CN107955830A

CN107955830A - 一种基于杂交链式反应及DNAzyme信号放大荧光检测黄曲霉素B1的方法

Info

Publication number: CN107955830A
Application number: CN201710948960.4A
Authority: CN
Inventors: 明晶晶; 姜廷福; 吕志华
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2017-10-12
Filing date: 2017-10-12
Publication date: 2018-04-24

Abstract

一种基于杂交链式反应及DNAzyme信号放大荧光检测黄曲霉素B1的方法，本发明涉及一种信号放大技术荧光光谱传感器的构建和应用。利用靶标黄曲霉素B1引发适体DNA构象产生变化，促使发夹探针组装形成长链重复DNAzyme单元，催化剪切分子灯标产生荧光信号的无酶法AFB1传感策略。依靠这种方法，检测限可以达到0.5 ng/mL，远远低于国标（10 ng/mL）。此外，我们在发霉的大米提取物中对黄曲霉素B1进行了检测，同样取得了满意的结果。

Description

一种基于杂交链式反应及DNAzyme信号放大荧光检测黄曲霉素B1的方法

技术领域

本发明属于分析化学和生物传感检测领域，涉及一种信号放大技术荧光光谱传感器的构建和应用。另外，本发明还涉及采用所述的荧光光谱传感器检测黄曲霉素B1的方法。

背景技术

黄曲霉素（Aflatoxin），是由黄曲霉、寄生曲霉和模式曲霉等在合适的温度和湿度条件下产生的真菌毒素，其中，尤以黄曲霉素B1（AFB1）的毒性最强，已经被国际癌症研究机构（IARC）划归为头类致癌物质。AFB1广泛存在于许多污染的粮食中，如谷物、啤酒、香料及其添加剂、坚果及豆类食品中。许多国家都规定了农作物产品中AFB1的含量标准。欧盟规定食品中黄曲霉素B1的含量不能超过2 ppb。因此，对黄曲霉素B1含量的控制检测对人类健康饮食具有十分重要的意义。

传统的黄曲霉素B1的检测途径有红外光谱法（Tripathi S., Mishra H. N. FoodControl., 2009, 20 (9): 840-846）、薄层色谱法（Stroka J., Van Otterdijk R.,Anklam E. J. Chromatogr. A, 2000, 904 (2): 251-256）、高效液相色谱法（Gomez-Catalan J., Pique E., Falco G., et al. Phytochem. Anal., 2005, 16 (3): 196-204）、液质联用（Cervino C., Asam S., Knopp D., et al. J. Agric. Food Chem.,2008, 56 (6): 1873-1879）、酶联免疫法（Lee N. A., Wang S., Allan R. D., et al.J. Agric. Food Chem., 2004, 52 (10): 2746-2755）、离子淌度谱法（Sheibani A.,Tabrizchi M., Ghaziaskar H. S. Talanta, 2008, 75(1): 233-238）等。此类方法往往需要面对昂贵的检测仪器，复杂的样品前处理步骤及额外的培训等较为苛刻的条件。近年来，生物传感器策略的出现引起了人们广泛的注意。其中，科学家们成功筛选出黄曲霉素B1对应的适体DNA序列，极大的促进了此类传感策略的设计与开发进程。Goud等开发了一种通过AFB1与适体DNA竞争引发荧光基团同淬灭基团间距离变化产生荧光信号的改变，完成了对AFB1的传感检测，检测限达到了0.2 ng/mL（Goud K. Y., Sharma A., Hayat A., etal. Anal. Biochem., 2016, 508: 19-24）。Seok等将G-四链体DNAzyme分成两部分，通过引入靶标使适体链结构产生变化，影响G-四链体构象的形成，从而直接用肉眼观察到信号的变化，该方法检测限为0.1 ng/mL（Seok Y., Byun J. Y., Shim W. B., et al. Anal.Chim. Acta., 2015, 886: 182-187）。Zhang等将黄曲霉素B1适体链修饰上荧光基团并固定到石墨烯氧化物上，利用石墨烯对荧光淬灭作用，结合DNase I对适体链的水解作为辅助放大检测信号，成功实现了对黄曲霉素B1的传感检测，检测限为0.35 ng/mL（Zhang J., LiZ., Zhao S., et al. Analyst, 2016, 141(13): 4029-4034）。Chen等利用纳米金颗粒合成简单，使用方便，定点检测等优点，结合适体DNA链同辅助DNA形成的Y型三杂交构象，做到了无标记法检测黄曲霉素B1，检测限为2 pM（Chen J., Wen J., Zhuang L., et al.Nanoscale, 2016, 8(18): 9791-9797）。然而上述方法也都具有一定缺点，Goud及Seok的策略没有做到信号放大；Zhang虽然做到了信号放大，但是石墨烯氧化物的前处理较为麻烦；Chen所用到的纳米金颗粒不稳定，对反应体系所需环境较为苛刻。因此，开发一种高选择、高灵敏的黄曲霉素B1生物传感策略迫在眉睫。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明的目的是提供一种基于信号放大技术的荧光光谱传感器的构建和应用。以及提供一种采用所述的荧光光谱传感器检测黄曲霉素B1的方法。

