CN113512578B - 基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒 - Google Patents

基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒，通过核酸互补杂交，目标miRNA特异性地打开发卡探针，发生催化发卡自组装反应，生成大量双链DNA产物，双链产物继续引发杂交链式反应，形成含有多个G‑四链体的DNA纳米线，G‑四链体与氯化血红素结合形成具有类辣根过氧化物酶催化活性的G‑四链体/氯化血红素DNAzyme。在过氧化氢的存在下，DNAzyme催化鲁米诺的氧化反应，产生多级扩增的化学发光信号。本发明试剂盒可以检测低至16 pM的miRNA；该检测方法无需荧光基团修饰、外部光源和蛋白酶介入，通过多级扩增反应即可有效提高miRNA检测的灵敏度，从而解决了现有检测方法由于自发荧光、荧光漂白、串光以及稳定性低导致的灵敏度有限的难题。

Description

基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学和医学检测领域，具体涉及到一种基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒。
背景技术
MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的小RNA，在细胞内具有多种重要的调节作用，其异常表达与癌症的进程密切相关，可以作为肿瘤标志物，为癌症的早期诊断、预后和相关生物学功能研究提供重要信息。
然而，由于miRNA序列短、含量低、同源性高等特点，限制了miRNA的检测应用。因此，发展高灵敏度、高特异性的miRNA检测方法对实现癌症的早期诊断具有重要意义。核酸扩增技术是生物学和医学等领域的一项重要技术，广泛应用于目标物检测，可以对一些特异性的病原体或疾病标记物进行识别。其中，恒温无酶核酸扩增技术对仪器的要求大大简化，反应时间大大缩短，且反应条件也不受酶反应环境的制约，主要包括催化发夹自组装(CHA)、杂交链式反应(HCR)和核酸酶(DNAzyme)介导的反应，适用性更强，相比于传统检测手段，该试剂盒更简单灵敏。但是目前还没有一种基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒，其中，所述miRNA-21的序列如表1所示，具体为UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA。
基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒由DNA粉末、反应底物和缓冲溶液组成，所述的DNA粉末包括发卡H1、发卡H2、发卡H3、发卡H4、发卡H5、发卡H6、发卡H7，具体序列如下：
H1核酸分子序列如SEQ ID NO：1，
H2核酸分子序列如SEQ ID NO：2，
H3核酸分子序列如SEQ ID NO：3，
H4核酸分子序列如SEQ ID NO：4，
H5核酸分子序列如SEQ ID NO：5，
H6核酸分子序列如SEQ ID NO：6，
和/或H7核酸分子序列如SEQ ID NO：7。
所述的反应底物包括氯化血红素、鲁米诺和过氧化氢溶液；
所述的缓冲溶液为HEPES缓冲液(10mM HEPES缓冲溶液，pH＝7.5，含有600mM氯化钠和50mM氯化钾)。
发卡H1、发卡H2、发卡H3、发卡H4、发卡H5、发卡H6的摩尔浓度比为1-2：1-2：6-7：8-9：7-8：8-9；或者所述的发卡H1、发卡H2、发卡H3、发卡H4、发卡H5、发卡H6、发卡H7的摩尔浓度比为1-2：1-2：6-7：8-9：7-8：8-9：0.3-0.8。
作为优选方案，所述的发卡H1、发卡H2、发卡H3、发卡H4、发卡H5、发卡H6的摩尔浓度比为2：2：6：8：7：8；或者所述的发卡H1、发卡H2、发卡H3、发卡H4、发卡H5、发卡H6、发卡H7的摩尔浓度比为2：2：6：8：7：8：0.5。
基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒检测miRNA-21的方法，包括如下步骤：
