生試劑之測試結果長條圖。
第6a圖：本發明第二實施例之穀胱甘肽的檢測方法之不同種類的鹼催化劑之測試結果長條圖。
第6b圖：本發明第二實施例之穀胱甘肽的檢測方法之不同濃度的氫氧化鈉水溶液(鹼催化劑)之測試結果長條圖。
第7圖：本發明第二實施例之穀胱甘肽的檢測方法之不同種類的移除干擾溶媒之測試結果長條圖。
第8圖：本發明第二實施例之穀胱甘肽的檢測方法之不同種類的萃取溶劑之測試結果長條圖。
第9圖：本發明第一實施例之穀胱甘肽的檢測方法與第二實施例之穀胱甘肽的檢測方法之比較結果，其中，波峰1所示為穀胱甘肽、波峰2所示為衍生試劑之水解產物，且波峰3所示為衍生試劑。
第10圖：本發明第二實施例之穀胱甘肽的檢測方法之不同種類的還原試劑之測試結果長條圖。
為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：請參照第2圖所示，本發明第一實施例的穀胱甘肽的檢測方法大抵可以包含：一樣品提供步驟S1，係提供一待測樣品；一衍生步驟S2，係使該待測樣品所含有之穀胱甘肽與一衍生試劑進行一衍生反應而形成一穀胱甘肽衍生物；一移除干擾步驟S3，係移除過多的衍生試劑；及一分析步驟S4，係偵測該穀胱甘肽衍生物，以獲得一穀胱甘肽強度值。
詳而言之，該樣品提供步驟S1係提供含有穀胱甘肽之待測樣品，工者係可以選用一藥物樣品、一化妝品樣品或一食品樣品作為該待測樣品，亦可以選用來自一哺乳生物之血液樣品(例如一全血樣品、一血漿樣品或一紅血球細胞樣品)作為該待測樣品。
值得注意的是，由於該血液樣品的成分複雜，於進行該衍生步驟S2之前，必須先移除該血液樣品中的蛋白質，進而可以避免蛋白質對後續衍生步驟S2造成干擾，而影響該衍生反應的效益；舉例而言，工者可以先混合該血液樣品及一蛋白質沉澱劑，使該血液樣品中的蛋白質形成一蛋白質沉澱物，並藉由離心(14,800rpm、1分鐘)去除該蛋白質沉澱物以獲得一上清液，該上清液即可以作為後續之衍生步驟S2所使用之待測樣品。於本實施例中，該蛋白質沉澱劑可以為丙酮(acetone)或乙腈(acetonitrile)。
又，第一實施例之穀胱甘肽的檢測方法應用於檢測氧化型穀胱甘肽時，必須額外添加一還原試劑，以打斷氧化型穀胱甘肽的雙硫鍵結，以利後續該衍生步驟S2的進行；舉例而言，工者可以先混合該血液樣品及該還原試劑，藉由微波(750W、1分鐘)使該還原試劑打斷該血液樣品中的氧化型穀胱甘肽的雙硫鍵結，再加入該蛋白質沉澱劑後去除該蛋白質沉澱物則獲得可以作為該待測樣品之上清液。於本實施例中，該還原試劑可 以為二硫蘇糖醇(dithiothreitol，簡稱DTT)，且該還原試劑可以溶解於水中，以形成濃度為0.025~25mM之間的還原試劑溶液。
該衍生步驟S2中，工者係能夠以9-溴甲基丫啶(9-bromomethyl acridine，簡稱Br-MA)作為該衍生試劑，該衍生試劑溶於一衍生溶媒中，並於其中加入該待測樣品而得一待反應溶液，即可以使該待測樣品中所含有之穀胱甘肽與該衍生試劑於該衍生溶媒中進行如第3圖所示之衍生反應，而獲得一衍生溶液，如此，穀胱甘肽之硫醇基能夠進行去質子化反應(deprotonation)並攻擊該衍生試劑，使該衍生試劑之離去基(即，溴基)自該衍生試劑脫離，穀胱甘肽即可以與該衍生試劑共同形成該穀胱甘肽衍生物，該穀胱甘肽衍生物即為硫醇基上置換有一標記之穀胱甘肽；於本實施例中，該衍生溶媒可以為丙酮(acetone)、乙腈(acetonitrile)或二甲基亞碸(dimethyl sulfoxide，簡稱DMSO)，且該衍生試劑可以溶於該衍生溶媒中，以形成濃度為0.25~5mM之間的衍生試劑溶液。值得注意的是，由於前述之蛋白質沉澱劑可以為丙酮或乙腈，在考量到溶媒的相容性之狀況下，該蛋白質沉澱劑及該衍生溶媒較佳可以同樣選擇為丙酮。
