CN117169486B - 一种基于cha的荧光适配体传感器、试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分析检测技术领域，提供一种基于CHA的荧光适配体传感器、试剂盒及其应用，传感器包括靶标识别装置、信号放大装置和碳点，靶标识别装置包括黄曲霉毒素M1适配体Apt和触发链P1‑DNA；信号放大装置包括发夹DNA探针1和辅助发夹DNA探针2；发夹DNA探针1含有C‑Ag+‑C结构；当检测体系中存在黄曲霉毒素M1时，促发靶标识别装置和信号放大装置，发生无酶催化发夹自组装，Ag+被释放，进而与碳点发生光致电子转移，使得碳点发生明显荧光猝灭；本发明满足液态奶中黄曲霉毒素M1低含量的高灵敏检测，采用碳点作为荧光信号分子，利用无酶催化发夹自组装循环反应放大荧光信号，现实可行。
Description
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，具体涉及一种基于无酶催化发夹自组装（CHA）的荧光适配体传感器、试剂盒及其应用。
背景技术
液态奶容易受到微生物污染从而影响其产品品质，特别是黄曲霉毒素M1（AFM1）污染，黄曲霉毒素M1（AFM1）污染不仅会导致乳制品霉败变质，营养物质损失，降低乳质量，还会对人和动物机体内DNA、RNA、蛋白质和各种酶类的合成有一定的抑制作用，同时会损害肝脏、肾脏、神经等组织器官，造成不同程度的直接或间接危害，因此，需要对黄曲霉毒素M1（AFM1）进行检测，近年来，传统检测黄曲霉毒素的方法有薄层色谱法、质谱法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法等技术，这些技术都存在成本高、耗时长、操作复杂、灵敏度差等不足，因此，需要研发一种现场快速高灵敏检测低含量的黄曲霉毒素M1（AFM1）的方法，以保障液态奶食品安全和产品品质。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明第一个目的是提供一种基于无酶催化发夹自组装（CHA）的荧光适配体传感器，包括靶标识别装置（P1-Apt）、信号放大装置和碳点（CDs）；
所述靶标识别装置包括黄曲霉毒素M1适配体Apt以及与其部分互补的触发链P1-DNA；
所述信号放大装置包括发夹DNA探针1（HP1）和辅助发夹DNA探针2（HP2）；发夹DNA探针1（HP1）含有C-Ag+-C结构；
当检测体系中存在黄曲霉毒素M1（AFM1）时，促发靶标识别装置（P1-Apt）和信号放大装置，发生无酶催化发夹自组装（CHA），Ag+被释放，进而与碳点（CDs）发生光致电子转移，使得碳点（CDs）发生明显荧光猝灭。
而且，所述黄曲霉毒素M1适配体Apt的基因序列如SEQ ID NO.1所示；
所述触发链P1-DNA的基因序列如SEQ ID NO.2所示；
所述发夹DNA探针1（HP1）的基因序列如SEQ ID NO.3所示；
所述辅助发夹DNA探针2（HP2）的基因序列如SEQ ID NO.4所示。
而且，所述发夹DNA探针1（HP1）和辅助发夹DNA探针2（HP2）的浓度为300nM；P1-DNA的浓度为1μM；Apt的浓度为1μM。
而且，所述发夹DNA探针1（HP1）的制备方法如下：将发夹DNA探针1（HP1）所用DNA链溶液（10μM）与硝酸银溶液（50μM）按照最终浓度比为1:6加入到添加了硝酸钠和硝酸镁的MOPS缓冲液中，混合均匀并室温静置孵育60min制得含有C-Ag+-C的发夹DNA探针1（HP1）。
