CN110055336B - 一种快速鉴别牦牛奶是否掺假的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速鉴别牦牛奶是否掺假的试剂盒。它包括试纸条、引物对、金标探针和缓冲溶液；试纸条包括样品吸收垫、反应膜、吸水垫和底板；沿样品流动方向，样品吸收垫、反应膜、吸水垫依次固定于底板上；试纸条的反应膜上包括检测区和质控区；检测区包被链霉亲和素；质控区包被连接有链霉亲和素或生物素的质控探针，质控探针与金标探针序列互补；引物对为5'端修饰有生物素的上游引物和下游引物5'端与一段序列tail相连，下游引物与序列tail两段序列中间修饰C3 spacer；金标探针为胶体金标记的探针；探针与下游引物的tail互补，同时与试纸条的质控探针序列互补。本发明能实现简单快速低成本的现场检测牦牛奶是否掺假。

Description

一种快速鉴别牦牛奶是否掺假的试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域中的检测试剂盒，特别是涉及一种快速鉴别牦牛奶是否掺假的试剂盒。
背景技术
随着社会的发展、生活水平逐渐提高，人们不再仅仅满足于普通的牛奶制品，而更青睐产地污染少、营养更丰富的奶制品，如牦牛奶。牦牛作为高海拔地区的生物，它们的生活环境无污染。因此牦牛奶有着普通牛奶所不能比拟的特点。牦牛奶中免疫球蛋白含量高，能够帮助人体调节免疫力；同时牦牛奶中富含天然乳钙和人体所必需的18种氨基酸、共轭亚油酸、а-亚麻酸、花生四烯酸、维生素H等多种稀有营养成分。正是由于牦牛奶的高营养价值所带来的良好的商业前景，很多不法商贩为了谋取暴利，往往人为的向牦牛奶中掺入普通牛奶。这种以假充好、名不副实的欺诈行为不仅损害消费者的权益，扰乱了市场秩序，而且牵涉到了人体健康。因此，建立准确、灵敏、快速的乳制品掺假鉴别方法，对保障乳及乳制品安全、维护消费者权益都具有重要的现实意义。
目前很多乳制品的检测方法，这些方法的主要研究对象为蛋白质和DNA。蛋白质是生命的物质基础，不同物种的肌肉组成拥有特定的氨基酸序列和组成成分以及特定的蛋白质三维结构，特别适用于物种鉴别。乳及乳制品中含有大量的蛋白质，不同的乳中蛋白质的结构不同。因此，以蛋白质为基础的检测方法是最常用的乳制品掺假鉴别方法，主要包括凯氏定氮法、电泳法、酶联免疫法、色谱法、光谱法。DNA作为遗传物质是生命最基本物质之一，存在于生物大多数细胞中，具有一定的热稳定性和物种特异性，因此相比其他方法具有更高的分辨率、特异性和敏感度。由于每种动物的 DNA序列都具有唯一性和稳定性，且不同组织器官的DNA序列相同，因此可以从不同部位提取DNA。目前DNA分析主要通过基因组DNA和线粒体DNA。聚合酶链式反应PCR是目前食品检测应用最广泛的技术，具有高效、快速、极高的灵敏度和分辨率的特点，不仅适用于动物的种类鉴别，还可用于各种加工产品中的检测。
重组酶聚合酶技术是近几年发展的热点，无论是从稳定性、灵敏度以及反应时间，RPA技术明显优于其他检测技术，它主要依赖于三种酶：重组酶(Recombinase)、单链结合蛋白(SSB)和DNA聚合酶。整个RPA反应过程进行得非常快，一般在恒定37℃反应20分钟内即可检测扩增产物。与之相同的重组酶介导链替换核酸扩增技术(简称 RAA技术)降低了RPA技术的成本，同样值得发展。
试纸条是一种简单方便灵敏的现场快速检测产品，已被广泛应用于检测行业。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速鉴别牦牛奶是否掺假的试剂盒。
本发明为了开发一种适于基层质检人员进行牦牛奶产品掺假鉴别的技术，本发明设计了牦牛的特异性RAA引物，开发了一种基于RAA试纸条技术的牦牛奶鉴别试纸条技术及其试剂盒。相比使用抗原抗体的方法进行试纸条显色反应，该方法借助于双链互补原则，降低了实验材料的成本，实现简单快速低成本的现场检测。
本发明提供的一种快速鉴别牦牛奶是否掺假的试剂盒，该试剂盒包括试纸条、引物对、金标探针和缓冲溶液；
所述试纸条包括样品吸收垫、反应膜、吸水垫和底板；沿样品流动方向，所述样品吸收垫、所述反应膜、所述吸水垫依次固定于所述底板上；所述试纸条的反应膜上包括检测区和质控区；所述检测区包被有链霉亲和素；所述质控区包被连接有链霉亲和素或生物素的质控探针，所述质控探针与金标探针序列互补；
所述引物对为5'端修饰有生物素的上游引物和下游引物5'端与一段序列tail相连，所述下游引物与序列tail两段序列中间修饰C3spacer；所述引物对用于扩增牦牛特异性基因；
所述金标探针为胶体金标记的探针；所述探针与所述下游引物的tail互补，同时与所述试纸条的质控探针序列互补。
