CN112525893A - 一种基于纳米金催化能力的比色法传感器检测肝脏中铜离子的方法 - Google Patents

一种基于纳米金催化能力的比色法传感器检测肝脏中铜离子的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于纳米金催化能力的比色法传感器检测肝脏中铜离子的方法,属于分析检测技术领域。其包括如下步骤：步骤S1：纳米金颗粒的制备；步骤S2：研究AuNPs‑H2O2‑TMB系统对pH值的影响；步骤S3：设计铜离子比色传感器；以及步骤S4：预处理猪肝样品。本发明具有如下的技术效果：本发明制作方法简单易行，灵敏度和特异性高。该方法检测铜离子的线性检测范围为0.2至10μM，LOD为0.13μM。本发明将纳米金催化能力的比色法传感器用来检测肝脏中铜离子的残留。我们的传感器用于检测真实肝脏样本中的铜离子，回收率高为2.57‑4.36％，合理的相对标准偏差为<2％，结果令人满意。

Description

一种基于纳米金催化能力的比色法传感器检测肝脏中铜离子 的方法
技术领域
本发明涉及一种基于纳米金催化能力的比色适体传感器检测铜离子，当前的适体传感器能成功的用于检测实际肝脏样品中的铜离子并且检测铜离子在肝脏样品中的回收率结果使人满意,属于分析检测领域。
背景技术
重金属离子被认为是广泛分布在土壤和水中的常见环境污染物。过量的重金属离子会导致严重的环境问题，因为它们难以降解并且易于浓缩。铜是动物和人类必需的微量元素，在许多生理过程中起着重要作用。微量铜可以促进动物生长。然而，过量的铜离子(Cu2+)是动物极毒的重金属离子。当它在生物体内累积到一定量时，会引起损伤，身体抵抗，停滞甚至死亡的症状。即使在短时间暴露后，高水平的铜也会引起胃肠道紊乱，长期接触会影响肝脏或肾脏。通常，实际样品中含有微量甚至更低的铜离子。因此，实际样品中Cu2+的快速有效检测已成为公众安全和社会关注的重要问题。
目前传统的铜离子检测分析技术有离子色谱法(IC)，电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)，原子吸收光谱法(AAS)，这些技术总是与样品预处理相结合，可以提供低检测限。然而，它们需要昂贵且笨重的仪器，耗时的样品预处理过程并且通常操作复杂。其他分析方法也已开发用于Cu2+检测，包括荧光，表面等离子共振，电化学和化学发光，原子光谱，免疫测定和比色法。在上文中，最广泛使用的用于Cu2+检测的比色法基于设计化学传感器，其利用特定的化学探针产生颜色变化从而达到检测目的。纳米粒子在开发比色传感器方面也获得了相当大的关注。然而，很少报道基于AuNPs的催化性质的分析策略，包括基于尿素和脲酶的比色法。最近，开发了一种基于尿素-尿素酶的比色传感器来检测脲酶抑制剂AHA。AHA是一种水基果酸。并且AHA可以抑制脲酶的活性，并导致信号的减少。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提出了一种基于纳米金催化能力的比色法传感器检测肝脏中铜离子的方法。一些重金属离子能够抑制脲酶活性，而不同浓度的铜离子对脲酶具有不同的抑制作用。基于这一原理，我们设计了一种比色传感器来定量检测铜离子。该传感器基于尿素和尿素酶之间的相互作用，并使用3,3'，5,5'-四甲基联苯胺(TMB)作为比色指示剂，其广泛用作比色测定的显色底物。AuNPs作为催化剂加速了H2O2对TMB的氧化反应，颜色由无色变为蓝色再变为黄色，便于肉眼观察。我们优化了检测条件。开发了一种新型的比色传感器高敏感和有选择性的检测Cu2+。在最佳条件下，我们获得良好的线性和低检测限。这种开发的比色传感器也成功用于检测肝脏样本中的铜离子。
