CN111793622A - 基于酶辅助级联循环扩增的发夹探针组及制备方法、用途 - Google Patents

基于酶辅助级联循环扩增的发夹探针组及制备方法、用途 Download PDF

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CN111793622A CN202010725811.3A CN202010725811A CN111793622A CN 111793622 A CN111793622 A CN 111793622A CN 202010725811 A CN202010725811 A CN 202010725811A CN 111793622 A CN111793622 A CN 111793622A
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Abstract

本发明涉及生化分析检测领域，具体涉及基于酶辅助级联循环扩增的发夹探针组及制备方法、用途，本发明提供的发夹探针组以待检测的生物靶标作为一级靶标触发第一重的靶标循环扩增，实现二级靶标序列的富集扩增。同时，二级靶标序列又能够触发第二重的靶标循环扩增，不断释放出荧光信号序列，实现了荧光信号序列的级联循环扩增。采用上述的发夹探针组，仅痕量的生物靶标就可触发产生大量的荧光信号序列，产生极强的荧光信号强度，显著提高了生物靶标检测的灵敏度，降低了检测限。同时，上述探针结合生物靶标进行级联循环扩增的特异性强，检测结果准确。

Description

基于酶辅助级联循环扩增的发夹探针组及制备方法、用途
技术领域
本发明涉及生化分析检测领域，具体涉及一种基于酶辅助级联循环扩增的发夹探针组、检测体系、生物传感器及制备方法、用途。
背景技术
目前，生化分析研究主要集中在对生物体、食品或环境中生物活性物质、重金属、生物大分子(核酸、蛋白质、酶和多肽等)、生物药物及微生物等的分析检测。因此，生化分析检测对疾病的预防诊断、环境监测、食品监控等具有十分重要的意义。通常，用于生化分析检测的实际生化分析样品中仅存在痕量靶物质，因此高灵敏度和高准确性一直是生化分析检测方法的改进目标。
为了实现低浓度靶标物质的高灵敏检测，人们引入了信号扩增技术来改善检测方法的灵敏度和特异性。到目前为止，已经开发出了多种信号扩增策略，例如酶辅助靶标循环扩增、环介导等温扩增、链置换扩增和滚环扩增等。在这些信号扩增策略中，基于工具酶(如聚合酶、连接酶、限制性内切酶、核酸外切酶、核糖核酸酶等)辅助的信号扩增策略，由于其具有操作简便、灵敏度和特异性高、反应条件温和、反应时间相对较短等优点，近年来在生化分析方面得到了飞速的发展。其中，利用核酸外切酶水解方式的差异性与纳米技术、酶切循环效应、核酸适体技术、荧光染料探针标记技术等相结合发展而成的一系列核酸外切酶辅助信号扩增策略，已广泛应用于核酸、蛋白质、离子和小分子等物质的检测。
黄曲霉毒素(AFs)是由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的双呋喃环类毒素，广泛存在于花生、玉米、水稻、小麦和坚果等农作物中。现在已经发现的黄曲霉毒素有20多种，最为重要的是黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1和M2。其中以黄曲霉毒素B1(AFB1)的毒性最大，其毒性是砒霜的68倍，氰化钾的10倍，对肝脏组织的破坏性极强，是目前所知的最强的生物致癌剂。1993年，AFB1被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定为1类致癌物。许多国家都制定了法律法规来规范食品中AFB1的含量。例如，中国和美国对食品的监管限值为20ng/mL。欧盟规定的最高允许含量为大米5ng/mL，坚果和干果2ng/mL。在日本和韩国，允许的最大含量为1ng/mL。目前，国内广泛采用高效液相色谱(HPLC)法检测食品、药品中AFB1的含量。HPLC法具有良好的灵敏度和高选择性，但所需仪器设备昂贵、操作程序复杂，需要专业人员才能进行操作。因此，开发简单、快速、高灵敏检测AFB1的方法具有十分重要的意义。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种简单、快速、高灵敏检测黄曲霉毒素B1的基于酶辅助级联循环扩增的发夹探针组、检测体系、生物传感器及制备方法、用途。
为此，本发明提供如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种基于酶辅助级联循环扩增的发夹探针组，包括
第一发夹探针，所述第一发夹探针由5’端到3’端依次包括结合生物靶标的适体序列和第一结合序列，所述适体序列与所述第一结合序列的部分碱基配对使所述第一发夹探针形成发夹结构；
第二发夹探针，所述第二发夹探针由5’端到3’端依次包括第二结合序列和二级靶标序列，所述第二结合序列为所述第一结合序列的互补序列，所述第二结合序列与所述二级靶标序列的部分碱基配对使所述第二发夹探针形成发夹结构；
第三发夹探针，所述第三发夹探针由5’端到3’端依次包括第三结合序列和荧光信号序列，所述第三结合序列为所述二级靶标序列的部分序列的互补序列，且所述二级靶标序列与所述第三结合序列互补杂交时，所述二级靶标序列的5’端为突出末端，所述第三结合序列与所述荧光信号序列部分碱基配对使所述第三发夹探针形成发夹结构；
所述荧光信号序列为荧光分子的模板序列。
可选地，上述的基于酶辅助级联循环扩增的发夹探针组，
所述适体序列由5’端到3’端依次包括序列a、序列b和序列c；所述第一结合序列由5’端到3’端依次包括序列d，和与序列b互补的序列b*；所述适体序列的序列b与序列b*配对形成发夹探针的茎干区，序列d和序列c形成发夹探针的茎环区；
所述第二结合序列由5’端到3’端依次包括序列b，和与序列d互补的序列d*；所述二级靶标序列由5’端到3’端依次包括突出末端序列、序列e和序列d；所述第二结合序列的序列d*与所述二级靶标序列的序列d配对形成发夹探针的茎干区，突出末端序列和序列e形成发夹探针的茎环区；
所述第三结合序列由5’端到3’端依次包括序列d*，和与序列e互补的序列e*；所述荧光信号序列由5’端到3’端依次包括序列f和序列e；所述第三结合序列的序列e*与所述荧光信号序列序列e配对形成发夹探针的茎干区，序列f形成发夹探针的茎环区。
可选地，上述的基于酶辅助级联循环扩增的发夹探针组，所述适体序列是以黄曲霉素为生物靶标的适体序列，所述荧光信号序列为AgNCs的模板序列，所述突出末端序列包含至少5个碱基；
优选地，所述适体序列是以黄曲霉毒素B1为生物靶标的适体序列；优选地，所述适体序列包含50个碱基，所述荧光信号序列包含12个胞嘧啶碱基。
可选地，上述的基于酶辅助级联循环扩增的发夹探针组，所述第一发夹探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二发夹探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述第三发夹探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
第二方面，本发明提供了一种基于酶辅助级联循环扩增的检测体系，包括上述的发夹探针组；
优选地，所述检测体系中，所述第一发夹探针、第二发夹探针和第三发夹探针的摩尔比为1:1:(1-1.5)。
第三方面，本发明提供了一种基于酶辅助级联循环扩增的生物传感器，包括上述的发夹探针组，或上述的检测体系。
第四方面，本发明提供了上述的基于酶辅助级联循环扩增的发夹探针组、检测体系，或生物传感器在如下a1-a2至少一种中的用途：
a1，检测生物靶标；a2，制备检测生物靶标的产品；
优选地，所述生物靶标为黄曲霉毒素B1。
第五方面，本发明提供了一种上述的基于酶辅助级联循环扩增的发夹探针组的制备方法，包括以下步骤：
