CN112574998B - 检测黄曲霉毒素b1的探针组、试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测黄曲霉毒素B1的探针组、试剂盒、传感器系统及其应用。本发明基于酶辅助靶标循环扩增策略成功构建了一种用于AFB1高灵敏检测的探针组，所设计的适体探针H1‑S1和发夹探针H2，对AFB1的检测灵敏度高，线性范围宽，特异性好，且探针组以G‑四链体/氯化血红素DNA酶为信号分子，不需要任何的化学修饰和荧光标记，制备成本低。利用上述探针组对靶标AFB1检测时整个扩增反应在等温均一的溶液中进行，不需要复杂的分离程序和耗时的热循环，操作简单。

Description

检测黄曲霉毒素B1的探针组、试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测黄曲霉毒素B1的探针组、试剂盒、传感器系统及其应用。
背景技术
黄曲霉毒素(AFT)是一类由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的带有双呋喃环和香豆素结构的毒素，其中黄曲霉毒素B1(AFB1)的毒性最大，是目前已知致癌性最强的天然毒素，1993年被国际癌症研究机构(IARC)划定为1类致癌物。中药材在生产、加工、贮藏、运输等过程中，受温度或湿度的变化极易发生霉变而污染黄曲霉毒素。《中国药典》2020版收载了24种中药材中黄曲霉毒素残留的限量检测，规定其中AFBl的含量不得高于5μg/kg。通过文献调研发现中药材或中药饮片中受黄曲霉毒素污染的情况十分普遍。杨美华等检测了14种中药材的29批样品，发现被AFB1污染的有12批，含量最高的达到32.18μg/kg。沈紧治等对35种中药饮片中AFB1的含量进行测定，结果有17种中药饮片被AFB1污染。赵祥升等整理并分析了2000年以来中药中AFB1检测呈阳性结果的文献，统计显示149种中药的1168批样品中检测有AFB1，阳性样品超标率达到52.40％(Yang M H,Chen J M,Zhang XH.Chromatographia,2005,62(9):499.沈紧治,王政,苏玉纯.国际中医中药杂志,2019,6(41):614-617.赵祥升,应光耀,魏建和,孙华,杨美华.中国药物警戒,2018,15(10):608-616.)。
目前，黄曲霉毒素的检测方法有酶联免疫吸附测定法(ELISA)、高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱-串联质谱法(LC-MS)等。这些方法定量准确、灵敏度高、抗干扰性强，但成本高昂、操作繁琐、费时耗力，不利于中药中黄曲霉毒素的快速检测，难以普及。近年来新发展起来的核酸扩增技术，不管是在仪器要求还是实际操作方面，都比传统的检测技术有了长足的进步，不仅摆脱了对精良设备的依赖，操作上也更为简单方便。酶辅助靶标循环扩增技术是基于核酸内切酶/核酸外切酶水解方式的差异性与核酸适配体技术、酶切循环效应、纳米技术、荧光标记技术等相结合，发展而成的一种等温核酸扩增技术。它具有反应条件温和、扩增效率高、能在恒温条件下进行等优点。酶辅助靶标循环扩增技术结合荧光、比色、化学发光和电化学发光等检测技术可以实现生物分子的高灵敏检测。
G-四链体/氯化血红素DNA酶是一种由富含鸟嘌呤碱基G的核酸四链体和氯化血红素(hemin)形成的生物催化DNA酶。它具有类似辣根过氧化物酶(HRP)的活性，可以在氯化血红素作用下催化H2O2介导的多种底物的氧化，比如3-氨基邻苯二甲酰肼(鲁米诺)、2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)。与其他DNA酶或蛋白酶相比，G-四链体/氯化血红素DNA酶具有明显的优势，包括较低的制备成本、不易水解、易于修饰以及较高的热稳定性。因此，G-四链体/氯化血红素DNA酶被广泛用于核酸、蛋白质、金属离子和小分子的高灵敏度检测。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的中药中黄曲霉毒素检测成本高昂、操作繁琐、费时耗力和难以普及缺陷，从而提供一种简单、灵敏、低成本的免标记的探针组、试剂盒、传感器系统以及检测方法，用于检测黄曲霉毒素B1。
为此，本发明提供了如下的技术方案：
探针组，包括：
适体探针H1-S1，由发夹探针H1和用于结合靶标的适体序列S1杂交而成；所述发夹探针H1包括环状区和茎秆区，所述环状区为部分G-四链体序列，剩余部分G-四链体序列位于茎秆区；所述发夹探针H1的5’末端具有凸出的单链DNA序列1，所述发夹探针1的3’末端具有凸出的单链DNA序列2；所述DNA序列1和DNA序列2分别与适体序列S1两端的序列互补杂交并形成平末端；
发夹探针H2，包括环状区和茎秆区，所述环状区为部分G-四链体序列，剩余部分G-四链体序列位于茎秆区；所述发夹探针H2的5’末端具有凸出的单链DNA序列3，所述发夹探针H2的3’末端为凹末端；所述发夹探针H2中DNA序列3以及与其相连的部分茎秆区序列能够与所述发夹探针H1中DNA序列1以及与其相连的部分茎秆区序列互补杂交。
可选的，所述G-四链体序列的长度为18个碱基，其中12个碱基位于环状区，剩余6个碱基位于茎秆区。
可选的，所述适体序列S1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述发夹探针H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述发夹探针H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明提供了一种检测黄曲霉毒素B1的试剂盒，包括所述的探针组。