本发明的一种基于纳米金催化能力的比色法传感器检测肝脏中铜离子的方法，包括如下步骤：步骤S1：纳米金颗粒的制备；步骤S2：研究AuNPs-H2O2-TMB系统对pH值的影响；步骤S3：设计铜离子比色传感器；以及步骤S4：预处理猪肝样品。
具体来说，本发明中纳米金催化能力的比色法传感器检测肝脏中铜离子的方法包括如下步骤：
S1.纳米金颗粒的制备：通过柠檬酸钠还原氯金酸可以制备直径为13nm的金纳米颗粒。氯金酸溶液浓度为1mM，氯金酸和柠檬酸钠的摩尔比为5:19.4。通过这种方法制备的纳米金溶液浓度约为10nM。
S2.研究AuNPs-H2O2-TMB系统对pH值的影响：
实验步骤描述如下：将30μL30％H2O2，TMB(20μL，2mM)和AuNPs(20μL，6nM)加入到60μL不同pH的PB溶液中，将上述混合溶液在37℃孵育10分钟。最后，将H2SO4(20μL，20％(v/v))加入到上述混合溶液用于停止催化反应，并记录450nm处的吸光度(A450)。A450是TMB氧化的特征吸收峰。每个样品平行6次。
S3.设计铜离子比色传感器：将尿素(10μL，40mM)和尿素酶(8μL，6U/mL)加入含有45μL磷酸盐缓冲液(PB)(10mM，pH＝6.2)和5μL不同浓度的Cu2+的试管中，将上述混合溶液在37℃中孵育30分钟。接下来，将30μL的30％H2O2,17μL的2mM TMB和20μL的6nM AuNPs加入到上述混合溶液中，在37℃度孵育10分钟。最后，将H2SO4(20μL，20％(v/v))加入到混合物中，并记录A450。每个样品平行6次。
S4.预处理猪肝样品：在分析之前，用剪刀剪碎肝脏并储存在-20℃的冰箱中。用10mL乙腈和5g NaCl处理5±0.01g肝脏。将混合物涡旋5分钟，并将提取物以8000rpm离心5分钟。将1.5mL上清液转移到含有150mg无水MgSO4的离心管中，加入质量分数为5％的三氟乙酸以除去肝脏中的蛋白质。将混合物再涡旋1分钟，然后以8000rpm离心5分钟。使用真空旋转蒸发器将1毫升乙腈相在30℃下蒸发至干。之后，将残余物溶解在1mL丙酮中，并将溶液通过0.22μm尼龙过滤器过滤。然后，将Cu2+溶解在上述提取的溶液中并稀释。最后，通过稀释获得肝样品中不同浓度的Cu2+(2,3,4μM)并用于下一分析。
本发明基于纳米金催化能力的比色法传感器检测肝脏中铜离子的方法，具有如下的技术效果：
1、本发明纳米金催化能力的比色法传感器检测肝脏中铜离子的方法的制作方法简单易行。
2、本发明纳米金催化能力的比色法传感器检测肝脏中铜离子的灵敏度和特异性高。
3、本发明提供了一种纳米金催化能力的比色法传感器检测肝脏中铜离子的方法。该方法检测铜离子的线性检测范围为0.2至10μM，LOD为0.13μM。
4、本发明将纳米金催化能力的比色法传感器用来检测肝脏中铜离子的残留。我们的传感器用于检测真实肝脏样本中的铜离子，回收率高(2.57-4.36％)，合理的相对标准偏差(<2％)，结果令人满意。
5、本发明还提供了一种检测铜离子的新方法。
附图说明
图1为本发明中PB溶液的pH值优化图，插图为溶液pH和吸光度之间的关系。
图2为本发明中基于AuNPs催化能力的比色传感器的检测原理图。
图3为本发明中不同溶液的吸收光谱。(a)尿素+AuNPs+TMB+H2SO4，(b)尿素酶+AuNPs+TMB+H2SO4，(c)尿素+尿素酶+AuNPs+TMB+H2SO4，(d)尿素+尿素酶+Cu2++AuNPs+TMB+H2SO4。
图4为本发明中尿素和尿素酶浓度的优化图。
图5为本发明中不同浓度铜离子溶液的比色紫外可见吸收光谱。
图6为本发明中水溶液中Cu2+传感器的灵敏度，插图：Cu2+的标准曲线和视觉颜色变化。
图7为比色传感器对肝脏样品中各种可能的干扰物质的响应图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
