CN114397256B - 一种检测MicroRNA-17的生物传感器 - Google Patents
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Abstract
本发明属于传感器技术领域，提供了一种检测微MicroRNA的生物传感器，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1‑6所示的crRNA，发夹探针pre‑trigger、H1、H2、H3、H4和Cas13a蛋白、血红素、鲁米诺试剂、H2O2。该生物传感器实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；制作该生物传感器的工艺成本低，且反应条件温和，反应速度快。
Description
技术领域
本发明属于传感器技术领域，特别涉及一种核酸适配体检测MicroRNA-17的生物传感器。
背景技术
MicroRNA (miRNA)在正常组织、良性肿瘤和恶性肿瘤中表达水平的不同，使其成为肿瘤诊断和预后评估的重要生物标志物，这就凸显了发展高敏感性和特异性miRNA检测的紧迫性和重要性。然而，传统的实验方法如Northern blotting、RT-PCR等因为其复杂的实验过程和较低的灵敏度限制了其应用。
CRISPR-Cas系统(clustered regularly interspaced short palindromicrepeats and crispr associated protein)作为原核生物的适应性免疫系统，已被广泛应用于真核生物的基因编辑。由前体crRNA (pre-crRNA)加工产生的成熟CRISPR RNA(crRNA)对形成活性CRISPR效应复合物至关重要。Cas13a的特别之处在于，Cas13a一旦识别并切割由crRNA序列指定的RNA目标，它就转入了一种酶促“激活”状态，这时它将结合并切割其他的RNA。因cas13a蛋白具有高保真度和独特的靶标激活侧切活性，使该策略具有较高的灵敏度和特异性。
发明内容
为了实现对MicroRNA-17更加灵敏、快速、低成本的检测，本发明提供了一种检测微MicroRNA的生物传感器。
一种检测MicroRNA-17的生物传感器，包括核苷酸序列如SEQ ID NO: 1-6所示的crRNA，发夹探针pre-trigger、H1、H2、H3、H4和Cas13a蛋白、血红素、鲁米诺试剂、H2O2。
优选地，上述传感器中还包括miRNA-17标准溶液。
上述生物传感器可用于制备检测miRNA-17试剂盒。
上述生物传感器或试剂盒在检测miRNA-17中的应用。
具体地，上述应用包括以下步骤：
（1）将发夹探针pre-trigger、H1、H2、H3、H4和缓冲溶液共孵育，在水浴锅中完成退火，获得产物液；
（2）将cas蛋白、crRNA、产物液及待测溶液在缓冲溶液中孵育，获得反应液；
（3）在反应液中依次加入血红素、鲁米诺试剂和H2O2溶液，进行分光光度测定。
优选地，所述Cas13a蛋白与crRNA的摩尔比为2:1。
优选地，步骤（3）中，检测波长为400 nm-600 nm。
本发明的检测原理如下：
本发明的传感器在对miRNA-17（CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG）进行检测时用到以下序列：
crRNA：GACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACUAAAACCUACCUGCACUGUAAGCAC UUUG；
pre-trigger：GGAATGTGTCACATTUUAATGTGTCACATTCC；
H1：AATGTGACACATTTAAGCCACGAGTGTC；
H2：GACACTCGTGGGACAGACGACACACGAG；
H3：CTCGTGTGTCGTCCTATCAGATGCCTACGACAC；
H4：GTGTCGTAGGCATCGGACACTCGTGGCTTAGATGCCT；
其中crRNA和miRNA-17的斜体部分为互补序列，pre-tirgger和H1中单下划线部分为互补序列，H1和H2中斜体部分为互补序列，H2和H3中单下划线部分为互补序列，H3和H4中斜体部分为互补序列，H4和H1中单下划线部位为互补序列；
如图1所示，当目标物存在时，可与crRNA结合，激活Cas13a的反式切割活性，将pre-trigger切断，使发夹pre-trigger之间不稳定，形成两条trigger链。两条trigger链都可以打开H1，H1又继而打开H2，H2打开H3，H3打开H4，触发杂交链反应（HCR反应），而H4又可与H1结合，释放trigger链，使其可以参与下一个循环。H1、H2、H3、H4的末端均为富G序列，通过上述无限次循环实现指数放大，产生大量的G四联体实现信号放大；
随着各发卡探针暴露出G四联体，当加入血红素时，组装成类过氧化物酶，在H2O2存在时，进行氧化还原反应，催化鲁米诺试剂发光，从而通过测量化学发光强度来定量检测目标产物。
本发明具有以下优点：
本发明利用Cas13/crRNA复合体对miRNA-17的特异性识别和反式切割活性，利用trigger引发的杂交链反应实现了对目标物的循环放大；利用发夹末端的富G序列形成G四链体，通过类过氧化物酶催化鲁米诺试剂反应，实现了信号的检测。由于该传感器无酶参与，其检测方法操作简便、检测速度快。该传感器的构建简单，仅需两步，有效避免了多步加入样品可能带来的污染、繁琐的样品前处理过程，具有操作简单、反应速度快等优势；检测原理的主要过程均是在均相中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；制作该生物传感器的工艺成本低，且反应条件温和，反应速度快。