可选的，还包括独立包装的核酸外切酶I；
可选的，所述试剂盒还包括独立包装的氯化血红素、鲁米诺和/或H2O2。
本发明提供了检测黄曲霉毒素B1的传感器系统，包括所述的探针组，或，所述的试剂盒；
可选的，在所述的传感器系统中，所述适体探针H1-S1的浓度为30-50nmol/L，所述发夹探针的浓度为40-60nmol/L，核酸外切酶I的用量为8-12U。
可选的，在所述的传感器系统中，以总体积为200μL为计，包括：
第一反应液，包括：
适体探针H1-S1，浓度为0.6-1μmol/L，10μL；
核酸外切酶I，浓度为8-12U/μL，1μL；
第一缓冲液，39μL；
第二反应液，包括：
发夹探针H2，浓度为0.8-1.2μmol/L，10μL；
第二缓冲液，40μL；
可选的，还包括第三反应液，包括：
氯化血红素，浓度为2μmol/L，10μL；
鲁米诺，浓度为1mmol/L，25μL；
H2O2，浓度为1mmol/L，25μL；
第三缓冲液，40μL；
可选的，所述第一缓冲液和第二缓冲液为1×NEBuffer 3.1缓冲液；
可选的，所述第三缓冲液为HEPES缓冲液。
可选的，以总体积为200μL为计，包括：
第一反应液，包括：
适体探针H1-S1，浓度为0.8μmol/L，10μL；
核酸外切酶I，浓度为10U/μL，1μL；
第一缓冲液，39μL；
第二反应液，包括：
发夹探针H2，浓度为1μmol/L，10μL；
第二缓冲液，40μL；
还包括第三反应液，包括：
氯化血红素，浓度为2μmol/L，10μL；
鲁米诺，浓度为1mmol/L，25μL；
H2O2，浓度为1mmol/L，25μL；
第三缓冲液，40μL。
本发明提供了一种检测黄曲霉毒素B1的方法，包括利用所述的探针组，所述的试剂盒，所述的传感器系统检测黄曲霉毒素B1的步骤。
可选的，所述检测黄曲霉毒素B1的方法，包括如下步骤：
S1、将待测样品加入含适体探针H1-S1、核酸外切酶I的溶液中，孵育，然后加热使核酸外切酶I失活，冷却，得到第一反应产物；
S2、向所述第一反应产物中加入含发夹探针H2的溶液，孵育，冷却得到酶辅助靶标循环扩增的反应产物；
可选的，在步骤S1中，所述孵育的条件为35-40℃孵育50-70min；
可选的，在步骤S2中，所述孵育的条件为35-40℃孵育30-50min；
可选的，在步骤S1中，加热的条件为80-90℃保持15-25min；
可选的，将得到的酶辅助靶标循环扩增的反应产物制备成G-四链体/氯化血红素DNA酶，以进行化学发光检测；
可选的，将氯化血红素溶液加入到酶辅助靶标循环扩增的反应产物中，室温孵育60min，形成G-四链体/氯化血红素DNA酶，然后加入鲁米诺和H2O2，检测化学发光信号强度。
本发明提供了所述的探针组，或，所述的试剂盒，所述的传感器系统在检测靶标中的应用；
可选的，所述靶标为黄曲霉毒素B1；
可选的，在检测中药或粮食中的黄曲霉毒素B1的应用。
本发明技术方案，具有如下优点：
1、本发明提供了探针组，包括适体探针H1-S1，由发夹探针H1和用于结合靶标的适体序列S1杂交而成；所述发夹探针H1包括环状区和茎秆区，所述环状区为部分G-四链体序列，剩余部分G-四链体序列位于茎秆区；所述发夹探针H1的5’末端具有凸出的单链DNA序列1，所述发夹探针1的3’末端具有凸出的单链DNA序列2；所述DNA序列1和DNA序列2分别与适体序列S1两端的序列互补杂交并形成平末端；
发夹探针H2，包括环状区和茎秆区，所述环状区为部分G-四链体序列，剩余部分G-四链体序列位于茎秆区；所述发夹探针H2的5’末端具有凸出的单链DNA序列3，所述发夹探针H2的3’末端为凹末端；所述发夹探针H2中DNA序列3以及与其相连的部分茎秆区序列能够与所述发夹探针H1中DNA序列1以及与其相连的部分茎秆区序列互补杂交；
上述探针组中，创新性的将发夹探针H1和适体序列S1结合构建适体探针H1-S1，当体系中不存在靶标时，适体探针H1-S1与核酸外切酶I稳定共存，将核酸外切酶I灭活后，加入发夹探针H2后仍然能与适体探针H1-S1在体系中稳定共存，加入氯化血红素不会形成G-四链体/氯化血红素DNA酶，整个体系的化学发光信号可以忽略不计；当体系中存在靶标AFB1时，适体探针H1-S1中的适体序列S1与靶标AFB1形成复合物AFB1-S1，复合物AFB1-S1从适体探针H1-S1中脱离，最终得到发夹探针H1和复合物AFB1-S1，在核酸外切酶I的作用下(核酸外切酶I具有从3’-5’方向降解单链DNA的外切酶活性)，发夹探针H1的3’末端凸出的单链DNA序列2被水解，5’末端凸出的单链DNA序列1则被保留下来，复合物AFB1-S1中的适体序列S1同样被核酸外切酶I水解，释放出靶标AFB1。释放出的靶标AFB1可以结合一个新的适体探针H1-S1再次形成复合物AFB1-S1，并得到发夹探针H1，发夹探针H1的单链DNA序列2被核酸外切酶I水解，单链DNA序列1则被保留，复合物AFB1-S1再次被核酸外切酶I水解，释放出靶标AFB1。在核酸外切酶I的辅助下，靶标AFB1不断循环参与结合/剪切反应，构成酶辅助的靶标循环扩增(Cycle)。在靶标不断循环扩增的过程中，生成了大量的发夹探针H1，所述发夹探针H1仅保留了5’末端凸出的单链DNA序列1，在核酸外切酶I灭活后，加入发夹探针H2，所述发夹探针H2中DNA序列3以及与其相连的部分茎秆区序列与所述发夹探针H1中DNA序列1以及与其相连的部分茎秆区序列互补杂交，形成复合物H1-H2，并打开了发夹探针H1和发夹探针H2的发夹结构，将封锁在发夹结构中的完整的G-四链体序列暴露出，完全暴露的G-四链体序列进一步折叠成G-四链体结构，并可以结合氯化血红素形成G-四链体/氯化血红素DNA酶。这些DNA酶可以催化氧化鲁米诺-H2O2化学发光体系，产生化学发光信号，从而实现靶标AFB1的放大检测。