(1)用HEPES缓冲溶液分别将发卡H1、发卡H2、发卡H3、发卡H4、发卡H5、发卡H6、发卡H7粉末配制为100μM溶液，震荡分散均匀，然后分别退火，再按摩尔浓度比进行混合，加入目标物miRNA-21，共同孵育12小时，再加入氯化血红素溶液，孵育1小时得到反应液，然后将反应液稀释20倍；
(2)向稀释20倍的反应液中加入鲁米诺溶液后，置于发光杯中，快速注入过氧化氢溶液，通过微弱化学发光测量仪检测化学发光信号，实现对miRNA-21的检测；
所述的H1核酸分子序列如SEQ ID NO：1，
H2核酸分子序列如SEQ ID NO：2，
H3核酸分子序列如SEQ ID NO：3，
H4核酸分子序列如SEQ ID NO：4，
H5核酸分子序列如SEQ ID NO：5，
H6核酸分子序列如SEQ ID NO：6，
和/或H7核酸分子序列如SEQ ID NO：7。
步骤(1)中发卡H1、发卡H2、发卡H3、发卡H4、发卡H5、发卡H6的摩尔浓度比为1-2：1-2：6-7：8-9：7-8：8-9；或者所述的发卡H1、发卡H2、发卡H3、发卡H4、发卡H5、发卡H6、发卡H7的摩尔浓度比为1-2：1-2：6-7：8-9：7-8：8-9：0.3-0.8。
作为优选方案，所述的发卡H1、发卡H2、发卡H3、发卡H4、发卡H5、发卡H6的摩尔浓度比为2：2：6：8：7：8；或者所述的发卡H1、发卡H2、发卡H3、发卡H4、发卡H5、发卡H6、发卡H7的摩尔浓度比为2：2：6：8：7：8：0.5。
本发明的又一技术方案是将所述的基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒在制备检测细胞裂解液中的miRNA-21的含量的药物上的应用。
所述的基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒通过检测细胞裂解液中的miRNA-21的含量在制备区分肿瘤细胞与正常细胞的药物中的应用，所述的肿瘤细胞包括HepG2、或HL-7702细胞。
本发明具有以下优点：本发明的试剂盒中，miRNA-21能引发上游CHA反应，生成的产物能够继续引发下游HCR，同时激活DNAzyme，产生多重级联放大的化学发光信号，具有稳定性好、灵敏度高和特异性强的优点。当存在miRNA-21时，能形成含有多个G-四链体结构的DNA纳米线，与氯化血红素复合后，大大提高催化活性；另外，基于核酸纳米结构的限域化作用，还能大大增加了反应物的利用率。本发明试剂盒不需外部激发光源，可以避免自发荧光、荧光漂白和串光等问题，具有较低的背景信号；本发明试剂盒所使用的发卡探针不需经过荧光基团修饰，大大减低检测成本；本发明试剂盒基于恒温无酶多级串联CHA-HCR-DNAzyme核酸扩增反应，能够有效提高miRNA检测的特异性和灵敏性，为癌症的早期诊断、治疗和预后判断提供高效的新方法。通过改变功能发卡H7的序列，也可以对其他核酸、蛋白等生物分子进行检测。
表1：文中所涉及核酸分子的序列
Figure BDA0003133577790000031
附图说明
附图1为本发明检测目标物的原理图。
附图2为CHA与HCR比值优化图。
附图3为机理验证图。
附图4为优化发卡H3浓度图。
附图5为优化发卡H5浓度图。
附图6为优化发卡H1浓度图。
附图7为CHA-HCR-DNAzyme、CHA-DNAzyme及HCR-DNAzyme的信号扩增效果图。
附图8为基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒对不同浓度miRNA-21的检测图。
图9为基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒对不同细胞裂解液中miRNA-21的检测图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明做进一步描述，本发明的保护范围不局限于以下所述。
本发明的实施例中所用到的各试剂如下：
HEPES：购自Sigma，99.5％；
HEPES钠盐：购自Sigma，96％；
氯化钠：购自Sigma，99％；
