CN114621999A

CN114621999A - 一种用于检测羊乳掺假的CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器及其检测羊乳掺假的方法和应用

Info

Publication number: CN114621999A
Application number: CN202210301504.1A
Authority: CN
Inventors: 李国梁; 潘瑞媛; 刘江花; 王盼雪; 苏卓群
Original assignee: Shaanxi University of Science and Technology
Current assignee: Shaanxi University of Science and Technology
Priority date: 2022-03-25
Filing date: 2022-03-25
Publication date: 2022-06-14
Anticipated expiration: 2042-03-25

Abstract

本发明公开了一种用于检测羊乳掺假的CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器及其检测羊乳掺假的方法和应用，属于分析化学和食品安全领域。该拉曼传感器包括单链DNA‑普鲁士蓝纳米颗粒探针、由CRISPR/Cas12a蛋白、crRNA、缓冲液以及提取扩增后的羊乳样品DNA构成的Cas12a酶切反应体系、含氢氧根的溶液以及作为拉曼增强基底的金核银壳纳米颗粒溶液。将该拉曼传感器应用于羊乳中掺假成分为牛乳的检测中，目标DNA含量可以经拉曼光谱仪检测转化为超灵敏、抗干扰的拉曼信号。该拉曼传感器及其方法对目标DNA的检出限可达到aM级别，目标DNA的设计选取灵活，以牛线粒体cytb基因为目标DNA，能够应用于羊乳中的掺假成分为牛乳的检测中，具有快速、灵敏、准确以及背景干扰低等优点。

Description

一种用于检测羊乳掺假的CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器及其检测羊乳掺假的方法和应用

技术领域

本发明属于分析化学和食品安全技术领域，具体涉及一种用于检测羊乳掺假的CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器及其检测羊乳掺假的方法和应用。

背景技术

乳品因其所含的丰富的营养物质，在各个年龄段的消费人群中都备受欢迎，在食品中占据重要地位。随着人们生活水平的提高，对营养更全面、更易吸收的高值乳品的需求量也在不断提升，在经济利益的驱使下，某些供应商在乳品中掺入便宜且不易分辨的原料。最常见的形式就是在高值羊乳中掺入牛乳。乳品掺假行为不仅损害了消费者经济利益、危害市场生产秩序，掺入的成分也存在诸如过敏等安全隐患。乳品真实性鉴别对保证食品质量安全具有重要意义。目前在乳品真实性鉴别主要有分析蛋白质、代谢物和核酸等方法。其中，基于蛋白质检测方法(如HPLC-MS)存在包括待测物的热稳定性差、仪器价格高、操作过程繁杂等不足；而基于代谢物的检测方法(如电子舌、红外)存在重复性低、准确性和灵敏度较差等不足。基于核酸的检测技术因核酸在加工过程中的稳定性、高特异性等优势已经广泛应用于乳品掺假的验证和证明，随着研究的深入与技术的更迭，检测技术与方法也在不断发展进步，但是行业仍急切需求高效灵敏且可实现现场检测的乳品真实性检测方法。

令人瞩目的是，在拉曼检测的基础上发展起来的表面增强拉曼散射技术近年来以特异性高、灵敏准确、设备小巧、操作方便等优点而备受好评，其已应用于医疗、环境监测、食品安全等各个领域。此外，表面增强拉曼散射技术已被应用于食品真实性分析，主要用其分析某类产品中的特殊小分子物质(如食用油中的脂肪酸、蜂蜜中的果糖)。而DNA因其官能团众多、结构复杂，强烈的生物背景干扰成为限制该技术在食品真实性分析中最大程度开发利用的主要原因。

普鲁士蓝纳米颗粒具有形状规则、易修饰、合成步骤简单等优点，而且具有良好的靶响应功能：在碱性条件下，普鲁士蓝纳米颗粒会与氢氧根反应，释放出大量的Fe(CN)₆ ^4-离子。其所含的特殊的C≡N结构可呈现出位于“拉曼生物沉默区”(1800cm^-1～2800cm^-1)区间的独特的拉曼峰特征。当碱处理后的溶液与SERS基底贵金属纳米颗粒混合并接受特定波长的拉曼光扫描后，高强度、高特异性、低生物背景干扰的拉曼峰就可以轻易获得。

