CN106370638B - 用于Hg2+检测的比色、荧光双信号生物传感器及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种用于Hg2+检测的比色、荧光双信号生物传感器及检测方法,包括分子发卡探针(H1、H2、H3)、辅助DNA和金纳米粒子。所述分子发卡探针为荧光素(FAM)标记的分子发卡。所述AuNPs通过用柠檬酸钠还原氯金酸的方法合成。检测方法为:将0.01 g氯金酸溶于100mL超纯水中,回流加热煮沸;快速搅拌下加入2.5 mL1 wt%柠檬酸钠溶液,反应30 min后冷却至室温,制备AuNPs;将硝酸汞与H1、H2、H3(30‑300 nmol/L)和辅助DNA(20‑500 nmol/L)的Tris‑HCl缓冲溶液混合,室温下反应1‑5 h,随后加入AuNPs反应5 min;分别用紫外‑可见分光光度计和荧光计进行检测。本发明提出的这种基于AuNPs和催化发卡组装无酶放大技术的双信号生物传感器制备便宜、检测灵敏度高、克服了单种检测模式的适用性窄的缺点。
Description
技术领域
本发明涉及生物传感领域,具体地,涉及一种用于Hg2+检测的兼具有比色和荧光信号的双信号生物传感器和检测方法。
背景技术
汞是最具毒性和最危险的重金属元素之一,在生物体内的累积给人们带来了严重的健康危害,如生长发育缓慢、器官损伤,甚至死亡。美国环保署(USEPA)规定的饮用水中汞离子(Hg2+)的含量最高不超高10nmol/L。有必要发展一种高选择性和高灵敏性的分析方法用于环境中Hg2+的检测。传统的检测方法包括原子发射光谱(AES)(Moreton J A,Delves HT.Simple direct method for the determination of total mercury levels in bloodand urine and nitric acid digests of fish by inductively coupled plasma massspectrometry[J].Journal of Analytical Atomic Spectrometry,1998,13(7):659-665.)、电感耦合-等离子质谱(ICP-MS)(Wan C C,Chen C S,Jiang S J.Determination ofMercury Compounds in Water Samples by LiquidChromatography–InductivelyCoupled Plasma Mass Spectrometry WithanIn Situ Nebulizer/Vapor Generator[J].Journal of Analytical Atomic Spectrometry,1997,12(7):683-687.)等,这些基于仪器的方法具有灵敏度高和检出限低的优点,但是由于仪器精密复杂和成本高,使得它们很难用于现场实时检测。最近Ono等人证明了Hg2+能以高特异性和高选择性的方式嵌入DNA的两个胸腺嘧啶(T)中间,形成T-Hg2+-T的错配碱基对(Miyake Y,Togashi H,Tashiro M,etal.MercuryII-mediated formation of thymine-HgII-thymine base pairs in DNAduplexes[J].Journal of the American Chemical Society,2006,128(7):2172-2173.)。基于这一特性,通过结合一些信号转换策略,发展了许多不同的传感方法,如比色法(ZhuY,Cai Y,Zhu Y,et al.Highly sensitive colorimetric sensor for Hg2+detectionbased on cationic polymer/DNA interaction[J].Biosensors and Bioelectronics,2015,69:174-178.)、荧光法(Yuan M,Zhu Y,Lou X,et al.Sensitive label-freeoligonucleotide-based microfluidic detection of mercury(II)ion by usingexonuclease I[J].Biosensors and Bioelectronics,2012,31(1):330-336.)等,这些方法的检出下限一般高于10nmol/L,无法满足实际需求。为了提高检测灵敏度,可以使用不同的酶来实现信号放大。但是基于酶的方法增加了实验的复杂性和检测成本,限制了他们的实际应用,此外Hg2+还有可能使酶变性。