氯化钾：购自国药集团化学试剂有限公司，含量≥99.5％；
鲁米诺：购自Sigma，≥97％(HPLC)；
氯化血红素：购自Sigma，≥97％(HPLC)；
30％过氧化氢溶液：购自成都市科隆化学品有限公司；
二甲亚砜：购自国药集团化学试剂有限公司；
DEPC水：多聚甲醛和焦碳酸二乙酯处理过的水，购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
HEPES缓冲液(10mM HEPES缓冲溶液，pH＝7.5，含有600mM氯化钠和50mM氯化钾)配制方法：称取0.834g HEPES、0.2603g HEPES钠盐、17.49g氯化钠、1.8638g氯化钾于烧杯中，加入DEPC水溶解后定容至500mL，然后在25℃条件下用1M的氢氧化钠溶液调pH至7.5；
DNA母液(100μM)的配制方法：DNA粉末经TE buffer(pH＝8.0)按照DNA管上标签提示量溶解，-20℃保存。
氯化血红素溶液(4μM)的配制方法：称取0.0326g氯化血红素粉末溶于5mL二甲亚砜，得到10mM的氯化血红素溶液，用二甲亚砜逐级稀释至4μM即可；
鲁米诺溶液(250μM)的配制方法：称取0.025g鲁米诺粉末溶于2.5ml浓氨水中，再加入25ml DEPC水进行稀释，得到5mM鲁米诺溶液，再取1μL 5mM鲁米诺溶液加入19μLHEPES溶液，得到250μM的鲁米诺溶液；
H2O2溶液(1.5mM)的配制方法：取2μL 30％H2O2溶液溶于17.58μL HEPES溶液中，得到1M的H2O2溶液，取1μL 1M的H2O2溶液溶于9μL HEPES溶液中，得到100mM的H2O2溶液，最后取1.8μL 100mM的H2O2溶液溶于118.2μL HEPES溶液中，即可得到浓度为1.5mM的H2O2溶液。
发卡探针的设计构思如下：运用NUPACK软件设计相关发卡探针，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成相关核酸序列。附图1为多级扩增反应用于目标物检测的原理图，目标物I首先通过链置换反应打开发夹H1得到I-H1中间体，随后发夹H2取代I-H1中的I，生成产物H1-H2，取代下来的I继续参与H1和H2的反应生成多个双链产物H1-H2。产物H1-H2使T的两部分序列靠近，从而引发下游HCR。T通过链置换反应，依次打开发夹H3、H4、H5和H6，生成中间产物T-H3-H4-H5-H6，并露出与T相同的序列，继续引发发夹的依次打开，最后生成长的双链DNA纳米线，即T-(H3-H4-H5-H6)N。DNA纳米线能够拉近修饰在发夹H3和H5上的两部分G4序列的距离，形成完整的G4，加入hemin之后，形成具有类辣根过氧化物酶催化活性的G4/hemin DNAzyme，在过氧化氢的存在下，DNAzyme催化鲁米诺发光，且发光强度与目标物浓度呈正相关，通过此种方法达到检测目标物的目的。
实施例1
为了提高信号放大效果，对DNA孵育溶液中CHA(包括发卡H1、H2)和HCR(包括发卡H3、H4、H5、H6)反应物的浓度比值进行优化。具体为CHA和HCR的发卡反应物浓度比值为4：1、2：1、1：1、1：2、1：4。
首先将1μL单个发卡母液与15.67μL HEPES缓冲液混合均匀后，得到浓度为6μM的单个发卡溶液，再通过PCR仪在95℃保持5min、25℃保持2h的条件下分别进行退火。
然后，按照不同的浓度比值将反应物发卡混合，例如，CHA和HCR浓度比值为4：1时的具体操作为，取5.83μL的发卡H1和H2，以及1.46μL的发卡H3、H4、H5和H6，加入25μL HEPES缓冲液，得到CHA和HCR浓度比值为4:1的核酸孵育液。其他比例关系依此进行换算，不同CHA和HCR发卡浓度比的核酸孵育液与1.25μL I(可以引发CHA反应和CHA-HCR-DNAzyme反应的目标物)共孵育12小时，加入9.85μL浓度为4μM的氯化血红素溶液，1小时后得到含有G-四链体/氯化血红素DNAzyme的反应液，将反应液稀释20倍，向稀释20倍的反应液中加入13.13μL浓度为250μM的鲁米诺溶液，混合均匀后放入发光杯中，随后注入108.27μL浓度为1.5mM的过氧化氢溶液，立即通过微弱化学发光测量仪检测化学发光信号。试验结果如图2所示，通过对比不同CHA和HCR发卡浓度比值下的信背比，发现当比值为1:4时，信背比最大，所以最终确定1:4为最优的CHA和HCR发卡浓度比值。