而且，所述靶标识别装置（P1-Apt）的制备方法如下：将10μM50μL的P1-DNA和10μM50μL的AFM1黄曲霉毒素M1适配体Apt混合在400μL添加了硝酸钠和硝酸镁的MOPS缓冲液中，室温静置孵育30min以形成靶标识别装置（P1-Apt）双链DNA结构。
而且，所述MOPS缓冲液的浓度为10mM，pH为7.0，其中添加了100mM硝酸钠、2.5mM硝酸镁。
而且，所述碳点（CDs）的制备方法如下：
S1、将5mL甲酰胺和20mL乙醇混合形成澄清溶液，然后将其转移到衬有聚四氟乙烯的反应釜中；
S2、将反应釜置于烘箱中于220℃下保持12h，反应结束冷却4h；
S3、将所得溶液用透析膜透析48h，随后，用0.22μm膜滤器过滤除去不溶物，然后冷冻干燥。
如图1所示，本发明提供的一种基于无酶催化发夹自组装（CHA）的荧光适配体传感器的反应原理如下：当检测反应体系中无黄曲霉毒素M1（AFM1）存在时，将无法引起CHA组装反应的进行，配体Apt和触发链P1-DNA组成的双链将会稳定存在于溶液中，触发链P1-DNA无法释放，就不会触发CHA开关组装反应的进行，同时发夹DNA探针1（HP1）和辅助发夹DNA探针2（HP2）开关将不会被打开，发夹DNA探针1（HP1）和辅助发夹DNA探针2（HP2）不能发生互补反应。当体系中存在黄曲霉毒素M1（AFM1）时，由于黄曲霉毒素M1（AFM1）与黄曲霉毒素M1适配体Apt结合的亲和力远远大于黄曲霉毒素M1适配体Apt与触发链PI-DNA之间简单的作用力，所以黄曲霉毒素M1（AFM1）会优先与黄曲霉毒素M1适配体Apt结合，形成稳定的AFM1-Apt复合物，之后会释放被置换出来的触发链P1-DNA。发夹DNA探针1（HP1）将会被自由状态下的触发链P1-DNA打开，并且互补配对。同时Ag+将从发夹DNA探针1（HP1）的C-Ag+-C结构中被释放出来，被打开的发夹DNA探针1（HP1）又将会与反应体系中的辅助发夹DNA探针2（HP2）的碱基结合，形成HP1/HP2双链DNA结构，以引发基于CHA的循环扩增，而最终触发链P1-DNA将会被释放出来继续参与到又一轮CHA的循环中，通过不断地循环实现反应的信号放大，而HP1/HP2双链DNA结构将会在体系中积累。重要的是在整个反应中，发夹DNA探针1（HP1）的C-Ag+-C结构会被打开释放Ag+，且随着循环反应的进行Ag+的释放不断地增加，而大量释放的游离Ag+将作为猝灭剂，使得碳点（CDs）的荧光猝灭，从而实现黄曲霉毒素M1（AFM1）的定量检测。
本发明用于牛奶中黄曲霉毒素M1（AFM1）检测。
本发明第三个目的是一种用于黄曲霉毒素M1（AFM1）检测的试剂盒包括试剂A：P1-Apt溶液、试剂B：发夹DNA探针1溶液、试剂C：辅助发夹DNA探针2溶液、试剂D：CDs溶液、微型反应瓶a，微型温度孵育器、荧光读数仪、微型石英比色皿；使用方法如下：将试剂B加入到微型反应瓶a中，接着加入试剂A和C，混匀放入微型温度孵育器于35℃下共孵育60min，再加入试剂D混匀并转移到微型石英比色皿，然后放入荧光读数仪，设置激发波长330nm，测定并记录376nm的荧光强度。
而且，所述A-D试剂的浓度分别为，A：1μM、B：300nM、C：300nM、D：0.1mg/mL。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1、本发明为了满足液态奶中黄曲霉毒素M1（AFM1）低含量时的高灵敏检测，采用碳点（CDs）作为荧光信号分子，利用CHA循环反应进一步放大荧光信号，该传感器现实可行。