进一步的，由于适体探针H1-S1上封锁有G-四链体序列，发夹探针H2上封锁有G-四链体序列，因此，在形成复合物H1-H2时，可以产生两个G-四链体结构，可以产生更强的化学发光信号，进一步实现靶标AFB1的放大检测，显著提高检测灵敏度和线性范围。
2、本发明提供的检测黄曲霉毒素B1的传感器系统，结合酶辅助靶标循环扩增技术和G-四链体/氯化血红素DNA酶，构建了一种简单、灵敏、低成本的免标记化学发光传感器系统。利用适体序列特异性结合靶标AFB1，核酸外切酶I(Exo I)特异性地剪切单链DNA的特性，所构建的酶辅助靶标循环扩增策略实现了靶标AFB1的循环再利用，极大地提高了传感器系统的检测灵敏度。同时，G-四链序列被巧妙地编码到发夹探针中用作化学发光信号分子，避免了发夹探针的荧光标记和化学修饰。该传感器系统制备成本低，操作简单，对靶标AFB1检测灵敏度高、线性范围宽，并成功地应用于中药材样品中靶标AFB1的测定，具有良好的应用前景。
3、本发明提供了一种检测黄曲霉毒素B1的方法，具有靶标AFB1检测灵敏度高、线性范围宽、容易操作的优势，检测速度快，且所用的试剂材料为常见试剂材料，成本低，对中药材样品中靶标AFB1的测定具有良好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1本发明实验例1中基于酶辅助靶标循环扩增的传感器系统检测靶标AFB1的原理图；
图2本发明实验例2中酶辅助靶标循环扩增策略的扩增效果结果；A图为无信号扩增传感器系统检测靶标AFB1的原理图；B图为两种传感器系统对同一浓度靶标AFB1的化学发光响应图；
图3本发明实验例3中适体探针H1-S1浓度的优化实验中检测结果；
图4本发明实验例3中核酸外切酶I用量的优化实验中检测结果；
图5本发明实验例3中扩增反应时间的优化实验中检测结果；
图6本发明实验例3中适体探针H2浓度的优化实验中检测结果；
图7A本发明实验例3中传感器系统对不同浓度靶标AFB1的化学发光响应图；图中a-g表示0、0.001、0.01、0.1、1、10、100ng/mL的靶标AFB1；
图7B本发明实验例3中化学发光强度与靶标AFB1浓度的关系图；
图8本发明实验例4中特异性实验的结果；图中A图为传感器系统的特异性实验；图中B图为不同霉菌毒素的化学结构图。
具体实施方式
仪器和试剂
SpectraMax M5e多功能酶标仪(美谷分子仪器(上海)有限公司)；PHSJ-3F型精密酸度计(上海雷磁仪器有限公司)；Eppendorf 5417R小型台式冷冻型离心机(艾本德中国有限公司)；HS3120D超声波清洗器(天津市恒奥科技发展有限公司)。
黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素G1(AFG1)、黄曲霉毒素M1(AFM1)、赭曲霉毒素A(OTA)和玉米赤霉烯酮(ZEN)购自广州分析测试中心科力技术开发公司；DEPC处理水和核酸外切酶I(Exo I)购自生工生物工程(上海)股份有限公司；10×NEBuffer 3.1购自纽英伦生物技术(北京)有限公司；三(羟甲基-1)氨基甲烷(Tris)、2-(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基)乙磺酸(HEPES)、3-氨基邻苯二甲酰肼(鲁米诺)、氯化血红素(hemin)和H2O2购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；当归、党参和黄芪购自无锡市中医院。本发明所用寡核苷酸由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
1×NEBuffer 3.1缓冲液：含50mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，10mmol/LMgCl2，100μg/mL BSA的溶液，pH 7.9；
HEPES缓冲液：含25mmol/L HEPES,200mmol/L NaCl，20mmol/L KCl，体积比1％DMSO的溶液，pH 7.4；
Tris-HCl缓冲液：含20mmol/L Tris-HCl,200mmol/L NaCl，20mmol/L KCl，2mmol/L MgCl2，pH 7.4；
AFB1溶液：溶质是AFB1，溶剂是苯：甲醇(98：2，体积比)，含有AFB1的苯/甲醇溶液，简称AFB1溶液。
黄曲霉毒素B1(AFB1)标准品：从广州分析测试中心科力技术开发公司购买。规格是2.0μg/mL，包装是1mL/支，溶剂是苯：甲醇(98：2，体积比)。
实施例中AFB1溶液配制方法为：以配制100ng/mL的AFB1溶液为例，移液枪移取0.5μL 2.0μg/mL的AFB1标准品，加入9.5μL的溶剂(苯：甲醇＝98：2，体积比)。稀释后可得，10μL100ng/mL的AFB1溶液。其他浓度的AFB1采用同样的方式逐级稀释成浓度为10ng/mL，1ng/mL，0.1ng/mL，0.01ng/mL，0.001ng/mL的AFB1溶液。
实验例5中实际样品检测时，待测样品是1μL 100ng/mL(或1μL 10ng/mL，或1μL1ng/mL)的AFB1溶液。此处，三种浓度的AFB1溶液的配制，溶剂采用的是实际样品提取液，而非苯：甲醇(98：2，体积比)溶剂。以100ng/mL的AFB1溶液为例，待测样品制备过程如下：移液枪移取0.5μL 2.0μg/mL的AFB1标准品，加入9.5μL的实际样品提取液。稀释后可得，10μL100ng/mL的AFB1溶液。其他浓度的AFB1采用同样的方式逐级稀释成浓度为10ng/mL和1ng/mL的AFB1溶液。