杂交链反应(HCR)作为一种等温、无酶和便宜的技术,被广泛用于传感器设计中,以提高其检测灵敏度。基于HCR放大的Hg2+比色和荧光传感器均有报道(Huang J,Gao X,JiaJ,et al.Graphene oxide-based amplified fluorescent biosensor for Hg(2+)detection through hybridization chain reactions.[J].Analytical Chemistry,2014,86(6):3209-3215.),灵敏度提升至了nmol/L量级。靶催化发卡组装(TCA)技术比HCR具有更高的放大效率,结合TCA的传感器的灵敏度更高,能达到pmol/L量级(Yun W,JiangJ,Cai D,et al.Ultrasensitive visual detection of DNA with tunable dynamicrange by using unmodified gold nanoparticles and target catalyzed hairpinassembly amplification.[J].Biosensors&Bioelectronics,2015,77:421-427.)。一般来说,比色法比荧光法要便利得多,通过肉眼即可进行检测,但是比色法不适用于有颜色的样品,检测灵敏度也比不上荧光法。
发明内容
本发明的目的是为了克服比色法适用性窄和灵敏度低的缺点,利用比色法便利和荧光法灵敏度高的优点,提供一种基于靶催化发卡组装无酶放大技术的兼具有比色和荧光信号的双信号超灵敏Hg2+生物传感器和检测方法。
本发明的技术方案:
一种用于Hg2+检测的比色、荧光双信号生物传感器及检测方法,组成为:
分子发卡探针H1:30-300nmol/L;
分子发卡探针H2:30-300nmol/L;
分子发卡探针H3:30-300nmol/L;
辅助DNA:20-500nmol/L;
金纳米粒子(AuNPs)。
所述分子发卡探针H1、H2、H3三个发卡,在Hg2+的作用下,辅助DNA和H1 配对,打开H1的发卡结构,打开后的H1暴露出的单链DNA片段与H2互补,辅助DNA又会继续打开H2,打开后的H2又与H3互补,辅助DNA继续打开H3,打开后的H3暴露出的单链DNA片段又与H1中和辅助DNA配对的碱基序列互补,置换出辅助DNA,从而形成一个“Y”型双链DNA刚性结构。
所述分子发卡探针H1、H2、H3为三个核苷酸,序列长度均不超过50个碱基,且由荧光素(FAM)标记。在使用前均加热至95±1℃反应约5min,然后自然冷却至室温,以形成发卡结构。
所述辅助DNA为特定的碱基序列,序列长度不超过分子发卡序列的一半,与H1存在分散的T错配碱基,T错配数约为6~8个,其余碱基均与H1的一端互补配对。在Hg2+的作用下,辅助DNA和H1的错配T碱基通过T-Hg2+-T作用配对,形成连续的碱基配对序列,且配对数目大于H1维持自身发卡结构稳定的碱基对数目,打开H1的发卡结构,催化三个分子发卡进行组装反应,置换出的辅助DNA又能够和Hg2+作用继续催化下一组发卡的组装反应,如此往复循环。
所述AuNPs采用下列组分配制而成:
氯金酸:0.01g/100mL,
1wt%柠檬酸钠:2.5mL/100mL。
一种用于Hg2+检测的双信号生物传感器的检测方法,步骤为:
S1:称取0.01g氯金酸溶于100mL超纯水中,回流加热煮沸;快速搅拌下加入2.5mL1wt%柠檬酸钠溶液,加热反应30min后逐渐冷却至室温;制备得到的AuNPs在4℃±2℃中保存;
