CN113151414B

CN113151414B - 基于冷冻构建金纳米探针的相对dna步行器引发指数扩增检测蓖麻毒素的方法及试剂盒

Info

Publication number: CN113151414B
Application number: CN202110496824.2A
Authority: CN
Inventors: 高志贤; 王瑜; 彭媛; 李双; 韩殿鹏; 任舒悦; 秦康; 韩铁; 李森; 孙璇
Original assignee: Environmental Medicine and Operational Medicine Institute of Military Medicine Institute of Academy of Military Sciences
Current assignee: Environmental Medicine and Operational Medicine Institute of Military Medicine Institute of Academy of Military Sciences
Priority date: 2021-05-07
Filing date: 2021-05-07
Publication date: 2022-06-21
Anticipated expiration: 2041-05-07
Also published as: CN113151414A

Abstract

本发明属于蛋白毒素检测领域，涉及一种基于冷冻构建金纳米探针的相对DNA步行器引发指数扩增检测蓖麻毒素的方法及试剂盒。本发明的方法主要有4个过程：冷冻构建金纳米探针，蓖麻毒素和金纳米探针竞争结合适配体，相对DNA步行器和指数扩增反应。本发明的方法和试剂盒可以在实际应用中以较高的灵敏度，良好的特异性和优异的稳定性检测蓖麻毒素。

Description

基于冷冻构建金纳米探针的相对DNA步行器引发指数扩增检测蓖麻毒素的方法及试剂盒

技术领域

本发明属于蛋白毒素检测领域，具体地，涉及一种基于冷冻构建金纳米探针的相对DNA步行器引发指数扩增检测蓖麻毒素的方法，以及一种基于冷冻构建金纳米探针的相对DNA步行器引发指数扩增检测蓖麻毒素的试剂盒。

背景技术

蓖麻是大戟科蓖麻属植物，为含油量较高的油料作物。但蓖麻植株的茎、叶或蓖麻的籽实中含有有毒物质，主要包括蓖麻毒素、蓖麻碱及蓖麻血球凝集素等。其中，蓖麻毒素也称蓖麻毒蛋白，是迄今所知毒性最强的植物毒蛋白，毒性约是氰化物的6000倍。蓖麻毒素主要存在于蓖麻蛋白中 (约占蓖麻蛋白的5％，分子量约为64-66kD)，是一种Ⅱ型异二聚体核糖体失活蛋白，由核糖体失活酶(蓖麻毒素A链)及与半乳糖/N-乙酰半乳糖胺特异结合的凝集素(蓖麻毒素B链)组成，二者之间由一个二硫键连接。在25℃时，蓖麻毒素可在较大范围的酸碱溶液中反复结冰和溶解，但其毒性仍保持不变。

蓖麻毒素具有很强的毒性作用，毫克级的剂量即可致人或动物死亡。由于分布广泛、易于获得、致命性强等特点，被一些国家军方深入研究并制作为化学武器。截至目前，适用于人的解毒药和特异性抗毒素特效药尚未被研制出来。因此，建立蓖麻毒素快速、准确、灵敏的检测方法引起了国内外学者的广泛关注。

根据蓖麻毒素的理化性质、生物化学特性及免疫学特性，建立了免疫吸收分析、生物传感器分析及生物质谱分析等方法。免疫标记及放射免疫方法具有检测灵敏度高的特点，但其对于相对繁杂的抗体制备及特殊标记物的要求，限制了该方法的大量推广应用；生物质谱法虽然借助于高科技的仪器设备，但高昂的仪器设备使得检测费用大大增加，不适合做现场检测。因此，建立快速、准确的生物传感器检测方法，将成为蓖麻毒素检测方法的研究重点，从而为临床治疗提供理论依据。