生物传感器因其出色的生物相容性，识别特异性以及设计灵活性等优势，在疾病诊疗、食品安全以及环境监测等各个领域的应用中备受关注与青睐。表面增强拉曼检测技术更是因其可达单分子检测的准确程度，以及其操作简单、仪器便携等优点在食品安全，环境监测等领域均有应用。拉曼生物传感器巧妙地搭建起一个信号转化平台，通过生物自身的特异识别结合性质，将目标核酸浓度等生物信号转化为拉曼光谱信号。

CRISPR/Cas(成簇规律间隔短回文体重复序列相关系统)是一种发现于细菌和古细菌中用来对抗病毒病原体的适应性免疫系统，该系统可以通过DNA互补配对原则靶向识别切割DNA序列。随着研究的深入，CRISPR/Cas12a，一种由单链引导CRISPR RNA(crRNA)引导的V-A型CRISPR相关酶，在开发新型核酸检测生物传感器方面表现出巨大的潜力。其不仅具有对目标DNA的精确识别与顺式切割功能，而且具有对单链非目标DNA的高效、无差别的反式切割。为了刺激CRISPR/Cas12a效应器的反式切割活性，激活物的靶DNA必须具有与crRNA互补的序列以及其附近的原间隔基序(PAM)位点。目前已有一批研究者成功建立了通过荧光、颜色、电化学等信号来表示核酸含量的CRISPR/Cas12a介导的生物传感器，但是通过CRISPR/Cas12a介导的拉曼生物传感器来检测羊乳掺假还未见报道。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种用于检测羊乳掺假的CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器及其检测羊乳掺假的方法和应用，克服现有检测方法灵敏度不高、操作过程繁杂且较难实现现场检测的问题。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了一种用于检测羊乳掺假的CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器，包括单链DNA-普鲁士蓝纳米颗粒探针、Cas12a酶切反应体系、含氢氧根的溶液以及作为拉曼增强基底的金核银壳纳米颗粒溶液；

其中，所述单链DNA-普鲁士蓝纳米颗粒探针中，单链DNA的5’端修饰生物素，3’端修饰氨基，单链DNA的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；所述Cas12a酶切反应体系由CRISPR/Cas12a蛋白、crRNA、缓冲液以及提取扩增后的羊乳样品DNA构成，其中，crRNA的识别序列与牛线粒体基因cytb上的片段互补，牛线粒体基因cytb上的片段的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.9所示。

优选地，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.8所示。

优选地，所述扩增为环介导等温扩增，扩增所用引物包括牛-FIP引物、牛-BIP引物、牛-F3引物和牛-B3引物；

其中，所述牛-FIP引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示，牛-BIP引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，牛-F3引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，牛-B3引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。

进一步优选地，所用引物还包括牛-LF引物和牛-LB引物；

其中，所述牛-LF引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示，牛-LB引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.7所示。

优选地，缓冲液为10×NEBuffer 2.1。

本发明还公开了上述用于检测羊乳掺假的CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器检测羊乳掺假的方法，按照以下步骤进行：

1)以普鲁士蓝纳米颗粒和单链DNA为原料制备单链DNA-普鲁士蓝纳米颗粒探针并固定；

2)将Cas12a酶切反应体系加入至步骤1)中进行剪切反应，弃上清液，洗涤，加NaOH溶液处理，制得碱处理溶液；

3)将步骤2)制得的碱处理溶液与金核银壳纳米颗粒溶液混合，搅拌，滴在玻片上，拉曼光谱仪扫描，以空白组和实验组在拉曼位移为2083cm^-1处的峰值差为信号建立标准曲线，根据标准曲线测定含未知浓度牛乳的羊乳样品中目标DNA含量。

优选地，步骤1)中，固定的具体步骤为：用链霉亲和素包被96孔板，通过生物素链霉亲和素的亲和在96孔板上固定单链DNA-普鲁士蓝纳米颗粒探针，再用BSA进行封闭处理。