S2:将硝酸汞Hg(NO3)2、分子发卡探针H1、H2和H3的Tris-HCl缓冲溶液和辅助DNA的Tris-HCl缓冲溶液混合,其中Tris-HCl缓冲溶液的浓度为50mmol/L,含50mmol/L MgCl2和0.5mol/L NaCl、pH为8.0,混合后的体积约为1单位体积,分子发卡探针H1、H2和H3的浓度均为30-300nmol/L,辅助DNA的浓度为20-500nmol/L,室温下反应1-5h,随后加入9单位体积的AuNPs,反应5min;
S3:取上述混合物用分光光度计进行检测;
S4:取上述混合物用荧光光度计进行检测。检测条件为:FAM的激发波长和发射波长分别设定为492nm和517nm,狭缝宽度为10nm,样品的荧光发射光谱用492nm的光激发,扫描范围为:505-600nm,扫描步长为1nm。
本发明的一种用于Hg2+检测的双信号生物传感器,具有制备便宜、检测灵敏度高、适用范围广的优点。没有Hg2+时,三个分子发卡探针(H1、H2、H3)末端的单链吸附在AuNPs表面,保护AuNPs不被盐诱导的聚集,溶液为红色,同时在AuNPs的猝灭作用下,荧光信号淬灭。在Hg2+的作用下,辅助DNA催化三个分子发卡探针组装生成分支结刚性双链DNA(dsDNA)结构,脱离AuNPs表面,荧光信号恢复,AuNPs没有了分子发卡的保护,在盐溶液中发生聚集,溶液由红色变为蓝色。其有效的荧光“打开”检测模式增加了方法可靠性,克服了以前的“关闭”检测模式的假阳性、选择性差等不利特征。溶液颜色的改变可由紫外-可见分光广度计读出。相比于基于酶的放大技术,该传感器所采用的催发发卡组装无酶放大技术展现出更高的放大效率。此外,具有双信号的传感器继承了每种检测模式的优点,克服了单个检测模式的不足。
附图说明
图1是没有Hg2+时,分子发卡探针吸附在AuNPs表面的示意图。
图2是Hg2+存在时,辅助DNA催化三个发卡进行TCA反应的示意图。
图3是TCA反应生成的刚性双链DNA脱离AuNPs表面的示意图。
图4是实施例1没加Hg2+和加入Hg2+的照片。
图5是实施例1中50nmol/L H1、H2、H3,100nmol/L辅助DNA和2.3nmol/L AuNPs的Tris-HCl缓冲溶液(50mmol/L,pH 8.0,含50mmol/L MgCl2和0.5mol/L NaCl)中的不同浓度Hg2+的荧光发射光谱。
图6是图3的强度曲线。
图7是荧光生物传感器的选择性分析结果。
图8是实施例2中Hg2+的荧光发射光谱。
图9是实施例3中Hg2+的荧光发射光谱。
图10是实施例5中Hg2+的荧光发射光谱。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进行详细说明,但并不因此限制本发明。
实施例
以下的实施例将对本发明作进一步的说明,但并不因此限制本发明。
以下实施例中:
氯金酸、柠檬酸钠、Tris-HCl缓冲溶液、硝酸汞、FAM、浓硫酸为分析纯,超纯水为实验室自制,实施例1-4中所用的核苷酸序列见表1。实施例1-4中辅助DNA和H1的T错配数为6个。
表1实施例1-4中用到的辅助DNA和核苷酸序列
实施例5中所用的核苷酸序列见表2。实施例5中辅助DNA和H1的T错配数为8个。
表2实施例5中用到的辅助DNA和核苷酸序列
上表1、2中HI、H2、H3的序列表如SEQUENCE LISTING所示。
仪器
荧光光度计,检测条件为:FAM的激发波长和发射波长分别设定为492nm和517nm,狭缝宽度为10nm,样品的荧光发射光谱用492nm的光激发,扫描范围为:505-600nm,扫描步长为1nm。
紫外-可见分光光度计。
由于荧光检测灵敏度高于比色检测,因此以下实施例均用荧光光度计进行检测,只是对比色检测进行简单说明。
实施例1
AuNPs制备
称取0.01g氯金酸溶于100mL超纯水中,回流加热煮沸;快速搅拌下加入2.5mL1wt%柠檬酸钠溶液,加热反应30min后自然冷却至室温;制备得到的AuNPs在4℃±2℃中保存。
具有比色和荧光信号的双信号Hg2+生物传感器的制备及检测过程