本发明所述的基于信号放大技术的荧光光谱传感器的构建通过如下步骤来实现：

1）适体DNA2和封闭DNA2的选取与杂交：适体DNA2包含适体结合序列及链式杂交反应的启动序列，且上述两部分序列部分可与封闭DNA2互补。

2）AFB1置换封闭DNA1，露出的杂交序列同发夹探针DNA3杂交；

3）打开DNA3链露出的序列同DNA4作用；

4）淬灭灯标探针DNA5在有Mg²⁺存在下，使荧光基团远离淬灭基团，产生荧光信号进行检测。

其中，上述所有DNA序列浓度在缓冲液中的终浓度分别为1-5 μM。

其中，上述缓冲液为含Tris和NaCl的pH 7-8的Tris-HCl缓冲液，所述Tris初始浓度为5-20 mM，NaCl初始浓度为50-150 mM。

其中，上述Mg²⁺浓度通常为20-50 mM。

上述AFB1检测步骤如下：取1 μM AFB1适体链DNA2 15 μL同10 μL 2 μM DNA1 反应30 min后，加入不同浓度AFB1标准品，补加Tris-HCl缓冲液至265 μL，5 μL 5 μM DNA3和5 μL 5 μM DNA4反应6 h。随后加入5 μL 5 μM的灯标DNA5，100 μL HEPES缓冲液，20 μL 40mM的Mg²⁺反应40 min后，检测荧光强度。

上述AFB1适体链DNA2的适体结合序列及链式杂交反应的启动序列首先被DNA1封闭，无法直接同后续的发夹探针作用。当有靶标存在时，由于适体同靶标结合力远远强于DNA与DNA间结合力，体结合序列同靶标结合后将封闭链DNA1置换下来，露出的杂交反应的启动序列可以直接同发夹探针DNA3杂交，打开DNA3链露出的序列又可以同DNA4作用，如此DNA3和DNA4可以往复循环，一个靶标可以引发多个DNA3和DNA4完成杂交，形成一条长链。加入5′端修饰有淬灭基团，3′端标记有荧光基团的具有荧光共振能量转移的淬灭灯标探针DNA5，组装形成Mg²⁺-DNAzyme特异结构，在有Mg²⁺存在下，催化剪切灯标探针，使荧光基团远离淬灭基团，产生荧光信号实现AFB1的特异性和高灵敏度检测。

本发明的显著效果及优点：

1）利用AFB1适体探针的特殊位点识别，提高AFB1检测的高度特异性。

2）DNA循环杂交链式反应，提高检测灵敏度，实现AFB1的高灵敏度检测。

3）操作简便，价格便宜，拥有较高的灵敏度和选择性以及实际样品检测能力。

附图说明

图1 基于杂交链式反应检测黄曲霉素B1原理图；

图2 不同杂交链式反应时间对应荧光信号图；

图3不同浓度下对应的荧光-时间变化曲线图。

具体实施方式

通过下述实施例将有助于理解本发明，但并不限制本发明的内容。

本实验中所用到的试剂及仪器：

黄曲霉素B1，4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES），三（羟甲基）氨基甲烷（Tris），六水合氯化镁（MgCl₂·6H₂O），氯化钠（NaCl），荧光分光光度计。实验所用DNA序列如下表1所示。