下述实施例中的室温范围为10-30℃。
实施例1探针组
1.1探针组，包括：
适体探针H1-S1，由发夹探针H1和用于结合靶标的适体序列S1杂交而成；所述发夹探针H1包括环状区和茎秆区，所述环状区为部分G-四链体序列，剩余部分G-四链体序列位于茎秆区；所述发夹探针H1的5’末端具有凸出的单链DNA序列1，所述发夹探针1的3’末端具有凸出的单链DNA序列2；所述DNA序列1和DNA序列2分别与适体序列S1两端的序列互补杂交并形成平末端；
发夹探针H2，包括环状区和茎秆区，所述环状区为部分G-四链体序列，剩余部分G-四链体序列位于茎秆区；所述发夹探针H2的5’末端具有凸出的单链DNA序列3，所述发夹探针H2的3’末端为凹末端；所述发夹探针H2中DNA序列3以及与其相连的部分茎秆区序列(如表1和图1中的发夹探针H2中的序列段(5'-3')e*、c*、d*)能够与所述发夹探针H1中DNA序列1以及与其相连的部分茎秆区序列(如表1和图1中的发夹探针H1中的序列段(5'-3')d、c、e)互补杂交。
作为优选的实施方式，所述G-四链体序列的长度为18个碱基，其中12个碱基位于环状区，剩余6个碱基位于茎秆区。
所述适体序列S1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述发夹探针H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述发夹探针H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示
上述探针的具体序列参见下表1，G-四链体序列(简称为GQ)，如下表1所示：
表1本实施例中使用的HPLC纯的寡核苷酸序列
Figure BDA0002884093660000121
1.2发夹探针H1、H2和适体探针H1-S1的制备
发夹探针H1和H2：将寡核苷酸H1和H2的粉末以12000r/min离心5min，分别加入Tris-HCl缓冲液(含20mmol/L Tris-HCl,200mmol/L NaCl，20mmol/L KCl，2mmol/L MgCl2的溶液，pH 7.4)配成10μmol/L标准储备液。将H1和H2的储备液分别加热到95℃保持10min，然后缓慢冷却到室温以形成发夹结构，4℃保存备用。
适体探针H1-S1：将寡核苷酸S1的粉末以12000r/min离心5min，加入Tris-HCl缓冲液配成10μmol/L标准储备液。将50μL 10μmol/L发夹探针H1标准储备液和50μL 10μmol/LS1标准储备液混合，37℃孵育30min，待发夹探针H1和适体序列S1充分杂交后得到适体探针H1-S1的标准储备液，浓度为5μmol/L，4℃保存备用。
实施例2检测黄曲霉毒素B1的试剂盒
本实施例提供了一种检测黄曲霉毒素B1的试剂盒，包括：
实施例1中制备的适体探针H1-S1和发夹探针H2。
进一步的，所述试剂盒还包括独立包装的核酸外切酶I。
进一步的，还包括独立包装的氯化血红素、鲁米诺和/或H2O2。
实施例3检测黄曲霉毒素B1的传感器系统
本实施例提供了一种检测黄曲霉毒素B1的传感器系统，以总体积为200μL为计，包括：
第一反应液，包括：
适体探针H1-S1，浓度为0.8μmol/L，10μL；
核酸外切酶I，浓度为10U/μL，1μL；
第一缓冲液，39μL；
第二反应液，包括：
发夹探针H2，浓度为1μmol/L，10μL；
第二缓冲液，40μL；
还包括第三反应液，包括：
氯化血红素，浓度为2μmol/L，10μL；
鲁米诺，浓度为1mmol/L，25μL；
H2O2，浓度为1mmol/L，25μL；
第三缓冲液，40μL；
进一步的，所述第一缓冲液和第二缓冲液为1×NEBuffer 3.1缓冲液；
进一步的，所述第三缓冲液为HEPES缓冲液。
实施例4检测黄曲霉毒素B1的传感器系统
本实施例提供了一种检测黄曲霉毒素B1的传感器系统，以总体积为200μL为计，包括：第一反应液，包括：适体探针H1-S1，浓度为0.6μmol/L，10μL；核酸外切酶I，浓度为8U/μL，1μL；第一缓冲液，39μL；第二反应液，包括：发夹探针H2，浓度为0.8μmol/L，10μL；第二缓冲液，40μL；第三反应液，包括：氯化血红素，浓度为2μmol/L，10μL；鲁米诺，浓度为1mmol/L，25μL；H2O2，浓度为1mmol/L，25μL；第三缓冲液，40μL。
所述第一缓冲液和第二缓冲液为1×NEBuffer 3.1缓冲液。
所述第三缓冲液为HEPES缓冲液。
实施例5检测黄曲霉毒素B1的传感器系统
本实施例提供了一种检测黄曲霉毒素B1的传感器系统，以总体积为200μL为计，第一反应液，包括：适体探针H1-S1，浓度为1μmol/L，10μL；核酸外切酶I，浓度为12U/μL，1μL；第一缓冲液，39μL；第二反应液，包括：发夹探针H2，浓度为1.2μmol/L，10μL；第二缓冲液，40μL；还包括第三反应液，包括：氯化血红素，浓度为2μmol/L，10μL；鲁米诺，浓度为1mmol/L，25μL；H2O2，浓度为1mmol/L，25μL；第三缓冲液，40μL。
所述第一缓冲液和第二缓冲液为1×NEBuffer 3.1缓冲液；
所述第三缓冲液为HEPES缓冲液。
实施例6检测黄曲霉毒素B1的方法
本实施例提供了一种检测黄曲霉毒素B1的方法，包括利用实施例1的探针组、实施例2的试剂盒或实施例3的传感器系统，如下：
核酸外切酶I辅助的靶标循环扩增
