CN112505017A - 一种基于sers技术检测血液中il-6的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明开发了一种基于SERS技术检测血液中白介素‑6(IL‑6)的方法。其技术方案包括：1)制备带普鲁士蓝内标的Au@Au NPs溶液活化后修饰上用于识别IL‑6的IL‑6抗体，得到Au@Au球形拉曼探针粒子。2)用改性玻璃片制备二维银片基底，修饰上4‑MPBA用于吸附IL‑6。3)二维银片基底捕获IL‑6，Au@Au球形拉曼探针粒子由于特异性识别IL‑6吸附在银基底上，利用激光拉曼光谱仪采集数据图谱，实现对血液中IL‑6的超灵敏检测，检测范围为：0.5‑50000pg/mL。

Description

一种基于SERS技术检测血液中IL-6的方法
技术领域
本发明属于检测的技术领域，具体涉及一种基于Au@Au球形核壳纳米粒子的SERS技术检测血液中IL-6的方法。
背景技术
白介素(IL-6)是一种人体细胞产生的糖蛋白，分子量为21kD，在生物体中起到促进T细胞增殖、促使B细胞的分化等重要的作用。人体中糖蛋白的表达往往与人体内产生的疾病相关，而IL-6也不例外。人血清中IL-6的正常生理浓度相对较低，在疾病环境中会迅速升高。临床研究已经表明，IL-6在感染、自身免疫或者癌症的情况下会被大量表达，其在机体内含量的升高可以预示机体正在发生的病症，是大多数炎症反应和部分疾病的重要标志物。因此，研发出一种可靠、灵敏的检测IL-6的方法至关重要。
传统的IL-6检测方法有：生物测定、荧光法、电化学法等，其中，常用的是酶联免疫吸附实验(ELISA)。这些方法中，不乏有灵敏度高的方法，但因其预处理繁琐、设备昂贵不易得、对样品有损害且检测环境要求高，使这些方法的应用受到限制。表面增强拉曼光谱技术(SERS)是在拉曼光谱的基础上，通过将被测物附着在金、银等粗糙金属表面，达到拉曼增强的效果，通常能实现6-14个数量级的增强效果。SERS因灵敏度高、对样品无损、痕量检测等优点，现被广泛应用于食品、生物、医学等行业检测。
专利一种直接检测IL-6的电化学免疫传感器及应用(CN 102706939)，公布了一种直接检测IL-6的电化学免疫传感器及应用，以单壁碳纳米管为基底，将金纳米粒子沉积于单壁碳纳米管上构成单壁碳纳米管/金纳米粒子杂化电极，杂化电极用巯基乙酸修饰，再在巯基乙酸上组装IL-6捕获抗体，再用质量浓度1-5％牛血清蛋白的PBS缓冲液封闭，获得所述电化学免疫传感器。上述方法虽然能达
足够低的检测限值，但是电化学设备要求比较高，成本高，检测过程和仪器设备不够简便；没有标记或者夹心处理，检测结果也容易受到环境和其他杂质的影响，稳定性不佳，不适合IL-6检测项目的基层推广。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种基于可捕获IL-6的二维拉曼特异性基底与修饰IL-6抗体的Au@Au核壳纳米粒子的SERS技术检测IL-6。本方法依赖于二维银基底的银纳米粒子和Au@Au核壳纳米粒子来实现等离子体共振，形成拉曼增强热点，修饰有4-MPBA的银片玻璃基底用于捕获IL-6以及对IL-6检测光谱进行校准，排除环境等因素对检测光谱的干扰；同时将修饰上IL-6抗体的Au@Au核壳纳米粒子作为IL-6检测探针粒子。本发明具有灵敏性高、特异性强、不受环境因素影响、价格低的优点。该发明涉及到的Au NPs直径20-30nm，Au NPs修饰上PB和金壳后Au@Au NPs直径为30-40nm；二维银基底中4-MPBA的修饰时间24h为最佳。适用的IL-6检测范围为0.5-50000pg/mL，在血清样品中还能检测到5pg/mL的IL-6。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
1、Au@Au球形核壳结构纳米粒子的制备