該衍生試劑較佳係於一鹼性環境下與穀胱甘肽共同形成該穀胱甘肽衍生物，因此工者於混合該待測樣品、該衍生試劑及該衍生溶媒的同時，可以一併混合一鹼催化劑以得該待反應混合液，以藉由該鹼催化劑加速穀胱甘肽之硫醇基的去質子化反應，進一步促進該衍生反應的進行，該鹼催化劑可以為可溶解於該衍生溶媒之一鹼性化合物；於本實施例中，該鹼催化劑可以為氫氧化鈉(NaOH)、氫氧化鉀(KOH)、碳酸氫鈉(NaHCO3)或碳酸氫鉀(KHCO3)，且該鹼催化劑可以溶解於水中，以形成濃度為0.5~1M之間的鹼催化劑溶液。
為了加速該衍生反應的進行，工者可以對該待反應混合液施 予一能量；舉例而言，工者能夠以微波加熱該待反應混合液，以對該待反應混合液施予該能量，如此該反應液中之偶極分子與離子均會受到微波的作用而旋轉、摩擦進而產生熱能，而增加該反應液中的穀胱甘肽與該衍生試劑的撞擊頻率(collision frequency)，因而可以快速地形成該穀胱甘肽衍生物。於本實施例中，工者係能夠以100~750W之微波瓦數微波加熱該待反應混合液0.5~9分鐘。
該移除干擾步驟S3係於該衍生溶液中加入一移除干擾溶媒，該移除干擾溶媒與該待反應混合液及該衍生溶液不互溶，進而可以於震盪及離心後發生分層，因而工者可以取得包含有該穀胱甘肽衍生物之層，並移除該衍生溶液中多餘的衍生試劑、該衍生試劑的水解產物及其他干擾物質；於本實施例中，該移除干擾溶媒的Log P值約介於0.5~2.0之間，例如可以為乙酸乙酯、乙酸正丙酯或乙酸叔丁酯，並且於該衍生溶液中加入該移除干擾溶媒後，經由震盪及離心(14,800rpm、1分鐘)以獲得一有機層溶液及一水層溶液，並取該水層溶液進行後續之分析步驟S4。
接著，於該分析步驟S4中，工者即可以將該水層溶液作為一待測溶液，利用各種習知方法來偵測該待測溶液中的穀胱甘肽衍生物，以獲得一穀胱甘肽強度值，並以該穀胱甘肽強度值來評估該待測樣品中是否包含穀胱甘肽，甚或是該待測樣品中的穀胱甘肽之含量多寡；詳而言之，工者係能夠以液相層析法或質譜分析法來偵測該待測溶液中的穀胱甘肽衍生物；例如係以毛細管液相層析法(capillary high performance liquid chromatography，簡稱CapLC)進行偵測，或者以奈米化液相層析法串聯質譜分析法進行偵測；又，由穀胱甘肽與該衍生試劑所共同形成之穀胱甘肽衍生物亦可以藉由紫外光光譜法、螢光光譜法來進行偵測，亦可以獲得該穀胱甘肽強度值。
此外，本發明第二實施例的穀胱甘肽的檢測方法與前述第一 實施例大抵相同，其主要差異在於：於移除干擾步驟S3後，優先進行一萃取步驟S5，續進行該分析步驟S4。
詳而言之，該萃取步驟S5中，係將一陽離子界面活性劑作為一萃取溶劑，將該萃取溶劑加入該水層溶液中，由於穀胱甘肽具有羧酸基(carboxyl group，即-COOH)，該穀胱甘肽衍生物於該水層溶液中會解離形成羧酸根離子(carboxylate anion，即-COO-)，透過該萃取溶劑所帶有之正電荷吸引該穀胱甘肽衍生物之羧酸根離子的負電荷，以自該水層溶液中萃取該穀胱甘肽衍生物而獲得一萃取液；又，該萃取溶劑之碳數可以選擇為25~32個，進而使該萃取溶劑可以與該穀胱甘肽衍生物之間除靜電吸引力外亦可以形成疏水性作用力，更有助於萃取該穀胱甘肽衍生物。於本實施例中，該萃取試劑可以為三辛基甲基氯化銨(trioctylmethylammonium chloride，簡稱A336)、四庚基溴化銨(tetraheptylammonium bromide，簡稱THepAB)或四辛基溴化銨(tetraoctylammonium bromide，簡稱TOAB)，且該萃取試劑可以溶於甲醇中，以形成濃度為1.5~3.5M之萃取試劑溶液。