将10μL 0.8μmol/L适体探针H1-S1、1μL一定浓度的含靶标AFB1的待测样品和1μL10U/μL核酸外切酶I依次加入到39μL 1×NEBuffer 3.1缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，10mmol/L MgCl2，100μg/mL BSA，pH 7.9)中，37℃孵育60min。然后，将反应液加热至80℃保持15min使核酸外切酶I失活，自然冷却至室温。接着加入10μL 1μmol/L发夹探针H2和40μL 1×NEBuffer 3.1缓冲液，37℃孵育30min，自然冷却后得到酶辅助靶标循环扩增的反应产物。
G-四链体/氯化血红素DNA酶的制备和化学发光检测
将10μL 2μmol/L氯化血红素和40μL HEPES缓冲液加入到上述酶辅助靶标循环扩增的反应产物中，室温孵育60min以形成G-四链体/氯化氯化血红素DNA酶。然后加入25μL1mmol/L鲁米诺和25μL1 mmol/L H2O2。使用SpectraMax M5e多功能酶标仪记录各样品溶液的化学发光信号强度，检测步长设为2nm，收集380～510nm范围内的化学发光光谱。最大发射波长为418nm。
实施例7检测黄曲霉毒素B1的方法
本实施例提供了一种检测黄曲霉毒素B1的方法，包括利用实施例1的探针组、实施例2的试剂盒或实施例4的传感器系统，如下：
核酸外切酶I辅助的靶标循环扩增
将10μL 0.6μmol/L适体探针H1-S1、1μL一定浓度的靶标AFB1和1μL 8U/μL核酸外切酶I依次加入到39μL 1×NEBuffer 3.1缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，10mmol/L MgCl2，100μg/mL BSA，pH 7.9)中，35℃孵育70min。然后，将反应液加热至90℃保持20min使核酸外切酶I失活，自然冷却至室温。接着加入10μL 0.8μmol/L发夹探针H2和40μL 1×NEBuffer 3.1缓冲液，35℃孵育40min，自然冷却后得到酶辅助靶标循环扩增的反应产物。
G-四链体/氯化血红素DNA酶的制备和化学发光检测
将10μL 2μmol/L氯化血红素和40μL HEPES缓冲液加入到上述酶辅助靶标循环扩增的反应产物中，室温孵育60min以形成G-四链体/氯化氯化血红素DNA酶。然后加入25μL1mmol/L鲁米诺和25μL1 mmol/L H2O2。使用SpectraMax M5e多功能酶标仪记录各样品溶液的化学发光信号强度，检测步长设为2nm，收集380～510nm范围内的化学发光光谱。最大发射波长为418nm。
实施例8检测黄曲霉毒素B1的方法
本实施例提供了一种检测黄曲霉毒素B1的方法，包括利用实施例1的探针组、实施例2的试剂盒或实施例5的传感器系统，如下：
核酸外切酶I辅助的靶标循环扩增
将10μL 1μmol/L适体探针H1-S1、1μL一定浓度的靶标AFB1和1μL 12U/μL核酸外切酶I依次加入到39μL 1×NEBuffer 3.1缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，10mmol/L MgCl2，100μg/mL BSA，pH 7.9)中，40℃孵育50min。然后，将反应液加热至85℃保持25min使核酸外切酶I失活，自然冷却至室温。接着加入10μL 1.2μmol/L发夹探针H2和40μL 1×NEBuffer 3.1缓冲液，40℃孵育50min，自然冷却后得到酶辅助靶标循环扩增的反应产物。
G-四链体/氯化血红素DNA酶的制备和化学发光检测
将10μL 2μmol/L氯化血红素和40μL HEPES缓冲液加入到上述酶辅助靶标循环扩增的反应产物中，室温孵育60min以形成G-四链体/氯化氯化血红素DNA酶。然后加入25μL1mmol/L鲁米诺和25μL1 mmol/L H2O2。使用SpectraMax M5e多功能酶标仪记录各样品溶液的化学发光信号强度，检测步长设为2nm，收集380～510nm范围内的化学发光光谱。最大发射波长为418nm。
实验例1
本发明的检测黄曲霉毒素B1的方法的检测靶标AFB1的原理如图1所示，该传感器系统主要由适体探针H1-S1、发夹探针H2、核酸外切酶I、氯化血红素、鲁米诺和H2O2组成。适体探针H1-S1和发夹探针H2都含有一段G-四链体序列(共18个碱基)，一部分位于发夹的环状区(12个碱基)，另一部分位于发夹的茎秆区(6个碱基)。当适体探针H1-S1和发夹探针H2未打开时，G-四链体序列不能折叠成G-四链体结构，因而，不能结合氯化血红素形成G-四链体/氯化血红素DNA酶。
当体系中不存在靶标AFB1时，适体探针H1-S1的末端是具有平末端的双链DNA结构，而核酸外切酶I是单链特异性外切酶，不能水解双链DNA，适体探针H1-S1和核酸外切酶I不发生相互作用。将核酸外切酶I灭活后，加入发夹探针H2，适体探针H1-S1的末端是具有平末端的双链DNA结构同样不会和发夹探针H2发生作用，两个探针在体系中共存。由于适体探针H1-S1和发夹探针H2的发夹结构未被打开，加入氯化血红素并不会形成G-四链体/氯化血红素DNA酶，整个体系的化学发光信号可以忽略不计。