附图说明
图1为该实验的原理图；
图2为pre-trigger浓度优化检测结果图；
图3为H1浓度优化检测结果图；
图4为反应时间优化检测结果图；
图5为传感器检测miRNA-17的工作曲线。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 pre-trigger浓度优化
（1）在1.5 mL离心管中，加入发夹pre-trigger（终浓度分别为0.4 μM，0.6 μM，0.8μM，1.0 μM，1.2 μM，1.4 μM）、H1（10 µM）、H2（10 µM）、H3（10 µM）、H4（10 µM）各10 µL，加入10 µL10×buffer2.1，震荡混匀后放入95℃水浴锅5 min，然后冷却至室温；
（2）取2 µL cas13a蛋白（100 nM）、2 µL crRNA（50 nM）、1 µL miRNA-17、26.7 µL灭菌水加入上述所得的溶液中，将离心管置于37℃水浴锅中反应75 min；
（3）加入3 µL血红素、3 µL鲁米诺试剂、3.3 µL过氧化氢，荧光仪在420 nm处检测化学发光峰值。化学发光光谱测量范围是400 nm到600 nm，读取荧光信号变化，检测目标物；
结果见图2，从图中可以看出，检测到的化学发光强度峰值随着pre-trigger的浓度增大而增大，当浓度超过1.0 μM后，化学发光强度趋于稳定。所以pre-trigger的最佳浓度为1.0 μM。
实施例2 H1浓度优化
（1）在1.5 mL离心管中，加入发夹pre-trigger（10 µM）、H1（终浓度分别为0.4 μM，0.6 μM，0.8 μM，1.0 μM，1.2 μM，1.4 μM）、H2（10 µM）、H3（10 µM）、H4（10 µM）各10 µL，加入10 µL10×buffer2.1，震荡混匀后放入95℃水浴锅5 min，然后冷却至室温；
（2）取2 µL cas13a蛋白（100 nM）、2 µL crRNA（50 nM）、1 µL miRNA-17、26.7 µL灭菌水加入上述所得的溶液中，将离心管置于37℃水浴锅中反应75 min；
（3）加入3 µL血红素、3 µL鲁米诺试剂、3.3 µL过氧化氢，荧光仪在420 nm处检测化学发光峰值。化学发光光谱测量范围是400 nm到600 nm，读取荧光信号变化，检测目标物；
结果见图3，从图中可以看出，检测到的化学发光强度峰值随着H1的浓度增大而增大，当浓度超过1.0 μM后，化学发光强度趋于稳定。所以H1的最佳浓度为1.0 μM。
实施例3 反应时间优化
（1）在1.5 mL离心管中，加入发夹pre-trigger（10 µM）、H1（10 µM）、H2（10 µM）、H3（10 µM）、H4（10 µM）各10 µL，加入10 µL10×buffer2.1，震荡混匀后放入95℃水浴锅5min，然后冷却至室温；
（2）取2 µL cas13a蛋白（100 nM）、2 µL crRNA（50 nM）、1 µL miRNA-17、26.7 µL灭菌水加入上述所得的溶液中，将离心管置于37℃水浴锅中反应30 min、45 min、60 min、75 min、90 min、105 min、120 min；
（3）加入3 µL血红素、3 µL鲁米诺试剂、3.3 µL过氧化氢，荧光仪在420 nm处检测化学发光峰值。化学发光光谱测量范围是400 nm到600 nm，读取荧光信号变化，检测目标物；
结果见图3，从图中可以看出，检测到的化学发光强度峰值随着时间延长而增大，当时间超过75 min后，化学发光强度趋于稳定。所以最佳反应时间为75 min。
应用例1 生物传感器对miRNA-17的检测
（1）在1.5 mL离心管中，加入发夹pre-trigger（10 µM）、H1（10 µM）、H2（10 µM）、H3（10 µM）、H4（10 µM）各10 µL，加入10 µL10×buffer2.1，震荡混匀后放入95℃水浴锅5min，然后冷却至室温；
（2）取2 µL cas13a蛋白（100 nM）、2 µL crRNA（50 nM）、1 µL miRNA-17（0 nM、5nM、100 nM、200 nM、500 nM、1 µM、2 µM、4 µM）、26.7 µL灭菌水加入上述所得的溶液中，将离心管置于37℃水浴锅中反应75 min；
（3）加入3 µL血红素、3 µL鲁米诺试剂、3.3 µL过氧化氢，荧光仪在420 nm处检测化学发光峰值。化学发光光谱测量范围是400 nm到600 nm，读取荧光信号变化，检测目标物；
结果见图5，从图中可以看出，检测到的荧光信号强度随着miRNA-17的浓度在0.1µM - 4 µM区间内逐渐上升；且miRNA浓度的对数与荧光强度大小呈正比关系，拟合曲线为I=411.05137+433.47807 lgC（nM）（相关系数是0.999，其中C代表了miRNA的浓度），经检测，当浓度低于100nM时，miRNA浓度的对数与荧光大小不再符合拟合曲线规律。因此，可得到该方法检测miRNA的下限为100 nM。
序列表
<110> 济南大学
<120> 一种检测MicroRNA-17的生物传感器
<130> 20211125-2
