CN113322256B - 一种探针组、传感器、检测方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生化分析检测领域，具体涉及一种探针组、传感器、检测方法及用途，本发明提供的一种探针组，包括发夹探针HP1，发夹探针HP2，发夹探针HP3；上述发夹探针在T7核酸外切酶的辅助下可以实现三重循环扩增策略检测靶标黄曲霉毒素B1，检测灵敏度高，无需荧光标记，成本低，在最佳条件下，检测限低至0.19pg/mL，检测线性范围宽，特异性高，能够区分黄曲霉毒素B1和其他黄曲霉毒素。本发明应用于中药材和食品样品中黄曲霉毒素B1的微量检测，效果良好，在食品药品安全领域具有较好的应用前景。

Description

一种探针组、传感器、检测方法及其用途

技术领域

本发明涉及生化分析检测领域，具体涉及一种探针组、传感器、检测方法及用途。

背景技术

黄曲霉毒素是由黄曲霉、寄生曲霉和特异曲霉等多种真菌产生的代谢产物，是一类化学结构类似的天然真菌毒素。常见于花生、玉米、大豆、小麦等粮食作物，具有很强的致癌、致畸和致突变性。目前已分离鉴定出近20种黄曲霉毒素，包括黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1和M2，其中，黄曲霉毒素B1(AFB1)的毒性和致癌性最强。短期内大量摄入AFB1可导致急性中毒，其急性毒性是氰化钾的10倍，砒霜的68倍；慢性毒性可诱发癌变，致癌能力是二甲基亚硝胺的75倍，二甲基偶氨苯的900倍。1993年，AFB1被国际癌症研究机构(IARC)划定为1类致癌物。随着人们对食品安全问题的关注度越来越高，黄曲霉毒素的污染越来越受到世界各国政府的重视。除国际食品法典委员会(CAC)的规定以外，全球100多个国家和地区制定了各类食品中黄曲霉毒素的限量标准。总体上，食品中AFB1的限量范围为1-20μg/kg，黄曲霉毒素总量(B1+B2+G1+G2)的限量范围为0-35μg/kg。美国相关标准规定人类消费食品中的黄曲霉毒素总量不能超过20μg/kg，牛奶中黄曲霉毒素M1的含量不能超过0.5μg/kg。欧盟规定更加严格，要求人类生活消费品中AFB1的含量不能超过2μg/kg，黄曲霉毒素总量不能超过4μg/kg。因此，开发快速、低成本、高灵敏检测AFB1的新方法具有重要的意义。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种探针组、传感器、检测方法及用途，以满足食品安全领域快速、低成本、高灵敏检测AFB1的需要。

为此，本发明提供了如下的技术方案：

本发明提供了一种探针组，包括：

发夹探针HP1，由5’端到3’端依次包括结合靶标的适体序列和第一结合序列，所述适体序列与所述第一结合序列的部分碱基配对使所述发夹探针HP1形成发夹结构；所述发夹探针HP1的5’端为突出末端；

发夹探针HP2，由5’端到3’端依次包括第二结合序列和二级靶标序列TS，所述第二结合序列与所述二级靶标序列TS的部分碱基配对使所述发夹探针HP2形成发夹结构；所述第二结合序列为所述第一结合序列的互补序列；所述发夹探针HP2的5’端为突出末端；

发夹探针HP3，由5’端到3’端依次包括第三结合序列和三级靶标序列TT，所述第三结合序列与所述三级靶标序列TT的部分碱基配对使所述发夹探针HP3形成发夹结构；所述第三结合序列可以与所述二级靶标序列TS部分互补杂交，并在二级靶标序列TS的3’端形成平末端；所述发夹探针HP3的5’端为突出末端；

所述二级靶标序列TS和所述三级靶标序列TT包含荧光分子的模板序列。

所述的探针组中：

所述发夹探针HP1由5’端到3’端依次包括序列a、序列b、序列c、序列d、序列b*；序列a、序列b、序列c为适体序列；序列d、序列b*为第一结合序列；

所述发夹探针HP2由5’端到3’端依次包括序列b、序列d*、序列f、序列e、序列d；序列b、序列d*为第二结合序列；序列f、序列e、序列d为二级靶标序列TS；

所述发夹探针HP3由5’端到3’端依次包括序列d*、序列e*、序列d*、序列e*、序列g、序列f、序列e、序列d；序列d*、序列e*、序列d*、序列e*为第三结合序列，序列g、序列f、序列e、序列d为三级靶标序列TT。

所述的探针组，所述适体序列是以黄曲霉素B1为生物靶标的适体序列，所述二级靶标序列TS和所述三级靶标序列TT包含银纳米簇AgNCs的模板序列。

所述的探针组，所述发夹探针HP1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述发夹探针HP2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述发夹探针HP3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明提供了一种检测体系，其特征在于，包括所述的探针组；

优选的，所述检测体系中，所述发夹探针HP1、发夹探针HP2和发夹探针HP3的摩尔比为1:1:(1-3)。

本发明提供了一种传感器，包括所述的探针组或所述的检测体系。

所述的传感器，以总体积为100μL为计，包括：

第一反应液，包括：

发夹探针HP1，浓度为0.8-1.2μmol/L，3μL；

发夹探针HP2，浓度为0.8-1.2μmol/L，3μL；

发夹探针HP3，浓度为0.8-1.2μmol/L，6μL；

T7核酸外切酶，浓度为8-12U/μL，2μL；

第一反应缓冲液，36μL；

可选的，还包括第二反应液，包括：

第二反应缓冲液，48μL；

AgNO₃溶液，浓度为50-70μmol/L，1μL；

NaBH₄溶液，浓度为50-70μmol/L，1μL。

本发明提供了一种生物靶标的检测方法，包括使用所述的探针组、所述的检测体系，或所述的传感器；

优选地，所述生物靶标为黄曲霉毒素B1。

所述的检测方法，包括如下步骤：

S1，将待测样品、发夹探针HP1、发夹探针HP2、发夹探针HP3和T7核酸外切酶在第一反应缓冲液中混合，混合液加热孵育，然后冷却至室温，得第一反应液；

S2，取第一反应液加入第二反应缓冲液中，然后向所述第二反应缓冲液中加入AgNO₃溶液，振荡后室温下避光孵育，然后加入还原溶液，室温下避光孵育，得第二反应液；

S3，对所述第二反应液进行荧光测定，实现对所述生物靶标的检测；

优选地，所述步骤S1中，混合液加热孵育的条件为35-40℃孵育100-140分钟；

优选地，所述第一缓冲液为NEBuffer 4缓冲液，所述第二缓冲液为柠檬酸钠缓冲液，所述还原溶液为NaBH₄溶液；

优选地，所述NEBuffer 4缓冲液包含20mM Tris-HNO₃,50mM KNO₃,10mM Mg(NO₃)₂,所述NEBuffer 4缓冲液的pH 7.9；

