CN113265447B - 一种用于检测肌酸激酶同工酶的滚环扩增-金四面体比色检测方法和试剂盒 - Google Patents
一种用于检测肌酸激酶同工酶的滚环扩增-金四面体比色检测方法和试剂盒 Download PDFInfo
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- G01N2333/9123—Phosphotransferases in general with a nitrogenous group as acceptor (2.7.3), e.g. histidine kinases
Abstract
本发明属于蛋白检测领域，涉及一种用于检测肌酸激酶同工酶的滚环扩增‑金四面体比色检测方法和试剂盒。包括以下步骤：S1.制备磁珠‑适配体‑互补链复合物；S2.制备DNA‑AuNPs复合物；S3.制备AuNPs四面体；S4.制备滚环扩增模板；S5.肌酸激酶同工酶与互补链的竞争反应；S6.滚环扩增；S7.金四面体聚集显色反应；S8.读数。本发明利用等温扩增技术,不需要复杂的变温过程，稳定性较好，灵敏度较高。相比于其他的检测方法，本发明的比色方法无需大型仪器检测，可以通过imaginJ软件获取检测结果，成本较低，检测限可达0.05pM，适用于现场的筛查与快速检测过程。
Description
技术领域
本发明属于蛋白检测领域，具体地，涉及一种用于检测肌酸激酶同工酶的滚环扩增-金四面体比色检测方法和试剂盒。
背景技术
过度的体力劳动往往诱发多种疾病。心肌梗死具有高发病率与致死率的特点，受到人们广泛的重视。正常状态下，人体血液中肌酸激酶同工酶(CK-MB)含量为1-20ng/ml，但在心肌梗死发生后会立即升高，并在4-6小时内出现异常，含量提高至正常状况的十倍，能够在发病早期被检测到，这使得肌酸激酶同工酶能够作为检测机体异常可靠有效的生物标志物。因此，及时、快速、灵敏地检测CK-MB对预防心肌梗死，保护强体力劳动群体的健康具有重要意义。
多种检测方法被用于定量检测CK-MB。传统的检测方法，如酶联免疫检测法(ELISA)、放射免疫检测法、酶活力法等在临床诊断和治疗过程中常常用于检测CK-MB的水平，但往往需要复杂的样品前处理过程、专业的技术操作人员以及较长的检测时间(5-6小时)，并且往往受限于实验室的环境，无法实现肌酸激酶同工酶的及时快速地检测。此外，抗体虽然能够特异地识别肌酸激酶同工酶，但价格较为昂贵，保存条件较为严格。因此，寻找一种能够实时、实地对肌酸激酶同工酶含量进行快速灵敏检测的方法，是十分重要的。
发明内容
针对现有技术的上述缺点，本发明旨在解决的技术问题是提供一种灵敏可视、简单方便的检测方法，以实现对生物标志物肌酸激酶同工酶含量的及时检测。
为了实现上述目的，本发明提供一种用于检测肌酸激酶同工酶的滚环扩增-金四面体比色检测方法，包括以下步骤：
S1.制备磁珠-适配体-互补链复合物：将链霉亲和素化的磁珠与生物素化的适配体相结合，振荡孵育，得到磁珠-适配体复合物；向磁珠-适配体复合物中加入互补链，振荡孵育，得到磁珠-适配体-互补链复合物；
所述适配体的核苷酸序列为5’-GGGGGGTGGGTGGGGGATCTCGGAGGATGCTTTTAGGGGGTTGGG-3’(SEQ ID NO：1)；
所述互补链的核苷酸序列为5’-AACCTAAGCATCTCGAGT-3’(SEQ ID NO：2)；
S2.制备DNA-AuNPs复合物：DNA-AuNPs复合物的制备是由加盐老化法制备的；在单链DNA中加入TCEP溶液，以实现对巯基的活化，然后向该反应体系中加入金纳米粒子，震荡孵育，得到DNA-AuNPs复合物；
所述DNA的核苷酸序列为：(SEQ ID NO：1)；
S3.制备AuNPs四面体：本实验采用两步法制备金四面体；DNA1-4用于合成四面体，先将DNA1-4分别连上Au，然后将修饰了DNA四面体链的AuNPs两两混合，在缓慢降温过程中形成DNA二聚体，之后将二聚体混合，震荡孵育形成DNA四聚体；
所述DNA四面体链分别为：
DNA1:
5’-TTTGCCTGGAGATACATGCACATTACGGCTTTCCCTATTAGAAGGTCTCAGGTGCGCGTTTCGGTAAGTAGACGGGACCAGTTCGCCTTTTTTTTTTTTATTCAGATTCAGGACAGT-3’(SEQ ID NO：3)