在本发明的实施方式中，表1为本发明中Cu2+检测分析方法的比较。表2为本发明中肝脏样品的回收率和重复性检测。
表1
Figure BDA0002206686200000051
Figure BDA0002206686200000061
表2
Figure BDA0002206686200000062
实施例1.AuNPs-H2O2-TMB体系对pH的响应
将30μL30％H2O2，TMB(20μL，2mM)和AuNPs(20μL，6nM)加入到60μL不同pH的PB溶液中，将上述混合溶液在37℃孵育10分钟。最后，将H2SO4(20μL，20％(v/v))加入到上述混合溶液用于停止催化反应，并记录450nm处的吸光度(A450)。A450是TMB氧化的特征吸收峰。每个样品平行6次。
结果表明，对于不同类型的过氧化物酶模拟物，AuNPs的催化效率非常依赖于系统的pH。从以前的文献中可以发现，在AuNPs存在下，用10mM PB作为反应介质，H2O2对TMB的催化氧化在6.40-6.60的pH范围内表现出线性响应。基于该结果，我们试图找到最佳溶液pH值，以使指示剂对我们设计的传感器具有最大的颜色响应。在我们的研究中，为了选择最佳pH，将PB缓冲液的不同pH添加到固定浓度的AuNPs中。结果如图1所示，A450随着溶液pH的降低而逐渐增加，并且在pH＝6.2后趋于平稳。显然，当pH为6.2时，指示剂对传感器具有最大的颜色响应。因此，我们选择6.2作为PB缓冲液的pH。
实施例2.铜离子的比色检测：
将尿素(10μL，40mM)和尿素酶(8μL，6U/mL)加入含有45μL磷酸盐缓冲液(PB)(10mM，pH＝6.2)和5μL不同浓度的Cu2+的试管中，将上述混合溶液在37℃中孵育30分钟。接下来，将30μL的30％H2O2,17μL的2mM TMB和20μL的6nM AuNPs加入到上述混合溶液中，在37℃度孵育10分钟。最后，将H2SO4(20μL，20％(v/v))加入到混合物中，并记录A450。每个样品平行6次。
结果表明，基于AuNPs催化能力的比色传感器的检测原理如图2所示。脲酶是一种高效的含镍酶，可将尿素水解成二氧化碳和氨水约1014倍。氨可以增加溶液的pH。AuNPs-TMB-H2O2系统的溶液颜色对pH值敏感。因此，尿素，尿素酶和脲酶抑制剂可以基于AuNPs的催化效率来定量，取决于产生的氨的量。在我们的研究中，我们使用Cu2+作为脲酶抑制剂，并基于TMB颜色来量化Cu2+浓度。设计的比色传感器方案如如图3所示。在没有Cu2+的情况下，尿素通过脲酶加速水解，氨引起pH值升高，AuNPs在高pH溶液中催化能力差，TMB被H2O2氧化为浅蓝色。在Cu2+存在下，Cu2+与脲酶结合，脲酶活性受到抑制，尿素水解产生的氨量减少，AuNPs在低pH溶液中具有良好的催化能力，TMB被H2O2氧化成深蓝色。作为过氧化物酶模拟物，AuNPs可以将H2O2的O-O键分解成二羟基。当加入H2SO4以停止催化反应时，所得羟基自由基与TMB反应形成黄色产物。因此，加入H2SO4，系统由蓝色变为黄色。加入H2SO4后，体系的颜色变为淡黄色。当仅添加尿素或尿素酶时不会发生这种现象。
实施例3.优化尿素和尿素酶的浓度
将不同浓缩的尿素溶液加入到固定体积的PB(10mM，pH＝6.2)缓冲液(初始尿素浓度：10,20,40,60,100mM)中，然后混合不同的活性脲酶溶液并孵育30分钟。(初始脲酶浓度：2,4,6,8,10U/mL)。在室温下使用紫外分光光度计测得其450nm处的吸光度。每个样品平行6次。