2、本发明通过引入等温扩增技术，荧光适配体传感器的灵敏度可以得到显著提高，进而增强其在生物传感和纳米医学中的应用潜力，等温扩增技术的操作简单，因此在传感器设计和实际应用中具有较高的可操作性，此外，该技术的信号放大效果也使得传感器能够检测到低浓度的目标物质，提高了检测的灵敏度和准确性。
3、本发明构建一种基于无酶催化发夹自组装（CHA）的荧光适配体传感器，在35℃孵育60min，可以完成高灵敏、特异性检测黄曲霉毒素M1（AFM1），检测线性范围为0.1~50ng/mL，检测限为0.1ng/mL，满足国标对乳中AFM1限量0.5μg/Kg(即0.4ng/mL）的检测；在接种黄曲霉毒素M1（AFM1）（1、5、10ng/mL）的牛奶样品检测中，检测回收率分别为99.0%、97.2%和109.5%，RSDs低于3%，精密度达到可接受水平。
附图说明
图1为基于无酶催化发夹自组装（CHA）的荧光适配体传感器检测示意图；
图2不同自组装时间条件下CDs在峰值376nm处的荧光强度变化；
图3(A)为不同发夹DNA探针1(HP1)浓度下的荧光强度变化，图3(B)为发夹DNA探针1(HP1)和Ag+不同浓度比值下荧光强度变化；
图4(A)为加入不同浓度AFM1后传感器的荧光光谱图；图4(B)为I/I0与AFM1浓度之间的线性关系；
图5为AFM1检测的特异性分析图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
实施例1
荧光适配体传感器构建
（1）基于无酶催化发夹自组装（CHA）的荧光适配体传感器中所用各种DNA链的基因序列如表1所示，本发明中所用到的各种DNA链由发明人设计，成品由生工生物工程（上海）有限公司合成。
表1 各种DNA链的基因序列
（2）DNA链原液配制
首先，在10000rpm的速度下将盛有DNA链干粉的离心管离心处理6min，然后按照各种DNA链离心管上标记的需加入超纯水的量，并涡旋振荡1~2min使得DNA链干粉全部溶解，最后将溶解好的各种DNA链原液于-20℃下保存。
（3）含有C-Ag+-C的发夹DNA探针1（HP1）的合成
将发夹DNA探针1（HP1）所用DNA链溶液与硝酸银溶液按照1:6的浓度比混合，即可制备得到稳定的含有C-Ag+-C的发夹DNA探针1（HP1），具体方法如下:将发夹DNA探针1（HP1）所用DNA链溶液（50μL，10μM）与硝酸银（60μL，50μM）在390μLMOPS缓冲液（10mM，pH7.0，100mM硝酸钠，2.5mM硝酸镁)中混匀，室温下静置60min以形成含有C-Ag+-C的发夹DNA探针1（HP1）。
（4）靶标识别装置（P1-Apt）双链DNA结构的合成
黄曲霉毒素M1适配体Apt与其部分互补的触发链P1-DNA组合成靶标识别装置（P1-Apt）双链DNA结构，具体方法如下：将50μLP1-DNA(10μM)和50μL黄曲霉毒素M1适配体Apt(10μM)混合在400μLMOPS缓冲液（10mM，pH7.0，100mM硝酸钠，2.5mM硝酸镁）在室温下静置30min，以形成靶标识别装置（P1-Apt）双链DNA结构。
（5）碳点（CDs）的合成
首先，将0.2g柠檬酸钠和1.5g碳酸氢铵于10mL超纯水中混合形成澄清溶液，然后将其转移至聚四氟乙烯反应釜（50mL）中，在烘箱中于180℃下保持4h；反应结束冷却4h后，将所得溶液用透析膜（MWCO3000Da）透析48h；随后，用0.22μm膜滤器过滤除去不溶物，冷冻干燥；最后用超纯水将粉末溶解为浓度0.1mg/mL，并于冰箱（4℃）中存储备用。
（6）CHA反应条件