优选地，步骤2)中，所述剪切反应的条件为在37℃条件下孵育30～80分钟。

进一步优选地，孵育时间应为70分钟。

优选地，步骤2)中，NaOH溶液处理的条件为在30～60℃孵育10～40分钟。

进一步优选地，NaOH溶液处理的条件为在44℃孵育22分钟。

优选地，步骤3)中，所述碱处理溶液与金核银壳纳米颗粒溶液的体积比为1：10。

优选地，步骤3)中，拉曼光谱仪扫描条件为：激光波长785nm，激光能量10mW，扫描时间为20秒，积分次数1次。

本发明还公开了上述用于检测羊乳掺假的CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器在检测羊乳的掺假成分为牛乳中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供的一种用于检测羊乳掺假的CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器，将表面增强拉曼技术与基于CRISPR系统的生物传感平台相结合，检测体系中的CRISPR/Cas12a酶切系统能高效切割底物探针的DNA链部分，形成孔板内普鲁士蓝纳米颗粒的数量差，经含氢氧根的溶液处理后产生大量亚铁氰根离子(Fe(CN)₆ ^4-)，通过亚铁氰根离子在“拉曼生物沉默区”内呈现单一、高特异性、易分辨的特征拉曼峰，与拉曼增强基底混合产生SERS信号，从而应用该拉曼传感器实现对目标DNA的灵敏检测，特别是在羊乳掺假检测中的应用。

进一步地，除必须的FIP、BIP、F3、B3四条LAMP引物外，添加的两条环引物LF和LB，能够使扩增效率显著提高。

本发明提供的上述拉曼传感器检测羊乳掺假的方法，利用该拉曼传感器可以实现羊乳中牛乳成分的灵敏、快速检测。该方法操作简单、可重复性强、检测灵敏度高、检测仪器便携、背景干扰低、对羊乳中牛乳成分具有出色的特异性，具有现场检测的潜力。该方法对目标DNA的检出限可达到aM级别，目标DNA的设计选取灵活，以牛的线粒体cytb基因为目标DNA，能够为羊乳掺假现场检测提供一条全新思路。

附图说明

图1为本发明的CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器检测原理图；

图2为本发明的CRISPR/Cas12a酶切处理时间对传感器性能的影响图；其中，ΔI为空白组与实验组的拉曼峰强度差值；

图3为本发明的碱液处理温度与时间对传感器性能的影响图；

图4为本发明的碱处理溶液与金核银壳纳米颗粒溶液混合比例对传感器性能的影响图；

图5为本发明的拉曼传感器检测不同浓度目标核酸的拉曼光谱图；

图6为本发明的拉曼传感器的标准曲线图；其中，ΔI为空白组与实验组的拉曼峰强度差值；

图7为本发明的牛、山羊、绵羊和骆驼基因经环介导等温扩增后的电泳图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下面结合附图1-7对本发明做进一步详细描述：

一、CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器的构建

实验材料与仪器：

(1)主要试剂与材料：

磁珠法血液基因组DNA提取试剂盒(购买自北京天根生物科技科技有限公司)；

氯金酸、三水合柠檬酸钠、硝酸银、Tween-20、抗坏血酸、三氯化铁、亚铁氰化钾、链霉亲和素、牛血清白蛋白(BSA)、n-羟基磺基琥珀酰亚胺钠盐(sulfo-NHS)以及1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)(均购买自西格玛奥德里奇贸易有限公司)；

CRISPR/Cas12a蛋白(购买自科昕生物科技有限公司)；

10×NEBuffer 2.1、Bst 3.0DNA聚合酶、甜菜碱、10×等温反应缓冲液以及脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)混合物(均购买自纽英伦生物技术有限公司)；

LAMP引物(牛-FIP、牛-BIP、牛-F3、牛-B3、牛-LF和牛-LB)均由上海生工生物工程有限公司合成。

(2)主要仪器：96孔板、i-Raman Plus便携式拉曼光谱仪(BWS475-L001，必达泰克光电设备有限公司)。

(3)缓冲液及其他溶液：

a.碳酸盐缓冲液(pH值9.6)：称取2.93g NaHCO₃，1.59g Na₂CO₃，去离子水定容至1L；

b.PB缓冲液(pH值7.4)：称取2.84g Na₂HPO₄，2.40g NaH₂PO₄，去离子水定容至1L；

c.PBS缓冲液(pH值7.4)：称取2.15g KH₂PO₄·7H₂O，0.2g KCl，8.00g NaCl，2.88gNa₂HPO₄·2H₂O，去离子水定容至1L；

d.洗涤液(PBST，pH值7.4)：称取2.15g KH₂PO₄·7H₂O，0.2g KCl，8.00gNaCl，2.88gNa₂HPO₄·2H₂O，5.0g Tween-20，去离子水定容至1L；