DNA2:
5’-TTTCGCGCACCTGAGACCTTCTAATAGGGTTTGCGACAGTCGTTCAACTAGAATGCCCTTTGGGCTGTTCCGGGTGTGGCTCGTCGG-3’(SEQ ID NO：4)
DNA3:
5’-TTTGGCCGAGGACTCCTGCTCCGCTGCGGTTTGGCGAACTGGTCCCGTCTACTTACCGTTTCCGACGAGCCACACCCGGAACAGCCC-3’(SEQ ID NO：5)
DNA4:
5’-TTTGCCGTAATGTGCATGTATCTCCAGGCTTTCCGCAGCGGAGCAGGAGTCCTCGGCCTTTGGGCATTCTAGTTGAACGACTGTCGC-3’(SEQ ID NO：6)
S4.滚环扩增模板的制备：在T-4DNA连接酶的作用下，使滚环链和靶链形成闭合的滚环模板链；加入核酸外切酶，移除未结合的DNA链，形成具有进行扩增反应功能的滚环模板链；
所述靶链的核苷酸序列为5’-AATACTGAACAAAAAGCTATTATTTT-3’(SEQ ID NO：7)；
所述滚环链的核苷酸序列为5’-P-CTTTTTGTTCAGTATTCAGATTCAGGACAGTGGGTGGAACTCGAGATGCTTAGGTTAATATCAAAAAATAATAG-3’(SEQ ID NO：8)；
S5.肌酸激酶同工酶与互补链的竞争：将待测样品加入磁珠-适配体-互补链复合物中，振荡孵育；由于适配体与肌酸激酶同工酶的亲和力更高，互补链游离，通过磁分离作用可以得到游离的互补链；
S6.滚环扩增：将游离的互补链与滚环模板链混合，在phi 29DNA聚合酶的作用下，产生大量序列重复的单链核酸序列；
S7.金四面体聚集显色反应：向上述反应体系中加入金四面体溶液，孵育；
S8.读数：测量反应体系灰度值。
本发明的检测原理是基于滚环扩增-金四面体的比色方法，实现对肌酸激酶同工酶的灵敏便捷检测。如图1所示，首先，金纳米粒子分别由四条不同的DNA单链修饰，基于碱基互补配对原则，DNA链间发生识别与折叠，形成金四面体，聚集四个金纳米粒子。将生物素化了的适配体与链霉亲和素化的磁珠相连，加入互补链后形成磁珠-适配体-互补链复合物。当样品中存在肌酸激酶同工酶时，适配体与肌酸激酶同工酶具有更强的亲和力，导致互补链游离。加入滚环扩增模板后，游离的互补链能够与滚环扩增模板相结合，在Phi29 DNA聚合酶与dNTP的作用下，引发滚环扩增过程。通过识别金四面体上DNA1的3’末端延伸出30个碱基，金四面体与滚环扩增产物结合，形成金纳米粒子的聚集，溶液颜色由红变蓝。通过imageJ软件检测反应体系的灰度值，判断金纳米粒子的聚集程度，进而确定样品中的肌酸激酶同工酶含量。金纳米粒子聚集的程度与肌酸激酶同工酶含量成正比。
根据本发明，优选地，该方法还包括制备标准曲线的步骤：按照S1-S8的方法，检测一系列浓度已知的肌酸激酶同工酶标准溶液，测得反应体系的灰度值，分别以浓度和灰度值为横纵坐标作图，测得肌酸激酶同工酶标准曲线。
根据本发明，优选地，步骤S2包括：将2-3μL、0.4-0.6M的三(2-羧乙基)膦溶液加入80-120μL、8-12μM的DNA单链中，震荡孵育20-40min，活化巯基；向活化了巯基后的DNA中加入600-800μL、粒径为2-4nm的AuNPs溶液，孵育1-3h，并在24h内，分四次向混合液中加入NaCl溶液，直至NaCl的终浓度为45-55mM；然后将样品以12000-13000rpm离心8-12min，除去溶液中未偶联的DNA链，除去上清液，重复三次；最终的沉淀重悬于1×TBE缓冲液中。进一步优选地，步骤S2包括：将2.5μL、0.5M的三(2-羧乙基)膦(Tris(2-carboxyethyl)phosphine，TCEP)溶液加入100μL、10μM的DNA单链中，震荡孵育30min，活化巯基。向活化了巯基后的DNA中加入700μL、粒径为3nm的AuNPs溶液，孵育2h，并在24h内，分四次向混合液中加入NaCl溶液，直至NaCl的终浓度为50mM。然后将样品以12000rpm离心10min，除去溶液中未偶联的DNA链，除去上清液，重复三次。最终的沉淀重悬于1×TBE缓冲液中。