本发明中，C3spacer指的是3个亚甲基。
上述的试剂盒中，所述质控探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述的上游引物和所述的下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示。
上述的试剂盒中，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
上述的试剂盒中，形成所述检测区的所述链霉亲和素的浓度可为 4mg/mL～10mg/mL，具体可为5mg/mL或4mg/mL～8mg/mL；
形成所述质控区的所述链霉亲和素或生物素的浓度可为1mg/mL；
所述质控探针的浓度可为100μM；
所述质控区包被有链霉亲和素或生物素的质控探针在反应膜上按照如下步骤得到：链霉亲和素或生物素与质控探针在反应膜上室温反应1～2小时。
上述的试剂盒中，所述缓冲溶液为TE Buffer；
制备所述金标探针的步骤如下：将胶体金溶液与所述探针，在避光下放置反应；然后加PB缓冲液，并加NaCl水溶液稀释，放置反应，即得所述金标探针。
上述的试剂盒中，所述胶体金溶液中胶体金的粒径为13～25nm，所述探针的浓度为100μM；
所述胶体金溶液与所述探针的体积比为25～50：1；
在所述避光下放置反应时间为16～24h；
所述PB缓冲液的浓度为10mM，所述探针与所述PB缓冲液的体积比为1:2.8；
加2M NaCl水溶液将体系稀释至0.3M，然后反应的时间为8～12h；
得到所述金标探针的后处理步骤如下：离心，除上清；再用所述NaCl水溶液和所述PB缓冲液冲洗两次，然后重悬于NaCl水溶液和PB缓冲液中，备用。
本发明还提供了一种利用上述的试剂盒快速检测牦牛奶中DNA的方法，包括如下步骤：(1)具有上述引物对扩增待测样品的核酸提取液，得到扩增产物；
(2)所述扩增产物与所述金标探针和缓冲溶液混合反应，然后滴加至所述试纸条的样品吸收垫上，检测结果如下：
1)当所述检测区显色，且所述质控区也显色，则所述待测样品检测结果为阳性；
2)当所述检测区不显色，且所述质控区显色，则所述待测样品检测结果为阴性；
3)当所述质控区不显色，则所述试纸条无效，需要用新的所述试纸条重新测定。
本发明中，所述待测样品检测结果为阳性，即为所述待测样品检测到牦牛奶中DNA，说明所述待测样品牦牛奶没有掺假；所述待测样品检测结果为阴性，即为所述待测样品没有检测到牦牛奶中DNA，说明所述待测样品牦牛奶掺假。
本发明中，所述扩增是将待测样品的核酸提取液，置于具有上述引物对的RAA 反应体系进行RAA反应进行。反应过程：37℃20min。
本发明中，所述待测样品扩增后若产物中有目标序列，则试纸条的检测区上的链霉亲和素抓住上游引物的生物素，下游引物的tail与金标探针互补，从而在检测区显色；若无目标序列，检测区不能显色，在质控区Control序列与金标探针互补，进行质控。
本发明上述的方法步骤(1)中，所述扩增产物的纯化使用柱式纯化试剂盒进行产物纯化目的片段。
上述的方法步骤(1)中，所述待测样品与所述引物对的体积比为1:2；
步骤(2)中，所述扩增产物、所述金标探针和所述缓冲溶液的体积比为2:5:25。
本发明中，所述待测样品的核酸提取液按照如下步骤：取奶样品，离心，去除脂肪和上清，加PBS缓冲液，再次离心，反复两次，将沉淀重悬于PBS缓冲液，按照血液核酸提取试剂盒说明书进行提取，得到100μL的所述待测样品的核酸提取液。
本发明还提供了一种快速鉴别牦牛奶是否掺假的试纸条，包括样品吸收垫、反应膜、吸水垫和底板；
沿样品流动方向，所述样品吸收垫、所述反应膜、所述吸水垫依次固定于所述底板上；
所述试纸条的反应膜上包括检测区和质控区；所述检测区包被有链霉亲和素；所述质控区包被连接有链霉亲和素或生物素的质控探针，所述质控探针与探针序列互补；所述质控探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述的试纸条中，形成所述检测区的所述链霉亲和素的浓度可为 4mg/mL～10mg/mL，具体可为5mg/mL；
形成所述质控区的所述链霉亲和素或生物素的浓度可为1mg/mL；
所述质控探针的浓度可为100μM；
所述质控区包被有链霉亲和素或生物素的质控探针在反应膜上按照如下步骤得到：链霉亲和素或生物素与质控探针在反应膜上室温反应1～2小时。
本发明还提供了一种用于牦牛奶中DNA检测的引物对，该引物对为5'端修饰有生物素的上游引物和下游引物5'端与一段序列tail相连，所述下游引物与序列tail两段序列中间修饰C3spacer；所述的上游引物和所述的下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了一种用于牦牛奶中DNA检测的探针，该探针为上述的金标探针；