e.封闭液(2％BSA)：2g PBS溶于100mL PBS缓冲液。

如图1，本发明提供的一种CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器检测羊乳掺假的方法：首先设计了生物素和氨基双端标记的单链DNA，通过生物素与链霉亲和素的特异性亲和，将普鲁士蓝纳米颗粒-单链DNA底物探针固定在96孔板上。随着目标DNA的加入，CRISPR/Cas12a系统被激活，其对底物探针中的单链DNA进行高效地反式剪切，使相应数量的普鲁士蓝纳米颗粒悬浮在溶液中。弃去上清后，氢氧化钠处理孔板，剩余的普鲁士蓝纳米颗粒结构被破坏，释放出大量的亚铁氰根离子(Fe(CN)₆ ^4-)，这些阴离子可在“拉曼生物沉默区”内呈现单一、高特异性、易分辨的特征拉曼峰。最终，孔板中经碱处理的溶液与拉曼增强基底金核银壳纳米颗粒混合后，Fe(CN)₆ ^4-的量可转化为具有超低背景噪声的独特且强的表面增强拉曼信号，实现DNA痕量鉴定。

具体检测方法如下：

1.覆盖有单链DNA-普鲁士蓝纳米颗粒探针的96孔板的制备

第一步：单链DNA-普鲁士蓝纳米颗粒探针的制备

将1.0mg的普鲁士蓝纳米颗粒在超声条件下分散于4.0mL PB缓冲液(pH值7.4)中，然后用0.2M的HCl滴定，调节混合溶液pH值至5.0后，向其中加入4.0mg EDC和8.0mg sulfo-NHS，室温振摇2h。随后，加入300μL单链DNA(1μM)混匀后在室温振摇3h，所得混合液在4℃环境下反应一夜。最后用0.2M NaOH溶液滴定调节溶液pH值至7.0，30min后以9500rpm离心10min，所得沉淀重悬于pH值7.4的PB缓冲液中，制得单链DNA-普鲁士蓝纳米颗粒探针。重复离心洗涤3次后，再将沉淀分散于600μL磷酸盐缓冲液中，保存在4℃下直至使用。

其中，单链DNA为5’端修饰生物素，3’端修饰氨基的单链DNA，交由上海生工生物工程有限公司合成该双端修饰的单链DNA；

其中，所述普鲁士蓝纳米颗粒可直接购买或制备得到，采用一步法在水溶液中制备普鲁士蓝纳米颗粒的具体过程为：在60℃中速搅拌下，先向20mL 1.0mM的FeCl₃水溶液中加入0.5mmol柠檬酸(C₆H₈O₇),再在60℃中速搅拌的条件下，将上述溶液加入含0.5mmol柠檬酸的20mL 1.0mM的K₄[Fe(CN)₆]溶液中，持续搅拌1min，冷却至室温后继续搅拌5min，然后将蓝色的普鲁士蓝纳米颗粒胶体以9500rpm离心20min，生成的沉淀用丙酮和超纯水等体积洗涤数次。所得沉淀在50℃烘箱中干燥一夜，即可得到普鲁士蓝纳米颗粒。

第二步：单链DNA-普鲁士蓝纳米颗粒探针在96孔板上的固定

先进行链霉亲和素包被96孔板，将链霉亲和素溶于碳酸盐缓冲液(pH值9.6)中，配为链霉亲和素浓度为10μg/mL的溶液，将其加入96孔板，每孔100μL，使用保鲜膜密封在4℃条件下过夜；包被结束后，用洗涤液(PBST，pH值7.4)洗涤3次，每次3min，此操作是为了固定链霉亲和素；接着进行封闭处理，BSA溶于PBS缓冲液中，配为BSA浓度为20mg/ml的封闭液，每孔100μL加入96孔板，37℃温育1h，倾倒后用洗涤液洗涤3次，此操作为阻断96孔板剩余结合位点，防止非特异性吸附，避免假阳性结果。最后，用100μL 1μM单链DNA-普鲁士蓝纳米颗粒探针在37℃下孵育1h，洗涤3次，此操作是为了固定探针。