第一发夹探针、第二发夹探针和第三发夹探针分别溶解后，加热至95℃保持5分钟，缓慢冷却至室温，使所述第一发夹探针、第二发夹探针和第三发夹探针形成发夹结构；
优选地，所述第一发夹探针、第二发夹探针和第三发夹探针分别溶解于20mMTris-HNO3缓冲液；
优选地，所述Tris-HNO3缓冲液包含20mM NaNO3,10mM NH4NO3,2mM Mg(NO3)2,所述Tris-HNO3缓冲液的pH 7.4。
第六方面，本发明提供了一种生物靶标的荧光检测方法，包括使用上述的基于酶辅助级联循环扩增的发夹探针组、检测体系，或生物传感器；
优选地，所述生物靶标为黄曲霉毒素B1。
可选地，上述的荧光检测方法，包括以下步骤：
S1，将待测样品、第一发夹探针、第二发夹探针、第三发夹探针和T7核酸外切酶在第一缓冲液中混合，混合液加热孵育，然后冷却至室温，得第一反应液；
S2，取第一反应液加入第二缓冲液中，然后向所述第二缓冲液中加入AgNO3溶液，振荡后室温下避光孵育，继续加入还原溶液，室温下避光孵育，得第二反应液；
S3，对所述第二反应液进行荧光测定，实现对所述生物靶标的检测；
优选地，所述步骤S1中，混合液加热孵育的条件为37℃孵育90分钟；
优选地，所述第一缓冲液为NEBuffer 4缓冲液，所述第二缓冲液为柠檬酸钠缓冲液，所述还原溶液为NaBH4溶液；
优选地，所述NEBuffer 4缓冲液包含20mM Tris-HNO3,50mM KNO3,10mM Mg(NO3)2,1mM DTT,所述NEBuffer 4缓冲液的pH 7.9；
优选地，所述柠檬酸钠缓冲液包含10mM柠檬酸钠,体积百分比0.05％Tween 20,所述柠檬酸钠缓冲液的pH 7.0。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的基于酶辅助级联循环扩增的发夹探针组，包括第一发夹探针、第二发夹探针和第三发夹探针，当以上述的发夹探针组检测生物靶标分子时，位于第一发夹探针5’端的适体序列特异性识别并结合生物靶标，形成第一发夹探针-生物靶标的复合体，使第一发夹探针的发夹结构打开，与适体序列部分碱基配对的第一结合序列与适体序列的双链结构解开后，使位于第一发夹探针3’端的第一结合序列暴露出来。暴露的第一结合序列作为立足点与第二发夹探针杂交，具体地，第一发夹探针3’端的第一结合序列与第二发夹探针5’端的第二结合序列杂交互补，形成第一发夹探针-生物靶标-第二发夹探针的复合体。第二发夹探针的发夹结构被打开，暴露出与第二结合序列部分碱基配对的二级靶标序列。同时，在第一发夹探针-生物靶标-第二发夹探针的复合体中，第一结合序列与第二结合序列杂交互补形成具有5’-平末端的双链DNA结构，在有T7核酸外切酶存在的环境下，从双链DNA的5’末端逐个消化水解核苷酸，使第二发夹探针5’端的第二结合序列被酶切消化，释放出第一发夹探针-生物靶标的复合体，以及第二发夹探针的二级靶标序列。释放出的第一发夹探针-生物靶标的复合体又可以结合另一个第二发夹探针，触发新一轮的循环过程，从而实现第一重的靶标循环扩增(Cycle I)。与此同时，每一轮循环扩增结束后产生的二级靶标序列，又可以触发第二重的级联循环扩增(Cycle II)。具体地，第一重靶标循环扩增产生的二级靶标序列与第三发夹探针的第三结合序列杂交配对，形成第三发夹探针-二级靶标复合体。第三发夹探针的发夹结构被打开，暴露出与第三结合序列配对的荧光信号序列。同时，第三结合序列与二级靶标序列互补形成双链DNA结构，由于在二级靶标序列的5’端具有突出末端序列，双链DNA结构仅在第三结合序列的5’端形成平末端，第三结合序列的5’平末端能够被T7核酸外切酶逐个消化水解，释放出第三发夹探针的荧光信号序列以及第二发夹探针的二级靶标序列。释放出的二级靶标序列又能够结合另一个第三发夹探针，触发新一轮的靶标循环过程，实现第二重的靶标循环扩增(Cycle II)。
上述的发夹探针组以待检测的生物靶标作为一级靶标触发第一重的靶标循环扩增，实现二级靶标序列的富集扩增。同时，二级靶标序列又能够触发第二重的靶标循环扩增，不断释放出荧光信号序列，实现T7核酸外切酶辅助的级联循环扩增。第一发夹探针-生物靶标的复合体始终存在于Cycle I的循环扩增过程中，通过不断与第二发夹探针结合，经T7核酸外切酶水解后，不断释放出二级靶标序列；释放的二级靶标序列又作为Cycle II循环扩增过程的触发序列，通过与第三发夹探针的结合释放出荧光信号序列。由于在CycleII循环扩增过程中仅第三发夹探针被水解，二级靶标序列始终存在于Cycle II的循环扩增过程中，使荧光信号序列被不断释放，实现了荧光信号序列的级联循环扩增。采用上述的发夹探针组，仅痕量的生物靶标就可触发产生大量的荧光信号序列，产生极强的荧光信号强度，显著提高了生物靶标检测的灵敏度，降低了检测限。同时，上述探针结合生物靶标进行级联循环扩增的特异性强，检测结果准确。
此外，发夹探针组以荧光信号序列作为荧光分子的模板序列，发夹探针不需要进行荧光基团及淬灭基团的标记，也不需要任何的化学修饰，避免了探针标记效率低、费用昂贵等问题，具有高性价比。
2.本发明提供的基于酶辅助级联循环扩增的发夹探针组，提供了第一发夹探针中适体序列、第一结合序列，第二发夹探针中第二结合序列、二级靶标序列，以及第三发夹探针中第三结合序列、荧光信号序列的具体序列组成。众所周知，探针的设计是整个分析检测的核心，生物探针通常是一段有序排列的DNA序列，虽然本领域中已公开了多类分析检测用的探针，但由于探针的序列构成繁杂多样，对于理论上具有可行性的生物探针，在实际应用时也未必能够产生有效的检测结果。对于本发明中的发夹探针组，第一发夹探针不仅是生物标靶的识别探针，还需要与第二发夹探针巧妙的配合以触发T7核酸外切酶辅助的靶标循环扩增，实现第一重靶标循环扩增。同时，靶标循环扩增后得到的第二发夹探针的酶切消化后的产物，还需要与第三发夹探针配合，触发T7核酸外切酶辅助的第二重的靶标循环扩增，在第二重靶标循环扩增中第三发夹探针在每次循环中被不断酶切释放出荧光信号序列，实现了T7核酸外切酶辅助的级联循环扩增。
发明人经创造性劳动，在纷繁复杂的探针序列中经过设计和筛选，得到上述具体地各序列区段及其组合方式，当检测环境中不存在待测的生物靶标时，三种探针各自构成稳定的发夹结构；当环境中存在待测的生物靶标时，发夹探针组的探针不仅识别并结合生物靶标，还通过相互联系和紧密的配合，实现荧光信号的转导与放大，荧光信号的强度随生物靶标浓度的增加呈指数级上升，最终实现对生物靶标高灵敏度和高特异性的检测。同时，通过上述的分区段设计，有效精简了探针结构，以功能为导向确认各区段序列，避免了探针序列冗余，降低了探针设计的难度，并且能够避免DNA序列的交替折叠，获得较高的序列稳定性。
3.本发明提供的基于酶辅助级联循环扩增的发夹探针组，适体序列是以黄曲霉素为生物靶标的适体序列，能够实现对黄曲霉素的低检测限、高灵敏度和特异性的检出，能够实现对黄曲霉素的痕量检出，为食品安全分析、环境分析、质量控制、进出口贸易等领域的黄曲霉素检出提供了一种有效的检测手段。同时，本发明提供的发夹探针组稳定性高，对检测环境的要求低，且检测过程中不需要使用大型仪器设备、操作简单，适于黄曲霉素检出的大规模普及应用。进一步地，发夹探针组所检出的黄曲霉素为黄曲霉素B1。
本发明提供的发夹探针组中的荧光信号序列为AgNCs的模板序列，银纳米团簇(AgNCs)具有优异的分散性和大的比表面积，高的光学稳定性和荧光发射强度，且荧光发射光谱在可见光范围内可调。以DNA为模板合成银纳米团簇(AgNCs)，利用DNA模板序列优异的生物相容性，使AgNCs具有良好的生物相容性和低的细胞毒性。此外，以荧光信号序列作为合成AgNCs的DNA模板序列，便于将荧光信号序列编码进探针序列中，使探针免于荧光标记。荧光信号序列包含12个胞嘧啶碱基，利用上述的DNA单链片段为模板制备的AgNCs的荧光发射光谱的种类多、荧光量子产率高。