当体系中存在靶标AFB1时，由于适体序列S1和靶标间的高亲和性，适体探针H1-S1上的适体序列S1与靶标AFB1结合形成复合物AFB1-S1，复合物AFB1-S1从适体探针H1-S1上脱离，适体探针H1-S1变为发夹探针H1。核酸外切酶I具有从3’-5’方向降解单链DNA的外切酶活性，因此，核酸外切酶I水解发夹探针H1的3’端的单链DNA序列2，而5’端的单链DNA序列1则被保留，同时核酸外切酶I识别复合物AFB1-S1并逐步水解适体序列S1，释放出靶标AFB1。释放出的靶标AFB1可以结合一个新的适体探针H1-S1形成复合物AFB1-S1，复合物AFB1-S1接着再次被核酸外切酶I酶切后释放靶标AFB1。在核酸外切酶I的辅助下，靶标AFB1不断循环参与结合/剪切反应，构成酶辅助的靶标循环扩增(Cycle)。在靶标不断循环扩增的过程中，生成了大量的发夹探针H1，这些发夹探针H1的3’端的单链DNA序列2被核酸外切酶I酶切，而5’端的单链DNA序列1未被酶切得以保留。核酸外切酶I灭活处理后，加入发夹探针H2，发夹探针H2可以和带有5’端的单链DNA序列1的发夹探针H1结合，具体为所述发夹探针H2中DNA序列3以及与其相连的部分茎秆区序列(如表1和图1中的发夹探针H2中的序列段(5'-3')e*、c*、d*)与所述发夹探针H1中DNA序列1以及与其相连的部分茎秆区序列(如表1和图1中的发夹探针H1中的序列段(5'-3')d、c、e)互补杂交，生成复合物H1-H2。两个发夹探针H1和H2的发夹结构被打开，暴露出完整的G-四链体序列。G-四链体序列进一步折叠成G-四链体结构，并结合氯化血红素形成G-四链体/氯化血红素DNA酶。这些DNA酶可以催化氧化鲁米诺-H2O2化学发光体系，产生化学发光信号，从而实现靶标AFB1的放大检测。
实验例2
为了验证本发明的酶辅助靶标循环扩增策略的扩增效果，考察了检测黄曲霉毒素B1的方法在不同条件下的化学发光响应，具体如下：
条件a:适体探针H1-S1(浓度为0.8μmol/L)、发夹探针H2(浓度为1μmol/L)、Exo I(浓度为0，用等体积DEPC处理水代替)、AFB1(浓度为0，用等体积溶剂(苯：甲醇＝98：2，体积比)代替)；
条件b:适体探针H1-S1(浓度为0.8μmol/L)、发夹探针H2(浓度为1μmol/L)、Exo I(10U/μL)、AFB1(浓度为0，用等体积溶剂(苯：甲醇＝98：2，体积比)代替)；
条件c:适体探针H1-S1(浓度为0.8μmol/L)、发夹探针H2(浓度为1μmol/L)、Exo I(浓度为0，用等体积DEPC处理水代替)、AFB1(浓度为100ng/mL)；
条件d:适体探针H1-S1(浓度为0.8μmol/L)、发夹探针H2(浓度为1μmol/L)、Exo I(10U/μL)、AFB1(浓度为100ng/mL)；
将上述条件a-d分别代入实施例6中的检测黄曲霉毒素B1的方法中，其余条件不变。
检测结果如图2所示，如图2中A图所示，该传感器系统主要由适体探针H1-S1、发夹探针H2、氯化血红素、鲁米诺和H2O2组成。当不存在靶标AFB1时，两个探针在体系中稳定共存，彼此不发生相互作用。当存在靶标AFB1时，适体探针H1-S1中的适体序列S1和靶标AFB1结合形成复合物AFB1-S1并从适体探针H1-S1上脱离，适体探针H1-S1变为发夹探针H1。发夹探针H1接着与发夹探针H2进行杂交形成复合物H1-H2，发夹结构被打开暴露出完整的G-四链体序列。G-四链体序列进一步折叠成G-四链体结构，并结合氯化血红素生成G-四链体/氯化血红素DNA酶。这些DNA酶催化氧化鲁米诺-H2O2化学发光体系，产生化学发光信号。
如图2中B图所示，在没有靶标AFB1的情况下，分别在条件a和条件b的情况下都显示出较低的化学发光响应(曲线a和b)。这说明适体探针H1-S1在溶液中既不会被核酸外切酶I剪切，也不会和发夹探针H2杂交。加入靶标AFB1后，在条件c情况下，可检测到一个明显的化学发光信号(曲线c)，在条件d情况下,可检测到一个更强的化学发光信号(曲线d)，明显强于条件c情况下的化学发光信号(曲线c)，信号增强了74.43％，说明采用酶辅助靶标循环扩增策略构建的传感器系统的化学发光信号(曲线d)明显强于没有信号扩增的传感器系统的化学发光信号(曲线c)，表明本发明所构建的传感器系统具有良好的扩增效果。
实验例3
1、适体探针H1-S1浓度的优化
本实验考察了在传感器系统中不同浓度(20、30、40、50、60nmol/L)的适体探针H1-S1对靶标AFB1检测的影响。
具体为：将上述传感器系统中适体探针H1-S1的浓度20、30、40、50、60nmol/L依次换算为向第一反应液中初始加入的适体探针H1-S1溶液的浓度。以传感器系统中适体探针H1-S1的浓度40nmol/L为例，(10μL×nμmol/L)/200μL＝0.04μmol/L＝40nmol/L，计算出初始加入的适体探针H1-S1溶液的浓度0.8μmol/L。依照上述计算，传感器系统中适体探针H1-S1的浓度20、30、40、50、60nmol/L对应初始加入的适体探针H1-S1溶液的浓度依次为0.4、0.6、0.8、1、1.2μmol/L。将上述初始加入的适体探针H1-S1溶液的浓度分别代入实施例6中的检测黄曲霉毒素B1的方法中，其余条件不变。分别检测待测样品中目标黄曲霉毒素B1(浓度为100ng/mL)存在和不存在情况下的化学发光强度。
结果如图3显示，在传感器系统中适体探针浓度为40nmol/L时，体系的化学发光强度比值I/I0最大，其中I和I0分别表示存在和不存在靶标AFB1时的化学发光强度。因此选择适体探针H1-S1的最优浓度为40nmol/L。
2、核酸外切酶I用量的优化
实验考察了不同核酸外切酶I用量(6、8、10、12、14U)对靶标AFB1检测的影响。
具体为：分别将核酸外切酶I浓度6、8、10、12、14U/μL分别代入实施例6中的检测黄曲霉毒素B1的方法中，其余条件不变。检测待测样品中目标黄曲霉毒素B1(浓度为100ng/mL)的化学发光强度。
结果如图4显示，随着核酸外切酶I用量的增加，体系的化学发光强度逐渐增加，但变化不大。考虑到核酸外切酶I的性价比，选择核酸外切酶I用量为10U。
3、扩增反应时间的优化
实验考察了不同扩增反应时间(40、50、60、70、80min)对靶标AFB1检测的影响。
具体为：将实施例6中的检测黄曲霉毒素B1的方法中核酸外切酶I辅助的靶标循环扩增的步骤中的“37℃孵育60min”分别替换为37℃孵育40、50、60、70、80min，其他条件不变。检测待测样品中目标黄曲霉毒素B1(浓度为100ng/mL)的化学发光强度。