将Hg(NO3)2、分子发卡探针H1、H2和H3的Tris-HCl缓冲溶液和辅助DNA的Tris-HCl缓冲溶液混合,其中Tris-HCl缓冲溶液的浓度为50mmol/L,含50mmol/L MgCl2和0.5mol/LNaCl、pH为8.0,混合后的体积约为100μL,分子发卡探针H1、H2和H3的浓度均为30-300nmol/L,辅助DNA的浓度为20-500nmol/L,Hg2+的浓度为0.2-100nmol/L,室温下反应1-5h,随后加入900μL AuNPs(2.3nmol/L)反应约5min。分别用紫外-可见分光光度计和荧光光度计进行检测。
图1、图2和图3为基于靶催化发卡组装无酶放大技术的兼具有比色和荧光信号的双信号超灵敏Hg2+生物传感器的制备及检测过程示意图。没有Hg2+时,三个分子发卡探针(H1、H2、H3)末端的单链吸附在AuNPs表面,保护AuNPs不被盐诱导的聚集,溶液为红色,同时在AuNPs的猝灭作用下,荧光信号淬灭,如图1所示。在Hg2+的作用下,辅助DNA和H1的错配T碱基通过T-Hg2+-T配对,其余碱基通过碱基互补配对原则进行配对,且配对数目大于H1维持自身发卡结构稳定的碱基对数目,打开H1的发卡结构,打开后的H1暴露出的单链DNA片段与H2的一端互补,又会继续打开H2,打开后的H2的另一端又与H3的一端互补,继续打开H3,打开后的H3暴露出的单链DNA片段又与H1中和辅助DNA配对的碱基序列互补,置换出辅助DNA,从而形成一个“Y”型双链DNA刚性结构,置换出的辅助DNA又能继续催化下一个组装反应,如此往复循环,如图2所示。生成的刚性双链结构脱离AuNPs表面,荧光信号恢复,AuNPs没有了分子发卡的保护,在盐溶液中发生聚集,溶液由红色变为蓝色,如图3所示。由此可通过AuNPs的吸光度变化和荧光物质FAM信号的强弱来实现Hg2+的双信号定量检测。
Hg2+-双信号生物传感器的比色检测
图4为没加Hg2+和加入Hg2+的照片,可以看出,没加Hg2+时,分子发卡探针保护AuNPs,AuNPs分散性很好,溶液仍为红色;加入Hg2+后,AuNPs发生聚集,溶液变为蓝色。由此可通过AuNPs的吸光度和溶液颜色变化进行比色定量检测。
Hg2+-双信号生物传感器的荧光检测性能分析
图5为50nmol/L H1、H2、H3,100nmol/L辅助DNA和2.3nmol/L AuNPs的Tris-HCl缓冲溶液(50mmol/L,pH 8.0,含50mmol/L MgCl2和0.5mol/L NaCl)中的不同浓度Hg2+的荧光发射光谱。图6为相应的强度曲线,可以看出,在Hg2+位于0.2-100nmol/L范围内,该生物传感器具有很好的线性关系,线性相关系数为R2=0.990,最低检出限为0.1nmol/L(3倍空白样品标准偏差),远远低于美国环保署(USEPA)规定的环境中Hg2+存在的最大水平(10nmol/L)。因此,本专利提出的传感器完全满足Hg2+检测要求。
传感器的选择性和重复性分析
图7为双信号生物传感器的荧光选择性分析结果,可以看出,约为Hg2+浓度100倍的干扰离子(Mg2+,Ca2+,Zn2+,Pb2+,Cu2+,Fe2+,Co2+,Sn2+)的荧光信号强度大大低于Hg2+。表明本发明提出的传感器具有很好的Hg2+选择性,可以从复杂的金属离子样品中区分Hg2+。
通过测试6组三个浓度Hg2+(0.5,10,100nmol/L)的平行试验的相对标准偏差(RSD)来估算本发明提出的传感器的重复性。相对标准偏差分别为9.7%,9.4%和8.6%,结果表明这种Hg2+传感器满足了重复性要求。
传感器的实际样品分析
为了验证提出的生物传感器在河水中的实用性,将河水过滤后作为溶液载体,并向溶液中加入已知一定量的硝酸汞进行测量。本文测量了四个含0、1、10、100nmol/LHg2+的样品,测量结果如表3所示。回收率范围为92%-97.7%,相对标准偏差(RSD)为6.4%-8.5%。结果表明本发明的双信号生物传感器有望用于实际样品分析。
表3实际样品测量结果
实施例2
AuNPs制备
按照实施例1的方法制备AuNPs。
Hg2+-双信号生物传感器的制备及荧光检测过程