4.本发明提供的基于酶辅助级联循环扩增的发夹探针组，第一发夹探针-第三发夹探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示，上述设计的第一发夹探针、第二发夹探针和第三发夹探针能够协同配合并在T7核酸外切酶辅助下实现级联循环扩增。第一发夹探针的适体序列为黄曲霉素B1(AFB1)的适体序列，能够高亲和性、高灵敏的捕获AFB1。
5.本发明提供的基于酶辅助级联循环扩增的检测体系及生物传感器，对探针的摩尔比，以及检测环境中缓冲液的选择与搭配、盐离子的浓度、体系的pH、扩增反应的温度与时间、工具酶的选择和用量等等进行优化，是最适于采用本发明提供的发夹探针组基于T7核酸外切酶辅助的级联循环扩增条件。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中发夹探针H1、H2和H3的设计过程示意图；
图2是本发明实施例1中基于T7核酸外切酶辅助的靶标级联循环扩增策略检测AFB1的示意图；
图3是本发明对比例1中基于T7核酸外切酶辅助的靶标循环扩增策略检测AFB1的示意图；
图4是本发明实验例1中对实施例1及对比例1中的发夹探针检测靶标AFB1的荧光响应图；
图5是本发明实验例2中发夹探针H1/H2浓度对传感系统的影响结果图；
图6是本发明实验例2中发夹探针H3浓度对传感系统的影响结果图；
图7是本发明实验例2中核酸外切酶用量对传感系统的影响结果图；
图8是本发明实验例2中扩增反应时间对传感系统的影响结果图；
图9是本发明实验例3中传感系统对不同浓度的AFB1的荧光响应图；图中a图为传感系统对不同浓度的AFB1的荧光响应；图中b图为604nm处的荧光强度与AFB1浓度间的指数关系，插图为荧光强度与AFB1浓度的对数间的线性关系；
图10是本发明实验例4中传感系统对不同靶标的荧光响应图；图中a图为传感系统对不同靶标的荧光响应；图中b图为黄曲霉毒素(AFB1、AFB2、AFG1和AFM1)和其他两种霉菌毒素(ZEN和OTA)的化学结构。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
下述实施例中涉及到的材料和试剂如下：HPLC纯的寡核苷酸序列(适体序列、荧光信号序列、第一发夹探针、第二发夹探针、第三发夹探针、第四发夹探针和第五发夹探针)从南京金斯瑞生物科技有限公司订购。黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素G1(AFG1)、黄曲霉毒素M1(AFM1)、赭曲霉毒素A(OTA)和玉米赤霉烯酮(ZEN)购自广州分析测试中心科力技术开发公司。T7核酸外切酶购自纽英伦生物技术(北京)有限公司。当归、党参和黄芪购自无锡市中医院。花生、玉米和小麦来自当地的大润发超市。硝酸银(AgNO3)和硼氢化钠(NaBH4)由西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司提供。整个实验过程中使用的DEPC处理水购自生工生物工程(上海)股份有限公司。其他化学品均为分析纯，未经进一步纯化即使用；
下述实施例中涉及的实验仪器如下：荧光测量在室温下SpectraMax M5e多模式酶标仪上进行，该酶标仪搭载有SoftMax Pro 6.3数据采集和分析工作站(美国加利福尼亚州，美谷分子仪器有限公司)。激发波长535nm，发射光谱收集范围560-700nm，检测步长2nm。最大荧光发射波长604nm。
下述实施例中涉及的室温温度范围为20-25℃。
下述实验例中涉及的AFB1标准品、AFB2标准品、AFG1标准品、AFM1标准品、ZEN标准品、OTA标准品均是从标准物质公司购买。规格均为：1mL的液体包装，溶剂是苯：甲醇＝98：2(体积比)，浓度是2.0μg/mL。在使用时，将标准品用溶剂苯：甲醇＝98：2(体积比)稀释至所需浓度。
本发明实验例中涉及的第一发夹探针H1、第二发夹探针H2或第三发夹探针H3“最终浓度”是指加入的发夹探针溶液的浓度×该发夹探针溶液初始加入的体积/所述生物传感器总体积，所述生物传感器总体积为100μL，例如在实验例2的检测方法中，假设步骤(1)中加入的第三发夹探针H3溶液的浓度为1μM，其初始加入的体积为3μL，所述生物传感器总体积为100μL，则第三发夹探针H3的最终浓度＝1μM×3μL/100μL＝30nM。
实施例1
本实施例提供一种基于酶辅助级联循环扩增的发夹探针组，包括如下探针：
第一发夹探针，由5’端到3’端依次包括结合生物靶标的适体序列和第一结合序列，适体序列与第一结合序列的部分碱基配对使第一发夹探针形成发夹结构。其中，适体序列由5’端到3’端依次包括序列a、序列b和序列c，第一结合序列由5’端到3’端依次包括序列d，和与序列b互补的序列b*。适体序列的序列b与第一结合序列的序列b*配对形成发夹探针的茎干区，适体序列的序列d与第一结合序列的序列c形成发夹探针的茎环区。
第二发夹探针，由5’端到3’端依次包括第二结合序列和二级靶标序列，第二结合序列为第一结合序列的互补序列，且第二结合序列与二级靶标序列的部分碱基配对使第二发夹探针形成发夹结构。其中，第二结合序列由5’端到3’端依次包括序列b，和与序列d互补的序列d*，二级靶标序列由5’端到3’端依次包括突出末端序列、序列e和序列d，第二结合序列的序列d*与二级靶标序列的序列d配对形成发夹探针的茎干区，突出末端序列和序列e形成发夹探针的茎环区。
第三发夹探针由5’端到3’端依次包括第三结合序列和荧光信号序列，第三结合序列为二级靶标序列的部分序列的互补序列，且所述二级靶标序列与所述第三结合序列互补杂交时，所述二级靶标序列的5’端为突出末端，第三结合序列与荧光信号序列部分碱基配对使第三发夹探针形成发夹结构。其中，第三结合序列由5’端到3’端依次包括序列d*，和与序列e互补的序列e*；荧光信号序列由5’端到3’端依次包括序列f和序列e；第三结合序列的序列e*与荧光信号序列的序列e配对形成发夹探针的茎干区，荧光信号序列的序列f形成发夹探针的茎环区。第三发夹探针的荧光信号序列作为荧光分子的模板序列。
基于上述发夹探针组设计得到具体的序列见序列表，所述第一发夹探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二发夹探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述第三发夹探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
为了反应上述发夹探针组的具体序列中的各区段，参见下表1，其中第一发夹探针(简称为H1)、第二发夹探针(简称为H2)、第三发夹探针(简称为H3)、适体序列(简称为AP)和荧光信号序列(简称为TP)，如下表1所示：
表1
Figure BDA0002601616760000081
上述探针的设计过程如图1所示：
本实施例的发夹探针组主要由三个免标记的第一发夹探针H1、第二发夹探针H2和第三发夹探针H3组成。根据设计，第一发夹探针H1是靶标AFB1的识别探针，它可以通过适体序列高亲和力和高特异性的捕获AFB1分子。第二发夹探针H2可以与第一发夹探针H1协同作用，在T7核酸外切酶辅助下进行第一重靶标循环扩增，并可以与第三发夹探针H3连接，起到桥梁的作用。第三发夹探针H3是第二重靶标循环扩增的重要探针，同时也是荧光信号的输出载体。适体序列AP(50个碱基)首先由5’端到3’端依次被划分为序列a、序列b和序列c，与序列a、序列b或序列c互补的序列分别用星号表示。一旦确定了适体序列AP中的序列，第一发夹探针H1中的序列a、序列b、序列c和序列b*也随之确定，剩下序列d有待设计。荧光信号序列TP(20个碱基)是一段富含12个胞嘧啶碱基的DNA序列，作为AgNCs的合成模板，被均分为两个序列e和序列f。当荧光信号序列TP被确定后，第三发夹探针H3中的序列e、序列f和序列e*也随之被确定，剩下序列d*有待设计。为了确定未定义的序列d和序列d*，在设计中引入了OligoAnalyzer软件(3.1版)来预测二级结构，避免DNA序列的交替折叠。经过软件计算，序列d和d*被确定下来。第一发夹探针H1和第三发夹探针H3设计完成后，根据碱基互补性进一步可确定第二发夹探针H2中的序列。值得注意的是，第二发夹探针H2中的二级靶标序列由5’端到3’端依次包括突出末端序列、序列e和序列d，设计突出末端序列的目的是为了在Cycle II中由第二发夹探针H2释放的二级靶标序列与第三发夹探针H3互补杂交产生双链DNA结构的复合物(简称为H3-ST)中二级靶标序列ST留下一个5'-突末端，避免二级靶标序列ST被T7核酸外切酶催化降解。同样地，使用OligoAnalyzer软件确定二级靶标突出末端序列中未定义的5个碱基(在本实施例中突出末端序列设置为5个碱基TCCTT)。通过这些精心设计，这三个未标记的发夹探针H1、H2和H3可以互相协同实现级联循环扩增。