实施例2
本实施例设计了反应体系中依次缺少单个发卡的对照实验，检测不同实验组产生的化学发光信号，方法及各原料的量同实施例1。
实验结果如附图3所示。当从上游CHA中去掉发夹H1或H2，或者从下游HCR中去掉发夹H3、H4和H5时，目标物引发的反应荧光均较低，证明上游CHA或者下游HCR被阻断时，CHA-HCR-DNAzyme无法发生信号放大。当从下游HCR中去掉发夹H6时，目标物引发的反应会产生较小的荧光，这是由于此时的反应等同于CHA反应，缺发夹H6的HCR只能作为信号输出工具，而不再放大信号。同样的，在无目标物的缺发夹体系中荧光也较低。由此说明CHA-HCR-DNAzyme反应只能在上游CHA和下游HCR的反应物共同存在时，加入目标物之后，才能产生多级放大的化学发光信号。
实施例3
本实施例对发卡浓度进行了优化。通过缺发卡试验，得出发卡H1、H3和H5产生的背景信号较大，进一步优化H1、H3或H5单个发卡的浓度，得到最佳反应浓度，具体操作步骤及其他试剂的量均同实施例1。具体调节内容如下：
H3：500nM、600nM、700nM、800nM，结果如图4所示。
H5：500nM、600nM、700nM、800nM，结果如图5所示。
H1：50nM、100nM、150nM、200nM，结果如图6所示。
通过改变上述H1、H3、H5的发卡浓度，发现当发卡H1为200nM、H3为600nM及H5为700nM时的信背比最高，所以最终确定核酸孵育液中，发卡H1、H2、H3、H4、H5和H6的浓度依次为200nM、200nM、600nM、800nM、700nM、800nM。
实施例4
为了验证多级信号扩增效果以及检测能力，我们通过设计了二级CHA-DNAzyme和HCR-DNAzyme反应，将其与多级CHA-HCR-DNAzyme反应的检测效果进行比较。
多级CHA-HCR-DNAzyme反应由42.5μL的DNA孵育溶液和131.25μL的反应底物溶液组成。所述DNA孵育溶液包括1.46μL发卡H1、1.46μL发卡H2、4.38μL发卡H3、5.83μL发卡H4、5.11μL发卡H5、5.83μL发卡H6和18.43μL HEPES缓冲液；131.25μL的反应底物溶液包括9.85μL氯化血红素溶液、13.13μL鲁米诺溶液和108.27μL过氧化氢溶液。取1μL 100μM的单个发卡母液，与15.67μL HEPES缓冲液混合均匀后，得到浓度为6μM的单个发卡溶液。将6μM的单个发卡溶液通过PCR仪在温度为95℃保持5min、25℃保持2h的条件下进行退火。退火之后按照上述发卡体积进行混合，混合后加入1.25μLI(可以引发CHA-DNAzyme反应和CHA-HCR-DNAzyme反应的目标物)，最终保证在整个核酸孵育液中发卡H1和H2浓度为200nM，发卡H3为600nM、H4为800nM、H5为700nM和H6为800nM。6个发卡与I共孵育12h后，加入4μM的氯化血红素溶液，反应1h后得到反应液，将反应液稀释20倍，再加入13.13μL的250μM的鲁米诺溶液，混合均匀后放入发光杯中，随后注入108.27μL的1.5mM的过氧化氢溶液，立即通过微弱化学发光测量仪检测化学发光信号。
实施例4-1
为证明该检测试剂盒具有较高的灵敏性和放大效果，将其与其它两种试剂盒做对比：即基于二级CHA-DNAzyme核酸扩增反应的化学发光检测试剂盒：目标物为I(能够引发CHA-DNAzyme和CHA-HCR-DNAzyme反应的目标物)，由42.5μL的DNA孵育溶液和131.25μL的反应底物溶液组成；所述的DNA孵育溶液包括1.46μL发卡H1、1.46μL发卡H2、4.38μL发卡H3、5.83μL发卡H4、5.11μL发卡H5和24.26μL HEPES缓冲溶液；发卡退火浓度及反应底物溶液与基于恒温无酶多级核酸扩增反应的miRNA化学发光检测试剂盒相同。
实施例4-2