根据本发明，优选地，步骤S3包括：将带有互补单链DNA的两个DNA-AuNPs复合物混合于1×TBE缓冲液，40-60nM NaCl中，将混合物放置于水浴锅中，在85-95℃中加热4-6min，并在水浴锅中缓慢冷却至室温；高温使长链DNA变性，而随着缓慢降温的过程，DNA发生互补配对过程，并逐渐形成预期结构；将两个形成预期结构的DNA-AuNPs复合物混合于1×TBE缓冲液，40-60nM NaCl中，室温下震荡孵育24h，分别在转速8000r、6000、5000rpm离心10min，除去上清液，重复三次，最终重悬于1×TBE缓冲液中，即得到所需的金四面体。进一步优选地，步骤S3包括：将带有互补单链DNA的两个DNA-AuNPs复合物混合于1×TBE缓冲液，50nMNaCl中，将混合物放置于水浴锅中，在90℃中加热5min，并在水浴锅中缓慢冷却至室温。高温使长链DNA变性，而随着缓慢降温的过程，DNA发生互补配对过程，并逐渐形成预期结构。将两个形成预期结构的DNA-AuNPs复合物混合于1×TBE缓冲液，50nM NaCl中，室温下震荡孵育24h，分别在转速8000r、6000、5000rpm离心10min，除去上清液，重复三次，最终重悬于1×TBE缓冲液中，即得到所需的金四面体。
根据本发明，优选地，步骤S4包括：取150-250μL的离心管，向其中加入0.8-1.2μL滚环链、3μL靶链、0.8-1.2μL T-4DNA连接酶缓冲液，4-6μL dd水；震荡2-4min，离心0.8-1.2min；在95℃下孵育4-6min，55-65℃下孵育40-60min；然后加入0.8-1.2μL T-4DNA连接酶，震荡混合，离心0.8-1.2min，并在15-18℃孵育1-3h，60-70℃下孵育8-12min以灭活T-4连接酶，终止反应；向上述反应体系中加入1-3μL核酸外切酶I、1-3μL核酸外切酶III、1-3μL核酸外切酶I缓冲液、1-3μL核酸外切酶III缓冲液、以及1-3μL dd水，震荡混匀，离心0.8-1.2min；在37℃下孵育30-50min，并在70-90℃下孵育4-6min灭活酶活性，终止反应。进一步优选地，步骤S4包括：取200μL的离心管，向其中加入1μL滚环链、3μL靶链、1μL T-4DNA连接酶缓冲液，5μL dd水。震荡3min，离心1min。在95℃下孵育5min，60℃下孵育45min。然后加入1μL T-4DNA连接酶，震荡混合，离心1min，并在16℃孵育2h，65℃下孵育10min以灭活T-4连接酶，终止反应；向上述反应体系中加入2μL核酸外切酶I、2μL核酸外切酶III、2μL核酸外切酶I缓冲液、2μL核酸外切酶III缓冲液、以及2μL dd水，震荡混匀，离心1min。在37℃下孵育40min，并在80℃下孵育5min灭活酶活性，终止反应。
根据本发明，优选地，步骤S5包括：将生物素化的适配体DNA与磁珠相连，加入互补链后形成磁珠-适配体-互补链复合物。取上述混合液4-6μL，与4-6μL待测样品相混合，30℃、600-1000rpm的条件下孵育0.8-1.2h，磁分离得到上清液。进一步优选地，步骤S5包括：将生物素化的适配体DNA与磁珠相连，加入互补链后形成磁珠-适配体-互补链复合物。取上述混合液5μL，与5μL待测样品相混合，30℃、800rpm的条件下孵育1h，磁分离得到上清液。
根据本发明，优选地，步骤S6包括：向上述反应溶液中加入竞争反应后的上清液、0.8-1.2μL的Phi29 DNA聚合酶缓冲液，震荡混匀，离心0.8-1.2min，并在37℃下孵育50-70min；之后向体系中加入2-4μL dNTP、1-3μL dd水、1-2μL Phi29 DNA聚合酶，将上述反应物置于25-35℃下孵育100-150min，并将反应溶液在60-70℃孵育8-12min以终止反应。进一步优选地，步骤S6包括：向上述反应溶液中加入竞争反应后的上清液、1μL的Phi29DNA聚合酶缓冲液，震荡混匀，离心1min，并在37℃下孵育60min；之后向体系中加入3μL dNTP、2μLdd水、1.5μL Phi29 DNA聚合酶，将上述反应物置于30℃下孵育120min，并将反应溶液在65℃孵育10min以终止反应。