将Hg(NO3)2与分子发卡探针H1、H2、H3(均为30nmol/L)和辅助DNA(20nmol/L)的Tris-HCl缓冲溶液(50mmol/L,pH 8.0,含50mmol/L MgCl2和0.5mol/L NaCl)混合,室温下反应1h,随后加入AuNPs反应5min。用荧光光度计检测。
图8为含30nmol/L H1、H2、H3,20nmol/L辅助DNA和2.3nmol/L AuNPs的Tris-HCl缓冲溶液(50mmol/L,pH 8.0,含50mmol/L MgCl2和0.5mol/L NaCl)中50nmol/L Hg2+的荧光发射光谱。荧光强度为110a.u.。与实施例1中同浓度Hg2+的荧光强度相比,强度降低很明显。这是因为分子发卡探针和辅助DNA的量减少,吸附在AuNPs表面的分子发卡量减少,进行发卡组装生成分支结刚性dsDNA结构的量降低,荧光强度减弱。
实施例3
AuNPs制备
按照实施例1的方法制备AuNPs。
Hg2+-双信号生物传感器的制备及荧光检测过程。
将Hg(NO3)2与分子发卡探针H1、H2、H3(均为300nmol/L)和辅助DNA(500nmol/L)的Tris-HCl缓冲溶液(50mmol/L,pH 8.0,含50mmol/L MgCl2和0.5mol/L NaCl)混合,室温下反应1h,随后加入AuNPs反应5min。用荧光光度计检测。
图9为含300nmol/L H1、H2、H3,500nmol/L辅助DNA和2.3nmol/L AuNPs的Tris-HCl缓冲溶液(50mmol/L,pH 8.0,含50mmol/L MgCl2和0.5mol/L NaCl)中50nmol/L Hg2+的荧光发射光谱。荧光强度为750a.u.。与实施例1相比,强度增强。这是因为分子发卡的浓度很大,有过量的分子发卡探针自由地存在于溶液中,导致荧光强度增强。
实施例4
AuNPs制备
按照实施例1的方法制备AuNPs。
Hg2+-双信号生物传感器的制备及荧光检测过程。
将Hg(NO3)2与分子发卡探针H1、H2、H3(均为50nmol/L)和辅助DNA(100nmol/L)的Tris-HCl缓冲溶液(50mmol/L,pH 8.0,含50mmol/L MgCl2和0.5mol/L NaCl)混合,室温下反应5h,随后加入AuNPs反应5min。用荧光光度计检测。荧光强度为230a.u.。与实施例1的荧光强度相一致,说明此时组装反应已完全。
实施例5
实施例5的操作条件完全与实施例1一样,只是所用到的辅助DNA和三个分子发卡序列有所改动,其序列见表2。其中辅助DNA与分子发卡探针1的T碱基错配数为8个。
测量50nmol/L Hg2+的荧光发射光谱,如图10所示,荧光强度为235a.u.。稍大于实施例1中同浓度汞离子的荧光强度。说明T错配数越多,该传感器对Hg2+的响应越灵敏。
以上描述了本发明的优选实施方式,但是,本发明并不限于上述实施方式中的具体细节,可以理解的是,在本发明中采用其他配对序列的分子发卡探针及相应的辅助DNA均可实现本发明的功能,均属于发明的技术构思范围。在本发明的技术构思范围内,可以对本发明的技术方案进行多种变型,这些变型均属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国工程物理研究院材料研究所
<120> 用于Hg2+检测的比色、荧光双信号生物传感器及检测方法
<130> 2016.10
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgtgccatt cactcaactt catcacacat tcaactgatg aagttgagtg 50
SEQUENCE LISTING
<110> 中国工程物理研究院材料研究所
<120> 用于Hg2+检测的比色、荧光双信号生物传感器及检测方法
<130> 2016.10
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cactcaactt catcagttga atgtggagtg aatggcacat tcaactgatg 50
SEQUENCE LISTING
<110> 中国工程物理研究院材料研究所