结果表明，如图4所示，该比色传感器的开发是基于尿素-尿素酶之间的相互作用，为了获得尿素和尿素酶的最佳浓度，尿素-尿素酶的浓度同时得到优化。从图4中可以看出，450nm处的吸光度随尿素和尿素酶的浓度而变化。以20mM尿素为例，A450首先降低，然后随着活性脲酶溶液的增加而增加。在脲酶活性为6U/mL时，A450最低。尿素-尿素酶反应越完全，产生的氨越多，A450的吸光度越低。从图2中可以看出这一结果。当尿素浓度为20,40,60,100mM时，从A450的趋势可以看出，不同浓度的尿素可以产生不同活性的脲酶敏感变化，A450是尿素浓度为40mM时最敏感。即，当尿素浓度为40mM时，随着脲酶浓度增加，A450变化的斜率最大。最佳浓度分别为40mM和6U/mL。
实施例4.设计铜离子比色传感器：
将尿素(10μL，40mM)和尿素酶(8μL，6U/mL)加入含有45μL磷酸盐缓冲液(PB)(10mM，pH＝6.2)和5μL不同浓度的Cu2+的试管中，将上述混合溶液在37℃中孵育30分钟。接下来，将30μL的30％H2O2,17μL的2mM TMB和20μL的6nM AuNPs加入到上述混合溶液中，在37℃度孵育10分钟。最后，将H2SO4(20μL，20％(v/v))加入到混合物中，并记录A450。每个样品平行6次。
结果表明，对于Cu2+的定量检测，在优化的条件下，在不同浓度的Cu2+的0-50μM范围内测量UV-可见吸收光谱。接下来，记录450nm处的吸光度峰。比色紫外-可见吸收光谱如图5所示。随着Cu2+浓度的增加，450nm处的吸收峰逐渐增加。如图6所示，A450的峰值随着Cu2+浓度的增加而变化，溶液颜色从无色变为蓝色变为黄色。当Cu2+浓度超过40μM时，A450的峰值趋于保持不变。图6的插图显示A450与Cu2+浓度之间的线性相关性为0.2至10μM，估计检测限(EDL)为0.13μM。线性方程为y＝0.02834x+0.36808(R2＝0.9907)，可以看出我们开发的传感器对Cu2+检测具有灵敏度。
LOD＝3×Standard deviation/Slope (1)
实施例5.方法比较：
将本研究所得结果与其他传感器进行比较归纳。
结果表明，所开发的方法与其他Cu2+检测方法的比较列于表1中。从表1中可以看出，所开发的传感器的性能优于一些报道的分析方法和比色传感器，并且提出的检测方法铜离子更简单，灵敏度更高。
实施例6.比色传感器对Cu2+检测的选择性
将尿素(10μL，40mM)和尿素酶(8μL，6U/mL)加入含有45μL磷酸盐缓冲液(PB)(10mM，pH＝6.2)和5μL不同浓度的干扰物的试管中，将上述混合溶液在37℃中孵育30分钟。接下来，将30μL的30％H2O2,17μL的2mM TMB和20μL的6nM AuNPs加入到上述混合溶液中，在37℃度孵育10分钟。最后，将H2SO4(20μL，20％(v/v))加入到混合物中，并记录A450。每个样品平行6次。
结果表明，比色法的选择性是一个重要因素，也是实际应用中的一个特殊问题。探测了比色传感器对肝脏样品中各种可能的干扰物质的响应。为了评估新方法的选择性，我们在报告系统中添加了肝脏样本中的一些可能的干扰，如图7所示。可能的干扰，包括直接在系统中存在离子，如Li+，Na+，K+，Ca2+，Fe3+，Ni2+，Cu+，Mg2+，Cl-，SO4 2-，NO3 -，H2PO4 -和HPO4 2-。然后，经常在肝脏中发现氨基酸和抗生素，例如赖氨酸，丝氨酸，丙氨酸，精氨酸，卡那霉素，链霉素和妥布霉素。正如预期的那样，图7显示所提出的传感器在含有Cu2+混合物时具有显著的响应。这些结果还表明，其他外来物质对肝脏样本中的Cu2+检测显示出轻微且可忽略的干扰。
实施例7.肝脏样品精密度和回收率实验：
分别取2μM/L、3μM/L、4μM/L三个浓度的铜离子标准溶液进行加标，平行测定5次，计算回收率和相对标准偏差。