在常用的DNA分子机器中，DNA步行器主要由3个元素组成：驱动力，步行链和步行轨道。根据步行链的移动方式和轨道范围，DNA步行器可分为 3种类型：1D线性轨道，2D平面轨道和3D纳米粒子表面轨道。值得注意的是，基于球形金纳米颗粒的3D轨道比1D或2D轨道具有更大的比表面积和 DNA密度，因此可以加快DNA步行器反应的速度。因此，本发明开发了一种新的相对运动3D DNA步行器方法。其中，金纳米颗粒创新的采用冷冻法快速合成，同时采用指数扩增放大荧光信号。

发明内容

针对现有检测方法的缺点，本发明要解决的技术问题是建立一种简单、便捷、高灵敏度的生物传感器技术，即基于冷冻构建金纳米探针的相对DNA 步行器引发指数扩增的新型方法，以实现食品中蓖麻毒素的痕量检测，并实现定量分析。

为了实现上述目的，本发明提供一种基于冷冻构建金纳米探针的相对DNA步行器引发指数扩增检测蓖麻毒素的方法，包括以下步骤：

1)冷冻构建金纳米探针：采用柠檬酸钠还原法制备金纳米颗粒，将巯基和PolyA双标记的DNA与三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐孵育，然后将制备的金纳米颗粒与DNA混合孵育，将溶液用HEPES缓冲液洗涤，最后将沉淀重悬于HEPES缓冲液中，并在黑暗中保存；通过此方法分别合成AW和AT；

所述AW为DNA Walker-金纳米探针，DNA Walker序列为： 5'-SH-(A)₂₀(T)₁₅AACTATACAACCTCAGCATTAGTCAAGAGGTA-3'(SEQ ID NO：1)；

所述AT为DNA Track-金纳米探针，DNA Track序列为： 5'-SH-(A)₂₀(T)₁₅TACCTCTTGACTAATGCTGAGGTTGTATAGTT-3'(SEQ ID NO：2)；

2)蓖麻毒素的竞争反应：反应前将蓖麻毒素适配体在高温孵育，然后逐渐冷却至室温，再将适配体和含蓖麻毒素的待测样品混合并孵育；反应结束后离心用PBS洗涤溶液；重悬沉淀，得到AW'；

所述蓖麻毒素适配体的序列为：5'-ATAGGAGTCACGACGACCAGAACCGTAGGT TCGGGGTCGGAGTGGTCCGGAAGATGGCGTGGTATGTGCGTCTACCTCTTGACTAAT-3'(SEQ ID NO：3)；

3)相对DNA步行器过程：相对DNA步行包括：所述AW'，所述AT， Nb.BbvCI切口酶，缓冲液和水；

4)指数扩增反应：指数扩增反应体系包括模板DNA缓冲液、dNTP， ssDNA产物、ThermoPol缓冲液、Nt.BstNBI切口酶，Vent(exo^-)DNA聚合酶，MgSO₄和水；

所述模板DNA的序列为：5'-AACTATACAACCTCAAACAGACTCAAACTATACAACC TCAA-3'(SEQ ID NO：4)；

所述ssDNA产物的序列为5'-TGAGGTTGTATAGTT-3'(SEQ ID NO：5)；

5)荧光强度测定：在反应前，将MB在高温孵育，然后在PBS中逐渐冷却至室温；然后，将MB溶液与步骤4)的扩增产物混合，并在室温下孵育；反应完毕后，使用荧光分光光度计测量荧光强度；

所述MB的序列为：5'-FAM-CTGGAGAACTATACAACCTCACTCCAG-BHQ1-3' (SEQ ID NO：6)。

根据本发明，优选地，还包括制作蓖麻毒素标准曲线的步骤，根据步骤1)-5)测试不同浓度蓖麻毒素，通过荧光强度对不同浓度蓖麻毒素的响应，得到测定蓖麻毒素的标准曲线。

根据本发明，优选地，还包括实际样品预处理步骤：将实际样品在 12000-13000rpm下离心5-15分钟，取上清并将其pH值调节至7.0。

根据本发明，具体地，步骤1)包括：

采用柠檬酸钠还原法制备15nm左右的金纳米颗粒；将巯基和PolyA双标记的DNA与三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐(TCEP)以1：80-120的摩尔比在室温下孵育0.5-2小时；然后将2-5nM制备的金纳米颗粒与8-12μM DNA 在-15℃至-25℃下以1：150-25-的摩尔比混合孵育30-150min；室温解冻后，将溶液用0.04-0.06M，pH 7.5-7.8的HEPES缓冲液于4℃以12000-15000 rpm离心并洗涤；最后将沉淀重悬于HEPES缓冲液中，并在黑暗中于4℃保存。