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 53
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> crRNA
<400> 1
gaccacccca aaaaugaagg ggacuaaaac cuaccugcac uguaagcacu uug 53
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pre-trigger
<400> 2
ggaatgtgtc acattuuaat gtgtcacatt cc 32
<210> 3
<211> 28
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aatgtgacac atttaagcca cgagtgtc 28
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H2
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gacactcgtg ggacagacga cacacgag 28
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<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H3
<400> 5
ctcgtgtgtc gtcctatcag atgcctacga cac 33
<210> 6
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H4
<400> 6
gtgtcgtagg catcggacac tcgtggctta gatgcct 37
Claims (8)
1.一种检测MicroRNA-17的生物传感器，其特征在于，包括crRNA、发夹探针pre-trigger、H1、H2、H3、H4、Cas13a蛋白、血红素、鲁米诺试剂和H2O2；
所述crRNA的核苷酸序列为：
GACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACUAAAACCUACCUGCACUGUAAGCACUUUG；
所述pre-trigger的核苷酸序列为：
GGAATGTGTCACATTUUAATGTGTCACATTCC；
所述H1的核苷酸序列为：
AATGTGACACATTTAAGCCACGAGTGTC ；
所述H2的核苷酸序列为：
GACACTCGTGGG ACAGACGACACACGAG；
所述H3的核苷酸序列为：
CTCGTGTGTCGTCCTATCAGATGCCTACGACAC ；
所述H4的核苷酸序列为：
GTGTCGTAGGCATC GGACACTCGTGGCTTAGATGCCT。
2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，还包括miRNA-17标准溶液。
3.一种包含权利要求1-2任一所述生物传感器的检测miRNA-17的试剂盒。
4.一种如权利要求1-2任一所述生物传感器在非诊断目的的检测miRNA-17中的应用。
5.一种如权利要求3所述的试剂盒在非诊断目的的检测miRNA-17中的应用。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将发夹探针pre-trigger、H1、H2、H3、H4和缓冲溶液共孵育，在水浴锅中完成退火，获得产物液；
（2）将Cas13a蛋白、crRNA、产物液及待测溶液在缓冲溶液中孵育，获得反应液；
（3）在反应液中依次加入血红素、鲁米诺试剂和H2O2溶液，进行分光光度测定。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述Cas13a蛋白与crRNA的摩尔比为2:1。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤（3）中，检测波长为400 nm-600 nm。
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| CN110982878A (zh) * | 2019-11-29 | 2020-04-10 | 华南师范大学 | CRISPR/Cas13a结合电化学发光系统检测microRNA的方法与应用 |
| CN112345751A (zh) * | 2020-11-06 | 2021-02-09 | 济南大学 | 一种检测赭曲霉毒素a的比色生物传感器 |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| DNA Domino-Based Nanoscale Logic Circuit: A Versatile Strategy for Ultrasensitive Multiplexed Analysis of Nucleic Acids;Hadi Ravan et al.;Anal. Chem.;第89卷;第6021-6028页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114397256A (zh) | 2022-04-26 |
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