2.CRISPR/Cas12a对单链DNA-普鲁士蓝纳米颗粒探针的剪切

第三步：DNA的提取与扩增

参照磁珠法血液基因组DNA提取试剂盒提取待测羊乳样品的DNA；提取产物用B-500BIOPHOTOMETER(上海元析仪器公司)进行核酸定量后，统一稀释至10nM后进行LAMP(环介导等温扩增反应)；

其中，环介导等温扩增的引物(6条引物)参考行业标准SN/T 4419.21-2016选取，核苷酸序列如表1所示，扩增体系见表2：

表1:核苷酸序列

表2:环介导等温扩增体系

第四步：crRNA序列的设计

选定的牛线粒体基因cytb上的片段为目标DNA，crRNA与选定的牛线粒体基因cytb上的片段(核苷酸序列如SEQ.ID.NO.9所示)互补，将选定的牛线粒体基因cytb上的片段的核苷酸序列输入http://crispor.tefor.net/网站，筛选剪切效率分数最高的片段，根据此片段结合crRNA的骨架序列得到最终完整的crRNA序列，所得crRNA(由金斯瑞生物科技有限公司合成)序列如SEQ.ID.NO.8所示。

第五步：CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器的构建

酶切反应：将40μL Cas12a酶切反应体系(0.5μL 8μM CRISPR/Cas12a蛋白、0.5μL10μM crRNA、4μL 10×NEBuffer 2.1、29μL超纯水以及6μL提取扩增后的羊乳样品的DNA)加入覆盖有单链DNA-普鲁士蓝纳米颗粒探针的96孔板中，37℃孵育30～80分钟，弃去上清液，用PBS缓冲液洗涤3次；

碱处理：向上述96孔板的各孔加入100μL 1M的NaOH溶液，在30～60℃条件下孵育10～40分钟，产生大量亚铁氰根离子(Fe(CN)₆ ^4-)，制得碱处理溶液。

3.拉曼检测

将上述制得的碱处理溶液与金核银壳纳米颗粒溶液以体积比为1：10混合，轻轻搅拌2分钟后，将8μL的混合溶液小心地滴在锡纸包裹的玻片上，用波长为785nm的便携式拉曼光谱仪进行拉曼扫描，扫描条件为：激光功率为10mW，采集时间20s，积分次数1次；

其中，金核银壳纳米颗粒溶液的制备方法为：将0.75mL 1％的三水合柠檬酸钠溶液加入50mL沸腾的0.25mM氯金酸溶液中，加热条件下剧烈搅拌10分钟后冷却至室温，即得到酒红色金种子溶液。中速搅拌下向20mL金种子液中加入3mL 0.1M的抗坏血酸，再逐滴加入5mM AgNO₃溶液(每30秒一滴)至溶液颜色为橙黄色，再保持搅拌30min后，即可得到金核银壳纳米颗粒溶液，于4℃保存。

1)建立检测拉曼传感器的标准曲线

按照上述方法测定含不同浓度牛乳的羊乳样品DNA的实验组(以牛乳DNA浓度10nM对应牛乳含量为100％)和空白组(即6μL超纯水代替酶切体系中的目标DNA)在特征峰(拉曼位移2083cm^-1)处的信号强度，得到空白组与实验组的拉曼峰强度差值(ΔI)，以该拉曼峰强度差值(ΔI)为纵坐标，Log(目标DNA浓度)为横坐标建立标准曲线；

2)计算羊乳中掺杂牛乳的含量

根据建立的标准曲线测定含未知浓度牛乳的羊乳样品中目标DNA含量(多次测定只需建立一次拉曼传感器的标准曲线)。

羊乳样品中掺杂牛乳含量的具体计算方法为：将空白组与待测羊乳样品DNA在特征峰(拉曼位移2083cm^-1)处的ΔI值带入标准曲线中得出对应目标DNA浓度值，对应目标DNA浓度值在总的目标DNA浓度值(即纯牛乳DNA的浓度值)的占比即为羊乳中掺杂牛乳的含量。

上述步骤，即构建完成一种CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器检测羊乳掺假的体系。

为了提高此拉曼传感器的检测性能，本发明还研究了CRISPR/Cas12a剪切孵育时间、碱液处理温度与时间、基底与碱处理液的混合比例对其性能的影响。如图2至图4所示。其中，图2表明当酶切体系孵育时间达到70min时信号趋于稳定，因此最佳孵育时间应设定为70min；图3表明基于响应面分析，最佳催化反应温度设定为44℃，时间设为22min时，传感器的检测灵敏性最高；图4表明当每10μL碱处理液与100μL金核银壳纳米颗粒溶液混合后，即混合比例为1：10时，传感器的检测灵敏性最高。