基于二级HCR-DNAzyme核酸扩增反应的化学发光检测试剂盒：目标物为T(能够引发HCR-DNAzyme反应的目标物)，由42.5μL的DNA孵育溶液和131.25μL的反应底物溶液组成；所述的DNA孵育溶液包括4.38μL发卡H3、5.83μL发卡H4、5.11μL发卡H5、5.83μL发卡H6和21.35μL HEPES缓冲溶液，发卡退火浓度及反应底物溶液与基于恒温无酶多级核酸扩增反应的miRNA化学发光检测试剂盒相同。
实施例4、实施例4-1、实施例4-2三种试剂盒对不同浓度的目标物的检测结果如附图7所示，实施例4中的测试剂盒相比于其它两种检测试剂盒，可以检测更低浓度的目标物，且对同一浓度的目标物检测时，信号放大效果更明显，如图所示，在目标物浓度为5nM时，基于二级CHA-DNAzyme核酸扩增反应的化学发光检测试剂盒的化学发光强度只有2300左右，基于二级HCR-DNAzyme核酸扩增反应的化学发光检测试剂盒的化学发光强度只有1600左右，而基于多级CHA-HCR-DNAzyme核酸扩增反应的化学发光检测试剂盒的化学发光强度有6800左右，证明本发明所设计的多级扩增试剂盒的信号扩增效果更好，而且，通过线性曲线计算可得，CHA-DNAzyme、HCR-DNAzyme和CHA-HCR-DNAzyme的检测限分别为0.41nM、2.67nM和0.021nM，明显可以看出，本发明所设计的多级扩增试剂盒的检测灵敏度更高。
实施例5
一种基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒用于溶液中miRNA-21的检测。
所述试剂盒由43.75μL的核酸孵育溶液和131.25μL的反应底物溶液组成；所述的核酸孵育溶液包括1.46μL发卡H1、1.46μL发卡H2、4.38μL发卡H3、5.83μL发卡H4、5.11μL发卡H5、5.83μL发卡H6、2.19μL发卡H7、1.25μL miRNA-21和16.24μL HEPES缓冲溶液；131.25μL的反应底物溶液包括9.85μL氯化血红素溶液、13.13μL鲁米诺溶液和108.27μL过氧化氢溶液。发卡H1-H6在浓度为6μM时、发卡H7在浓度为1μM时进行退火，退火条件为95℃保持5min、25℃保持2h，退火之后按照上述发卡体积进行混合，再加入1.25μL不同浓度的miRNA-21，保证在核酸孵育液中发卡H1和H2浓度为200nM，发卡H3为600nM、H4为800nM、H5为700nM、H6为800nM、H7为50nM。发卡与miRNA-21共孵育12h后，加入4μM的氯化血红素溶液，室温下反应1h，将反应液稀释20倍，再加入13.13μL的250μM的鲁米诺溶液，混合均匀后放入发光杯中，随后注入108.27μL的1.5mM的过氧化氢溶液，立即通过微弱化学发光测量仪检测化学发光信号。该检测试剂盒的检测效果如附图8所示，化学发光强度与miRNA-21浓度呈现良好的线性关系，在miRNA-21浓度为0-100pM范围内，得到线性曲线为y＝11738.11795+29.7558*x(R2＝0.9939)，计算出检测限为16pM，能够通过检测化学发光强度来计算样品中miRNA-21的浓度，从而实现miRNA-21的高灵敏检测。
实施例6
一种基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒用于细胞中miRNA-21的检测。
用胰酶分别将2×106个人肝癌细胞(HepG2)和人正常肝细胞(HL-7702)消化，分散在1mL的PBS溶液中，在1000rpm下离心5min，除去PBS溶液，将细胞重新分散在250μL的Tris-HCl溶液中，通过超声波细胞粉碎机在0℃下粉碎20min，最后在4℃下，12000rpm离心20min，得到的上清液为细胞裂解液。