发夹探针H1、H2、H3的工作原理如图2所示：由于T7核酸外切酶对双链DNA的5'-突出末端没有剪切活性，因此，初始状态下，三个发夹探针H1、H2和H3可以保持其发夹构象不被体系中的T7核酸外切酶剪切。因此，在没有靶标AFB1的情况下，三个发夹探针在溶液中稳定共存，荧光背景几乎可以忽略不计。当存在靶标AFB1时，第一发夹探针H1高亲和性高特异性地捕获AFB1分子，从而打开发夹结构并暴露出序列b*和d。以暴露的序列b*和d作为立足点与第二发夹探针H2杂交，形成具有5'-平末端的第一发夹探针H1-AFB1分子-第二发夹探针H2的复合物(简称为H1-AFB1-H2)。体系中的T7核酸外切酶随即催化降解该复合物，从5'-3'方向逐步去除单核苷酸，并释放出第一发夹探针H1-AFB1分子的复合物(简称为H1-AFB1)。释放出的H1-AFB1可自由结合新的第二发夹探针H2，从而触发新一轮的循环，从而实现第一重的靶标循环扩增(Cycle I)。与此同时，在每一轮的剪切反应过程中，二级靶标序列ST同样被释放出来，作为二级靶标触发第二重的级联循环扩增(Cycle II)，具体为，二级靶标序列ST与第三发夹探针H3互补结合，形成双链DNA结构的复合物。值得注意的是，二级靶标序列ST中的序列e的5’端具有5个碱基的突出末端序列，当二级靶标序列ST和第三发夹探针H3杂交后形成的双链DNA结构中二级靶标序列ST的5’端具有突出末端，只有在第三发夹探针H3的5’端形成了5’-平末端，因此，T7核酸外切酶只能从第三发夹探针H3的5’端催化降解第三发夹探针H3，并再次释放出二级靶标序列ST作为下一轮Cycle II循环的二级靶标，同时释放出荧光信号序列TP(序列f和e)作为合成AgNCs的DNA模板。Cycle I和Cycle II构成了T7核酸外切酶辅助的级联循环扩增。遵循这一机制，痕量的靶标AFB1可以进行多轮次的级联循环反应产生大量的荧光信号序列TP，在AgNO3和NaBH4存在下，合成荧光AgNCs，实现痕量的靶标AFB1荧光检测信号的放大。因此，传感系统的荧光响应与AFB1的浓度呈正相关。
实施例2
本实施例提供一种基于酶辅助级联循环扩增的发夹探针组的制备方法，包括如下步骤：
将发夹探针序列H1、H2和H3的干粉12000rpm离心5分钟，然后分别溶解于20mMTris-HNO3缓冲液(20mM NaNO3,10mM NH4NO3,2mM Mg(NO3)2,pH 7.4)中，得到100μM储备溶液。接着，将发夹探针序列H1、H2和H3的储备溶液(100μM)分别加热至95℃保持5分钟，随后缓慢冷却至室温以形成发夹结构。
实施例3
本实施例提供一种生物靶标的荧光检测方法，生物靶标具体为黄曲霉素B1(AFB1)，包括以下步骤：
S1，将待测样品、第一发夹探针、第二发夹探针、第三发夹探针和T7核酸外切酶在第一缓冲液中混合，混合液加热孵育，然后冷却至室温，得第一反应液；具体为：
将1μL可能含靶标AFB1的待测样品、2μL第一发夹探针H1(1μM)、2μL第二发夹探针H2(1μM)、3μL第三发夹探针H3(1μM)和1μL的T7 Exo(10U/μL)依次加入到42μL的1×NEBuffer 4缓冲液(20mM Tris-HNO3,50mM KNO3,10mM Mg(NO3)2,1mM DTT,pH 7.9)中。混合液于37℃孵育90分钟，然后冷却至室温，得到第一反应液。
S2，取第一反应液加入第二缓冲液中，然后向所述第二缓冲液中加入AgNO3溶液，振荡后室温下避光孵育，继续加入还原溶液，室温下避光孵育，得第二反应液；具体为：
将51μL上述第一反应液转移至48μL柠檬酸钠缓冲液(10mM柠檬酸钠,体积百分比0.05％Tween 20,pH 7.0)中。加入1μL AgNO3(60μM)溶液，然后剧烈振荡1分钟。混合液室温避光孵育30分钟。随后，加入1μL新鲜制备的NaBH4(60μM)溶液，室温避光孵育60分钟。
S3，待第二反应液完全还原后，对所述第二反应液进行荧光测定，实现对所述生物靶标的检测。
实施例4
本实施例提供一种基于酶辅助级联循环扩增的检测体系，包括实施例1中的发夹探针组，包括：第一发夹探针H1，1μM，2μL；第二发夹探针H2，1μM，2μL；第三发夹探针H3，1μM，2μL；发夹探针H1、H2、H3分别溶解于20mM Tris-HNO3缓冲液(20mM NaNO3,10mM NH4NO3,2mMMg(NO3)2,pH 7.4)中。
实施例5
本实施例提供一种基于酶辅助级联循环扩增的检测体系，包括实施例1中的发夹探针组，包括：
第一发夹探针H1，1μM，2μL；第二发夹探针H2，1μM，2μL；第三发夹探针H3，1μM，3μL；H1、H2、H3分别溶解于20mM Tris-HNO3缓冲液(20mM NaNO3,10mM NH4NO3,2mM Mg(NO3)2,pH7.4)中。
实施例6
本实施例提供一种基于酶辅助级联循环扩增的生物传感器，包括实施例1中的发夹探针组，具体地，以总体积为100μL为计，包括：
第一发夹探针H1，1μM，2μL；第二发夹探针H2，1μM，2μL；第三发夹探针H3，1μM，3μL；T7 Exo，10U/μL，1μL；NEBuffer 4缓冲液，1×，42μL；柠檬酸钠缓冲液，1×，48μL；AgNO3溶液，60μM，1μL；NaBH4溶液，60μM，1μL；NEBuffer4缓冲液包含：20mM Tris-HNO3,50mM KNO3,10mM Mg(NO3)2,1mM DTT,pH 7.9；柠檬酸钠缓冲液包含10mM柠檬酸钠,体积百分比0.05％Tween 20,pH 7.0。
实施例7
本实施例提供一种基于酶辅助级联循环扩增的生物传感器，包括实施例1中的发夹探针组，具体地，以总体积为100μL为计，包括：
第一发夹探针H1，1μM，2μL；第二发夹探针H2，1μM，2μL；第三发夹探针H3，1μM，2μL；T7 Exo，10U/μL，1μL；NEBuffer 4缓冲液，1×，43μL；柠檬酸钠缓冲液，1×，48μL；AgNO3溶液，60μM，1μL；NaBH4溶液，60μM，1μL；NEBuffer4缓冲液包含：20mM Tris-HNO3,50mM KNO3,10mM Mg(NO3)2,1mM DTT,pH 7.9；柠檬酸钠缓冲液包含10mM柠檬酸钠,体积百分比0.05％Tween 20,pH 7.0。
对比例1
为验证本发明提供的基于酶辅助级联循环扩增(T7-EACRA)策略的发夹探针组的扩增效果，本对比例设计了一种T7核酸外切酶辅助的靶标循环扩增(T7-EATRA)策略。T7-EATRA传感系统由第四发夹探针H4、第五发夹探针H5以及T7核酸外切酶组成，发夹探针H4和H5的核苷酸序列如下表2所示：
表2
Figure BDA0002601616760000111