2.评估CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器的检测性能

为了进一步说明上述CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器的检测性能，本发明做了以下评估：在上述最优条件下分别把6μL 10^-7、10^-6、10^-5、10^-4、10^-3、10^-2、10^-1、10⁰、10¹nM的提取到的目标DNA经LAMP扩增后加入到含有0.5μL8μM CRISPR/Cas12a蛋白、0.5μL 10μMcrRNA、4μL 10×NEBuffer 2.1以及29μL超纯水的单链DNA-普鲁士蓝纳米颗粒探针包被的96孔板中，37℃孵育70min，弃去上清液，用PBS缓冲液洗涤3次。之后向各孔加入100μL 1M的NaOH溶液44℃孵育22分钟。碱处理溶液与金核银壳纳米颗粒溶液混合，轻轻搅拌2分钟后，将8μL的混合溶液小心地滴在锡纸包裹的玻片上，用配有785nm激光的便携式拉曼光谱仪扫描记录位移2083cm^-1处的拉曼强度。

(1)可行性验证

图5为牛特异性核酸浓度在10^-6～10¹nM测量的拉曼光谱图，图6是根据测定结果建立的拉曼传感器的标准曲线，当目标牛特异性核酸浓度在10^-6～10¹nM之间时，在拉曼特征峰所在位移处(2083cm^-1)信号强度随着目标核酸浓度的增加而减少，即空白组与实验组的拉曼峰强度差值(ΔI)随着目标核酸浓度的增加而增加，目标核酸浓度与(ΔI)吸光值具有良好的线性关系，标准曲线方程为：△I＝2373.2lgCtarget DNA+17970,相关系数R²＝0.996，检测限为2.24×10^-7nM。

(2)特异性验证

特异性是免疫传感器的一项重要性能，为了验证方法对牛基因的特异性，选择了山羊、绵羊、骆驼基因对其进行环介导等温扩增，图7结果表明只有牛基因组扩增成功，因此，本发明提供的方法具有良好的特异性。

实施例1

用构建的上述CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器检测纯羊乳样品，具体操作如下：

第一步：单链DNA-普鲁士蓝纳米颗粒探针的制备

制备方法同上述CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器的构建方法第一步。

第二步：单链DNA-普鲁士蓝纳米颗粒探针在96孔板上的固定

制备方法同上述CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器的构建方法第二步。

第三步：DNA的提取与扩增

(1)纯羊乳样品DNA的提取参照磁珠法血液基因组DNA提取试剂盒进行；

(2)提取出的DNA用B-500BIOPHOTOMETER(上海元析仪器公司)进行核酸定量后，统一稀释至10nM后进行LAMP(环介导等温扩增反应)，其中，环介导等温扩增的引物核苷酸序列如表1所示，扩增体系见表2。

第四步：crRNA序列的设计

制备方法同上述CRISPR/Cas12a对单链DNA-普鲁士蓝纳米颗粒探针的剪切方法第四步。

第五步：CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器的构建

酶切反应：将40μL Cas12a酶切反应体系(0.5μL 8μM CRISPR/Cas12a蛋白、0.5μL10μM crRNA、4μL 10×NEBuffer 2.1、29μL超纯水以及6μL提取扩增后的样品DNA)加入覆盖有单链DNA-普鲁士蓝纳米颗粒探针的96孔板中，37℃孵育70min后，弃去上清液，用PBS缓冲液洗涤3次。(注：空白组即用6μL超纯水代替提取扩增后的样品DNA。)

碱处理：向上述96孔板的各孔中加入100μL 1M的NaOH溶液，在44℃条件下孵育22min，制得碱处理溶液。

拉曼检测：10μL碱处理溶液与100μL金核银壳纳米颗粒溶液进行混合，轻轻搅拌2分钟后，将8μL的混合溶液小心地滴在锡纸包裹的玻片上，用波长为785nm的便携式拉曼光谱仪进行拉曼扫描，扫描条件为：激光功率为10mW，采集时间20s，积分次数1次。