结果如图5显示，随着扩增反应时间的增加，体系的化学发光强度迅速增加然后趋于平缓，60min后进入平台期。因此选择扩增反应时间为60min。
4、适体探针H2浓度的优化
实验考察了传感器系统中不同浓度(30、40、50、60、70nmol/L)的发夹探针H2对靶标AFB1检测的影响。
具体为：将上述传感器系统中发夹探针H2的浓度30、40、50、60、70nmol/L依次换算为向第二反应液中初始加入的适体探针H2溶液的浓度。以传感器系统中发夹探针H2的浓度为50nmol/L为例，(10μL×nμmol/L)/200μL＝0.05μmol/L＝50nmol/L，计算出初始加入的发夹探针H2溶液的浓度1μmol/L。依照上述计算，传感器系统中发夹探针H2的浓度30、40、50、60、70nmol/L对应初始加入的发夹探针H2溶液的浓度依次为0.6、0.8、1、1.2、1.4μmol/L。将上述初始加入的发夹探针H2溶液的浓度分别代入实施例6中的检测黄曲霉毒素B1的方法中，其余条件不变。检测待测样品中目标黄曲霉毒素B1(浓度为100ng/mL)存在和不存在的化学发光强度。
结果如图6显示，传感器系统中发夹探针H2的浓度50nmol/L时，体系的化学发光强度比值I/I0最大，其中I和I0分别表示存在和不存在靶标AFB1时的化学发光强度。因此选择发夹探针H2的最优浓度为50nmol/L。
5、黄曲霉毒素B1的检测
为了考察本发明所构建传感器系统的检测性能，在最佳实验条件下，即：将不同浓度(0、0.001、0.01、0.1、1、10、100ng/mL)AFB1溶液作为待测样品分别代入实施例6中的检测黄曲霉毒素B1的方法中，其余条件不变。检测待测样品中目标黄曲霉毒素B1的化学发光响应。
检测结果如图7A所示，随着靶标AFB1浓度在0～100ng/mL范围内的增加，其化学发光强度也相应增加。从图7B可以看出，化学发光强度与AFB1浓度呈指数对应的关系。此外，由图7B中插图可知，当AFB1浓度在0.001～100ng/mL范围内，化学发光强度与AFB1浓度的对数呈良好的线性关系。线性回归方程为I＝42951.74+10888.47 log10C，相关系数(R2)为0.9955，以3倍信噪比(S/N＝3)计算得到AFB1的检出限为0.93pg/mL。
实验例4特异性实验
特异性是衡量传感器系统性能的重要指标。选择黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素G1(AFG1)、黄曲霉毒素M1(AFM1)、玉米赤霉烯酮(ZEN)和赭曲霉毒素A(OTA)作为潜在的干扰物质，考察了传感器系统的特异性。
具体为：将实施例6中的检测黄曲霉毒素B1的方法中核酸外切酶I辅助的靶标循环扩增步骤中，将1μL一定浓度的靶标AFB1分别替换为1μL 100ng/mL黄曲霉毒素B2(AFB2)、1μL 100ng/mL黄曲霉毒素G1(AFG1)、1μL 100ng/mL黄曲霉毒素M1(AFM1)、1μL 100ng/mL玉米赤霉烯酮(ZEN)和1μL 100ng/mL赭曲霉毒素A(OTA)，且设置空白对照，空白对照为将1μL一定浓度的靶标AFB1替换为不含AFB1的溶剂，即，1μL溶剂(苯：甲醇＝98：2，体积比)。其余条件不变。
结果如图8显示，由图8中A图可见，ZEN和OTA的化学发光信号响应和空白的化学发光信号响应无明显差异。由图8中B图可见，AFB2、AFG1、AFM1与AFB1的分子结构相似，虽然同属于黄曲霉毒素家族，但它们的化学发光信号强度仅略高于ZEN和OTA，而靶标AFB1的化学发光信号响应明显增强。这些结果表明本发明所构建的传感器系统对AFB1具有良好的特异性。
实验例5中药材样品中靶标AFB1的检测
选取当归、党参和黄芪三种中药材作为实际样品，采用标准加入法进行回收率实验，以评估传感器系统对实际样品的检测能力。准确称取2g中药材样品，加入5mL甲醇-水(6：4，体积比)萃取液，浸泡60min后超声处理45min，然后将混合物以3000r/m离心5min。提取1mL上清液，0.22μm微孔滤膜过滤，用1×NEBuffer 3.1缓冲液定容至10mL。将三种浓度水平(1、10、100ng/mL)的AFB1加标到稀释的样品溶液中进行回收率实验，按照实施例6的检测黄曲霉毒素B1的方法进行检测，每个浓度平行测定3次。计算得AFB1的回收率为93.7％～107.3％，相对标准偏差(RSD)为3.7％～6.4％，表明本发明所构建的传感器系统可用于中药材样品中AFB1的检测。
实验结论
本发明基于酶辅助靶标循环扩增策略成功构建了一种用于AFB1高灵敏检测的传感器系统。所设计的适体探针H1-S1和发夹探针H2，以G-四链体/氯化血红素DNA酶为信号分子，不需要任何的化学修饰和荧光标记，制备成本低。整个扩增反应在等温均一的溶液中进行，不需要复杂的分离程序和耗时的热循环，操作简单。该传感器系统对AFB1的检测灵敏度高，线性范围宽，特异性好，并成功地应用于中药材样品中AFB1的测定。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<110> 江苏省原子医学研究所
<120> 检测黄曲霉毒素B1的探针组、试剂盒及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gttgggcacg tgttgtctct ctgtgtctcg tgcccttcgc taggcccaca 50
<210> 2
<211> 98