发夹探针H4、H5的工作原理如图3所示：在第四发夹探针H4中，序列a、b和c共同构成靶标的识别区域，用于特异性捕获AFB1分子。序列c和序列e位于发夹的环状区，序列b*与序列b在发夹的茎干区杂交，形成稳定的发夹结构。在第五发夹探针H5中，序列f和e是一段富含12个胞嘧啶碱基的DNA序列，是荧光信号序列简称为TP序列，可作为合成荧光AgNCs的优良DNA模板。值得注意的是，在第五发夹探针H5中，序列e最初被锁定在茎干区的双链中。因此，初始状态下，银纳米团簇的合成受到抑制。当加入靶标AFB1后，靶标与第四发夹探针H4特异性结合，导致第四发夹探针H4的发夹构象发生变化，暴露出序列b*和e，并与第五发夹探针H5中的结构域b和e*杂交，形成第四发夹探针H4-AFB1-第五发夹探针H5的复合物(简称为H4-AFB1-H5)，所述复合物H4-AFB1-H5具有双链DNA结构，且在第五发夹探针H5的5’端形成5'-平末端，可被T7核酸外切酶催化降解，从复合物H4-AFB1-H5的5'-平末端逐步去除单核苷酸。催化降解的过程中，释放出第四发夹探针H4-AFB1的复合物(简称为H4-AFB1)用于下一轮的循环，同时释放出荧光信号序列TP作为合成AgNCs的DNA模板。
上述发夹探针H4和H5的制备方法如下：将发夹探针序列H4和H5的干粉12000rpm离心5分钟，然后分别溶解于20mM Tris-HNO3缓冲液(20mM NaNO3,10mM NH4NO3,2mM Mg(NO3)2,pH 7.4)中，得到100μM储备溶液。接着，将发夹探针序列H4和H5的储备溶液(100μM)分别加热至95℃保持5分钟，随后缓慢冷却至室温以形成发夹结构。
实验例1
分别使用实施例1中基于酶辅助级联循环扩增(T7-EACRA)策略的发夹探针组的发夹探针与对比例1中基于酶辅助靶标循环扩增(T7-EATRA)策略的发夹探针检测100ng/mL的靶标AFB1，结果见图4，图中a-d分别表示：
(a)H4+H5+T7 Exo,即基于酶辅助靶标循环扩增的生物传感器中包括第四发夹探针H4、第五发夹探针H5和T7 Exo；但在检测时待测样品中不含靶标AFB1；
(b)H1+H2+H3+T7 Exo,即基于酶辅助级联循环扩增的生物传感器中包括第一发夹探针H1、第二发夹探针H2、第三发夹探针H3和T7 Exo；但在检测时待测样品中不含靶标AFB1；
(c)H4+H5+T7 Exo+AFB1,即基于酶辅助靶标循环扩增的生物传感器中包括第四发夹探针H4、第五发夹探针H5和T7 Exo；且在检测时待测样品中含靶标AFB1；
(d)H1+H2+H3+T7 Exo+AFB1，即基于酶辅助级联循环扩增的生物传感器中包括第一发夹探针H1、第二发夹探针H2、第三发夹探针H3和T7 Exo；且在检测时待测样品中含靶标AFB1；
检测方法如下：
(1)、将1μL含靶标AFB1的待测样品(黄曲霉毒素B1标准品经过溶剂苯：甲醇＝98：2(体积比)稀释得到的AFB1浓度为100ng/mL的AFB1溶液)或空白对照(不含靶标AFB1的溶剂苯：甲醇＝98：2(体积比))、2μL第一发夹探针H1(1μM)、2μL第二发夹探针H2(1μM)、3μL第三发夹探针H3(1μM)、2μL第四发夹探针H4(1μM)和/或2μL第五发夹探针H5(1μM)，以及1μL的T7Exo(10U/μL)依次加入到1×NEBuffer 4缓冲液(20mMTris-HNO3,50mM KNO3,10mM Mg(NO3)2,1mM DTT,pH 7.9)中，用NEBuffer 4缓冲液补足至51μL。将所得混合液于37℃孵育90分钟，然后冷却至室温，得到第一反应液；
(2)将51μL上述第一反应液转移至48μL柠檬酸钠缓冲液(10mM柠檬酸钠,体积百分比0.05％Tween 20,pH 7.0)中。加入1μL AgNO3(60μM)溶液，然后剧烈振荡1分钟。混合液室温避光孵育30分钟。随后，加入1μL新鲜制备的NaBH4(60μM)溶液，室温避光孵育60分钟，得到第二反应液；
(3)待第二反应液完全还原后，对所述第二反应液进行荧光测定，实现对所述生物靶标的检测。λex＝535nm；λem＝604nm。
检测结果如图4所示：
在检测时，靶标AFB1不存在的情况下，a和b的两个传感系统都显示出较低的荧光响应(曲线a和b)。这间接证明了第一发夹探针H1、第二发夹探针H2、第三发夹探针H3和第四发夹探针H4、第五发夹探针H5在反应液中既没有被T7核酸外切酶剪切，也没有相互间杂交。当将AFB1引入传感系统后，基于T7-EATRA策略的传感系统可观察到明显的荧光信号(曲线c)。与T7-EATRA策略不同，基于T7-EACRA策略的传感系统的荧光信号(曲线d)明显强于基于T7-EATRA策略的传感信号(曲线c)。比较两种扩增策略，很明显，T7-EACRA策略具有更高的扩增效率，信号增强了44.13％(曲线d vs c)。这些结果有力地证明了T7-EACRA策略对于AFB1的扩增检测是非常有效的，引入级联扩增策略更有助于传感系统分析性能的提高。
实验例2
1、实验目的：为了获得最佳的传感系统分析性能，通过检测100ng/mL靶标AFB1的荧光，详细研究了发夹探针浓度、T7核酸外切酶用量、级联扩增反应时间等实验条件对传感系统分析性能的影响。
2、实验方法及结果：
下述实验中涉及的检测方法：
(1)、将1μL待测样品(黄曲霉毒素B1标准品经过溶剂苯：甲醇＝98：2(体积比)稀释得到的AFB1浓度为100ng/mL的AFB1溶液)、2μL第一发夹探针H1、2μL第二发夹探针H2、3μL第三发夹探针H3和1μL的T7 Exo依次加入到的1×NEBuffer 4缓冲液(20mM Tris-HNO3,50mMKNO3,10mM Mg(NO3)2,1mM DTT,pH 7.9)中，用NEBuffer 4缓冲液补足至51μL。混合液于37℃孵育90分钟，然后冷却至室温，得到第一反应液；
(2)将51μL上述第一反应液转移至48μL柠檬酸钠缓冲液(10mM柠檬酸钠,体积百分比0.05％Tween 20,pH 7.0)中。加入1μL AgNO3(60μM)溶液，然后剧烈振荡1分钟。混合液室温避光孵育30分钟。随后，加入1μL新鲜制备的NaBH4(60μM)溶液，室温避光孵育60分钟，得到第二反应液；
(3)待第二反应液完全还原后，对所述第二反应液进行荧光测定，实现对所述生物靶标的检测。λex＝535nm；λem＝604nm。
2.1、第一发夹探针H1和第二发夹探针H2
第一重的靶标循环扩增反应(Cycle I)主要涉及第一发夹探针H1和第二发夹探针H2。因此，在实验方法中，将第三发夹探针H3的最终浓度固定为20nM，第一发夹探针H1和第二发夹探针H2的最终浓度设置成从10nM梯度变化为50nM(两者浓度相同)，梯度为10nM。评判的标准基于F/F0的比值，其中F和F0分别表示存在和不存在AFB1时的荧光强度(λem＝604nm)。实验条件：第三发夹探针H3最终浓度20nM,T7核酸外切酶用量10U。检测条件：λex＝535nm；λem＝604nm。误差棒代表标准偏差(n＝3)。将上述第一发夹探针H1和第二发夹探针H2设定的最终浓度、实验条件和检测条件代入上述检测方法。
检测结果如图5所示，当发夹探针H1和H2的最终浓度均为20nM时，可获得最高的F/F0比值。因此，选择最终浓度20nM作为发夹探针H1和H2的最优最终浓度用于后续的实验。
2.2、第三发夹探针
由于第三发夹探针H3在第二重的靶标循环扩增反应(Cycle II)中起着关键的作用。合适的第三发夹探针H3浓度可以提高反应动力学，正向促进级联扩增反应，从而提高传感系统的灵敏度。因此，很有必要对第三发夹探针H3的浓度进行进一步的优化。
因此，在实验方法中，将第一发夹探针H1和第二发夹探针H2的最终浓度固定为20nM的基础上，将第三发夹探针H3的最终浓度从20nM梯度变化为40nM，梯度为5nM。实验条件：第一发夹探针H1最终浓度20nM,第二发夹探针H2最终浓度20nM,T7核酸外切酶用量10U。检测条件：λex＝535nm；λem＝604nm。误差棒代表标准偏差(n＝3)。将上述第三发夹探针H3设定的最终浓度、实验条件和检测条件代入上述检测方法。
检测结果如图6所示，F/F0比值随着第三发夹探针H3最终浓度从20nM到30nM的增加而增加，之后随着第三发夹探针H3浓度的增加而下降。F/F0比值的降低主要是由于过高的第三发夹探针H3浓度所致。虽然高浓度的第三发夹探针H3可以提高反应的扩增效率，但由于非特异性扩增的存在，这也会带来较高的背景信号。因此，选择30nM作为第三发夹探针H3的最优最终浓度用于后续的实验。