依據前述，基於相同的技術概念下，本發明之一實施例的穀胱甘肽的檢測套組可以包含：該衍生試劑、該衍生溶媒及該移除干擾溶媒，該衍生試劑為9-溴甲基丫啶，且用以與穀胱甘肽進行該衍生反應而能夠共同形成該穀胱甘肽衍生物，該衍生溶媒為可以溶解該衍生試劑及穀胱甘肽之一溶媒，例如丙酮、乙腈或二甲基亞碸，該移除干擾溶媒為與該待反應混合液及該衍生溶液不互溶之一溶媒，以移除該衍生溶液中多餘的衍生試劑以及該衍生試劑的水解產物，該移除干擾溶媒之Log P值較佳約介於0.5~2.0之間，例如乙酸乙酯、乙酸正丙酯或乙酸叔丁酯。
該穀胱甘肽的檢測套組可以另包含：該鹼催化劑，該鹼催化劑為可以溶於該衍生溶媒之一鹼性化合物，且用以提供進行該衍生反應的該鹼性環境，例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸氫鈉或碳酸氫鉀。
此外，該穀胱甘肽的檢測套組亦可以包含：該萃取溶劑，該萃取溶劑為碳數25~32的一陽離子界面活性劑，且用以萃取該穀胱甘肽衍生物，例如三辛基甲基氯化銨、四庚基溴化銨或四辛基溴化銨。
為證實本發明第二實施例之穀胱甘肽的檢測方法係能夠用以檢測紅血球細胞樣品中所含之穀胱甘肽的含量，遂配製濃度為40μM之穀胱甘肽作為標準品，續混合該紅血球細胞樣品(15μL)、穀胱甘肽(120μL)及丙酮(165μL，作為該蛋白質沉澱劑使用)，經震盪及離心以取得上清液以作為該待測樣品；將該待測樣品(280μL)混合9-溴甲基丫啶(0.5mM溶於該衍生溶媒中、35μL)及該鹼催化劑(0.5M溶於水中、5μL)以得該待反應混合液，以微波瓦數550W微波加熱該待反應混合液1分鐘，以得該衍生溶液；於該衍生溶液中加入該移除干擾溶媒(350μL)，經震盪離心後取得該水層溶液，並於該水層溶液中加入該萃取溶劑(1.5M溶於甲醇、25μL)，經震盪離心後取得該萃取液(8μL)；將該萃取液以甲醇稀釋至25μL，最終取0.5μL之萃取液作為該待測溶液，並利用毛細管液相層析法進行偵測，以獲得該穀胱甘肽強度值。
(A)衍生試劑的選擇
本試驗各組之衍生試劑係分別選用9-溴甲基丫啶(Br-MA，第A1組)、4-溴甲基聯苯(Br-MMP，第A2組)、7-乙醯氧基-4-溴甲基香豆素(Br-MAC，第A3組)、2-溴甲基萘(Br-MN，第A4組)、3-溴甲基-7-甲氧基-1,4-苯並惡嗪-2-酮(Br-MMB，第A5組)、1-(溴乙醯)芘(Br-AP，第A6組)、3-(溴乙醯基)香豆素(Br-AC，第A7組)及2-溴甲基-6-甲基吡啶(Br-MP，第A8組)，其餘條件均如上所述。其結果如第5圖所示，相較於使用第A1組之衍生試劑所獲得的穀胱甘肽強度值，其他各組的穀胱甘肽強度值均無法測得，顯示以9-溴甲基丫啶作為該衍生試劑對於第二實施例之穀胱甘肽的檢測方法具有較佳的效果。
(B)鹼催化劑的選擇
本試驗各組之鹼催化劑係分別選用氫氧化鈉(NaOH，第B1組)、氫氧化鉀(KOH，第B2組)、碳酸氫鈉(NaHCO3，第B3組)或碳酸氫鉀(KHCO3，第B4組)，其餘條件均如上所述。其結果如第6a圖所示，相較於第B1、B2組之鹼催化劑所測得的穀胱甘肽強度值，第B3、B4組之鹼催化劑所測得的穀胱甘肽強度值明顯下降，顯示以氫氧化鈉及氫氧化鉀作為該鹼催化劑對於第二實施例之穀胱甘肽的檢測方法具有較佳的效果，其中又以氫氧化鈉為佳。