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgtgggccta gcgaagggca cgaggtgaga aaacaatggg ttgggcggga tgggaaccca 60
ttgttttctc acacacagag agacaacacg tgcccaac 98
<210> 3
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttgttttctc acctcgtgcc cttcgctagg cccacatggg ttgggcggga tgggaaccca 60
tgtgggccta gc 72

Claims (17)

1.探针组，包括：
适体探针H1-S1，由发夹探针H1和用于结合靶标的适体序列S1杂交而成；所述发夹探针H1包括环状区和茎秆区，所述环状区为部分G-四链体序列，剩余部分G-四链体序列位于茎秆区；所述发夹探针H1的5’末端具有凸出的单链DNA序列1，所述发夹探针H1的3’末端具有凸出的单链DNA序列2；所述DNA序列1和DNA序列2分别与适体序列S1两端的序列互补杂交并形成平末端；
发夹探针H2，包括环状区和茎秆区，所述环状区为部分G-四链体序列，剩余部分G-四链体序列位于茎秆区；所述发夹探针H2的5’末端具有凸出的单链DNA序列3，所述发夹探针H2的3’末端为凹末端；所述发夹探针H2中DNA序列3以及与其相连的部分茎秆区序列能够与所述发夹探针H1中DNA序列1以及与其相连的部分茎秆区序列互补杂交。
2.根据权利要求1所述的探针组，其特征在于，所述G-四链体序列的长度为18个碱基，其中12个碱基位于环状区，剩余6个碱基位于茎秆区。
3.根据权利要求1或2所述的探针组，其特征在于，所述适体序列S1的核苷酸序列如SEQID NO.1所示；所述发夹探针H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述发夹探针H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.检测黄曲霉毒素B1的试剂盒，其特征在于，包括权利要求3所述的探针组。
5.根据权利要求4所述检测黄曲霉毒素B1的试剂盒，其特征在于，
还包括独立包装的核酸外切酶I。
6.根据权利要求4或5所述检测黄曲霉毒素B1的试剂盒，其特征在于，
所述试剂盒还包括独立包装的氯化血红素、鲁米诺和/或H2O2。
7.检测黄曲霉毒素B1的传感器系统，其特征在于，包括权利要求3所述的探针组，或，权利要求4-6任一项所述的试剂盒。
8.根据权利要求7所述检测黄曲霉毒素B1的传感器系统，其特征在于，
在所述的传感器系统中，所述适体探针H1-S1的浓度为30-50nmol/L，所述发夹探针的浓度为40-60nmol/L，核酸外切酶I的用量为8-12U。
9.根据权利要求8所述检测黄曲霉毒素B1的传感器系统，其特征在于，以总体积为200μL为计，包括：
第一反应液，包括：
适体探针H1-S1，浓度为0.6-1μmol/L，10μL；
核酸外切酶I，浓度为8-12 U/μL，1μL；
第一缓冲液，39μL；
第二反应液，包括：
发夹探针H2，浓度为0.8-1.2μmol/L，10μL；
第二缓冲液，40μL。
10.根据权利要求9所述检测黄曲霉毒素B1的传感器系统，其特征在于，
还包括第三反应液，包括：
氯化血红素，浓度为2 μmol/L，10 μL；
鲁米诺，浓度为1mmol/L，25 μL；
H2O2，浓度为1mmol/L，25 μL；
第三缓冲液，40μL。
11.根据权利要求10所述检测黄曲霉毒素B1的传感器系统，其特征在于，
所述第一缓冲液和第二缓冲液为1 × NEBuffer3.1缓冲液；和/或
所述第三缓冲液为HEPES缓冲液。
12.一种检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，包括利用权利要求3所述的探针组，权利要求4-6任一项所述的试剂盒，和/或，权利要求7-11任一项所述的传感器系统检测黄曲霉毒素B1的步骤。
13.根据权利要求12所述检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将待测样品加入含适体探针H1-S1、核酸外切酶I的溶液中，孵育，然后加热使核酸外切酶I失活，冷却，得到第一反应产物；
S2、向所述第一反应产物中加入含发夹探针H2的溶液，孵育，冷却得到酶辅助靶标循环扩增的反应产物。
14.根据权利要求13所述检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，
在步骤S1中，所述孵育的条件为35-40°C孵育50-70min；和/或
在步骤S2中，所述孵育的条件为35-40°C孵育30-50min；和/或
在步骤S1中，加热的条件为80-90 °C保持15-25min；和/或
将得到的酶辅助靶标循环扩增的反应产物制备成G-四链体/氯化血红素DNA酶，以进行化学发光检测；和/或
将氯化血红素溶液加入到酶辅助靶标循环扩增的反应产物中，室温孵育60 min，形成G-四链体/氯化血红素DNA酶，然后加入鲁米诺和H2O2，检测化学发光信号强度。
15.权利要求1-3任一项所述的探针组，或，权利要求4-6任一项所述的试剂盒，或权利要求 7-11任一项所述的传感器系统在检测靶标中的应用。
16.权利要求3所述的探针组，或，权利要求4-6任一项所述的试剂盒，或权利要求7-11任一项所述的传感器系统在检测黄曲霉毒素B1中的应用。
17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，在检测中药或粮食中的黄曲霉毒素B1的应用。
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