2.3、T7核酸外切酶
T7核酸外切酶贯穿两个扩增反应(Cycle I、Cycle II)的过程，其用量在级联扩增反应中起着重要的作用。因此，在实验方法中，将第一发夹探针H1最终浓度固定为20nM、第二发夹探针H2最终浓度固定为20nM、第三发夹探针H3最终浓度固定为30nM的基础上，将T7核酸外切酶用量从5U梯度变化到15U，梯度为2.5U。实验条件：第一发夹探针H1最终浓度20nM,第二发夹探针H2最终浓度20nM,第三发夹探针H3最终浓度30nM。检测条件：λex＝535nm；λem＝604nm。误差棒代表标准偏差(n＝3)。将上述T7核酸外切酶设定的用量、实验条件和检测条件代入上述检测方法。
检测结果如图7所示，传感系统的荧光强度随着T7核酸外切酶用量的增加而增加，直到达到10U的平台期为止。考虑到核酸外切酶的成本效益，选择10U的T7核酸外切酶用于后续的实验。
2.4、级联扩增时间
在本发明的传感系统中，级联扩增时间是另一个不可忽视的重要因素。因此，在实验方法中，将第一发夹探针H1最终浓度固定为20nM、第二发夹探针H2最终浓度固定为20nM、第三发夹探针H3最终浓度固定为30nM、T7核酸外切酶用量固定为10U基础上，将步骤(1)中“混合液于37℃孵育”的孵育时间从30分钟梯度变化到150分钟，梯度为30分钟。实验条件：第一发夹探针H1最终浓度20nM,第二发夹探针H2最终浓度20nM,第三发夹探针H3最终浓度30nM,T7核酸外切酶用量10U。检测条件：λex＝535nm；λem＝604nm。误差棒代表标准偏差(n＝3)。将上述设定的孵育时间、实验条件和检测条件代入上述检测方法。
检测结果如图8所示，随着孵育时间扩增反应时间的增加，传感系统的荧光强度在30到90分钟内迅速增加，然后达到平衡。因此，选择90分钟的级联扩增时间用于后续的实验。
实验例3
1、实验目的：在最佳实验条件下，通过测定不同浓度的靶标AFB1，研究了本发明基于T7-EACRA策略的传感系统的分析性能。
2、实验条件及实验结果：
下述实验中涉及的检测方法：
(1)、将1μL待测样品、2μL第一发夹探针H1(1μM)、2μL第二发夹探针H2(1μM)、3μL第三发夹探针H3(1μM)和1μL的T7 Exo(10U/μL)依次加入到42μL的1×NEBuffer 4缓冲液(20mM Tris-HNO3,50mM KNO3,10mM Mg(NO3)2,1mM DTT,pH 7.9)中。混合液于37℃孵育90分钟，然后冷却至室温，得到第一反应液；
(2)将51μL上述第一反应液转移至48μL柠檬酸钠缓冲液(10mM柠檬酸钠,体积百分比0.05％Tween 20,pH 7.0)中。加入1μL AgNO3(60μM)溶液，然后剧烈振荡1分钟。混合液室温避光孵育30分钟。随后，加入1μL新鲜制备的NaBH4(60μM)溶液，室温避光孵育60分钟，得到第二反应液；
(3)待第二反应液完全还原后，对所述第二反应液进行荧光测定，实现对所述生物靶标的检测。λex＝535nm；λem＝604nm。
在实验方法中，将第一发夹探针H1最终浓度固定为20nM、第二发夹探针H2最终浓度固定为20nM、第三发夹探针H3最终浓度固定为30nM、T7核酸外切酶用量固定为10U基础上，待测样品(黄曲霉毒素B1标准品经过溶剂苯：甲醇＝98：2(体积比)稀释得到的所需浓度的AFB1溶液)中含AFB1的浓度分别设置为0、0.001、0.01、0.1、1、10和100ng/mL。实验条件：第一发夹探针H1最终浓度20nM,第二发夹探针H2最终浓度20nM,第三发夹探针H3最终浓度30nM,T7核酸外切酶用量10U。检测条件：λex＝535nm；λem＝604nm。误差棒代表标准偏差(n＝3)。将上述含不同浓度AFB1的待测样品、实验条件和检测条件代入上述检测方法。
检测结果如图9所示，图9中a图为传感系统对不同浓度AFB1的荧光响应：0、0.001、0.01、0.1、1、10和100ng/mL(从a到g)。随着靶标AFB1的浓度从0增加到100ng/mL，荧光强度稳步增加。图9中b图显示604nm处的荧光强度与AFB1浓度间的指数关系。图9中b图的插图显示荧光强度与AFB1浓度的对数间的线性关系。图9中a图，图9中b图中的检测结果间接证实了本发明的基于酶辅助级联循环扩增(T7-EACRA)策略的工作原理：(1)级联扩增反应是由靶标AFB1触发的。如果没有AFB1，只能观察到微弱的背景信号；(2)反应中加入的靶标越多，体系的荧光强度越强，信号呈指数级增强，表明两个级联的循环(CycleI和Cycle II)对扩增反应具有很强的促进作用。此外，如图9中b图中的插图所示，荧光强度在1pg/mL至100ng/mL范围内与AFB1浓度的对数呈线性相关。线性回归方程为F＝638.62+108.94log10C(R2＝0.9994)，检测限为0.89pg/mL(S/N＝3σ)，其中F，C和σ分别为荧光强度、AFB1浓度和空白样品的标准偏差。
与以往报道的AFB1检测方法相比，本方法的检测限低于大多数其他方法的检测限，显示出更好的检测灵敏度(如下表3，EIS：电化学阻抗谱，ECL：电致化学发光，ICA：免疫层析法，EC：电化学，PEC：光致电化学；FRET：荧光能量共振转移)。据发明人所知，本发明是首次使用T7-EACRA策略进行AFB1荧光检测的报告。此外，与常用的荧光方法相比，本发明的方法不需要任何荧光标记和化学修饰，也不需要复杂和耗时的热循环操作。
表3基于不同方法检测AFB1的比较
Figure BDA0002601616760000161
上述表3中涉及的文献如下：
[1].Krittayavathananon A,Sawangphruk M(2017)Impedimetric sensor ofss-HSDNA/reduced graphene oxide aerogel electrode toward aflatoxin B1detection:effects of redox mediator charges and hydrodynamic diffusion.AnalChem 89:13283-13289；[2].Wei J,Zhang D,Zhang L,Ouyang H,Fu Z(2019)Alkalinehydrolysis behavior of metal-organic frameworks NH2-MIL-53(Al)employed forsensitive immunoassay via releasing fluorescent molecules.ACS Appl MaterInterfaces 11:35597-35603；[3].Wang C,Qian J,An K,Ren C,Lu X,Hao N,Liu Q,Li H,Huang X,Wang K(2018)Fabrication of magnetically assembled aptasensing devicefor label-free determination of aflatoxin B1 based on EIS.Biosens Bioelectron108:69-75；[4].Wang Y,Zhao G,Li X,Liu L,Cao W,Wei Q(2018)Electrochemiluminescent competitive immunosensor based on polyethyleneiminecapped SiO2 nanomaterials as labels to release Ru(bpy)32+fixed in 3D Cu/Nioxalate for the detection of aflatoxin B1.Biosens Bioelectron 101:290-296；[5].Qie Z,Liu Q,Yan W,Gao Z,Meng W,Xiao