所述试剂盒由43.75μL的核酸孵育溶液和131.25μL的反应底物溶液组成；所述的核酸孵育溶液包括1.46μL发卡H1、1.46μL发卡H2、4.38μL发卡H3、5.83μL发卡H4、5.11μL发卡H5、5.83μL发卡H6、2.19μL发卡H7、1.25μL miRNA-21和16.24μL HEPES缓冲溶液；131.25μL的反应底物溶液包括9.85μL氯化血红素溶液、13.13μL鲁米诺溶液和108.27μL过氧化氢溶液。发卡H1-H6在浓度为6μM时、发卡H7在浓度为1μM时进行退火，退火条件为95℃保持5min、25℃保持2h，退火之后按照上述发卡体积进行混合，再分别加入1.25μL不同细胞裂解液，保证在核酸孵育液中发卡H1和H2浓度为200nM，发卡H3为600nM、H4为800nM、H5为700nM、H6为800nM、H7为50nM。发卡与细胞裂解液共孵育12h后，加入4μM的氯化血红素溶液，室温下反应1h，将反应液稀释20倍，再加入13.13μL的250μM的鲁米诺溶液，混合均匀后放入发光杯中，随后注入108.27μL的1.5mM的过氧化氢溶液，立即通过微弱化学发光测量仪检测化学发光信号，不同细胞内化学发光强度如图9所示。通过实施例5中的线性曲线(图8)换算得到HepG2和HL-7702细胞中的miRNA-21的浓度分别为92.3pM和19.8pM，HepG2细胞中的miRNA-21比HL-7702细胞中的高，因此，该试剂盒能够通过检测化学发光强度来计算细胞中miRNA-21的浓度，通过细胞中miRNA-21含量的不同为区分癌细胞和正常细胞提供一定的数据支撑。
SEQUENCE LISTING
Figure BDA0003133577790000091
Figure BDA0003133577790000101
Figure BDA0003133577790000111
SEQUENCE LISTING
<110> 三峡大学
<120>基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒
<160> 10
<210> 1
<211>54
<212> RNA
<213> H1
<400> 1
CTCTATCATTATCTTGCTTCATCTTCATCAAGATAATGATAGAGACCGACACTC
<210> 2
<211>53
<212> RNA
<213> H2
<400> 2
GCTTCATCTTCATCTTCTCTATCATTATCTTGATGAAGATGAAGCAAGATAAT
<210> 3
<211>60
<212> RNA
<213> H3
<400> 3
GAGTGTCGGAGATGAAGATGAAGCCATCGTGCTTCATCTTCATCTCCGTGGGTAGGGCGG
<210> 4
<211>48
<212> RNA
<213> H4
<400> 4
GCTTCATCTTCATCTCCGGTTTTGCGGAGATGAAGATGAAGCACGATG
<210> 5
<211>54
<212> RNA
<213> H5
<400> 5
GTGGGTCAAAACCGGAGATGAAGATGAAGCTTGCCTGCTTCATCTTCATCTCCG
<210> 6
<211>48
<212> RNA
<213> H6
<400> 6
GCTTCATCTTCATCTCCGACACTCCGGAGATGAAGATGAAGCAGGCAA
<210> 7
<211>62
<212> RNA
<213> H7
<400> 7
TCAACATCAGTCTGATAAGCTAAGAGTGTCGGTCTCTATCATTATCTTAGCTTATCAGACTG
<210> 8
<211>25
<212> RNA
<213> I
<400> 8
GAGTGTCGGTCTCTATCATTATCTT
<210> 9
<211>24
<212> RNA
<213> T
<400> 9
GCTTCATCTTCATCTCCGACACTC
<210> 10
<211>24
<212> RNA
<213> miR-21
<400> 10
UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA

Claims (10)

1.一种基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由发卡核酸和反应底物组成，所述的发卡核酸包括发卡H1、发卡H2、发卡H3、发卡H4、发卡H5、发卡H6及羟乙基哌嗪乙硫磺酸盐缓冲液；
H1核酸分子序列如SEQ ID NO：1，
H2核酸分子序列如SEQ ID NO：2，
H3核酸分子序列如SEQ ID NO：3，