續針對前述之鹼催化劑的濃度進行進一步之測試。係分別選用濃度為0.05M(第B1-1組)、0.1M(第B1-2組)、0.5M(第B1-3組)、1M(第B1-4組)、2.5M(第B1-5組)及5M(第B1-5組)之氫氧化鈉，其餘試驗條件均如上所述。其結果如第6b圖所示，第B1-3組之濃度為0.5M之氫氧化鈉所測得的鹼催化劑強度值明顯優於其餘各組所測得的鹼催化劑強度值。
(C)移除干擾溶媒的選擇
本試驗各組之移除干擾溶媒係分別選用乙酸乙酯(EA，第C1組)、乙酸正丙酯(PA，第C2組)及乙酸叔丁酯(BA，第C3組)，其餘條件均如上所述。其結果如第7圖所示，以使用第C3組之移除干擾溶媒最能夠去除該衍生溶液中多餘的衍生試劑(Br-MA)及該衍生試劑的水解產物(MA-OH)，因而能夠獲得最大的穀胱甘肽強度值(GSH衍生物)，顯示以乙酸叔丁酯作為該移除干擾溶媒對於第二實施例之穀胱甘肽的檢測方法具有較佳的效果。
(D)萃取溶劑的選擇
本試驗各組之萃取溶劑係分別選用四己基溴化銨(THAB，第D1組)、三辛基甲基氯化銨(A336，第D2組)、四庚基溴化銨(THepAB， 第D3組)及四辛基溴化銨(TOAB，第D4組)，其餘條件均如上所述。其結果如第8圖所示，以三辛基甲基氯化銨作為該萃取溶劑對於第二實施例之穀胱甘肽的檢測方法具有較佳的效果。
接著進行本發明第一實施例之穀胱甘肽的檢測方法與第二實施例之穀胱甘肽的檢測方法之間的比較。
(E)移除干擾步驟及萃取步驟的加乘效果
本試驗係以未進行該移除干擾步驟S3及該萃取步驟S5的衍生溶液作為第E1組之待測溶液，以僅進行該移除干擾步驟S3，未進行該萃取步驟S5所得之水層溶液作為第E2組之待測溶液，及以依序進行該移除干擾步驟S3及該萃取步驟S5所得之萃取液作為第E3組之待測溶液；並利用毛細管液相層析法分析前述待測溶液(即，第E2組之結果為第一實施例之穀胱甘肽的檢測方法，第E3組之結果為第二實施例之穀胱甘肽的檢測方法)，其結果如第9圖所示，相較於第E1組之待測溶液的分析結果，第E2組之待測溶液已減少許多波峰，顯示該移除干擾步驟S3的進行有助於移除該衍生溶液中多餘的衍生試劑等干擾物質，而第E3組之待測溶液則可以更加提升代表該穀胱甘肽衍生物之波峰，顯示該移除干擾步驟S3及該萃取步驟S5的依序進行對於第二實施例之穀胱甘肽的檢測方法具有加乘的效果。
此外，為證實本發明第二實施例之穀胱甘肽的檢測方法亦能夠用以檢測紅血球細胞樣品中所含有之氧化型穀胱甘肽的含量，遂混合該紅血球細胞樣品(15μL)、穀胱甘肽(40μM、120μL)及該還原試劑(20μL)，藉由微波(750W、1分鐘)使該還原試劑打斷氧化型穀胱甘肽的雙硫鍵結，續加入丙酮(165μL，作為該蛋白質沉澱劑使用)，經震盪及離心以取得上清液以作為該待測樣品；將該待測樣品(280μL)混合9-溴甲基丫啶(0.5mM溶於該衍生溶媒中、35μL)及氫氧化鈉(0.5M溶於水中、 5μL，作為該鹼催化劑使用)以得該待反應混合液，以微波瓦數550W微波加熱該待反應混合液1分鐘，以得該衍生溶液；於該衍生溶液中加入乙酸叔丁酯(350μL，作為該移除干擾溶媒使用)，經震盪離心後取得該水層溶液，並於該水層溶液中加入三辛基甲基氯化銨(1.5M溶於甲醇、25μL，作為該萃取溶劑使用)，經震盪離心後取得該萃取液(8μL)；將該萃取液以甲醇稀釋至25μL，最終取5μL之萃取液作為該待測溶液，並利用毛細管液相層析法進行偵測，以獲得該穀胱甘肽強度值。
(F)還原試劑的選擇