优选地，所述柠檬酸钠缓冲液包含10mM柠檬酸钠,体积百分比0.05％Tween 20,所述柠檬酸钠缓冲液的pH 7.0。

所述的探针组、所述的检测体系，或所述的传感器在如下a₁-a₂至少一种中的用途：

a₁，检测生物靶标；a₂，制备检测生物靶标的产品；

可选的，所述生物靶标为黄曲霉毒素B1。

可选的，在检测中药材或粮食中的黄曲霉毒素B1的应用。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的探针组，包括：发夹探针HP1，由5’端到3’端依次包括结合靶标的适体序列和第一结合序列，所述适体序列与所述第一结合序列的部分碱基配对使所述发夹探针HP1形成发夹结构；所述发夹探针HP1的5’端为突出末端；发夹探针HP2，由5’端到3’端依次包括第二结合序列和二级靶标序列TS，所述第二结合序列与所述二级靶标序列TS的部分碱基配对使所述发夹探针HP2形成发夹结构；所述第二结合序列为所述第一结合序列的互补序列；所述发夹探针HP2的5’端为突出末端；发夹探针HP3，由5’端到3’端依次包括第三结合序列和三级靶标序列TT，所述第三结合序列与所述三级靶标序列TT的部分碱基配对使所述发夹探针HP3形成发夹结构；所述第三结合序列可以与所述二级靶标序列TS部分互补杂交，并在二级靶标序列TS的3’端形成平末端；所述发夹探针HP3的5’端为突出末端；所述二级靶标序列TS和所述三级靶标序列TT包含荧光分子的模板序列；

上述探针组中，创新性的设计了三个发夹探针HP1、HP2、HP3，可以在T7核酸外切酶的辅助下，实现三重循环扩增策略检测靶标AFB1，满足快速、低成本、高灵敏检测的需求；具体原理为：当传感器体系中不存在靶标时，三个发夹探针HP1、HP2、HP3与T7核酸外切酶稳定共存；当传感器体系中存在靶标时，发夹探针HP1中的适体序列与靶标特异性结合形成复合物HP1-AFB1，同时打开发夹探针HP1暴露出第一结合序列，第一结合序列与发夹探针HP2的第二结合序列互补杂交形成双链DNA，在发夹探针HP2的5’端形成平末端，同时打开发夹探针HP2并暴露出二级靶标序列TS，利用T7核酸外切酶作用于双链DNA沿5’-3’方向催化去除5’端单核苷酸的特性，消化去除发夹探针HP2的第二结合序列，释放出二级靶标序列TS和复合物HP1-AFB1，复合物HP1-AFB1继续与新的发夹探针HP2结合引发第一重靶标循环扩增反应I(Cycle I)；第一重靶标循环扩增反应I产生的大量的二级靶标序列TS与发夹探针HP3中的第三结合序列结合，在发夹探针HP3的5’端形成平末端，在T7核酸外切酶的作用下，消化去除发夹探针HP3的第三结合序列，释放出二级靶标序列TS和三级靶标序列TT，二级靶标序列TS继续与新的发夹探针HP3结合引发第二重靶标循环扩增反应II(Cycle II)；第二重靶标循环扩增反应II产生的大量的三级靶标序列TT与发夹探针HP3中的第三结合序列结合，在发夹探针HP3的5’端形成平末端，在T7核酸外切酶的作用下，消化去除发夹探针HP3的第三结合序列，释放出三级靶标序列TT，三级靶标序列TT继续与新的发夹探针HP3结合引发第三重靶标循环扩增反应III(Cycle III)；第一重靶标循环扩增反应I产生的二级靶标序列TS，第二重靶标循环扩增反应II产生的二级靶标序列TS和三级靶标序列TT，第三重靶标循环扩增反应III产生的三级靶标序列TT，都包含AgNCs的模板序列，能够形成荧光信号分子DNA-AgNCs产生荧光信号，实现三重循环扩增策略检测靶标，检测灵敏度高，无需荧光标记，成本低，在最佳条件下，检测限低至0.19pg/mL，检测线性范围宽，特异性高，能够区分AFB1和其他黄曲霉毒素。本发明应用于中药材和食品样品中AFB1的微量检测，效果良好，在食品药品安全领域具有较好的应用前景。

2.本发明提供了生物靶标AFB1的检测方法，具有检测灵敏度高、线性范围宽、容易操作的优势，成本低，对中药材和食品样品中AFB1的测定具有良好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例1中发夹探针HP1、HP2、HP3的设计过程示意图；

图2是本发明实验例1中T7核酸外切酶辅助的三重循环扩增反应的扩增策略的工作原理图；

图3是本发明实验例1中三种不同的扩增策略的工作原理图；

图4是本发明实验例1中不同条件下的荧光响应图；图中(a)HP1+HP2+T7核酸外切酶,(b)AFB1+HP1+HP2,(c)AFB1+HP1+HP2+T7核酸外切酶,(d)AFB1+HP1+HP2+HP4+T7核酸外切酶，(e)AFB1+HP1+HP2+HP3+T7核酸外切酶；

图5是本发明实验例2中发夹探针HP1和HP2浓度的优化实验结果图；

图6是本发明实验例2中发夹探针HP3浓度的优化实验结果图；

图7是本发明实验例2中T7核酸外切酶用量的优化实验结果图；

图8是本发明实验例2中扩增反应时间的优化实验结果图；

图9是本发明实验例3中传感系统对不同浓度的AFB1的荧光响应图；图中A为传感系统对不同浓度的AFB1的荧光响应；图中B为612nm处的荧光强度与AFB1浓度间的指数关系，插图为612nm处的荧光强度与AFB1浓度的对数间的线性关系；