H4核酸分子序列如SEQ ID NO：4，
H5核酸分子序列如SEQ ID NO：5，
H6核酸分子序列如SEQ ID NO：6；
所述的反应底物包括氯化血红素粉末、鲁米诺粉末和30%过氧化氢溶液。
2.根据权利要求1所述的基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述的发卡还包括H7，H7核酸分子序列如SEQ ID NO：7。
3.根据权利要求2所述的基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒，其特征在于，发卡H1、发卡H2、发卡H3、发卡H4、发卡H5、发卡H6的摩尔浓度比为1-2：1-2：6-7：8-9：7-8：8-9；或者所述的发卡H1、发卡H2、发卡H3、发卡H4、发卡H5、发卡H6、发卡H7的摩尔浓度比为1-2：1-2：6-7：8-9：7-8：8-9：0.3-0.8。
4.根据权利要求3所述的基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒，其特征在于，发卡H1、发卡H2、发卡H3、发卡H4、发卡H5、发卡H6的摩尔浓度比为2：2：6：8：7：8；或者所述的发卡H1、发卡H2、发卡H3、发卡H4、发卡H5、发卡H6、发卡H7的摩尔浓度比为2：2：6：8：7：8：0.5。
5.一种基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）分别将溶于HEPES的发卡H1、发卡H2、发卡H3、发卡H4、发卡H5、发卡H6和发卡H7退火，然后按摩尔比混合，加入miRNA和HEPES共同孵育12小时，再加入氯化血红素溶液孵育1小时，然后将反应液稀释20倍；
（2）向稀释20倍的反应液中加入鲁米诺溶液后，置于发光杯中，快速注入过氧化氢溶液，通过微弱化学发光测量仪检测化学发光信号，实现对miRNA的检测；
所述的H1核酸分子序列如SEQ ID NO：1，
H2核酸分子序列如SEQ ID NO：2，
H3核酸分子序列如SEQ ID NO：3，
H4核酸分子序列如SEQ ID NO：4，
H5核酸分子序列如SEQ ID NO：5，
H6核酸分子序列如SEQ ID NO：6。
6.根据权利要求5所述的基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述的发卡还包括H7，H7核酸分子序列如SEQ ID NO：7。
7.根据权利要求6所述的基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒的制备方法，其特征在于，发卡H1、发卡H2、发卡H3、发卡H4、发卡H5、发卡H6的摩尔浓度比为1-2：1-2：6-7：8-9：7-8：8-9；
或者所述的发卡H1、发卡H2、发卡H3、发卡H4、发卡H5、发卡H6、发卡H7的摩尔浓度比为1-2：1-2：6-7：8-9：7-8：8-9：0.3-0.8。
8.根据权利要求7所述的基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述的发卡H1、发卡H2、发卡H3、发卡H4、发卡H5、发卡H6的摩尔浓度比为2：2：6：8：7：8；或者所述的发卡H1、发卡H2、发卡H3、发卡H4、发卡H5、发卡H6、发卡H7的摩尔浓度比为2：2：6：8：7：8：0.5。
9.根据权利要求1-4任一项所述的基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒在制备检测细胞裂解液中的miRNA-21的含量的试剂上的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，所述的基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒通过检测细胞裂解液中的miRNA-21的含量在制备区分肿瘤细胞与正常细胞的试剂中的应用，所述的肿瘤细胞包括HepG2、或HL-7702细胞。
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