CHA信号放大所用各种DNA链使用浓度：P1-Apt为1μM，发夹DNA探针1（HP1）和辅助发夹DNA探针2（HP2）的浓度为300nM。
CHA反应温度与时间：温度35℃；时间60min。
实施例2
基于CHA的荧光适配体传感器的检测方法
选用实施例1步骤（6）中所述各种浓度DNA链于35℃下共孵育60min（即CHA循环反应60min），立即加入0.1mg/mL碳点（CDs）溶液混匀，然后用荧光分光光度计在激发波长330nm下测荧光发射光谱，记录最大发射波长376nm处的荧光强度；检测体系中无黄曲霉毒素M1（AFM1）时，即单纯由各DNA链和碳点（CDs）存在时，作为对照组，且376nm处的初始荧光强度记为I0，存在黄曲霉毒素M1（AFM1）或其他毒素时的荧光强度记为I。
随着检测体系中黄曲霉毒素M1（AFM1）含量增加，CHA中释放的Ag+含量越多，376nm处的荧光强度降低越大，即I/I0数值越小。
实施例3
一种用于黄曲霉毒素M1（AFM1）检测的试剂盒，包括试剂A：P1-Apt溶液、试剂B：发夹DNA探针1溶液、试剂C：辅助发夹DNA探针2溶液、试剂D：CDs溶液、微型反应瓶a，微型温度孵育器、荧光读数仪、微型石英比色皿；使用方法如下：将试剂B加入到微型反应瓶a中，接着加入试剂A和C，混匀放入微型温度孵育器于35℃下共孵育60min，再加入试剂D混匀并转移到微型石英比色皿，然后放入荧光读数仪，设置激发波长330nm,测定并记录376nm的荧光强度。
所述试剂A-D的浓度分别为，试剂A：1μM、试剂B：300nM、试剂C：300nM、试剂D：0.1mg/mL。
实验部分
实验1、实验条件优化
为了使该传感器获得最佳的检测性能，首先对CHA孵育时间、Ag+的浓度以及发夹DNA探针1（HP1）所用DNA链的浓度进行优化，标准偏差为三次重复试验测量结果；如图2所示，触发触发链P1-DNA催化双发卡自组装（CHA）的自组装时间为20、30、40、60、90和120min情况下，荧光强度随着自组装时间的增加而逐步降低，这表明在一定自组装时间范围内，自组装反应时间越长，发卡自组装过程越充分；将碳点（CDs）376nm波峰处的荧光强度值进行比较，自组装时间在60~120min之间的荧光猝灭程度较平缓，荧光强度猝灭率在120min时达到最大，因此，综合考虑最佳反应程度以检测时间成本因素，本实验把CHA循环反应的自组装时间确定为60min。
此外，探究了发夹DNA探针1（HP1）所用DNA链的浓度与Ag+的浓度对检测结果的影响，如图3(A)所示，固定其他条件不变，体系中分别加入不同浓度的发夹DNA探针1（HP1）所用DNA链（100、200、300、400、500nM），实验结果表明，浓度为300nM时最佳，此时碳点（CDs）的荧光强度猝灭变化最小，说明此时Ag+与发夹DNA探针1（HP1）所用DNA链已充分反应产生含有C-Ag+-C结构的发夹DNA探针1（HP1），使得体系中没有游离的Ag+，因而无法猝灭碳点（CDs）荧光；而当发夹DNA探针1（HP1）所用DNA链浓度继续增加至过剩时，逐渐达到饱和的正反应不能够引起荧光的显著增加。同时，过高的发夹DNA探针1（HP1）所用DNA链浓度可能导致背景反应发生的概率，从而使得背景信号增大；综合考虑300nM可以作为反应过程中发夹DNA探针1（HP1）的最适宜浓度。
将不同浓度的游离Ag+与碳点（CDs）混合，随着Ag+浓度增加，碳点（CDs）的荧光逐步降低，说明游离的Ag+与碳点(CDs）发生光致电子转移，因而荧光猝灭，因此可以通过考察碳点（CDs）的荧光变化来优化得到检测体系中发夹DNA探针1（HP1）所用DNA链浓度与Ag+的最适浓度比。