图10是本发明实验例4中传感系统对不同真菌毒素的荧光响应图；图中A为传感系统对不同真菌毒素的荧光响应；图中B为黄曲霉毒素(AFB1、AFB2、AFG1和AFM1)和其他两种霉菌毒素(ZEN和DON)的化学结构。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

仪器和试剂

本发明中使用的寡核苷酸序列(HP1、HP2、HP3和HP4)由南京金斯瑞生物科技有限公司合成并经HPLC纯化。这些寡核苷酸的序列在表1中列出。枸杞、甘草和杜仲购自无锡市中医医院。玉米和大米购自无锡大润发超市。T7核酸外切酶购自纽英伦生物技术(北京)有限公司。硝酸银(AgNO₃)和硼氢化钠(NaBH₄)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。

下述实施例中涉及的实验仪器如下：荧光测量在室温下SpectraMax M5e多模式酶标仪上进行。激发波长540nm，发射光谱收集范围560-700nm，检测步长2nm。最大荧光发射波长612nm。

下述实验例中涉及的AFB1标准品、AFB2标准品、AFG1标准品、AFM1标准品、ZEN标准品、DON标准品均是从标准物质公司购买。规格均为：1mL的液体包装，溶剂是苯：甲醇＝98：2(体积比)，浓度是2.0μg/mL。在使用时，将标准品用溶剂苯：甲醇＝98：2(体积比)稀释至所需浓度。

下述实施例中涉及的室温温度范围为20-25℃。

实施例1

本实施例提供了探针组，包括：

发夹探针HP1，由5’端到3’端依次包括结合靶标的适体序列和第一结合序列，所述适体序列与所述第一结合序列的部分碱基配对使所述发夹探针HP1形成发夹结构；所述发夹探针HP1的5’端为突出末端；所述发夹探针HP1由5’端到3’端依次包括序列a、序列b、序列c、序列d、序列b*；序列a、序列b、序列c为适体序列；序列d、序列b*为第一结合序列；

发夹探针HP2，由5’端到3’端依次包括第二结合序列和二级靶标序列TS，所述第二结合序列与所述二级靶标序列TS的部分碱基配对使所述发夹探针HP2形成发夹结构；所述第二结合序列为所述第一结合序列的互补序列；所述发夹探针HP2的5’端为突出末端；所述发夹探针HP2由5’端到3’端依次包括序列b、序列d*、序列f、序列e、序列d；序列b、序列d*为第二结合序列；序列f、序列e、序列d为二级靶标序列TS；

发夹探针HP3，由5’端到3’端依次包括第三结合序列和三级靶标序列TT，所述第三结合序列与所述三级靶标序列TT的部分碱基配对使所述发夹探针HP3形成发夹结构；所述第三结合序列可以与所述二级靶标序列TS部分互补杂交，并在二级靶标序列TS的3’端形成平末端；所述发夹探针HP3的5’端为突出末端；所述发夹探针HP3由5’端到3’端依次包括序列d*、序列e*、序列d*、序列e*、序列g、序列f、序列e、序列d；序列d*、序列e*、序列d*、序列e*为第三结合序列，序列g、序列f、序列e、序列d为三级靶标序列TT；

所述二级靶标序列TS和所述三级靶标序列TT包含荧光分子的模板序列，具体为包含银纳米簇AgNCs的模板序列；

基于上述发夹探针组设计得到具体的序列，所述发夹探针HP1的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，所述发夹探针HP2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述发夹探针HP3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。对比序列HP4的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

为了反应上述探针的具体序列中的各区段，参见下表1，如下表1所示：

表1 本实施例中使用的HPLC纯的寡核苷酸序列

上述表1中的a、b、c、d、e、f、g、a*、b*、c*、d*、e*、f*所对应的序列分别代表序列a、b、c、d、e、f、g、a*、b*、c*、d*、e*、f*。

上述三个发夹探针的设计过程，如图1所示：

发夹探针HP1是识别探针，通过适体序列特异性结合靶标AFB1，发夹探针HP2能够与打开的发夹探针HP1杂交，在T7核酸外切酶辅助下进行靶标循环扩增反应，释放出二级靶标。发夹探针HP3是整个三重循环扩增反应的关键，一是进行二级靶标循环扩增反应，二是进行三级靶标循环扩增反应。此外，每个靶标循环扩增反应的扩增产物都包含AgNCs的模板序列。为了降低设计难度，采用分段设计的方法进行发夹探针的设计。首先将适体序列AS分成三个编号的结构域a，b，c，模板序列TS分成三个编号的结构域f，e，d。在上述基础上，确定了发夹探针HP1的五个结构域(a、b、c、d和b*)和发夹探针HP2的五个结构域(b、d*、f、e和d)，其中星号表示互补结构域。相应地，还确定了发夹探针HP3中的结构域(d*、e*、d*、e*、f、e和d)，仅留下结构域g待确定。通过预测发夹探针HP3的二级结构以避免不必要的选择性折叠，使用OligoAnalyzer软件计算确定了结构域g。值得注意的是，在发夹探针HP2和发夹探针HP3中，虽然包含AgNCs的模板序列(结构域d、e和f)，但这段序列的一部分被固定在发夹探针的茎部区域。因此，在初始状态下，发夹探针HP2和发夹探针HP3不能用来合成DNA-AgNCs。

实施例2

本实施例提供一种探针组的制备方法，包括如下步骤：

将发夹探针序列HP1、HP2和HP3的干粉在18000g下离心5分钟，然后分别溶解于20mM Tris-HNO₃缓冲液(20mM NaNO₃,10mM NH₄NO₃,2mM Mg(NO₃)₂,pH 7.4)中，得到100μmol/L储备溶液。接着，将发夹探针序列HP1、HP2和HP3的储备溶液(100μmol/L)分别加热至90℃保持10分钟，然后缓慢冷却至室温以形成发夹结构。

实施例3

本实施例提供一种检测体系，包括实施例1中的发夹探针，所述发夹探针HP1、发夹探针HP2和发夹探针HP3的摩尔比为1:1:(1-3)。

进一步的，所述发夹探针HP1、发夹探针HP2和发夹探针HP3的摩尔比为1:1:1、1:1:2、1:1:3，在本实施例中选择发夹探针HP1、发夹探针HP2和发夹探针HP3的摩尔比为1:1:2。