R,Wang S(2019)Universal andultrasensitive immunochromatographic assay by using an antigen as abifunctional element and antialbumin antibody on a test line.Anal Chem 91:9530-9537；[6].Abnous K,Danesh NM,Alibolandi M,Ramezani M,Sarreshtehdar EmraniA,Zolfaghari R,Taghdisi SM (2017)A new amplified pi-shape electrochemicalaptasensor for ultrasensitive detection of aflatoxin B1.Biosens Bioelectron94:374-379；[7].Zhang B,Lu Y,Yang C,Guo Q,Nie G(2019)Simple"signal-on"photoelectrochemical aptasensor for ultrasensitive detecting AFB1 based onelectrochemically reduced graphene oxide/poly(5-formylindole)/Aunanocomposites.Biosens Bioelectron 134:42-48；[8].Liu R,Li W,Cai T,Deng Y,DingZ,Liu Y,Zhu X,Wang X,Liu J,Liang B,Zheng T,Li J(2018)TiO2 nanolayer-enhancedfluorescence for simultaneous multiplexmycotoxin detection by aptamermicroarrays on a porous silicon surface.ACS Appl Mater Interfaces 10:14447-14453；[9].Khan IM,Niazi S,Yu Y,Mohsin A,Mushtaq BS,Iqbal MW,Rehman A,AkhtarW,Wang Z(2019)Aptamer induced multicolored AuNCs-WS2“turn on”FRET nanoplatform for dual-color simultaneous detection of aflatoxinB1 andzearalenone.Anal Chem 91:14085-14092。
实验例4
1、实验目的：本实验例通过分析三种常见的结构类似物(黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素G1(AFG1)和黄曲霉毒素M1(AFM1))以及另外两种常见的霉菌毒素(玉米赤霉烯酮(ZEN)和赭曲霉毒素A(OTA))，评估本发明传感系统的选择性。
2、实验方法及结果：
下述实验中涉及的检测方法：
(1)、将1μL待测样品、2μL第一发夹探针H1(1μM)、2μL第二发夹探针H2(1μM)、3μL第三发夹探针H3(1μM)和1μL的T7 Exo(10U/μL)依次加入到42μL的1×NEBuffer 4缓冲液(20mM Tris-HNO3,50mM KNO3,10mM Mg(NO3)2,1mM DTT,pH 7.9)中。混合液于37℃孵育90分钟，然后冷却至室温，得到第一反应液；(2)将51μL上述第一反应液转移至48μL柠檬酸钠缓冲液(10mM柠檬酸钠,体积百分比0.05％Tween 20,pH 7.0)中。加入1μL AgNO3(60μM)溶液，然后剧烈振荡1分钟。混合液室温避光孵育30分钟。随后，加入1μL新鲜制备的NaBH4(60μM)溶液，室温避光孵育60分钟，得到第二反应液；(3)待第二反应液完全还原后，对所述第二反应液进行荧光测定，实现对所述生物靶标的检测。λex＝535nm；λem＝604nm。
在实验方法中，将待测样品分别设置为含AFB1(1ng/mL)的AFB1溶液、AFB2(5ng/mL)的AFB2溶液、AFG1(5ng/mL)的AFG1溶液、AFM1(5ng/mL)的AFM1溶液、ZEN(5ng/mL)的ZEN溶液或OTA(5ng/mL)的OTA溶液(上述溶液均由相应的标准品溶液经过溶剂苯：甲醇＝98：2(体积比)稀释得到)，同时设置不含靶标的空白对照(为不含靶标的溶剂苯：甲醇＝98：2(体积比))。实验条件：第一发夹探针H1最终浓度20nM,第二发夹探针H2最终浓度20nM,第三发夹探针H3最终浓度30nM,T7核酸外切酶用量10U。检测条件：λex＝535nm；λem＝604nm。误差棒代表标准偏差(n＝3)。将上述含不同靶标的待测样品、实验条件和检测条件代入上述检测方法。
检测结果如图10所示，图10中b图为黄曲霉毒素(AFB1、AFB2、AFG1和AFM1)和其他两种霉菌毒素(ZEN和OTA)的化学结构，检测结果可从图10中a图看出两种霉菌毒素(ZEN和OTA)没有引起荧光响应的明显变化，与背景信号相差无异(空白样品)。由于结构上的高度相似性，AFB1的三种类似物(AFB2、AFG1和AFM1)的荧光强度略高于两种霉菌毒素。而当靶标AFB1存在时，荧光响应明显增强。这种良好的选择性主要归因于第一发夹探针H1的适体序列对AFB1的特异性识别。以上结果表明，本发明的传感系统对AFB1的检测具有较高的特异性。
实验例5
1、实验目的：为了探讨本发明的T7-EACRA策略的潜在应用价值，将构建的传感系统应用于实际食品和中药样品中AFB1的检测。
2、实验方法及结果：
2.1、样品制备：选取三种食品(花生、玉米和小麦)和三种中药(当归、党参和黄芪)作为AFB1测定的基底物质。样品溶液的提取步骤如下。首先，准确称取上述各样品2g，分别转移到10mL聚乙烯(PE)离心管中。然后加入5mL萃取溶剂(甲醇：水＝6:4(v/v))，浸泡1小时，再将样品溶液超声处理45分钟，然后小心提取上清液，3000rpm离心5分钟。最后，取出上清液1mL，用0.22μm微孔滤膜过滤。所得滤液用1×NEBuffer 4缓冲液稀释10倍，得到稀释的样品溶液。将三种浓度的AFB1(1、10和100ng/mL)加标到稀释的样品溶液中并进行测量，即待测样品为AFB1标准品经过上述得到的稀释的样品溶液稀释得到的1ng/mL、10ng/mL和100ng/mL的AFB1溶液。
2.2、下述实验中涉及的检测方法：
(1)、将1μL待测样品、2μL第一发夹探针H1(1μM)、2μL第二发夹探针H2(1μM)、3μL第三发夹探针H3(1μM)和1μL的T7 Exo(10U/μL)依次加入到42μL的1×NEBuffer 4缓冲液(20mM Tris-HNO3,50mM KNO3,10mM Mg(NO3)2,1mM DTT,pH 7.9)中。混合液于37℃孵育90分钟，然后冷却至室温，得到第一反应液；(2)将51μL上述第一反应液转移至48μL柠檬酸钠缓冲液(10mM柠檬酸钠,体积百分比0.05％Tween 20,pH7.0)中。加入1μL AgNO3(60μM)溶液，然后剧烈振荡1分钟。混合液室温避光孵育30分钟。随后，加入1μL新鲜制备的NaBH4(60μM)溶液，最终体积为100μL，室温避光孵育60分钟，得到第二反应液；(3)待第二反应液完全还原后，对所述第二反应液进行荧光测定，实现对所述生物靶标的检测。λex＝535nm；λem＝604nm。
在实验方法中，将第一发夹探针H1最终浓度固定为20nM、第二发夹探针H2最终浓度固定为20nM、第三发夹探针H3最终浓度固定为30nM、T7核酸外切酶用量固定为10U基础上，将2.1样品制备中得到的待测样品代入到上述检测方法中。
结果如下表4：
表4加标食品和中药样品中AFB1的检测(n＝3)
Figure BDA0002601616760000181
Figure BDA0002601616760000191
