CN112304913B - 一种检测Hg2+荧光生物传感器及检测Hg2+的方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及传感器技术领域，特别涉及目标金属介导临近触发劈开金属DNAzyme催化裂解性能、催化发夹自组装放大反应的一种检测Hg2+的荧光生物传感器，还涉及其制备方法与应用。利用了碱基T与Hg2+之间特异性结合的特性进行检测；利用了DNAzyme的裂解循环和催化发夹自组装扩增反应起到了信号放大的作用，提高了检测的灵敏度；制备方法简单，性能稳定，适用于食品、土壤及饮用水中Hg2+的检测；制备过程的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。

Description

一种检测Hg2+荧光生物传感器及检测Hg2+的方法与应用
技术领域
本发明涉及传感器技术领域，特别涉及目标金属介导临近触发劈开金属DNAzyme催化裂解性能、催化发夹自组装放大反应的一种检测Hg2+的荧光生物传感器，还涉及其检测Hg2+的方法与应用。
背景技术
重金属污染已成为世界性的农业生态环境问题，严重威胁着现代农业、生态安全，尤其是粮食安全。一些重金属，如镉、铅、汞和砷，即使在微量水平上也被认为是剧毒和有害于人类健康的。它们可能会进入土壤和地下水，在动物和植物中积累生物，然后通过食物链进入人体。重金属离子中，汞离子（Hg2+）毒性强，在环境中广泛存在。Hg2+暴露后可引起多种不良的健康影响，如脑损伤、肾功能衰竭、免疫系统紊乱、肌肉无力、四肢瘫痪等。世界卫生组织(WHO)允许饮用水中汞的最高水平为6 ppb。因此，开发快速、痕量、高灵敏度和选择性的检测 Hg2+的分析方法是十分必要的。
发明内容
为了实现更加灵敏、特异性的检测Hg2+，本申请提出了一种目标金属介导临近触发金属DNAzyme的催化裂解性能和催化发夹自组装放大策略检测Hg2+的荧光生物传感器。
本发明的技术方案如下：
一种检测Hg2+的荧光生物传感器，包括触发链T1、触发链T2、发夹H1、发夹H2、发夹H3、发夹H4、目标物Hg2+和荧光素ThT；
所述的触发链T1序列如SEQ-ID-NO.1所示，具体为：5’-TCTCTTGGCACCCATGTAGCAGG-3’；
所述的触发链T2序列如SEQ-ID-NO.2所示，具体为：5’-AGTGGGTCAGCGATCCTTGTGT-3’；
所述的发夹H1序列如SEQ-ID-NO.3所示，具体为：5’-TGGGTAGGGCGGGTTGGGCCTGCT(rA)GCACCCACTTTCTCACCCAACAACCCGCG-3’；
所述的发夹H2序列如SEQ-ID-NO.4所示，具体为：5’-AGTGGGTCAGCGATGGTTGTTGGGTGAGAAAGTGGGTGCACCCACAAGAC CACCCACTTTCTCACCCATGTAGCAGG-3’；
所述的发夹H3序列如SEQ-ID-NO.5所示，具体为：5’-AGTGGGTCAGCGATAGAAAGTGGGTGGTCTTGTGGGTGCACCCAACAACCCAC CCACAAGACCACCCATGTAGCAGG-3’；
所述的发夹H4序列如SEQ-ID-NO.6所示，具体为：5’-AGTGGGTCAGCGATGTCTTGTGGGTGGGTTGTTGGGTGCACCCACTTTCTCACC CAACAACCCACCCATGTAGCAGG-3’；
所述的发夹H1的5’端第24个碱基上含有rA。
上述荧光生物传感器检测Hg2+的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）均相反应：将Hg2+、T1、T2、H1、H2、H3、H4和ThT混合，反应；
（2）荧光仪检测荧光强度。
优先地，所述的步骤（1）均相反应条件为： 37℃下水浴90 min。
优先地，所述的步骤（2）荧光仪设置激发波长为425nm，发射波长设置为485nm，检测范围设置450-620nm。
上述检测Hg2+的荧光生物传感器在检测水中或食品中Hg2+的应用。
该发明的检测方式是荧光检测，基于碱基T会特异性地与目标物Hg2+结合形成稳定的T-Hg2+-T结构，使得两条含有劈开金属DNAzyme序列的T1、T2临近，触发Mg2+金属DNAzyme的作用，在Mg2+存在时与H1杂交，将H1裂解为S1、S2，其中S2是一段G-rich的序列嵌入ThT后产生荧光信号，而S1可作为次级触发器，触发H2、H3和H4的催化发夹自组装形成三通路，三通路的两端临近又会形成金属DNAzyme，其进一步与H1杂交裂解释放S1、S2，以此循环进行，进而产生更多的S2产生更高的荧光信号。