更具体地，步骤1)包括：

采用柠檬酸钠还原法制备15nm左右的金纳米颗粒；与此同时，将巯基 (SH)和PolyA双标记的DNA与三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐(TCEP)以1： 100的摩尔比在室温下孵育1小时；接下来，将制备的金纳米颗粒(4nM) 与DNA(10μM)在-20℃下以1：200的摩尔比混合孵育1小时；室温解冻后，将溶液用HEPES缓冲液(0.05M，pH 7.6)于4℃以14000rpm离心 20分钟并洗涤3次；最后将沉淀重悬于HEPES缓冲液中，并在黑暗中于4℃保存。

根据本发明，具体地，步骤2)包括：

反应前将0.8-1.2μM的蓖麻毒素适配体在90-95℃下孵育4-6分钟，然后逐渐冷却至室温；接下来，将0.6-1.0nM AW，0.1-0.3μM的适配体和含蓖麻毒素的待测样品混合并在37℃下孵育0.8-1.2h；反应结束后 12000-15000rpm离心10-30分钟，用PBS洗涤溶液，重悬沉淀，得到AW'。

更具体地，步骤2)包括：

反应前将1μM的蓖麻毒素适配体在95℃下孵育5分钟，然后逐渐冷却至室温；接下来，将0.8nM AW，0.2μM的适配体和蓖麻毒素混合并在 37℃下孵育1h；反应结束后14000rpm离心20分钟，用PBS洗涤溶液。重悬沉淀并命名它为AW'。

根据本发明，具体地，步骤3)中，

相对DNA步行包括：AW'，1-3nM的AT，0.1-0.2UμL^-1的Nb.BbvCI 切口酶，1×CutSmart缓冲液和ddH₂O；

该步骤包括：将各组分在37℃下孵育0.5-2小时，并在70-90℃下加热10-30分钟终止反应；接下来，将该溶液以12000-15000rpm离心10-30 分钟以分离ssDNA产物的上清液。

更具体地，步骤3)包括：

将各组分在37℃下孵育1小时，并在80℃下加热20分钟终止反应；接下来，将该溶液以14000rpm离心20分钟以分离ssDNA产物的上清液。

根据本发明，步骤(4)中指数扩增反应可包括A部分和B部分，立即混合后发生反应，也适用于不区分两个部分，将其包括的试剂混合后即发生反应，或经过适当调节发生扩增反应也可达到本发明的测试结果。具体地，步骤4)中，指数扩增反应体系包括A部分和B部分，A部分包括0.4-0.8μM 的模板DNA，0.6×缓冲液，0.1-0.3mM的dNTP，30-50nM ssDNA产物；B 部分包括1×ThermoPol缓冲液，0.1-0.2UμL^-1的Nt.BstNBI切口酶， 0.03-0.05UμL^-1的Vent(exo^-)DNA聚合酶，1-3mM的MgSO₄和ddH₂O；

该步骤包括：反应时，将A部分和B部分立即混合，并在50-60℃下孵育0.8-1.2小时，然后在70-90℃下加热10-30分钟以终止反应。

更具体地，步骤4)包括：

反应时，将体系A和B立即混合，并在55℃下孵育1小时，然后在80℃下加热20分钟以终止反应。

在上述的制备方法中，冷冻构建金纳米探针时，研究了金纳米粒子与 DNA的摩尔比。当DNA的比例较低时，金纳米粒子被冰晶挤压并聚集。当 DNA比率增加时，更多的DNA与冰晶“微囊”中的金纳米粒子反应形成金纳米探针。由于金纳米探针具有更大的空间体积和更稳定的电位，因此它们在融化后不会聚集，并且具有明显的紫外吸收峰。因此，选择金纳米粒子与DNA的摩尔比为1：200。