根据本发明，优选地，步骤S7包括：向上述反应体系中加入40-60μL金四面体溶液，孵育8-12min。进一步优选地，步骤S7包括：向上述反应体系中加入50μL金四面体溶液，孵育10min。
根据本发明，优选地，步骤S8包括：在暗箱中拍摄上述的反应体系，在曝光板上拍摄孵育后的反应体系，形成png格式的文件；通过imageJ软件检测该反应体系的灰度值，实现对检测结果快速及时的读数。
本发明还提供一种用于检测肌酸激酶同工酶的滚环扩增-金四面体比色检测试剂盒，包括以下组分：
(1)上述磁珠-适配体-互补链复合物；
(2)上述DNA-AuNPs复合物；
(3)上述AuNPs四面体；
(4)上述滚环扩增模板。
本发明在滚环扩增聚集金四面体的过程中优化了滚环模板链浓度、T-4DNA连接酶孵育时间、phi 29DNA聚合酶孵育时间、phi 29DNA聚合酶加入量、金纳米粒子的粒径、金四面体的加入量，在最优的实验条件可以对肌酸激酶同工酶进行准确灵敏的检测。本发明利用等温扩增技术,不需要复杂的变温过程，稳定性较好，灵敏度较高。相比于其他的检测方法，本发明的比色方法无需大型仪器检测，可以通过imaginJ软件获取检测结果，成本较低，检测限可达0.05pM，适用于现场的筛查与快速检测过程。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。
图1为本发明检测方法原理图。
图2为本发明实施例中目标物的检测标准曲线。
图3为本发明实施例中特异性检测的结果。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
以下实验例中，所用的DNA链、链霉亲和素化的磁珠均购自上海生工生物有限公司；T-4DNA连接酶、EXO I、EXO III核酸外切酶、phi29 DNA聚合酶均购自北京百灵克生物科技有限责任公司。
实施例1
本实施例用于说明人体中肌酸激酶同工酶检测的滚环扩增-金四面体比色检测方法，具体包括以下步骤：
1)人血清样本前处理：取人血清样本，使用TM缓冲液将其稀释30倍，作为样品检测基质。向稀释后的血清样本中加入肌酸激酶同工酶，使其终浓度为10nM，作为待检测的目标溶液。
2)磁珠-适配体-互补链的制备：取100μL MNP-SA于离心管中，用磁力架分离10min，去除上清。加入100μLPBS缓冲液、100μL生物素化的适配体，震荡混匀3min，30℃孵育1h，后磁分离上清，使用PBS缓冲液洗涤三次，最后重悬于PBS缓冲液中。
3)制备DNA四面体溶液：分别制备修饰了DNA四面体链的DNA-AuNPs复合物，并将其两两等体积混匀，在90℃水浴锅中孵育10min，缓慢降至室温，形成金二聚体。随后将二聚体溶液等体积混匀，室温500rpm震荡孵育24h，形成DNA四面体。
4)制备滚环扩增模板链：在T-4DNA连接酶的作用下，滚环链与靶链形成滚环模板链，加入EXO I、EXO III DNA核酸外切酶，将未结合的单链去除，形成完备的滚环扩增模板链。
5)竞争互补链：1)中准备的待测样品与2)中准备的磁珠-适配体-互补链复合物各取5μL，混合后室温震荡孵育1h，通过磁分离过程获得上清液。
6)滚环扩增：将5)中的上清液与4)中的滚环模板链混合，在phi 29DNA聚合酶、dNTP的作用下，30℃孵育2h。
7)显色：向6)中的反应体系中加入50μL AuNPs四面体，孵育10min。
8)读数：使用紫外吸光光谱与imageJ软件实现对7)反应体系的读数。
9)根据步骤1)-8)测定一系列已知浓度的肌酸激酶同工酶标准溶液，制作标准曲线，如图2所示。
实施例2
根据实施例1的步骤1)-8)测定实际样品，将步骤8)所得的数值代入测得的标准曲线中，计算生物标志物肌酸激酶同工酶的含量。结果如表1所示。
表1
实施例3
1)人血清样本前处理：取人血清样本，使用TM缓冲液将其稀释30倍，作为样品检测基质。向稀释后的血清样本中分别加入心肌肌钙蛋白、c反应蛋白、心型脂肪酸结合蛋白、降钙素，使其终浓度为500nM。向稀释后的血清样本中加入上述干扰物质，并加入CK-MB使终浓度为50nM，得到混合样品Mixture。制备上述5组检测样品，检验所设计方法的特异性。
2)根据实施例1的步骤2)-7)完成滚环扩增显色反应。