本发明基于碱基T与Hg2+之间特异性的结合能力，以及DNAzyme的裂解循环和催化发夹自组装扩增反应实现信号放大，实现对目标物灵敏检测的生物传感器。该传感器具有检测速度快，检测限低，灵敏度高等优点，可以弥补 Hg2+现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的定量检测。
本发明的有益效果：
1、检测灵敏度高
利用了碱基T与Hg2+之间特异性结合的特性进行检测；利用了DNAzyme的裂解循环和催化发夹自组装扩增反应起到了信号放大的作用，提高了检测的灵敏度；
2、反应条件温和
该传感器的反应条件温和，反应速度快；检测原理的主要过程均是在均相溶液中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；
3、方法简单，易于工业化生产
制备方法简单，性能稳定，适用于食品、土壤及饮用水中Hg2+的检测；制备过程的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。
附图说明
图1为该实验的原理图；
图2为实施例1检测结果图；
图3为实施例2检测结果图；
图4为实施例3检测结果图；
图5为实施例4传感器检测Hg2+的标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1
均相反应操作步骤如下：
将Hg2+（3 µL）、T1（3 µL）、T2（3 µL）、H1（100 nM、200 nM、350 nM 、500 nM、 1 µM、1.2 µM）、H2（3 µL）、H3（3 µL）、H4（3 µL）和ThT（3 µL）加到灭菌的离心管中，震荡20-30s，于37℃下水浴90 min。
荧光仪检测荧光强度主要步骤如下：
将均相反应后的溶液稀释至100 µL，用荧光仪在485 nm处检测荧光。荧光仪激发波长设置为425 nm，发射波长设置为485 nm，检测范围450 nm—620 nm，读取荧光信号变化，检测目标物。
结果见图2，从图中可以看出，随着H1浓度的增加，实验得到的荧光强度不断增强，在H1的浓度达到1 µM之后，荧光强度基本不变。说明最适的H1浓度是1 µM。
实施例2
均相反应操作步骤如下：
将Hg2+（3 µL）、T1（3 µL）、T2（3 µL）、H1（3 µL）、H2（100 nM、200 nM、500 nM、800nM、 1 µM、1.2 µM）、H3（3 µL）、H4（3 µL）和ThT（3 µL）加到灭菌的离心管中，震荡20-30s，于37℃下水浴90 min。
荧光仪检测荧光强度主要步骤如下：
将均相反应后的溶液稀释至100 µL，用荧光仪在485 nm处检测荧光。荧光仪激发波长设置为425 nm，发射波长设置为485 nm，检测范围450 nm—620 nm，读取荧光信号变化，检测目标物。
结果见图3，从图中可以看出，随着H2浓度的增加，实验得到的荧光强度不断增强，在H2的浓度达到800 nM之后，荧光强度基本不变。说明最适的H2浓度是800 nM。
实施例3
均相反应操作步骤如下：
将Hg2+（3 µL）、T1（3 µL）、T2（3 µL）、H1（3 µL）、H2（3 µL）、H3（3 µL）、H4（3 µL）和ThT（1 µM、4 µM、8 µM、10 µM、12 µM、14µM）加到灭菌的离心管中，震荡20-30s，于37℃下水浴90 min。
荧光仪检测荧光强度主要步骤如下：
将均相反应后的溶液稀释至100 µL，用荧光仪在485 nm处检测荧光。荧光仪激发波长设置为425 nm，发射波长设置为485 nm，检测范围450 nm—620 nm，读取荧光信号变化，检测目标物。
结果见图4，从图中可以看出，随着ThT浓度的增加，实验得到的荧光强度不断增强，在ThT的浓度达到10 µM之后，荧光强度基本不变。说明最适的ThT浓度是10 µM。
实施例4
均相反应操作步骤如下：
将灭菌水、缓冲液、Hg2+（浓度分别为0pM、1 pM、5 pM、10 pM、50 pM、100 pM、500pM、1000 pM、5000 pM、10000pM、）、T1（3 µL）、T2（3 µL）、H1（3 µL）、H2（3 µL）、H3（3 µL）、H4（3 µL）和ThT（3 µL）加到灭菌的离心管中，震荡20-30s，于37℃下水浴2h。
荧光仪检测荧光强度主要步骤如下：
将均相反应后的溶液稀释至100 µL，用荧光仪在485nm处检测荧光。荧光仪激发波长设置为425nm，发射波长设置为485nm，检测范围450—620nm，读取荧光信号变化，检测目标物。