实施例4传感器

本实施例提供一种传感器，以总体积为100μL为计，包括：

第一反应液，包括：

发夹探针HP1，浓度为0.8μmol/L，3μL；

发夹探针HP2，浓度为0.8μmol/L，3μL；

发夹探针HP3，浓度为0.8μmol/L，6μL；

T7核酸外切酶，浓度为8U/μL，2μL；

第一反应缓冲液，36μL；

可选的，还包括第二反应液，包括：

第二反应缓冲液，48μL；

AgNO₃溶液，浓度为50μmol/L，1μL；

NaBH₄溶液，浓度为50μmol/L，1μL。

所述第一缓冲液为NEBuffer 4缓冲液，所述第二缓冲液为柠檬酸钠缓冲液；

所述NEBuffer 4缓冲液包含20mM Tris-HNO₃,50mM KNO₃,10mM Mg(NO₃)₂,所述NEBuffer 4缓冲液的pH 7.9；

所述柠檬酸钠缓冲液包含10mM柠檬酸钠,体积百分比0.05％Tween 20,所述柠檬酸钠缓冲液的pH 7.0。

实施例5传感器

本实施例提供一种传感器，以总体积为100μL为计，包括：

第一反应液，包括：

发夹探针HP1，浓度为1.2μmol/L，3μL；

发夹探针HP2，浓度为1.2μmol/L，3μL；

发夹探针HP3，浓度为1.2μmol/L，6μL；

T7核酸外切酶，浓度为12U/μL，2μL；

第一反应缓冲液，36μL；

可选的，还包括第二反应液，包括：

第二反应缓冲液，48μL；

AgNO₃溶液，浓度为70μmol/L，1μL；

NaBH₄溶液，浓度为70μmol/L，1μL。

所述第一缓冲液为NEBuffer 4缓冲液，所述第二缓冲液为柠檬酸钠缓冲液；

所述NEBuffer 4缓冲液包含20mM Tris-HNO₃,50mM KNO₃,10mM Mg(NO₃)₂,所述NEBuffer 4缓冲液的pH 7.9；

所述柠檬酸钠缓冲液包含10mM柠檬酸钠,体积百分比0.05％Tween 20,所述柠檬酸钠缓冲液的pH 7.0。

实施例6传感器

本实施例提供一种传感器，以总体积为100μL为计，包括：

第一反应液，包括：

发夹探针HP1，浓度为1μmol/L，3μL；

发夹探针HP2，浓度为1μmol/L，3μL；

发夹探针HP3，浓度为1μmol/L，6μL；

T7核酸外切酶，浓度为10U/μL，2μL；

第一反应缓冲液，36μL；

可选的，还包括第二反应液，包括：

第二反应缓冲液，48μL；

AgNO₃溶液，浓度为60μmol/L，1μL；

NaBH₄溶液，浓度为60μmol/L，1μL。

所述第一缓冲液为NEBuffer 4缓冲液，所述第二缓冲液为柠檬酸钠缓冲液；

所述NEBuffer 4缓冲液包含20mM Tris-HNO₃,50mM KNO₃,10mM Mg(NO₃)₂,所述NEBuffer 4缓冲液的pH 7.9；

所述柠檬酸钠缓冲液包含10mM柠檬酸钠,体积百分比0.05％Tween 20,所述柠檬酸钠缓冲液的pH 7.0。

实施例7

本实施例提供了一种生物靶标的检测方法，包括利用实施例1的探针组、实施例3的检测体系或实施例4的传感器系统，如下：

S1，将待测样品、发夹探针HP1、发夹探针HP2、发夹探针HP3和T7核酸外切酶在第一反应缓冲液中混合，混合液加热孵育，然后冷却至室温，得第一反应液；具体为：

将HP1(3μL,0.8μmol/L),HP2(3μL,0.8μmol/L),HP3(6μL,0.8μmol/L)和T7核酸外切酶(2μL,8U/μL)与不同浓度的AFB1(1μL)混合加至36μL的1×NEBuffer 4缓冲液(50mMKNO₃,20mM Tris-HNO₃,10mM Mg(NO₃)₂,pH 7.9)中，剧烈振荡1分钟。混合液35℃孵育140分钟，然后冷却至室温。

S2，取第一反应液加入第二反应缓冲液中，然后向所述第二反应缓冲液中加入AgNO₃溶液，振荡后室温下避光孵育，然后加入还原溶液，室温下避光孵育，得第二反应液；具体为：

将51μL上述第一反应液转移至48μL柠檬酸钠缓冲液(10mM柠檬酸钠,体积百分比0.05％Tween 20,pH 7.0)中。加入AgNO₃(1μL,50μmol/L)溶液，然后剧烈振荡1分钟。混合液室温避光孵育30分钟。随后，加入新鲜制备的NaBH₄(1μL,50μmol/L)溶液，室温避光孵育60分钟。

S3，待第二反应液完全还原后，对所述第二反应液进行荧光测定，实现对所述生物靶标的检测。

实施例8

本实施例提供了一种生物靶标的检测方法，包括利用实施例1的探针组、实施例3的检测体系或实施例5的传感器系统，如下：

S1，将待测样品、发夹探针HP1、发夹探针HP2、发夹探针HP3和T7核酸外切酶在第一反应缓冲液中混合，混合液加热孵育，然后冷却至室温，得第一反应液；具体为：

将HP1(3μL,1.2μmol/L),HP2(3μL,1.2μmol/L),HP3(6μL,1.2μmol/L)和T7核酸外切酶(2μL,12U/μL)与不同浓度的AFB1(1μL)混合加至36μL的1×NEBuffer 4缓冲液(50mMKNO₃,20mM Tris-HNO₃,10mM Mg(NO₃)₂,pH 7.9)中，剧烈振荡1分钟。混合液40℃孵育100分钟，然后冷却至室温。

S2，取第一反应液加入第二反应缓冲液中，然后向所述第二反应缓冲液中加入AgNO₃溶液，振荡后室温下避光孵育，然后加入还原溶液，室温下避光孵育，得第二反应液；具体为：