3)分别测定2)反应溶液的紫外吸光光谱，取A650/A520作为检验反应特异性的指标。结果如图3所示。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。
序列表
<110> 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所
<120> 一种用于检测肌酸激酶同工酶的滚环扩增-金四面体比色检测方法和试剂盒
<130> BJI2100572WY
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggggggtggg tgggggatct cggaggatgc ttttaggggg ttggg 45
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aacctaagca tctcgagt 18
<210> 3
<211> 117
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tttgcctgga gatacatgca cattacggct ttccctatta gaaggtctca ggtgcgcgtt 60
tcggtaagta gacgggacca gttcgccttt ttttttttta ttcagattca ggacagt 117
<210> 4
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tttcgcgcac ctgagacctt ctaatagggt ttgcgacagt cgttcaacta gaatgccctt 60
tgggctgttc cgggtgtggc tcgtcgg 87
<210> 5
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tttggccgag gactcctgct ccgctgcggt ttggcgaact ggtcccgtct acttaccgtt 60
tccgacgagc cacacccgga acagccc 87
<210> 6
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tttgccgtaa tgtgcatgta tctccaggct ttccgcagcg gagcaggagt cctcggcctt 60
tgggcattct agttgaacga ctgtcgc 87
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aatactgaac aaaaagctat tatttt 26
<210> 8
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctttttgttc agtattcaga ttcaggacag tgggtggaac tcgagatgct taggttaata 60
tcaaaaaata atag 74
Claims (4)
1.一种用于检测肌酸激酶同工酶的滚环扩增-金四面体比色检测试剂盒，包括以下组分：
（1）磁珠-适配体-互补链复合物，其制备方法包括：将链霉亲和素化的磁珠与生物素化的适配体相结合，振荡孵育，得到磁珠-适配体复合物；向磁珠-适配体复合物中加入互补链，振荡孵育，得到磁珠-适配体-互补链复合物；
所述适配体的核苷酸序列为5’-GGGGGGTGGGTGGGGGATCTCGGAGGATGCTTTTAGGGGGTTGGG-3’（SEQ ID NO：1）；
所述互补链的核苷酸序列为5’-AACCTAAGCATCTCGAGT-3’（SEQ ID NO：2）；
（2）AuNPs四面体，其制备方法包括：将修饰了DNA四面体链的AuNPs两两混合，在缓慢降温过程中形成DNA二聚体，之后将二聚体混合，震荡孵育形成DNA四聚体；
所述DNA四面体链分别为：
DNA1: 5’-TTTGCCTGGAGATACATGCACATTACGGCTTTCCCTATTAGAAGGTCTCAGGTGCGCGTTTCGGTAAGTAGACGGGACCAGTTCGCCTTTTTTTTTTTTATTCAGATTCAGGACAGT-3’（SEQ ID NO：3）