如图3(B)中（HP1+Ag+）+CDs组所示：固定其他条件不变，并将发夹DNA探针1（HP1）所用DNA链浓度固定为300nM，然后将其与Ag+按照不同浓度比例加入到检测体系中（1:3，1:4，1:5.1:6，1:7，1:8），实验结果表明，当发夹DNA探针1（HP1）所用DNA链浓度与Ag+浓度比例为1：3-1：5时，荧光强度基本呈一条直线，变化不明显，说明体系中Ag+全部用来与发夹DNA探针1（HP1）所用DNA链反应生成了含有C-Ag+-C结构的发夹DNA探针1（HP1），Ag+都是以与DNA探针1（HP1）结合的形式存在没有游离态；而当浓度比为1:7-1：8时，荧光强度明显降低，说明体系中Ag+过量而引发荧光猝灭，当浓度为1：6时，此时虽然荧光有些许减弱至7700。
如图3(B)中Ag++CDs组（对照组）所示：当添加了1:6Ag+时，荧光强度仅减弱至5500；说明浓度为1：6时剩余的游离态Ag+较少，因此选择发夹DNA探针1（HP1）所用DNA链浓度与Ag+的浓度比1:6为制备含有C-Ag+-C结构的发夹DNA探针1（HP1）最佳比例。
实验2、基于CHA的荧光适配体传感器检测方法的表征
（1）定量检测：检测线性范围实验是测定分别加入0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、10、50、100ng/mL的黄曲霉毒素M1（AFM1）的荧光发射光谱，结果如图4（A）所示；随着黄曲霉毒素M1（AFM1）浓度增加，376nm处的荧光强度逐步越低；如图4（B）所示，在AMF1浓度为0.1~50ng/mL范围内，荧光猝灭倍数（I/I0）与AFM1浓度之间呈现良好的线性关系，计算出检测限（LOD）约为0.1ng/mL。
（2）特异性评价：在基于CHA的荧光适配体传感器检测检测体系中添加不同毒素，进行特异性分析实验，所述不同毒素为：黄曲霉毒素M1（AFM1）、赭曲霉毒素A（OTA）、玉米赤霉烯酮毒素（ZEN）、黄曲霉毒素B1（AFB1)、黄曲霉毒素G1（AFG1）、真菌混合毒素（Mix），真菌混合毒素（Mix）由黄曲霉毒素M1（AFM1）与其他毒素混合形成，黄曲霉毒素M1（AFM1）浓度为10ng/mL，其余浓度均为50ng/mL；设置空白对照组（Control），空白对照组（Control）不添加任何毒素，荧光信号呈正常状态；实验结果如图5所示，添加浓度比黄曲霉毒素M1（AFM1）高5倍的赭曲霉毒素A（OTA）、玉米赤霉烯酮毒素（ZEN）、黄曲霉毒素B1（AFB1)、黄曲霉毒素G1（AFG1）时，与空白对照组（Control）相比，也仅仅只能观察到微小的荧光强度变化；然而，检测体系中存在黄曲霉毒素M1（AFM1）时荧光信号明显降低；此外，当检测到真菌混合毒素（Mix）的荧光信号与检测到黄曲霉毒素M1（AFM1）的荧光信号相似；以上结果表明，基于CHA的荧光适配体传感器检测方法对黄曲霉毒素M1（AFM1）检测的特异性显著，确保了检测准确度。
（3）牛奶样品检测：向从超市购买的牛奶中添加不同浓度的黄曲霉毒素M1（AFM1），然后离心脱脂肪（12000rpm，10min）后将上清液用PBS缓冲液稀释100倍，得到AFM1最终浓度分别为1ng/mL、5ng/mL和10ng/mL的三种样品，然后，按照本实验步骤（1）中定量检测方法对三个牛奶样品进行荧光检测并计算回收率。
表2显示，在三组牛奶样品中测定的回收率分别为97.0%、95.4%和106.5%，RSDs低于3%，表明利用所构建的检测方法在定量检测牛奶中黄曲霉毒素M1（AFM1）的精密度达到了可接受的水平。