将51μL上述第一反应液转移至48μL柠檬酸钠缓冲液(10mM柠檬酸钠,体积百分比0.05％Tween 20,pH 7.0)中。加入AgNO₃(1μL,70μmol/L)溶液，然后剧烈振荡1分钟。混合液室温避光孵育30分钟。随后，加入新鲜制备的NaBH₄(1μL,70μmol/L)溶液，室温避光孵育60分钟。

S3，待第二反应液完全还原后，对所述第二反应液进行荧光测定，实现对所述生物靶标的检测。

实施例9

本实施例提供了一种生物靶标的检测方法，包括利用实施例1的探针组、实施例3的检测体系或实施例6的传感器系统，如下：

S1，将待测样品、发夹探针HP1、发夹探针HP2、发夹探针HP3和T7核酸外切酶在第一反应缓冲液中混合，混合液加热孵育，然后冷却至室温，得第一反应液；具体为：

将HP1(3μL,1μmol/L),HP2(3μL,1μmol/L),HP3(6μL,1μmol/L)和T7核酸外切酶(2μL,10U/μL)与不同浓度的AFB1(1μL)混合加至36μL的1×NEBuffer 4缓冲液(50mM KNO₃,20mM Tris-HNO₃,10mM Mg(NO₃)₂,pH 7.9)中，剧烈振荡1分钟。混合液37℃孵育120分钟，然后冷却至室温。

S2，取第一反应液加入第二反应缓冲液中，然后向所述第二反应缓冲液中加入AgNO₃溶液，振荡后室温下避光孵育，然后加入还原溶液，室温下避光孵育，得第二反应液；具体为：

将51μL上述第一反应液转移至48μL柠檬酸钠缓冲液(10mM柠檬酸钠,体积百分比0.05％Tween 20,pH 7.0)中。加入AgNO₃(1μL,60μmol/L)溶液，然后剧烈振荡1分钟。混合液室温避光孵育30分钟。随后，加入新鲜制备的NaBH₄(1μL,60μmol/L)溶液，室温避光孵育60分钟。

S3，待第二反应液完全还原后，对所述第二反应液进行荧光测定，实现对所述生物靶标的检测。

实验例1

本发明设计的T7核酸酶辅助的三重循环扩增反应的扩增策略的工作原理：

如图2显示，当传感器系统中不存在靶标AFB1时，三个发夹探针HP1、HP2和HP3既不会发生杂交，也不会被T7核酸外切酶消化，而是与T7核酸外切酶在溶液中稳定共存。这是因为T7核酸外切酶是一种双链DNA特异性核酸外切酶，仅沿5’到3’方向催化去除线性或切口双链DNA的5’单端核苷酸。当传感器系统中存在靶标AFB1时，发夹探针HP1中的适体序列特异性结合靶标形成复合物HP1-AFB1，同时打开发夹探针HP1暴露出结构域b*和d。结构域b*和d与发夹探针HP2的结构域b和d*互补，进一步杂交形成复合物HP2-HP1-AFB1。形成的复合物HP2-HP1-AFB1含有一个5’平末端(结构域b、d*、b*和d)，成为T7核酸外切酶的酶切底物。经T7核酸外切酶部分消化后，复合物HP1-AFB1和单链序列(结构域f、e和d)被释放。释放的复合物HP1-AFB1能与新的发夹探针HP1结合触发下一个循环，构成第一重靶标循环扩增反应I(Cycle I)。释放的单链序列(结构域f、e和d)可以作为后续反应的二级靶标序列TS。二级靶标序列TS的结构域d和e进一步与发夹探针HP3的结构域d*和e*杂交形成复合物HP3-TS。结果，发夹探针HP3的5’突出末端转变为复合物HP3-TS的5’平末端，成为T7核酸外切酶的酶切底物。经T7核酸外切酶部分消化后，产生两个单链序列，一个是二级靶标序列TS，另一个是由结构域g，f，e和d组成的单链序列。二级靶标序列TS可循环利用，与新的发夹探针HP3结合触发下一个循环，构成第二重靶标循环扩增反应II(Cycle II)。单链序列(结构域g、f、e和d)可作为三级靶标序列TT，进一步与发夹探针HP3杂交形成复合物HP3-TT。形成的复合物HP3-TT同样含有一个5’平末端，成为T7核酸外切酶的酶切底物。经T7核酸外切酶部分消化后，释放两个相同的三级靶标序列TT。与二级靶标序列TS相似，释放的三级靶标序列TT可以与新的发夹探针HP3结合触发下一个循环，构成第三重靶标循环扩增反应III(CycleIII)。经充分反应后，产生大量的三重循环扩增反应的产物(单链序列TS和TT)。值得注意的是，不管是TS还是TT，都包含AgNCs的模板序列(结构域d、e和f)，并且处于自由的单链状态。在AgNO₃和NaBH₄存在下，序列TS和TT作为DNA模板合成荧光信号分子DNA-AgNCs，产生明显的荧光信号。DNA-AgNCs的荧光强度与靶标AFB1的浓度呈正相关，由此实现靶标的高灵敏检测。

(2)、为了研究T7核酸外切酶辅助的三重循环扩增策略的扩增效果，引入了三种不同的策略进行比较。通过控制反应物的添加，分别获得了无信号放大的传感策略(图3方案A)和T7核酸外切酶辅助的单重循环扩增策略(图3方案B)。此外，还设计了T7核酸外切酶辅助的双循环扩增策略(图3方案C)。如方案A所示，当只有发夹探针HP1和HP2时，发夹探针HP1通过适体序列特异性结合靶标AFB1形成复合物HP1-AFB1。复合物HP1-AFB1进一步与发夹探针HP2杂交形成复合物HP2-HP1-AFB1，暴露出单链模板序列(结构域f、e和d)。在AgNO₃和NaBH₄存在下，形成DNA-AgNCs产生荧光信号，构成无信号放大的传感策略。相比方案A，在方案B中引入T7核酸外切酶。形成的复合物HP2-HP1-AFB1含有一个5’平末端，经T7核酸外切酶部分消化后，释放出复合物HP1-AFB1和单链模板序列。释放的复合物HP1-AFB1可以与一个新的发夹探针HP2结合进行靶标循环扩增反应，释放更多的单链模板序列，构成T7核酸外切酶辅助的单重循环扩增策略。对于T7核酸外切酶辅助的双重循环扩增策略，利用OligoAnalyzer软件设计了发夹探针HP4。发夹探针HP4由结构域d*、e*、h*、j、i和h组成，结构域j、i和h(作为一个整体)也是AgNCs的模板序列。初始状态下，结构域h被固定在发夹探针的茎部区域，所以DNA-AgNCs的合成受到抑制。经T7核酸外切酶辅助单重循环扩增反应释放的单链模板序列(结构域f、e和d)可以进一步作为后续反应的二级靶标TS。二级靶标TS与发夹探针HP4杂交形成复合物HP4-TS。形成的复合物HP4-TS含有一个5’平末端，经T7核酸外切酶部分消化后，释放出单链模板序列(结构域j，i和h)与二级靶标TS。释放的二级靶标TS可以与一个新的发夹探针HP4结合进行靶标循环扩增反应，经过双循环扩增反应，得到大量的单链模板序列(结构域f、e和d；结构域j、i和h)，形成更多的DNA-AgNCs，构成T7核酸外切酶辅助的双循环扩增策略。