DNA2: 5’-TTTCGCGCACCTGAGACCTTCTAATAGGGTTTGCGACAGTCGTTCAACTAGAATGCCCTTTGGGCTGTTCCGGGTGTGGCTCGTCGG-3’（SEQ ID NO：4）
DNA3: 5’-TTTGGCCGAGGACTCCTGCTCCGCTGCGGTTTGGCGAACTGGTCCCGTCTACTTACCGTTTCCGACGAGCCACACCCGGAACAGCCC-3’（SEQ ID NO：5）
DNA4: 5’-TTTGCCGTAATGTGCATGTATCTCCAGGCTTTCCGCAGCGGAGCAGGAGTCCTCGGCCTTTGGGCATTCTAGTTGAACGACTGTCGC-3’（SEQ ID NO：6）
所述修饰了DNA四面体链的AuNPs的制备方法包括：在单链DNA中加入TCEP溶液，以实现对巯基的活化，然后向该反应体系中加入金纳米粒子，震荡孵育，得到DNA-AuNPs复合物；
（3）滚环扩增模板，其制备方法包括：在T4 DNA连接酶的作用下，使滚环链和靶链形成闭合的滚环模板链；加入核酸外切酶，移除未结合的DNA链，形成具有进行扩增反应功能的滚环模板链；
所述靶链的核苷酸序列为5’-AATACTGAACAAAAAGCTATTATT TT-3’（SEQ ID NO：7）；
所述滚环链的核苷酸序列为5’- P-CTTTTTGTTCAGTATTCAGA TTCAGGACAGTGGGTGGAACTCGAGATGCTTAGGTTAATATCAAAAAATAATAG-3’（SEQ ID NO：8）。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，修饰了DNA四面体链的AuNPs的制备方法包括：将2-3 μL、0.4-0.6 M的三(2-羧乙基)膦溶液加入80-120 μL、8-12 μM的DNA单链中，震荡孵育20-40 min，活化巯基；向活化了巯基后的DNA中加入600-800 μL、粒径为2-4 nm的AuNPs溶液，孵育1-3 h，并在24 h内，分四次向混合液中加入NaCl溶液，直至NaCl的终浓度为45-55 mM；然后将样品以12000-13000 rpm离心8-12 min，除去溶液中未偶联的DNA链，除去上清液，重复三次；最终的沉淀重悬于1×TBE缓冲液中。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，AuNPs四面体的制备方法包括：将带有互补单链DNA的两个DNA-AuNPs复合物混合于1×TBE缓冲液，40-60 nM NaCl中，将混合物放置于水浴锅中，在85-95℃中加热4-6 min，并在水浴锅中缓慢冷却至室温；高温使长链DNA变性，而随着缓慢降温的过程，DNA发生互补配对过程，并逐渐形成预期结构；将两个形成预期结构的DNA-AuNPs复合物混合于1×TBE缓冲液，40-60 nM NaCl中，室温下震荡孵育24 h，分别在转速8000、6000、5000 rpm离心10 min，除去上清液，重复三次，最终重悬于1×TBE缓冲液中，即得到所需的金四面体。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，滚环扩增模板的制备方法包括：取150-250 μL的离心管，向其中加入0.8-1.2 μL滚环链、3 μL靶链、0.8-1.2μL T4 DNA连接酶缓冲液，4-6μL dd水；震荡2-4 min，离心0.8-1.2 min；在95℃下孵育4-6 min，55-65℃下孵育40-60min；然后加入0.8-1.2 μL T4 DNA连接酶，震荡混合，离心0.8-1.2 min，并在15-18℃孵育1-3 h，60-70℃下孵育8-12 min以灭活T4 DNA连接酶，终止反应；向上述反应体系中加入1-3 μL核酸外切酶 I、1-3 μL核酸外切酶 III、1-3 μL核酸外切酶I缓冲液、1-3 μL核酸外切酶III缓冲液、以及1-3 μL dd水，震荡混匀，离心0.8-1.2 min；在37℃下孵育30-50 min，并在70-90℃下孵育4-6 min灭活酶活性，终止反应。
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