所述的金标探针为胶体金标记的探针，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述探针与所述下游引物的tail互补，同时与所述试纸条的质控探针序列互补。
上述的探针中，制备所述金标探针的步骤如下：将胶体金溶液与所述探针，在避光下放置反应；然后加PB缓冲液，并加NaCl水溶液稀释，放置反应，即得所述金标探针。
上述的探针中，所述胶体金溶液中胶体金的粒径为13～25nm，所述探针的浓度为100μM；
所述胶体金溶液与所述探针的体积比为25～50：1；
在所述避光下放置反应时间为16～24h；
所述PB缓冲液的浓度为10mM，所述探针与所述PB缓冲液的体积比为1:2.8；
加2M NaCl水溶液将体系稀释至0.3M，然后反应的时间为8～12h；
得到所述金标探针的后处理步骤如下：离心，除上清；再用所述NaCl水溶液和所述PB缓冲液冲洗两次，然后重悬于NaCl水溶液和PB缓冲液中，备用。
本发明中，制备所述金标探针的具体步骤如下：将500μL纳米金(胶体金溶液，13nm)与20μL 100μM探针在避光下放置16h，加10mM PB缓冲液56μL，加2M NaCl 至0.3M，放置8h；4℃，16100×g离心30min，除上清；再用0.3M NaCl和10mM PB 缓冲液洗涤两次，最后重悬于0.3M NaCl和10mM PB缓冲液中，置于4℃备用。
本发明进一步提供了快速鉴别牦牛奶中DNA检测的扩增体系，该体系包括上述引物对、一种或多种DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液和Buffer B。
上述的扩增体系中，所述缓冲液包括TE Buffer。
本发明具有以下优点：
本发明基于重组酶聚合酶扩增技术的牦牛奶掺假鉴别的试纸条产品，与普通PCR相比，该方法操作简单快速，仅需水浴锅即可完成反应，反应时间仅为20min，结果可用裸眼进行判读，时间不超过10min，灵敏度及准确度高且成本较低。本方法的建立为牦牛奶掺假鉴别奠定了一定的基础。
附图说明
图1为本发明试剂盒检测原理。
图2为本发明试剂盒特异性实验的检测结果，其中图2(a)为引物对不同奶制品的DNA模板的电泳结果，图2(b)为本发明试剂盒中引物对不同奶制品的DNA模板的检测结果，从左至右依次为牦牛奶、牛奶、羊奶、骆驼奶、驴奶、水。
图3为本发明挑选引物ZF1～ZF3分别作两组平行电泳实验的结果。
图4为本发明试剂盒灵敏度实验的检测结果，图4中从左到右分别是10～10-6ng/μL牦牛奶核酸提取液的检测结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所使用的样品均取自养殖场，所有样品放在-20℃下保存使用；
RAA基础型核酸扩增试剂盒购自杭州众测生物科技有限公司；引物均由上海生工生物工程技术有限公司合成。乳制品核酸提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；核酸试纸条购自北京雁栖湾生物科技有限公司；电泳仪购自Bio-Rad公司；凝胶成像系统(Alphalmager EP)购自美国UVP公司；紫外分光光度计购自Thermo有限生物公司；微量离心机购自Thermo Fisher Scientific公司。
DNA提取试剂盒：Tiangen；RAA基础型核酸扩增试剂盒购自杭州众测生物科技有限公司；胶体金溶液(13nm)；链霉亲和素、氯化钠、叠氮化钠、PBS缓冲液、PB 缓冲液、TE缓冲液均购自北京百诺威生物科技有限公司；水浴锅；Nanodrop-2000(Gene 公司)；离心管：0.1mL、1.5mL、2mL；计时器；移液枪：量程0.5μL～10μL、10μL～100μL、 100μL～1000μL；无菌去离子水。
实施例、
1、试纸条的制备
将链霉亲和素按照包被浓度5mg/mL包被在反应膜上形成检测区；将1mg/mL的链霉亲和素与100μM的质控探针在室温下反应两个小时后，在反应膜上做为质控区，得到包被检测区与质控区的反应膜。试纸条由样品吸收垫(上海杰一生物技术有限公司，JY-BX111)，上述制备的包被检测区和质控区的反应膜、吸水垫依次按照顺序黏贴在底板上。质控探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示和表1中Control所示。
2、引物设计