分别利用上述方案A、B、C和本发明的方案检测分析靶标AFB1(浓度为1μg/mL)。设计了不同反应条件的实验，实验条件如下表2所示：

表2 实验条件

将上述表2中实验条件分别代入实施例9中，检测结果如图4所示，当传感器系统中不存在靶标AFB1时，只观察到微弱的荧光信号(曲线a)。当传感器系统中存在靶标AFB1时，观察到一个清晰的荧光信号(曲线b)，但荧光强度相对较弱，对应无信号放大的传感策略(方案A)。添加T7核酸外切酶后，观察到一个增强的荧光信号(曲线c)，表明T7核酸外切酶辅助的单重循环扩增策略(方案B)能提高检测的灵敏度。进一步地，添加发夹探针HP4后，观察到荧光强度的显著增加(曲线d)。这主要是由于二级靶标ST循环利用进行了T7核酸外切酶辅助的双重循环扩增反应(方案C)所致。将发夹探针HP4替换为发夹探针HP3，观察到荧光强度的进一步增加(曲线e)。荧光强度的增加得益于发夹探针HP3的巧妙设计，它不仅实现了二级靶标TS的循环利用，同时也实现了三级靶标TT的循环利用(图1)。经三重循环扩增反应产生了大量的二级靶标TS和三级靶标TT，在AgNO₃和NaBH₄存在下，这些靶标序列作为DNA模板合成DNA-AgNCs，从而产生显著的荧光信号。比较这四种不同的方案，发现T7核酸外切酶辅助的三重循环扩增策略具有最好的检测灵敏度。荧光强度分别增加了101.2％(曲线e比c)和28.9％(曲线e比d)，表明T7核酸外切酶辅助的三重循环扩增策略可用于AFB1的高灵敏检测。

实验例2实验条件优化

本实验对这些实验条件进行了系统的研究。本实验研究发现以下因素对系统影响较大。

1、发夹探针HP1和HP2浓度的优化

本实验考察了在传感器系统中发夹探针HP1和HP2浓度(10、20、30、40、50nmol/L)对靶标AFB1检测的影响。

具体为：将上述传感器系统中发夹探针HP1和HP2的各自浓度10、20、30、40、50nmol/L依次换算为向第一反应液中初始加入的发夹探针HP1和HP2溶液的浓度。以传感器系统中发夹探针HP1浓度30nmol/L为例，(3μL×nμmol/L)/100μL＝0.03μmol/L＝30nmol/L，计算出初始加入的发夹探针HP1溶液的浓度1μmol/L。依照上述计算，发夹探针HP1和HP2的各自浓度10、20、30、40、50nmol/L对应初始加入的发夹探针HP1和HP2的各自浓度依次为1/3、2/3、1、4/3、5/3μmol/L。将上述初始加入的发夹探针HP1和HP2溶液的浓度分别代入实施例9中的检测AFB1的方法中，其余条件不变。分别检测待测样品中靶标AFB1(浓度为1μg/mL)存在和不存在情况下的荧光强度。λ_ex＝540nm；λ_em＝612nm。

检测结果如图5所示，在浓度为30nmol/L时获得最佳F/F₀值，其中F和F₀分别表示存在和不存在AFB1时的荧光强度(612nm)。因此，发夹探针HP1和HP2的最佳浓度确定为30nmol/L。

2、发夹探针HP3浓度的优化

本实验考察了在传感器系统中发夹探针HP3浓度(40、50、60、70、80nmol/L)对靶标AFB1检测的影响。

具体为：将上述传感器系统中发夹探针HP3的浓度依次换算为向第一反应液中初始加入的发夹探针HP3溶液的浓度，换算方法与上述的1、发夹探针HP1和HP2浓度的优化中相同。将上述初始加入的发夹探针HP3溶液的浓度分别代入实施例9中的检测AFB1的方法中，其余条件不变。分别检测待测样品中靶标AFB1(浓度为1μg/mL)存在和不存在情况下的荧光强度。λ_ex＝540nm；λ_em＝612nm。

检测结果如图6所示，随着发夹探针HP3浓度的增加，F/F₀值逐渐增加，在浓度达到60nmol/L后开始降低。因此，发夹探针HP3的最佳浓度确定为60nmol/L。

3、T7核酸外切酶用量的优化

本实验考察了在传感器系统中T7核酸外切酶用量(5、10、15、20、25、30U)对靶标AFB1检测的影响。

具体为：分别将不同用量的T7核酸外切酶分别代入实施例9中的检测AFB1的方法中，其余条件不变。分别检测待测样品中靶标AFB1(浓度为1μg/mL)存在情况下的荧光强度。λ_ex＝540nm；λ_em＝612nm。

检测结果如图7所示，随着T7核酸外切酶用量增加到20U，传感器系统的荧光强度从快速增长状态转入缓慢增长状态。因此，T7核酸外切酶的最佳用量确定为20U。

4、扩增反应时间的优化

本实验考察了在传感器系统中扩增反应时间(30、40、50、60、70、80分钟)对靶标AFB1检测的影响。

具体为：将实施例9中“混合液37℃孵育120分钟，然后冷却至室温”中反应时间替换为不同的反应时间，其余条件不变。分别检测待测样品中靶标AFB1(浓度为1μg/mL)存在情况下的荧光强度。λ_ex＝540nm；λ_em＝612nm。