构建金纳米探针时，冻结时间是决定金纳米探针形成的另一个关键因素。金纳米探针形成的关键是冻融过程，延长冷冻时间不会促进DNA与金纳米粒子的附着。但是，由于冷冻效果(-20℃)与冰箱的性能，样品量或样品放置位置有关，因此选择60分钟的冷冻时间以确保样品完全冷冻。

本发明对相对DNA步行器过程中使用的切口酶Nb.BbvCI浓度进行了探究。荧光信号随着Nb.BbvCI切口酶浓度的增加而增加，直至浓度达到0.15 UμL^-1，因此选择0.15UμL^-1的切口酶Nb.BbvCI。

本发明对指数扩增反应过程中Vent(exo^-)DNA聚合酶浓度进行了探究。随着Vent(exo^-)DNA聚合酶浓度的增加，荧光强度逐渐增加，直至0.04U μL^-1。因此，本方法选择了0.04UμL^-1的Vent(exo^-)DNA聚合酶。

本发明中所述待测样品可以为奶制品、果汁或碳酸饮料制品。所述奶制品包括不限于纯牛奶、奶茶、酸奶，所述果汁包括但不限于浓缩果汁、鲜榨果汁。

本发明还提供一种基于冷冻构建金纳米探针的相对DNA步行器引发指数扩增检测蓖麻毒素的试剂盒，包括：

(1)DNA Walker-金纳米探针，序列为： 5'-SH-(A)₂₀(T)₁₅AACTATACAACCTCAGCATTAGTCAAGAGGTA-3'(SEQ ID NO：1)；

(2)DNA Track-金纳米探针，序列为：5'-SH-(A)₂₀(T)₁₅TACCTCTTGACTAATGCTGAGGTTGTATAGTT-3'(SEQ ID NO：2)；

(3)蓖麻毒素适配体，序列为：5'-ATAGGAGTCACGACGACCAGAACCGTAGGT TCGGGGTCGGAGTGGTCCGGAAGATGGCGTGGTATGTGCGTCTACCTCTTGACTAAT-3'(SEQ ID NO：3)；

(4)模板DNA，序列为：5'-AACTATACAACCTCAAACAGACTCAAACTATACAACCT CAA-3'(SEQ ID NO：4)；

(5)ssDNA，序列为5'-TGAGGTTGTATAGTT-3'(SEQ ID NO：5)；

(6)MB序列，序列为：5'-FAM-CTGGAGAACTATACAACCTCACTCCAG-BHQ1-3' (SEQ IDNO：6)；

(7)Nb.BbvCI切口酶；

(8)缓冲液。

本发明开发了一种基于相对DNA步行器触发的指数扩增方法。本发明的方法主要有4个过程：冷冻构建金纳米探针，蓖麻毒素和金纳米探针竞争结合适配体，相对DNA步行器和指数扩增反应。与以往的检测方法相比，优势在于：通过冷冻技术合成的金纳米探针具有操作简单，省时，稳定性好，杂交效率高的优点；新型相对DNA步行器反应实现了“识别-裂解-相对运动”的循环，反应效率高；指数扩增反应由相对DNA步行器的产物引发，并采用设计简单的分子信标直接对扩增产物进行荧光检测。通过选择具有强结合亲和力的适配体，可以在实际应用中以较高的灵敏度，良好的特异性和优异的稳定性检测蓖麻毒素。因此，该方法在生物传感器、食品安全检测和临床诊断领域具有广阔的前景。