1)建立检测拉曼传感器的标准曲线

把6μL 10^-6、10^-5、10^-4、10^-3、10^-2、10^-1、10⁰、10¹nM的提取到的目标DNA按照上述“CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器的构建”方法测定拉曼位移2083cm^-1处的信号强度，以该拉曼峰强度差值(ΔI)为纵坐标，Log(目标DNA浓度)为横坐标建立标准曲线，得到图6所示标准曲线。

2)计算羊乳中掺杂牛乳的含量

根据图6建立的标准曲线对实验组纯羊乳用该方法进行检测，对空白组，记录其在2083cm^-1位移处输出的拉曼强度，平行测定六次，计算得到平均值与误差棒。

所得拉曼信号值均在空白组信号的误差范围内，证实其中不含牛乳成分，且提取后的纯羊乳基因经环介导等温扩增后未形成明显LAMP条带，进一步证实了其准确性。

实施例2

用构建的上述CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器检测市售羊乳是否掺假，具体操作如下：

第一步：单链DNA-普鲁士蓝纳米颗粒探针的制备

第二步：单链DNA-普鲁士蓝纳米颗粒探针在96孔板上的固定

第三步：DNA的提取与扩增

(1)除市售羊乳样品外，还制备了向该样品中人为掺加5％牛乳的回收样品；

(2)市售羊乳样品DNA以及市售羊乳中人为掺加5％牛乳的回收样品DNA的提取参照磁珠法血液基因组DNA提取试剂盒进行；

(3)提取出的DNA用B-500BIOPHOTOMETER(上海元析仪器公司)进行核酸定量后，统一稀释至10nM后进行LAMP(环介导等温扩增反应)，其中，环介导等温扩增的引物核苷酸序列如表1所示，扩增体系见表2。

第四步：crRNA序列的设计

第五步：CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器的构建

拉曼检测：碱处理溶液与金核银壳纳米颗粒溶液混合，轻轻搅拌2分钟后，将8μL的混合溶液小心地滴在锡纸包裹的玻片上，用波长为785nm的便携式拉曼光谱仪进行拉曼扫描，计算ΔI值。注：对空白组，记录其在2083cm^-1位移处输出的拉曼强度，平行测定六次，计算得到平均值与误差棒。

对实验组市售羊乳以及掺入5％牛乳的市售羊乳样品用该方法进行检测，将所得ΔI代入实施例1所得图6的标准曲线后，测得市售羊乳中牛乳含量为7.29％，与该样品成分表所述相符(羊乳、炼乳)；5％牛乳的市售羊乳样品中牛乳含量为12.37％，其检测掺入量与实际掺入量的比值为101.7％，接近100％，证实该方法具有良好的准确性。

实施例3

用构建的上述CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器检测市售羊乳粉是否掺假，具体操作如下：

第一步：单链DNA-普鲁士蓝纳米颗粒探针的制备

第二步：单链DNA-普鲁士蓝纳米颗粒探针在96孔板上的固定

第三步：DNA的提取与扩增

(1)对市售羊乳粉样品按照产品推荐的冲泡比例，用去离子水冲泡为液体后再进行后续操作；

(2)除该市售羊乳粉样品外，制备了向该市售羊乳粉样品中人为掺加5％牛乳的回收样品；

(3)市售羊乳粉DNA以及的向该市售羊乳粉样品中人为掺加5％牛乳的回收样品DNA的提取参照磁珠法血液基因组DNA提取试剂盒进行；

(4)提取出的DNA用B-500BIOPHOTOMETER(上海元析仪器公司)进行核酸定量后，统一稀释至10nM后进行LAMP(环介导等温扩增反应)，其中，环介导等温扩增的引物核苷酸序列如表1所示，扩增体系见表2。

第四步：crRNA序列的设计

第五步：CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器的构建

对实验组市售羊乳粉样品以及掺入5％牛乳的市售羊乳粉样品用该方法进行检测，将所得ΔI代入实施例1所得图6的标准曲线，市售羊乳粉的检测结果在空白组的误差范围内，未检出牛乳；掺入5％牛乳的市售羊乳粉样品中牛乳含量为5.03％，其检测掺入量与实际掺入量的比值为100.55％，接近100％，证实其具有良好的准确性。