检测结果如图8所示，随着反应时间的增加，传感器系统的荧光强度迅速增加后趋于平缓，120分钟后进入平台期。因此，最佳的扩增反应时间确定为120分钟。

实验例3传感器分析性能

为了验证本发明制备的传感器高敏感检测靶标的能力，在最佳的实验条件下，将不同浓度(0、1×10^-6、1×10^-5、1×10^-4、1×10^-3、1×10^-2、1×10^-1、1μg/mL)的靶标AFB1溶液作为待测样品分别代入实施例9中的检测AFB1的方法中，其余条件不变。

检测结果如图9A所示，随着靶标AFB1浓度在0-1μg/mL范围内的增加，荧光强度也相应增加。如图9B所示，最大发射波长(612nm)处的荧光强度与AFB1浓度呈指数关系，如图9B中插图所示，荧光强度和AFB1浓度(1×10^-6-1μg/mL范围内)的对数呈良好的线性关系。线性回归方程为F＝115.14log₁₀C+1020.32，相关系数(R²)为0.9990，F和C分别代表荧光强度和AFB1浓度，以3倍信噪比(S/N＝3)计算得到AFB1的检测限为0.19pg/mL。

与以往报道的AFB1检测方法相比，本方法的检测限低于其他大多数方法的检测限，显示出更好的检测灵敏度，如下表3。其优异的性能主要来源于三个发夹探针和T7核酸外切酶密切配合下进行的三重靶标循环反应所带来的高效信号放大。同时，发夹探针不需要荧光标记，实验操作简单，相对传统的荧光检测方法显示出明显的优势。

表3 基于不同方法检测AFB1的比较

上述表3中涉及的文献如下：

1.Wang C,Qian J,An K,Ren C,Lu X,Hao N,Liu Q,Li H,Huang X,Wang K(2018)Fabrication of magnetically assembled aptasensing device for label-freedetermination of aflatoxin B1based on EIS.Biosens Bioelectron 108:69–75.

2.Wang Y,Zhao G,Li X,Liu L,Cao W,Wei Q(2018)Electrochemiluminescentcompetitive immunosensor based on polyethyleneimine capped SiO₂ nanomaterialsas labels to release Ru(bpy)₃ ²⁺ fixed in 3D Cu/Ni oxalate for the detection ofaflatoxin B1.Biosens Bioelectron 101:290–296.

3.Zhang B,Lu Y,Yang C,Guo Q,Nie G(2019)Simple“signal-on”photoelectrochemical aptasensor for ultrasensitive detecting AFB1based onelectrochemically reduced graphene oxide/poly(5-formylindole)/Aunanocomposites.Biosens Bioelectron 134:42–48.

4.Qie Z,Liu Q,Yan W,Gao Z,Meng W,Xiao R,Wang S(2019)Universal andultrasensitive immunochromatographic assay by using an antigen as abifunctional element and antialbumin antibody on a test line.Anal Chem 91:9530–9537.

5.Liu R,Li W,Cai T,Deng Y,Ding Z,Liu Y,Zhu X,Wang X,Liu J,Liang B,Zheng T,Li J(2018)TiO₂ nanolayer-enhanced fluorescence for simultaneousmultiplex mycotoxin detection by aptamer microarrays on a porous siliconsurface.ACS Appl Mater Interfaces 10:14447–14453.

6.Khan IM,Niazi S,Yu Y,Mohsin A,Mushtaq BS,Iqbal MW,Rehman A,AkhtarW,Wang Z(2019)Aptamer induced multicolored AuNCs-WS₂“turn on”FRET nanoplatform for dual-color simultaneous detection of aflatoxinB1 andzearalenone.Anal Chem 91:14085–14092.

7.Wu SS,Wei M,Wei W,Liu Y,Liu S,(2019)Electrochemical aptasensor foraflatoxin B1 based on smart host-guest recognition of beta-cyclodextrinpolymer.Biosens Bioelectron 129:58–63.

实验例4特异性实验

选择黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素G1(AFG1)、黄曲霉毒素M1(AFM1)、玉米赤霉烯酮(ZEN)和呕吐毒素(DON)作为干扰物质，考察了传感器系统的特异性。

具体为：将实施例9中的检测AFB1的方法中，将1μL不同浓度的靶标AFB1分别替换为1μL 1μg/mL黄曲霉毒素B2(AFB2)、1μL 1μg/mL黄曲霉毒素G1(AFG1)、1μL 1μg/mL黄曲霉毒素M1(AFM1)、1μL 1μg/mL玉米赤霉烯酮(ZEN)和1μL 1μg/mL呕吐毒素(DON)，1μL 1μg/mL黄曲霉毒素B1(AFB1)，1μL的混合溶液(含1μg/mLAFB2、1μg/mL AFG1、1μg/mL AFM1、1μg/mLZEN、1μg/mL DON、1μg/mL AFB1)，且设置空白(Blank)对照，空白对照为将1μL不同浓度的靶标AFB1替换为不含AFB1的溶剂，即，1μL溶剂(苯：甲醇＝98：2，体积比)。其余条件不变。

结果如图10显示，由图10中A图可见，DON和ZEN的荧光强度和空白(Blank)的荧光强度无明显差异，AFB2、AFG1、AFM1和AFB1同属于黄曲霉毒素家族，虽然具有高度的结构相似性(图10B)，但他们的荧光强度仅略高于DON和ZEN。

当存在靶标AFB1的情况下，传感器系统检测到强烈的荧光信号。此外，当靶标AFB1与上述5种真菌毒素混合时，传感器系统同样检测到显著的荧光信号，其荧光强度与仅用AFB1获得的荧光强度几乎相同。这些结果表明，该传感器对AFB1的检测具有良好的选择性。

实验例5实际样品中AFB1的检测

为了评价传感器在实际样品中的应用潜力，利用其检测中药材和食品样品中的AFB1含量。选取3种常用中药材(枸杞、甘草和杜仲)和2种粮食作物(玉米和大米)进行相对回收率试验。