本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。

图1为本发明对不同浓度蓖麻毒素的荧光响应，蓖麻毒素浓度分别为 10pM、100pM、1nM、10nM、50nM。

图2为本发明实施例中通过指数扩增反应后得到的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图3为本发明实施例中利用此方法检测系列浓度蓖麻毒素制得的标准曲线。

具体实施方式

下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。

以下实施例用于说明本发明的基于冷冻构建金纳米探针的相对DNA步行器引发的指数扩增方法检测蓖麻毒素。

DNA Walker序列为：5'-SH-(A)₂₀(T)₁₅AACTATACAACCTCAGCATTAGTCAAGA GGTA-3'(SEQ ID NO：1)；

DNA Track序列为：5'-SH-(A)₂₀(T)₁₅TACCTCTTGACTAATGCTGAGGTTGTAT AGTT-3'(SEQ ID NO：2)

蓖麻毒素适配体序列为：5'-ATAGGAGTCACGACGACCAGAACCGTAGGTTCGGGG TCGGAGTGGTCCGGAAGATGGCGTGGTATGTGCGTCTACCTCTTGACTAAT-3'(SEQ ID NO： 3)

模板DNA序列为：5'-AACTATACAACCTCAAACAGACTCAAACTATACAACCTC AA-3'(SEQ IDNO：4)

ssDNA序列为5'-TGAGGTTGTATAGTT-3'(SEQ ID NO：5)；

MB序列为：5'-FAM-CTGGAGAACTATACAACCTCACTCCAG-BHQ1-3'(SEQ ID NO：6)

实施例1

(1)冷冻构建金纳米探针。采用柠檬酸钠还原法制备15nm左右的金纳米颗粒。与此同时，将巯基(SH)和PolyA双标记的DNA与三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐(TCEP)以1：100的摩尔比在室温下孵育1小时。接下来，将制备的金纳米颗粒(4nM)与DNA(10μM)在-20℃下以1：200的摩尔比混合孵育1小时。室温解冻后，将溶液用HEPES缓冲液(0.05M，pH 7.6) 于4℃以14000rpm离心20分钟并洗涤3次。最后将沉淀重悬于HEPES缓冲液中，并在黑暗中于4℃保存。通过此方法可以分别合成AW(DNA Walker- 金纳米探针)和AT(DNA Track-金纳米探针)。

(2)蓖麻毒素的竞争反应。反应前将1μM的蓖麻毒素适配体在95℃下孵育5分钟，然后逐渐冷却至室温。接下来，将0.8nM AW，0.2μM的适配体和饮用水样品混合并在37℃下孵育1h。反应结束后14000rpm离心20分钟，用PBS洗涤溶液。重悬沉淀并命名它为AW'。

(3)相对DNA步行器过程。相对DNA步行由AW'和AT组成，包括：上述沉淀AW'，2nM的AT，0.15UμL^-1的Nb.BbvCI切口酶，1×CutSmart 缓冲液和ddH₂O，在37℃下孵育1小时，并在80℃下加热20分钟终止反应。接下来，将该溶液以14000rpm离心20分钟以分离ssDNA产物的上清液。

(4)指数扩增反应。指数扩增反应包括A和B部分：A部分由0.6μM 的模板DNA，0.6×缓冲液3.1，0.2mM的dNTP，40nM ssDNA产物组成；B 部分由1×ThermoPol缓冲液，0.15UμL^-1的Nt.BstNBI切口酶，0.04UμL^-1的Vent(exo^-)DNA聚合酶，2mM的MgSO₄和ddH₂O组成。总体积为50μL。反应时，将体系A和B立即混合，并在55℃下孵育1小时，然后在80℃下加热20分钟以终止反应。

(5)荧光强度测定。在反应前，将0.67μM的MB在95℃下孵育5分钟，然后在PBS中逐渐冷却至室温。接下来，将MB溶液(150μL)与扩增产物(50μL)混合，并在室温下孵育1小时。反应完毕后，使用荧光分光光度计测量荧光强度。通过荧光强度的不同响应，可以得到本方法测定饮用水中蓖麻毒素的标准曲线。图1为对不同浓度蓖麻毒素的荧光响应。图2为通过指数扩增反应后得到的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图3为检测系列浓度蓖麻毒素制得的标准曲线。