挑选引物：设计了如表1所示不同引物MF1～MF5，经过凝胶电泳比对的结果如图3中所示，由图3可知本发明MF5的阳性条带最为清晰明亮，选MAO-F和MAO-R 作为最佳引物。MF5引物对修饰后标记为MAO-F和MAO-R。
表1所用引物序列
Figure RE-GDA0002099814410000061
注：表1中，MAO-F的核苷酸序列为MF5F(MF5上游引物)的5'端连接Bio， Bio表示生物素；MAO-R的核苷酸序列中间修饰C3表示3个亚甲基；金标探针的探针序列probe的3'端连接HS-SH表示两个巯基，巯基中S与纳米金连接；质控探针的核苷酸序列Control的5'端连接Bio表示链霉亲和素。
本发明引物对：上游引物的5'端修饰有生物素，如表1中MAO-F所示；下游引物与一段序列tail相连，如表1中MAO-R所示，两段序列修饰中间C3spacer。MAO-F 的上游引物和MAO-R的下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3 所示。MF1～MF4引物对的上游引物F和下游引物R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5-12所示，MF5的上游引物F和下游引物R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和 SEQ ID NO.13所示所示。
3、金标探针的制备
探针(其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示和表1中所示probe)与下游引物的tail互补，同时与试纸条的质控序列互补，将纳米金标记在探针上后，将反应产物与金标探针在上样缓冲液TE Buffer的作用下反应两分钟，滴加在是纸条上。若产物中有目标序列，则试纸条的检测区上的链霉亲和素抓住上游引物的生物素，下游引物的tail与金标探针probe互补，从而在检测区显色。若无目标序列，检测区不能显色，在质控区质控探针序列与金标探针互补，进行质控。金标探针的制备：将500ul纳米金(13nm) 与20μL 100μM探针probe在避光下放置16h，加10mM PB缓冲液56μL，加2M NaCl 至0.3M，放置8h。4℃，16100×g离心30min，除上清。最后重悬于0.3M NaCl和 10mM PB缓冲液中，置于4℃备用。
4、快速鉴别牦牛奶是否掺假的试剂盒，包括上述1中试纸条、2中引物对、3中金标探针和缓冲溶液。
5、利用上述的试剂盒快速检测牦牛奶是否掺假的方法，包括如下步骤：
1)DNA模板的制备：取10mL的奶样品，8500×g离心15min，去除脂肪和上清，加2mLPBS缓冲液，再次离心，反复两次，将沉淀重悬于200μL PBS缓冲液，按照血液核酸提取试剂盒说明书进行提取，最终得到100μL的提取液。
2)RAA反应
用牦牛源性成分基因组DNA，即步骤1)中得到的提取液，用RAA试剂盒进行扩增并用电泳检测扩增产物。RAA反应体系为：41.5μL的反应缓冲液、2μL的上游引物与2μL的下游引物、2μL的DNA模板、2.5μL的Buffer B启动反应。反应过程：37℃ 20min。
3)目的片段的纯化
使用柱式纯化试剂盒进行产物纯化目的片段。
4)将试纸条平放，取4μL的扩增产物、10μL的金标探针与50μL展开液(TE Buffer)，混匀滴加到试纸条的样品吸收垫中，室温下判读结果，T线显色，结果为阳性；T线不显色，结果为阴性；若C线不显色，则试纸条无效。
本发明试剂盒的检测原理：
核酸试纸条检测牦牛成分的原理如图1所示。使用一对特异性引物扩增从牦牛奶中提取得到的基因组，上、下游引物的5'端分别修饰有生物素和tail。扩增产物纯化后与金标探针、展开液滴加在试纸条上，混合液通过毛细管作用向前流动。当有扩增产物存在时，扩增产物一端添加的tail首先与金标探针probe结合，接着液相继续向前流动到达检测线，固定在检测线上的链霉亲和素将一端修饰有生物素的扩增产物捕获，这样就使被扩增产物一端结合的胶体金都停留在检测线处，产生红色的条带。多余的胶体金继续层析，最终与质控线上的质控探针序列结合，使质控线同样显色。当扩增产物不存在时，胶体金颗粒无法停留在检测线处，而与质控线上的质控探针序列结合，所以质控线的显色情况可以用来对试纸条进行指控。
特异性实验：
根据确立的反应体系进行特异性实验，使用本研究设计的引物对不同种属的DNA模板进行实验，检测结果如图2所示，由图2可知除了牦牛源性DNA外，其他几个物种的奶制品均没有扩增，从而证明试验方法的特异性良好。电泳结果与试纸条结果一致。