将干净的样品放在温暖潮湿的环境(35℃，相对湿度90％)中10天，得到发霉的样品。然后将发霉的样品进行预处理，包括有机溶剂浸渍、超声处理、滤膜过滤和缓冲液稀释(具体为：准确称取上述各样品2g，分别转移到15mL聚乙烯(PE)离心管中。然后加入5mL萃取溶剂(甲醇：水＝6：4，体积比)，浸泡24小时，再将样品溶液超声处理45分钟，4500g离心5分钟。最后，小心提取上清液，用0.22μm微孔滤膜过滤。所得滤液用1×NEBuffer 4缓冲液稀释10倍)，得到稀释的样品溶液。将两种浓度的AFB1(10和100ng/mL)加标到稀释的样品溶液中并进行测量，即，待测样品为AFB1标准品经过上述得到的稀释的样品溶液稀释得到的10ng/mL和100ng/mL的AFB1溶液。将上述的AFB1溶液代入到实施例9中检测。

检测结果如下表4：

表4 加标食品和中药样品中AFB1的检测(n＝3)

由上表中可知，相对回收率(RR)在93.5-108.8％之间。相对标准差(RSD)基于一天内三次平行测量的结果(日内精密度)和连续三天内三次平行测量的结果(日间精密度)分别在4.7-7.7％和4.1-8.2％之间。这些结果表明，本发明所提出的传感器具有良好的准确度和精密度，可用于中药材和食品样品中AFB1的检测。

实验结论

本发明提供了一种基于T7核酸外切酶辅助三重循环扩增的新型荧光适体传感器用于AFB1的高灵敏高特异性检测。与现有的AFB1检测方法相比，本发明提出的传感器具有如下优势：发夹探针不需要任何的化学修饰和荧光标记，成本低；整个三重循环扩增反应在一个反应器中进行等温扩增，操作简单方便，不需要繁琐的分离和热循环操作；信号放大效果显著，对AFB1具有良好的分析性能，检测限低，线性范围宽，特异性高。该传感器应用于中药材和食品样品中AFB1的微量检测，效果良好，在食品药品安全领域具有较好的应用前景。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

序列表

<110> 江苏省原子医学研究所

<120> 一种探针组、传感器、检测方法及其用途

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gttgggcacg tgttgtctct ctgtgtctcg tgcccttcgc taggcccaca gccctttggg 60

cacgagacac ag 72

<210> 2

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctgtgtctcg tgcccaaagg gctttcccac cctcccgccc ttt 43

<210> 3

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaagggcggg agggaaaggg cgggagggct ctctctttcc caccctcccg cccttt 56

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaagggcggg agggttgggt gggtcccttc ccacccaccc aa 42

Claims (14)

1.探针组，其特征在于，包括：发夹探针HP1、发夹探针HP2和发夹探针HP3；

所述发夹探针HP1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述发夹探针HP2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述发夹探针HP3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.一种检测体系，其特征在于，包括权利要求1所述的探针组。

3.根据权利要求2所述的检测体系，其特征在于，

所述检测体系中，所述发夹探针HP1、发夹探针HP2和发夹探针HP3的摩尔比为1:1:（1-3）。

4.一种传感器，其特征在于，包括权利要求1所述的探针组或权利要求2或3所述的检测体系。

5.根据权利要求4所述的传感器，其特征在于，以总体积为100 μL为计，包括：

第一反应液，包括：

发夹探针HP1，浓度为0.8-1.2 μmol/L，3 μL；

发夹探针HP2，浓度为0.8-1.2 μmol/L，3 μL；

发夹探针HP3，浓度为0.8-1.2 μmol/L，6 μL；

T7核酸外切酶，浓度为8-12 U/μL，2 μL；和

第一反应缓冲液，36 μL。

6.根据权利要求5所述的传感器，其特征在于，

还包括第二反应液，包括：

第二反应缓冲液，48 μL；

AgNO₃溶液，浓度为50-70 μmol/L，1 μL；和

NaBH₄溶液，浓度为50-70 μmol/L，1 μL。

7.一种非疾病诊断目的生物靶标的检测方法，其特征在于，包括使用权利要求1所述的探针组、权利要求2或3所述的检测体系，或权利要求4-6任一项所述的传感器。

8.根据权利要求7所述的一种非疾病诊断目的生物靶标的检测方法，其特征在于，所述生物靶标为黄曲霉毒素B1。

9.根据权利要求8所述的一种非疾病诊断目的生物靶标的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1，将待测样品、发夹探针HP1、发夹探针HP2、发夹探针HP3和T7核酸外切酶在第一反应缓冲液中混合，混合液加热孵育，然后冷却至室温，得第一反应液；

S2，取第一反应液加入第二反应缓冲液中，然后向所述第二反应缓冲液中加入AgNO₃溶液，振荡后室温下避光孵育，然后加入还原溶液，室温下避光孵育，得第二反应液；

S3，对所述第二反应液进行荧光测定，实现对所述生物靶标的检测。

10.根据权利要求9所述的一种非疾病诊断目的生物靶标的检测方法，其特征在于，

所述步骤S1中，混合液加热孵育的条件为35-40 ℃孵育100-140分钟；和/或

所述第一反应缓冲液为NEBuffer 4缓冲液，所述第二反应缓冲液为柠檬酸钠缓冲液，所述还原溶液为NaBH₄溶液。

11.根据权利要求10所述的一种非疾病诊断目的生物靶标的检测方法，其特征在于，

所述NEBuffer 4缓冲液包含20 mM Tris-HNO₃, 50 mM KNO₃, 10 mM Mg(NO₃)₂, 所述NEBuffer 4缓冲液的pH 7.9；和/或

所述柠檬酸钠缓冲液包含10 mM 柠檬酸钠, 体积百分比0.05% Tween 20, 所述柠檬酸钠缓冲液的pH 7.0。

12.权利要求1所述的探针组、权利要求2或3所述的检测体系，或权利要求4-6任一项所述的传感器在如下a₁-a₂至少一种中的用途：

a₁，非疾病诊断目的检测生物靶标；a₂，制备检测生物靶标的产品。

13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，

所述生物靶标为黄曲霉毒素B1。

14.根据权利要求13所述的用途，其特征在于，所述的用途为在检测中药材或粮食中的黄曲霉毒素B1的应用。

Images