表1蓖麻毒素检测方法在饮用水中的应用

实施例2

(2)蓖麻毒素的竞争反应。反应前将1μM的蓖麻毒素适配体在95℃下孵育5分钟，然后逐渐冷却至室温。将2mL牛奶/果汁样品在12000rpm 下离心10分钟，取上清用0.1M的NaOH将果汁的pH值调节至7.0。接下来，将0.8nM AW，0.2μM的适配体和处理后的牛奶/果汁样品混合并在 37℃下孵育1h。反应结束后14000rpm离心20分钟，用PBS洗涤溶液。重悬沉淀并命名它为AW'。

(5)荧光强度测定。在反应前，将0.67μM的MB在95℃下孵育5分钟，然后在PBS中逐渐冷却至室温。接下来，将MB溶液(150μL)与扩增产物(50μL)混合，并在室温下孵育1小时。反应完毕后，使用荧光分光光度计测量荧光强度。通过荧光强度的不同响应，可以得到本方法测定牛奶/果汁中蓖麻毒素的标准曲线。

表2蓖麻毒素检测方法在牛奶/果汁中的应用

以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

序列表

<110> 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所

<120> 基于冷冻构建金纳米探针的相对DNA步行器引发指数扩增检测蓖麻毒素的方法及试剂盒

<130> BJI2100670PY

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa tttttttttt tttttaacta tacaacctca gcattagtca 60

agaggta 67

<210> 2

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa tttttttttt ttttttacct cttgactaat gctgaggttg 60

tatagtt 67

<210> 3

<211> 87

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ataggagtca cgacgaccag aaccgtaggt tcggggtcgg agtggtccgg aagatggcgt 60

ggtatgtgcg tctacctctt gactaat 87

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aactatacaa cctcaaacag actcaaacta tacaacctca a 41

<210> 5

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgaggttgta tagtt 15

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctggagaact atacaacctc actccag 27

Claims

1.一种非诊断的基于冷冻构建金纳米探针的相对DNA步行器引发指数扩增检测蓖麻毒素的方法，包括以下步骤：

所述AW为DNA Walker-金纳米探针，DNA Walker序列为：5'-SH-(A)₂₀(T)₁₅AACTATACAACCTCAGCATTAGTCAAGAGGTA-3'（SEQ ID NO：1）；

所述AT为DNA Track-金纳米探针，DNA Track序列为：5'-SH-(A)₂₀(T)₁₅TACCTCTTGACTAATGCTGAGGTTGTATAGTT-3'（SEQ ID NO：2）；

2)蓖麻毒素的竞争反应：反应前将蓖麻毒素适配体在高温孵育，然后逐渐冷却至室温，再将AW、适配体和含蓖麻毒素的待测样品混合并孵育；反应结束后离心用PBS洗涤溶液；重悬沉淀，得到AW'；

所述蓖麻毒素适配体的序列为：5'-ATAGGAGTCACGACGACCAGAACCGTAGGT TCGGGGTCGGAGTGGTCCGGAAGATGGCGTGGTATGTGCGTCTACCTCTTGACTAAT-3'（SEQ ID NO：3）；

4)指数扩增反应：指数扩增反应体系包括：模板DNA、缓冲液、dNTP，ssDNA产物、ThermoPol缓冲液、Nt.BstNBI切口酶，Vent（exo^-）DNA聚合酶，MgSO₄和水；

所述模板DNA的序列为：5'-AACTATACAACCTCAAACAGACTCAAACTATACAACC TCAA-3'（SEQID NO：4）；

所述ssDNA产物的序列为5'-TGAGGTTGTATAGTT-3'（SEQ ID NO：5）;