本試驗各組之還原試劑係分別選用二硫蘇糖醇(DTT，第F1組)及三(2-羰基乙基)磷鹽酸鹽(TCEP，第F2組)，其餘條件均如上所述。其結果如第10圖所示，以二硫蘇糖醇作為該還原試劑對於本實施例之穀胱甘肽的檢測方法具有較佳的效果。
(G)人類紅血球樣品中的穀胱甘肽的檢測結果
本試驗係取來自五個不同健康成人個體之紅血球樣品，於其中分別添加不同量(0、0.12、0.6、2.4及4.8nmol)之穀胱甘肽，並依前述的穀胱甘肽的檢測方法進行偵測並獲得該穀胱甘肽強度值，最終換算各健康成人個體之紅血球樣品中的穀胱甘肽的含量，其結果如第1表所示。
請參照第1表所示，係以未加入該還原試劑時所得之穀胱甘肽強度值換算為該紅血球樣品中的還原型穀胱甘肽(GSH)的含量，並以加入該還原試劑時所得之穀胱甘肽強度值換算為該紅血球樣品中的總穀胱甘肽(tGSH)的含量，該紅血球樣品中的氧化型穀胱甘肽(GSSG)的含量則係以總穀胱甘肽(tGSH)的含量扣除還原型穀胱甘肽(GSH)的含量所計算獲得。又，經由上述計算所得之還原型穀胱甘肽含量與氧化型穀胱甘肽含量的比值(GSH/GSSG)為9.15~12.01之間，符合健康成人的比值。
依據上述，本發明之穀胱甘肽的檢測方法，係藉由以9-溴甲基丫啶作為該衍生試劑，能夠與穀胱甘肽有效地共同形成安定性良好的穀胱甘肽衍生物，進而可以被各種習知方法(例如，紫外光光譜法、螢光光譜法、液相層析法或質譜分析法)偵測其存在，因此本發明之穀胱甘肽的檢測方法具有良好的靈敏度，能夠降低該待測樣品的使用量，為本發明之功效。
再者，本發明之穀胱甘肽的檢測套組，係能夠應用於實施前述之穀胱甘肽的檢測方法，有效地與穀胱甘肽共同形成安定性良好的穀胱甘肽衍生物，工者因而可以因應需求選用各種習知方法(例如，紫外光光譜法、螢光光譜法、液相層析法或質譜分析法)來偵測該穀胱甘肽衍生物，為本發明之功效。
雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

Claims (18)

  1. 一種穀胱甘肽的檢測方法，係包含：提供一待測樣品，該待測樣品含有穀胱甘肽；以9-溴甲基丫啶作為一衍生試劑，混合該待測樣品、該衍生試劑及一衍生溶媒以得一待反應混合液，以使該衍生試劑與該待測樣品所含有之穀胱甘肽進行一衍生反應而得一衍生溶液，該衍生溶液含有一穀胱甘肽衍生物，該穀胱甘肽衍生物為硫醇基上置換有一標記之穀胱甘肽，該衍生溶媒為可溶解該衍生試劑及穀胱甘肽之一溶媒；於該衍生溶液中加入一移除干擾溶媒以移除該衍生溶液中多餘的衍生試劑，經由震盪及離心以獲得一水層溶液，該移除干擾溶媒為與該待反應混合液不互溶之一溶媒，該移除干擾溶媒之Log P值介於0.5~2.0之間；及以該水層溶液作為一待測溶液，以紫外光光譜法、螢光光譜法、液相層析法或質譜分析法偵測該待測溶液中的穀胱甘肽衍生物，以獲得一穀胱甘肽強度值。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之穀胱甘肽的檢測方法，其中，選擇丙酮、乙腈或二甲基亞碸作為該衍生溶媒。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之穀胱甘肽的檢測方法，其中，混合該待測樣品、該衍生試劑、該衍生溶媒及一鹼催化劑以得該待反應混合液，以使該衍生試劑與該待測樣品所含有之穀胱甘肽進行該衍生反應。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之穀胱甘肽的檢測方法，其中，選擇丙酮、乙腈或二甲基亞碸作為該衍生溶媒，且選擇氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸氫鈉或碳酸氫鉀作為該鹼催化劑。