结果表明，如表2所示，回收率在95.75-101.44.6％范围内，相对标准偏差在0.99-1.51％范围内，该结果表明本发明提出的方法具有良好的稳定性和再现性。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于纳米金催化能力的比色法传感器检测肝脏中铜离子的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤S1：纳米金颗粒的制备；步骤S2：研究AuNPs-H2O2-TMB系统对pH值的影响；步骤S3：设计铜离子比色传感器；以及步骤S4：预处理猪肝样品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1：纳米金颗粒的制备如下：通过柠檬酸钠还原氯金酸制备直径为13nm的金纳米颗粒。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，氯金酸溶液浓度为1mM，氯金酸和柠檬酸钠的摩尔比为5:19.4，通过这种方法制备的纳米金溶液浓度约为10nM。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，步骤S2：研究AuNPs-H2O2-TMB系统对pH值的影响如下：将30μL30％H2O2，20μL，2mM的TMB和20μL，6nM的AuNPs加入到60μL不同pH的PB溶液中，将上述混合溶液在37℃孵育10分钟，最后，将20μL，20％H2SO4加入到上述混合溶液用于停止催化反应，并记录450nm处的吸光度A450，A450是TMB氧化的特征吸收峰，每个样品平行6次。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，选择6.2作为PB缓冲液的最佳pH。
6.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，步骤S3：设计铜离子比色传感器如下：将10μL，40mM的尿素和8μL，6U/mL的尿素酶加入含有45μL磷酸盐缓冲液和5μL不同浓度的Cu2+的离心管中，将上述混合溶液在37℃中孵育30分钟，接下来，将30μL的30％H2O2,17μL的2mM TMB和20μL的6nM AuNPs加入到上述混合溶液中，在37℃度孵育10分钟，最后，将20μL，20％的H2SO4加入到混合物中，并记录吸光度A450，A450是TMB氧化的特征吸收峰，每个样品平行6次。
7.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，步骤S4：预处理猪肝样品如下：在分析之前，用剪刀剪碎肝脏并储存在-20℃的冰箱中，用10mL乙腈和5g NaCl处理5±0.01g肝脏，将混合物涡旋5分钟，并将提取物以8000rpm离心5分钟，将1.5mL上清液转移到含有150mg无水MgSO4的离心管中，加入质量分数为5％的三氟乙酸以除去肝脏中的蛋白质，将混合物再涡旋1分钟，然后以8000rpm离心5分钟，使用真空旋转蒸发器将1毫升乙腈相在30℃下蒸发至干，之后，将残余物溶解在1mL丙酮中，并将溶液通过0.22μm尼龙过滤器过滤，然后，将Cu2+溶解在上述提取的溶液中并稀释，最后，通过稀释获得肝样品中不同浓度的Cu2+并用于下一分析。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，通过稀释获得肝样品中不同浓度的Cu2+为2,3,4μM。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该比色传感器的开发是基于尿素-尿素酶之间的相互作用。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，尿素浓度为40mM，尿素酶的脲酶活性为6U/mL。
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