实施例4

用构建的上述CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器检测市售酸羊乳是否掺假，具体操作如下：

第一步：单链DNA-普鲁士蓝纳米颗粒探针的制备

第二步：单链DNA-普鲁士蓝纳米颗粒探针在96孔板上的固定

制备方法同上述CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器的构建方法第二步

第三步：DNA的提取与扩增

(1)除市售酸羊乳样品外，还制备了向该样品中人为掺加5％牛乳的回收样品；

(2)市售酸羊乳样品DNA以及市售酸羊乳中人为掺加5％牛乳的回收样品DNA的提取参照磁珠法血液基因组DNA提取试剂盒进行；

第四步：crRNA序列的设计

第五步：CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器的构建

对实验组市售酸羊乳样品以及掺入5％牛乳的市售酸羊乳样品用该方法进行检测，将所得ΔI代入实施例1所得图6的标准曲线，市售酸羊乳的检测结果在空白组的误差范围内，未检出牛乳；掺入5％牛乳的市售酸羊乳样品中牛乳含量为5.23％，其检测掺入量与实际掺入量的比值为104.63％，接近100％，证实其具有良好的准确性。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

序列表

<110> 陕西科技大学

<120> 一种用于检测羊乳掺假的CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器及其检测羊乳掺假的方法和应用

<141> 2022-03-23

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 96

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttt 96

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

tacgcaatct tacgatcaat cc 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

ccgttggtat tagcactagg 20

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

ggctcagaat aggcattggc tccctactac acacctccaa 40

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

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<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

aggacaacca gtcgaacac 19

<210> 7

<211> 44

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

uaauuucuac uaaguguaga ucguguaugu aucgaauaau ucau 44

<210> 8

<211> 402

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

atgaccaaca ttcgaaaatc ccacccacta ataaaaattc taaacaacgc tttcattgat 60

ctcccagctc catcaaacat ctcatcatga tgaaattttg gctccctcct aggtatttgc 120

ctaatcttac aaatcctcac aggcttgttc ctagcaatgc attacacatc agacacaaca 180

acagcatttt cttccgtcgc ccacatctgc cgagacgtta actacggatg aattattcga 240

tacatacacg caaacggagc ttcaatattc ttcatctgct tatatataca cgtaggacga 300

ggcctatact acggatccta cactttttta gaaacatgaa acatcggagt aatcctccta 360

ttcacagtaa tagctacagc attcatagga tatgtactgc ca 402

Claims

1.一种用于检测羊乳掺假的CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器，其特征在于，包括单链DNA-普鲁士蓝纳米颗粒探针、Cas12a酶切反应体系、含氢氧根的溶液以及作为拉曼增强基底的金核银壳纳米颗粒溶液；

2.如权利要求1所述的一种用于检测羊乳掺假的CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器，其特征在于，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.8所示。

3.如权利要求1所述的一种用于检测羊乳掺假的CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器，其特征在于，所述扩增为环介导等温扩增，环介导等温扩增所用引物包括牛-FIP引物、牛-BIP引物、牛-F3引物和牛-B3引物；

4.如权利要求3所述的一种用于检测羊乳掺假的CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器，其特征在于，所用引物还包括牛-LF引物和牛-LB引物；

5.如权利要求1所述的一种用于检测羊乳掺假的CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器，其特征在于，缓冲液为10×NEBuffer 2.1。

6.权利要求1所述的一种用于检测羊乳掺假的CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器检测羊乳掺假的方法，其特征在于，按照以下步骤进行：

7.如权利要求5所述的一种用于检测羊乳掺假的CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器检测羊乳掺假的方法，其特征在于，步骤2)中，所述剪切反应的条件为在37℃条件下孵育30～80分钟。

8.如权利要求5所述的一种用于检测羊乳掺假的CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器检测羊乳掺假的方法，其特征在于，步骤3)中，所述碱处理溶液与金核银壳纳米颗粒溶液的体积比为1：10。

9.如权利要求5所述的一种用于检测羊乳掺假的CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器检测羊乳掺假的方法，其特征在于，步骤3)中，拉曼光谱仪扫描条件为：激光波长785nm，激光能量10mW，扫描时间为20秒，积分次数1次。

10.权利要求1-5任意一项所述的一种用于检测羊乳掺假的CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器在检测羊乳的掺假成分为牛乳中的应用。