  5. 如申請專利範圍第1~4項中任一項所述之穀胱甘肽的檢測方法，其中，選擇乙酸乙酯、乙酸正丙酯或乙酸叔丁酯作為該移除干擾溶媒。
  6. 如申請專利範圍第1~4項中任一項所述之穀胱甘肽的檢測方法，其中，以一陽離子界面活性劑作為一萃取試劑，萃取該水層溶液中的穀胱甘肽衍生物並獲得一萃取液，續將該萃取液作為該待測溶液，以獲得該穀胱甘肽強度值。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之穀胱甘肽的檢測方法，其中，選擇乙酸乙酯、乙酸正丙酯或乙酸叔丁酯作為該移除干擾溶媒，且選擇三辛基甲基氯化銨、四庚基溴化銨或四辛基溴化銨作為該萃取試劑。
  8. 如申請專利範圍第1~4項中任一項所述之穀胱甘肽的檢測方法，其中，混合一血液樣品及一蛋白質沉澱劑，使該血液樣品中的蛋白質形成一蛋白質沉澱物，藉由離心去除該蛋白質沉澱物以獲得一上清液，該上清液即為該待測樣品。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之穀胱甘肽的檢測方法，其中，選擇丙酮或乙腈作為該蛋白質沉澱劑。
  10. 如申請專利範圍第1~4項中任一項所述之穀胱甘肽的檢測方法，其中，混合一血液樣品及一還原試劑，使該還原試劑打斷該血液樣品中的穀胱甘肽的雙硫鍵結，再加入一蛋白質沉澱劑，使該血液樣品中的蛋白質形成一蛋白質沉澱物，藉由離心去除該蛋白質沉澱物以獲得一上清液，該上清液即為該待測樣品。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之穀胱甘肽的檢測方法，其中，選擇二硫蘇糖醇作為該還原試劑，且選擇丙酮或乙腈作為該蛋白質沉澱劑。
  12. 一種穀胱甘肽的檢測套組，用以檢測一待測樣品是否包含穀胱甘肽，該穀胱甘肽的檢測套組係包含：一衍生試劑，該衍生試劑為9-溴甲基丫啶，且用以與該待測樣品中的穀胱甘肽進行一衍生反應以形成一穀胱甘肽衍生物，該穀胱甘肽衍生物為硫醇基上置換有一標記之穀胱甘肽； 一衍生溶媒，用以與該待測樣品及該衍生試劑共同形成一待反應混合液，該衍生溶媒為可溶解該衍生試劑及穀胱甘肽之一溶媒；及一移除干擾溶媒，該移除干擾溶媒為與該待反應混合液不互溶之一溶媒，該移除干擾溶媒之Log P值介於0.5~2.0之間。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之穀胱甘肽的檢測套組，其中，該衍生溶媒為丙酮、乙腈或二甲基亞碸。
  14. 如申請專利範圍第12或13項所述之穀胱甘肽的檢測套組，其中，該檢測套組另包含：一鹼催化劑，該鹼催化劑為可溶解於該衍生溶媒之鹼性化合物，且用以提供進行該衍生反應的一鹼性環境。
  15. 如申請專利範圍第14項所述之穀胱甘肽的檢測套組，其中，該鹼催化劑為氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸氫鈉或碳酸氫鉀。
  16. 如申請專利範圍第12項所述之穀胱甘肽的檢測套組，其中，該移除干擾溶媒為乙酸乙酯、乙酸正丙酯或乙酸叔丁酯。
  17. 如申請專利範圍第12或16項所述之穀胱甘肽的檢測套組，其中，該檢測套組另包含：一萃取溶劑，該萃取溶劑為碳數25~32的一陽離子界面活性劑，且用以萃取該穀胱甘肽衍生物。
  18. 如申請專利範圍第17項所述之穀胱甘肽的檢測套組，其中，該萃取試劑為三辛基甲基氯化銨、四庚基溴化銨或四辛基溴化銨。
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