<120> 用于Hg2+检测的比色、荧光双信号生物传感器及检测方法
<130> 2016.10
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
catcagttga atgtgccatt cactctgatg aagtagagag aatggcacat 50
Claims (7)
1.用于Hg2+检测的比色、荧光双信号生物传感器,组成为:
分子发卡探针H1:30-300nmol/L;
分子发卡探针H2:30-300nmol/L;
分子发卡探针H3:30-300nmol/L;
辅助DNA:20-500nmol/L;
金纳米粒子AuNPs;
所述辅助DNA为特定的碱基序列,序列长度不超过分子发卡序列的一半,与H1存在分散的T错配碱基,T错配数约为6~8个,其余碱基均与H1的一端互补配对;
所述分子发卡探针H1、H2、H3由荧光素标记。
2.根据权利要求1所述的用于Hg2+检测的比色、荧光双信号生物传感器,其特征在于,所述分子发卡探针H1、H2、H3三个发卡,在Hg2+的作用下,辅助DNA和H1配对,打开H1的发卡结构,打开后的H1暴露出的单链DNA片段与H2互补,辅助DNA又会继续打开H2,打开后的H2又与H3互补,辅助DNA继续打开H3,打开后的H3暴露出的单链DNA片段又与H1中和辅助DNA配对的碱基序列互补,置换出辅助DNA,从而形成一个“Y”型双链DNA刚性结构。
3.根据权利要求1或2所述的用于Hg2+检测的比色、荧光双信号生物传感器,其特征在于,所述分子发卡探针H1、H2、H3为三个核苷酸,序列长度均不超过50个碱基,且由荧光素FAM标记。
4.根据权利要求1所述的用于Hg2+检测的比色、荧光双信号生物传感器,其特征在于:所述金纳米粒子AuNPs采用下列组分配制而成:
氯金酸:0.01g/100mL,
1wt%柠檬酸钠:2.5mL/100mL。
5.一种用于Hg2+检测的双信号生物传感器的检测方法,步骤为:
S1:称取0.01g氯金酸溶于100mL超纯水中,回流加热煮沸;快速搅拌下加入2.5mL1wt%柠檬酸钠溶液,加热反应30min后逐渐冷却至室温;制备得到的金纳米粒子AuNPs在4℃±2℃中保存;
S2:将硝酸汞Hg(NO3)2、分子发卡探针H1、H2和H3的Tris-HCl缓冲溶液和辅助DNA的Tris-HCl缓冲溶液混合,其中Tris-HCl缓冲溶液的浓度为50mmol/L,含50mmol/L MgCl2和0.5mol/L NaCl、pH为8.0,混合后的体积约为1单位体积,分子发卡探针H1、H2和H3的浓度均为30-300nmol/L,辅助DNA的浓度为20-500nmol/L,室温下反应1-5h,随后加入9单位体积的金纳米粒子AuNPs,反应5min;所述辅助DNA为特定的碱基序列,序列长度不超过分子发卡序列的一半,与H1存在分散的T错配碱基,T错配数约为6~8个,其余碱基均与H1的一端互补配对;所述分子发卡探针H1、H2、H3由荧光素FAM标记;
S3:取上述混合物用分光光度计进行检测;
S4:取上述混合物用荧光光度计进行检测。
6.根据权利要求5所述的一种用于Hg2+检测的双信号生物传感器的检测方法,其特征在于,所述步骤S3中分光光度计检测时,测量范围为:300-800nm。
7.根据权利要求5所述的一种用于Hg2+检测的双信号生物传感器的检测方法,其特征在于,所述步骤S4中荧光光度检测时,FAM的激发波长和发射波长分别设定为492nm和517nm,狭缝宽度为10nm;样品的荧光发射光谱用492nm的光激发,扫描范围为:505-600nm,扫描步长为1nm。
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201610943832.6A CN106370638B (zh) | 2016-10-26 | 2016-10-26 | 用于Hg2+检测的比色、荧光双信号生物传感器及检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
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