灵敏度实验：为了确定本试剂盒的最小检出量，将提取的牦牛奶核酸提取液稀释成10、1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6ng/μL等7个浓度梯度后作为模板进行检测。结果如图4显示，本发明具有较广的检测范围，其最低检测限为10-6ng/μL。
<110> 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所
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<400> 12
gaagaagagc agaggtgggc agggcgag 28
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gaatagtacc agaagtatta gggctagaat 30

Claims (7)

1.一种快速鉴别牦牛奶是否掺假的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括试纸条、引物对、金标探针和缓冲溶液；
所述试纸条包括样品吸收垫、反应膜、吸水垫和底板；沿样品流动方向，所述样品吸收垫、所述反应膜、所述吸水垫依次固定于所述底板上；所述试纸条的反应膜上包括检测区和质控区；所述检测区包被有链霉亲和素；所述质控区包被连接有链霉亲和素或生物素的质控探针，所述质控探针与所述金标探针序列互补；
所述引物对为5'端修饰有生物素的上游引物和5'端与一段序列tail相连的下游引物，所述下游引物与序列tail两段序列中间修饰C3 spacer，所述C3 spacer指的是3个亚甲基，所述引物对用于扩增牦牛特异性基因；
所述金标探针为胶体金标记的探针；所述金标探针与所述下游引物的序列tail互补，同时与所述试纸条的质控探针的序列互补；
所述质控探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述的上游引物和所述的下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；
所述金标探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：形成所述检测区的所述链霉亲和素的浓度为4mg/mL~10mg/mL；
形成所述质控区的所述链霉亲和素或生物素的浓度为1mg/mL；
所述质控探针的浓度为100μM；
所述质控区包被有链霉亲和素或生物素的质控探针在反应膜上按照如下步骤得到：链霉亲和素或生物素与质控探针在反应膜上室温反应1~2小时。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：形成所述检测区的所述链霉亲和素的浓度具体为5 mg/mL。
4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述缓冲溶液为TE Buffer；
制备所述金标探针的步骤如下：将胶体金溶液与所述探针，在避光下放置反应；然后加PB缓冲液，并加NaCl水溶液稀释，放置反应，即得所述金标探针。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述胶体金溶液中胶体金的粒径为13~25nm，所述探针的浓度为100μM；
所述胶体金溶液与所述探针的体积比为25~50：1；
在所述避光下放置反应时间为16~24h；
所述PB缓冲液的浓度为10mM，所述探针与所述PB缓冲液的体积比为1:2.8；
加2M NaCl水溶液将体系稀释至0.3M，然后反应的时间为8~12h；
得到所述金标探针的后处理步骤如下：离心，除上清；再用所述NaCl水溶液和所述PB缓冲液冲洗两次，然后重悬于NaCl水溶液和PB缓冲液中，备用。
6.一种利用权利要求1或5所述的试剂盒快速检测牦牛奶中DNA的方法，包括如下步骤：（1）利用权利要求1或5所述试剂盒中的引物对扩增待测样品的核酸提取液，得到扩增产物；
（2）所述扩增产物与所述金标探针和缓冲溶液混合反应，然后滴加至所述试纸条的样品吸收垫上，检测结果如下：
1）当所述检测区显色，且所述质控区也显色，则所述待测样品检测结果为阳性；
2）当所述检测区不显色，且所述质控区显色，则所述待测样品检测结果为阴性；
3）当所述质控区不显色，则所述试纸条无效，需要用新的所述试纸条重新测定。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述待测样品与所述引物对的体积比为1:2；
步骤（2）中，所述扩增产物、所述金标探针和所述缓冲溶液的体积比为2:5:25。
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