所述MB的序列为：5'-FAM-CTGGAGAACTATACAACCTCACTCCAG-BHQ1-3'（SEQ ID NO：6）。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，还包括制作蓖麻毒素标准曲线的步骤，根据步骤1)-5)测试不同浓度蓖麻毒素，通过荧光强度对不同浓度蓖麻毒素的响应，得到测定蓖麻毒素的标准曲线。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，还包括实际样品预处理步骤：将实际样品在12000-13000 rpm下离心5-15分钟，取上清并将其pH值调节至7.0。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，步骤1）包括：

采用柠檬酸钠还原法制备15nm左右的金纳米颗粒；将巯基和PolyA双标记的DNA与三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐（TCEP）以1：80-120的摩尔比在室温下孵育0.5-2小时；然后将2-5nM制备的金纳米颗粒与8-12μM DNA在-15℃至-25℃下以1：200的摩尔比混合孵育30-150min；室温解冻后，将溶液用0.04-0.06 M，pH 7.5-7.8的HEPES缓冲液于4℃以12000-15000 rpm离心并洗涤；最后将沉淀重悬于HEPES缓冲液中，并在黑暗中于4℃保存。

5.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，步骤2）包括：

反应前将0.8-1.2 μM的蓖麻毒素适配体在90-95℃下孵育4-6分钟，然后逐渐冷却至室温；接下来，将0.6-1.0 nM AW，0.1-0.3 μM的适配体和含蓖麻毒素的待测样品混合并在37℃下孵育0.8-1.2 h；反应结束后12000-15000 rpm离心10-30分钟，用PBS洗涤溶液，重悬沉淀，得到AW'。

6.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，步骤3）中，

相对DNA步行包括：AW'，1-3 nM的AT，0.1-0.2 U μL^-1的Nb.BbvCI切口酶，1×CutSmart缓冲液和ddH₂O；

该步骤包括：将各组分在37℃下孵育0.5-2小时，并在70-90℃下加热10-30分钟终止反应；接下来，将该溶液以12000-15000 rpm离心10-30分钟以分离ssDNA产物的上清液。

7.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，步骤4）中，指数扩增反应体系包括A部分和B部分，A部分包括0.4-0.8μM的模板DNA，0.6×缓冲液，0.1-0.3 mM的dNTP，30-50 nMssDNA产物；B部分包括1×ThermoPol缓冲液，0.1-0.2 U μL^-1的Nt.BstNBI切口酶，0.03-0.05 U μL^-1的Vent（exo^-）DNA聚合酶，1-3 mM的MgSO₄和ddH₂O；

8.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，所述待测样品为奶制品、果汁或碳酸饮料制品。

9.一种基于冷冻构建金纳米探针的相对DNA步行器引发指数扩增检测蓖麻毒素的试剂盒，包括：

（1）DNA Walker-金纳米探针，序列为：5'-SH-(A)₂₀(T)₁₅AACTATACAACCTCAGCATTAGTCAAGAGGTA-3'（SEQ ID NO：1）；

（2）DNA Track-金纳米探针，序列为：5'-SH-(A)₂₀(T)₁₅TACCTCTTGACTAATGCTGAGGTTGTATAGTT-3'（SEQ ID NO：2）；

（3）蓖麻毒素适配体，序列为：5'-ATAGGAGTCACGACGACCAGAACCGTAGGTTCGGGGTCGGAGTGGTCCGGAAGATGGCGTGG TATGTGCGTCTACCTCTTGACTAAT-3'（SEQ ID NO：3）；

（4）模板DNA，序列为：5'-AACTATACAACCTCAAACAGACTCAAACTATACAACCT CAA-3'（SEQ IDNO：4）；

（5）ssDNA，序列为5'-TGAGGTTGTATAGTT-3'（SEQ ID NO：5）;

（6）MB序列，序列为：5'-FAM-CTGGAGAACTATACAACCTCACTCCAG-BHQ1-3'（SEQ ID NO：6）；

（7）Nb.BbvCI切口酶；

（8）缓冲液。