表2 牛奶样品中检测AFM1的回收率（n=3）
Claims (7)
1.一种基于CHA的荧光适配体传感器，包括靶标识别装置、信号放大装置和碳点，其特征在于，所述靶标识别装置包括黄曲霉毒素M1适配体Apt以及与其部分互补的触发链P1-DNA；
所述黄曲霉毒素M1适配体Apt的基因序列如SEQ ID NO.1所示；
所述触发链P1-DNA的基因序列如SEQ ID NO.2所示；
所述信号放大装置包括发夹DNA探针1和辅助发夹DNA探针2；所述发夹DNA探针1和辅助发夹DNA探针2的浓度为300nM；
所述发夹DNA探针1含有C-Ag+-C结构；
所述发夹DNA探针1的基因序列如SEQ ID NO.3所示；
所述辅助发夹DNA探针2的基因序列如SEQ ID NO.4所示；
当检测体系中存在黄曲霉毒素M1时，促发靶标识别装置和信号放大装置，发生无酶催化发夹自组装，Ag+被释放，进而与碳点发生光致电子转移，使得碳点发生明显荧光猝灭；
靶标识别装置双链DNA结构的浓度为1μM；触发链P1-DNA原液和黄曲霉毒素M1适配体Apt浓度均为10μM，所述靶标识别装置双链DNA结构为将10μM50μL的P1-DNA和10μM50μL的黄曲霉毒素M1适配体Apt混合在400μL添加了硝酸钠和硝酸镁的MOPS缓冲液中，室温静置孵育30min以形成靶标识别装置双链DNA结构。
2.如权利要求1所述的一种基于CHA的荧光适配体传感器，其特征在于，所述发夹DNA探针1的制备方法如下：将10μM发夹DNA探针1所用DNA链溶液与50μM硝酸银溶液按照最终浓度比为1:6加入到添加了硝酸钠和硝酸镁的MOPS缓冲液中，混合均匀并室温静置孵育60min制得含有C-Ag+-C的发夹DNA探针1。
3.如权利要求1所述的一种基于CHA的荧光适配体传感器，其特征在于，所述MOPS缓冲液的浓度为10mM，pH为7.0，其中添加了100mM硝酸钠、2.5mM硝酸镁。
4.如权利要求1所述的一种基于CHA的荧光适配体传感器，其特征在于，所述碳点的制备方法如下：
S1、将5mL甲酰胺和20mL乙醇混合形成澄清溶液，然后将其转移到衬有聚四氟乙烯的反应釜中；
S2、将反应釜置于烘箱中于220℃下保持12h，反应结束冷却4h；
S3、将所得溶液用透析膜透析48h，随后，用0.22μm膜滤器过滤除去不溶物，然后冷冻干燥。
5.一种如权利要求1-4任意一项所述基于CHA的荧光适配体传感器用于检测黄曲霉毒素M1的检测试剂盒，其特征在于，包括试剂A：P1-Apt溶液、试剂B：发夹DNA探针1溶液、试剂C：辅助发夹DNA探针2溶液、试剂D：CDs溶液、微型反应瓶a，微型温度孵育器、荧光读数仪、微型石英比色皿。
6.如权利要求5所述基于CHA的荧光适配体传感器用于检测黄曲霉毒素M1检测试剂盒，其特征在于，所述试剂A-D的浓度分别为，试剂A：1μM、试剂B：300nM、试剂C：300nM、试剂D：0.1mg/mL。
7.如权利要求6所述的基于CHA的荧光适配体传感器用于检测黄曲霉毒素M1的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，将试剂B加入到微型反应瓶a中，接着加入试剂A和C，混匀放入微型温度孵育器于35℃下共孵育60min，再加入试剂D混匀并转移到微型石英比色皿，然后放入荧光读数仪，设置激发波长330nm,测定并记录376nm的荧光强度。
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