检测结果如图5所示，从图中可以看出，检测到的荧光强度峰值随着Hg2+浓度的增大而增大，得到荧光强度与Hg2+浓度的对数的线性曲线，获得回归方程为y=147.17LogC +165.92，相关系数为98.9%，由此计算优化后的生物传感器的检测限为1.33 pM。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 济南大学
<120> 一种检测Hg2+荧光生物传感器及其制备方法与应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 1
tctcttggca cccatgtagc agg 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 2
agtgggtcag cgatccttgt gt 22
<210> 3
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 3
tgggtagggc gggttgggcc tgctgcaccc actttctcac ccaacaaccc gcg 53
<210> 4
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 4
agtgggtcag cgatggttgt tgggtgagaa agtgggtgca cccacaagac cacccacttt 60
ctcacccatg tagcagg 77
<210> 5
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 5
agtgggtcag cgatagaaag tgggtggtct tgtgggtgca cccaacaacc cacccacaag 60
accacccatg tagcagg 77
<210> 6
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 6
agtgggtcag cgatgtcttg tgggtgggtt gttgggtgca cccactttct cacccaacaa 60
cccacccatg tagcagg 77

Claims (5)

1.一种检测Hg2+的荧光生物传感器，其特征在于，包括触发链T1、触发链T2、发夹H1、发夹H2、发夹H3、发夹H4、目标物Hg2+和荧光素ThT；
所述的触发链T1序列如SEQ-ID-NO.1所示，具体为：5’-TCTCTTGGCACCCATGTAGCAGG-3’；
所述的触发链T2序列如SEQ-ID-NO.2所示，具体为：5’-AGTGGGTCAGCGATCCTTGTGT-3’；
所述的发夹H1序列如SEQ-ID-NO.3所示，具体为：5’-TGGGTAGGGCGGGTTGGGCCTGCT(rA)GCACCCACTTTCTCACCCAACAACCCGCG-3’；
所述的发夹H2序列如SEQ-ID-NO.4所示，具体为：5’-AGTGGGTCAGCGATGGTTGTTGGGTGAGAAAGTGGGTGCACCCACAAGAC CACCCACTTTCTCACCCATGTAGCAGG-3’；
所述的发夹H3序列如SEQ-ID-NO.5所示，具体为：5’-AGTGGGTCAGCGATAGAAAGTGGGTGGTCTTGTGGGTGCACCCAACAACCCAC CCACAAGACCACCCATGTAGCAGG-3’；
所述的发夹H4序列如SEQ-ID-NO.6所示，具体为：5’-AGTGGGTCAGCGATGTCTTGTGGGTGGGTTGTTGGGTGCACCCACTTTCTCACC CAACAACCCACCCATGTAGCAGG-3’；
所述的发夹H1的5’端第24个碱基上含有rA。
2.一种利用如权利要求1所述的荧光生物传感器检测Hg2+的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）均相反应：将Hg2+、T1、T2、H1、H2、H3、H4和ThT混合，反应；
（2）荧光仪检测荧光强度。
3.根据权利要求2所述的荧光生物传感器检测Hg2+的方法，其特征在于，所述的步骤（1）均相反应条件为： 37℃下水浴90 min。
4.根据权利要求2所述的荧光生物传感器检测Hg2+的方法，其特征在于，所述的步骤（2）荧光仪设置激发波长为425nm，发射波长设置为485nm，检测范围设置450-620nm。
5.权利要求1所述的检测Hg2+的荧光生物传感器在检测水中或食品中Hg2+的应用。
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