表1 实验所用DNA序列

实施例1：基于杂交链式反应及DNAzyme信号放大荧光检测黄曲霉素B1方法的建立

1. 链式杂交反应时间优化

图2为加入发夹探针后不同的反应时间下对应的荧光信号谱图。由图中可以看出，在2~6个小时内，荧光信号随着杂交链式反应时间的增长而变强，当反应时间为7小时时，信号同6小时几乎没有区别，因此，实验中我们选择链式杂交反应时间为6小时。

2. 荧光传感器灵敏度

系统考察了反应时间对荧光强度的影响。结果表明，体系加入Mg²⁺后，反应时间为40min时，荧光信号最强。系统考察了不同浓度的AFB1对荧光强度的影响。结果表明，在518 nm处荧光强度最强，反应体系荧光强度随着AFB1浓度的增加而增加。同时，当AFB1浓度范围在1 ng/mL至20 ng/mL时，荧光信号同浓度对数值大致呈线性关系。该体系检测限为0.5 ng/mL，与前人实验相比具有一定的可比性，且远远低于国标10 ng/mL，我们的方法可以达到实际样品中的AFB1的检测需求。

3. 回收率测定

为了考查实验方法用于复杂样品中检测的耐受性，我们对该方法的回收率进行了测定，样品提取液中加入不同浓度的标准品，荧光发射光谱图如图3所示， AFB1回收率在88.4%~106.0%之间，表明该传感策略具有检测实际样品中AFB1的潜力。

实施例2：霉变样品中黄曲霉素B1检测

取2 g大米粉碎后加6 mL甲醇/水溶液（甲醇:水=8:2），涡旋震荡30 min后，5000 rpm离心10 min，取上清液用0.45 μM滤头过滤，依次加入不同浓度标准品配成待测溶液。随后，按所述优化条件进行检测。检测表2中为样品提取液中黄曲霉素B1的检测数据。由表2中数据结合样品液浓度计算可知，黄曲霉素含量约为9.24±1.34 ng/g和7.82±0.62 ng/g，已经超过欧洲标准2 μg/kg，接近国标10 μg/kg，表明发霉的样品中含有一定的黄曲霉素B1，不可食用。

表2 实际样品中黄曲霉素B1含量测定

样品号	加入量（稀释倍数）	检测量（ng/mL）	原始浓度（ng/mL）
				1	4	2.31±0.33	9.24±1.34
2	2	3.91±0.31	7.82±0.62

<110> 中国海洋大学

<120> 一种基于杂交链式反应及DNAzyme信号放大荧光检测黄曲霉素B1的方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttatggtggg cctagcgaag ggcacgagac a 31

<210> 2

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列

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<210> 3

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gatatcagcg atcttttaat aactttcaat tagcataaga cttctaattg aaagcaccca 60

tgttactct 69

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agagtatrag gatatc 16

Claims

1.一种信号放大技术荧光光谱传感器检测黄曲霉素B1的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）适体DNA2和封闭DNA2的选取与杂交；

2）AFB1置换封闭DNA1，露出的杂交序列同发夹探针DNA3杂交；

3）打开DNA3链露出的序列同DNA4作用；

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法的具体步骤如下：

取AFB1适体链DNA2同DNA1 反应30 min后，加入不同浓度AFB1标准品，补加Tris-HCl缓冲液， DNA3和DNA4反应6 h，随后加入灯标DNA5，加入Mg²⁺反应40 min后，检测荧光强度。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的DNA浓度在缓冲液中的终浓度分别为1~5μM。

4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述缓冲液为含Tris和NaCl的pH 7~8的Tris-HCl缓冲液，所述Tris初始浓度为5~20 mM，NaCl初始浓度为50~150 mM。

5.根据权利要求1或2任一项所述的检测方法，其特征在于，所述的DNA序列如下：

所述的DNA1的部分序列为：5′-TTATGGTGGGCCTAGCGAAGGGCACGAGACA-3′；

所述的DNA2的部分序列为：

5′-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACCATAAGAC

TTCTAATTGA-3′；

所述的DNA3的部分序列为：

5′-GATATCAGCGATCTTCTAATTGAAAGTTATTAATCAATTAGAAGTCTTATGAAGCACC

CATGTTACTCT-3′；

所述的DNA4的部分序列为：

5′-GATATCAGCGATCTTTTAATAACTTTCAATTAGCATAAGACTTCTAATTGAAAGCACC

CATGTTACTCT-3′；

所述的DNA5的部分序列为：5′-BHQ-AGAGTATrAGGATATC-FAM-3′。