从上表中可以看到，花生的平均回收率和相对标准偏差为95.0％–105.5％和≤5.2％、玉米为94.7％–102.0％和≤5.5％、小麦为97.0％–106.7％和≤5.7％、当归为94.0％–107.3％和≤6.2％、党参为100.4％–105.6％和≤5.3％、黄芪为95.9％–104.8％和≤6.5％。上述结果表明，本发明所构建的传感系统可用于实际样品中的AFB1检测，检测结果令人满意。
实验结论
本发明提供了一种基于T7核酸外切酶辅助的级联循环扩增和DNA银纳米团簇的新型免标记荧光检测AFB1的方法。在三个精心设计的发夹探针和T7核酸外切酶的巧妙配合下，痕量的靶标AFB1可以触发级联靶标循环反应，实现信号的高效放大。基于适体序列的高特异性和级联扩增的高效率，该方法对靶标AFB1具有很高的选择性和灵敏度。此外，该方法成功地应用于加标食品和中药样品中AFB1的检测，结果令人满意。本发明的方法在食品和中药中毒素的检测上具有很大的应用潜力。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省原子医学研究所
<120> 基于酶辅助级联循环扩增的发夹探针组及制备方法、用途
<130> SHA202000186
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gttgggcacg tgttgtctct ctgtgtctcg tgcccttcgc taggcccaca gcagttgatc 60
ctttggggca cgagacacag agaga 85
<210> 2
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
tctctctgtg tctcgtgccc caaaggatca actgctcctt cccgcccttc gcagttgatc 60
ctttg 65
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
caaaggatca actgcgaagg gcgggttccc accctcccgc ccttc 45

Claims (10)

1.一种基于酶辅助级联循环扩增的发夹探针组，其特征在于，包括
第一发夹探针，所述第一发夹探针由5’端到3’端依次包括结合生物靶标的适体序列和第一结合序列，所述适体序列与所述第一结合序列的部分碱基配对使所述第一发夹探针形成发夹结构；
第二发夹探针，所述第二发夹探针由5’端到3’端依次包括第二结合序列和二级靶标序列，所述第二结合序列为所述第一结合序列的互补序列，所述第二结合序列与所述二级靶标序列的部分碱基配对使所述第二发夹探针形成发夹结构；
第三发夹探针，所述第三发夹探针由5’端到3’端依次包括第三结合序列和荧光信号序列，所述第三结合序列为所述二级靶标序列的部分序列的互补序列，且所述二级靶标序列与所述第三结合序列互补杂交时，所述二级靶标序列的5’端为突出末端，所述第三结合序列与所述荧光信号序列部分碱基配对使所述第三发夹探针形成发夹结构；
所述荧光信号序列为荧光分子的模板序列。
2.根据权利要求1所述的基于酶辅助级联循环扩增的发夹探针组，其特征在于：
所述适体序列由5’端到3’端依次包括序列a、序列b和序列c；所述第一结合序列由5’端到3’端依次包括序列d，和与序列b互补的序列b*；所述适体序列的序列b与序列b*配对形成发夹探针的茎干区，序列d和序列c形成发夹探针的茎环区；
所述第二结合序列由5’端到3’端依次包括序列b，和与序列d互补的序列d*；所述二级靶标序列由5’端到3’端依次包括突出末端序列、序列e和序列d；所述第二结合序列的序列d*与所述二级靶标序列的序列d配对形成发夹探针的茎干区，突出末端序列和序列e形成发夹探针的茎环区；
所述第三结合序列由5’端到3’端依次包括序列d*，和与序列e互补的序列e*；所述荧光信号序列由5’端到3’端依次包括序列f和序列e；所述第三结合序列的序列e*与所述荧光信号序列的序列e配对形成发夹探针的茎干区，序列f形成发夹探针的茎环区。
3.根据权利要求1或2所述的基于酶辅助级联循环扩增的发夹探针组，其特征在于，所述适体序列是以黄曲霉素为生物靶标的适体序列，所述荧光信号序列为AgNCs的模板序列；
优选地，所述适体序列是以黄曲霉毒素B1为生物靶标的适体序列；优选地，所述适体序列包含50个碱基，所述荧光信号序列包含12个胞嘧啶碱基。
4.根据权利要求1-3任一项所述的基于酶辅助级联循环扩增的发夹探针组，其特征在于，所述第一发夹探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二发夹探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述第三发夹探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
5.一种基于酶辅助级联循环扩增的检测体系，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的发夹探针组；
优选地，所述检测体系中，所述第一发夹探针、第二发夹探针和第三发夹探针的摩尔比为1:1:(1-1.5)。
6.一种基于酶辅助级联循环扩增的生物传感器，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的发夹探针组，或权利要求5所述的检测体系。
7.权利要求1-4任一项所述的基于酶辅助级联循环扩增的发夹探针组、权利要求5所述的检测体系，或权利要求6所述的生物传感器在如下a1-a2至少一种中的用途：
a1，检测生物靶标；a2，制备检测生物靶标的产品；
优选地，所述生物靶标为黄曲霉毒素B1。
8.一种基于酶辅助级联循环扩增的发夹探针组的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
权利要求1-4任一项所述的第一发夹探针、第二发夹探针和第三发夹探针分别溶解后，加热至95℃保持5分钟，缓慢冷却至室温，使所述第一发夹探针、第二发夹探针和第三发夹探针形成发夹结构；
优选地，所述第一发夹探针、第二发夹探针和第三发夹探针分别溶解于20mM Tris-HNO3缓冲液；
优选地，所述Tris-HNO3缓冲液包含20mM NaNO3,10mM NH4NO3,2mM Mg(NO3)2,所述Tris-HNO3缓冲液的pH 7.4。
9.一种生物靶标的荧光检测方法，其特征在于，包括使用权利要求1-4任一项所述的基于酶辅助级联循环扩增的发夹探针组、权利要求5所述的检测体系，或权利要求6所述的生物传感器；
优选地，所述生物靶标为黄曲霉毒素B1。
10.根据权利要求9所述的荧光检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，将待测样品、第一发夹探针、第二发夹探针、第三发夹探针和T7核酸外切酶在第一缓冲液中混合，混合液加热孵育，然后冷却至室温，得第一反应液；
S2，取第一反应液加入第二缓冲液中，然后向所述第二缓冲液中加入AgNO3溶液，振荡后室温下避光孵育，继续加入还原溶液，室温下避光孵育，得第二反应液；
S3，对所述第二反应液进行荧光测定，实现对所述生物靶标的检测；
优选地，所述步骤S1中，混合液加热孵育的条件为37℃孵育90分钟；
优选地，所述第一缓冲液为NEBuffer 4缓冲液，所述第二缓冲液为柠檬酸钠缓冲液，所述还原溶液为NaBH4溶液；
优选地，所述NEBuffer 4缓冲液包含20mM Tris-HNO3,50mM KNO3,10mM Mg(NO3)2,1mMDTT,所述NEBuffer 4缓冲液的pH 7.9；
优选地，所述柠檬酸钠缓冲液包含10mM柠檬酸钠,体积百分比0.05％Tween 20,所述柠檬酸钠缓冲液的pH 7.0。
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