1)Au NPs胶体的制备：99mL水中加入1mL 1％的HAuCl4溶液，加热至沸后加入1mL1％柠檬酸三钠溶液，剧烈搅拌下继续沸腾15min直至还原反应完全，得到酒红色Au NPs纳米胶体，离心洗涤备用。
2)Au@PB纳米颗粒的制备：Au NPs胶体溶液中加入K3[Fe(CN)6]的水溶液(0.5mmol/L)，使CN-在Au NPs纳米颗粒表面形成刻蚀。使用步进电机将适宜体积的K4[Fe(CN)6](0.1mmol/L)和FeCl3·6H2O(0.1mmol/L)以相同的速度(0.1mL/min)同时滴入刻蚀好的AuNPs胶体溶液中，生成普鲁士蓝(PB)。Au@PB纳米粒子溶液离心洗涤后重新分散到超纯水中备用。
3)Au@Au纳米粒子的制备：将上述制备好的Au@PB胶体溶液浓缩10倍后加入1％柠檬酸三钠溶液反应30min，加热至沸，再按10:1的比例加入对应量的1mmol/L HAuCl4溶液反应1h，得到蓝紫色Au@PB@Au NPs(简称Au@Au NPs)纳米胶体，离心洗涤备用。
2、IL-6检测探针Au@Au粒子的制备
4)Au@Au表面修饰-COOH：将2mL Au@Au NPs加入等体积不同浓度(10-5、10-6、10-7、10-8、10-9M)的SH-PEG-COOH，在核壳结构表面修饰上-COOH。离心洗涤后得到Au@Au@COOHNPs。
5)活化-COOH：在Au@Au@COOH NPs中加入20μL,34mmol/L的EDC和17mmol/L的NHS溶液，反应30min，离心后备用。
6)修饰IL-6抗体：活化好的Au@Au@COOH NPs加入5ng/mL的IL-6抗体，反应1h，4℃下孵育24h，离心洗涤后重分散在PBS溶液中，得到IL-6检测探针粒子溶液。
3、SERS二维银基底的制备
7)改性玻璃片的制备：将玻璃片(5mm×5mm×1mm)浸泡于无水乙醇超声后干燥处理，除去玻璃片表面残留的油渍和有机物。再将玻璃片与“食人鱼”溶液(V(H2SO4):V(H2O2)＝7:3)进行反应(95℃，40min)，反应后用乙醇和水冲洗后得到修饰大量-OH基团的玻璃片。再将玻璃片浸没于10％APTES的醇水(10％水)溶液中，反应24h后，用水和乙醇反复冲洗，在110℃下进行30min的缩合反应，玻璃片浸泡在超纯水中备用。
8)Ag NPs胶体的制备：100mL水中加入18mg AgNO3，加热至沸，立即加入10mL 1％柠檬酸三钠，继续反应1h得到灰绿色Ag NPs纳米胶体，离心洗涤后定容至原体积备用。
9)二维银基底的制备：将步骤7)制备出来的改性玻璃片浸泡在步骤8)的Ag NPs胶体溶液(500μL)24h，取出后冲洗去没有修饰上的Ag NPs胶体。
10)特异性吸附IL-6二维银基底的制备：在银基底修饰上可以吸附糖蛋白的4-MPBA，将二维银片玻璃基底浸泡在4-MPBA中(1、3、8、12、24、48h)，利用Ag-S键的连接将4-MPBA固载在银膜上，再用乙醇冲去未修饰的4-MPBA，最后再用PBS冲洗，得到捕获IL-6的SERS二维基底。
4、工作曲线
11)IL-6样品的检测：将不同浓度IL-6标准溶液(0.5、5、50、500、5000、50000pg/mL)与二维SERS基底充分接触1h，PBS溶液冲洗后，加入100μL 0.2％BSA溶液反应20min，减少其他非特异性抗体的吸附。而后加入修饰有IL-6的Au@Au球形核壳结构共孵育1h后，用PBS溶液洗去未结合上目标分子IL-6的SERS探针，自然干燥后使用雷尼绍拉曼光谱仪进行拉曼信号检测，得到对应浓度的拉曼图谱。以IL-6检测探针粒子中PB特征峰2172cm-1作为IL-6检测拉曼信号峰，即随着IL-6浓度的增大，二维基底吸附下来的IL-6检测探针粒子就更多，2172cm-1处的拉曼信号峰就越强。此外，对应的谱图还需以二维基底上4-MPBA的特征拉曼峰1070cm-1作为标准峰进行校准，排除环境和其他杂质的干扰。
12)血液样品中IL-6的检测：选用白血病患者的血液，离心除去大分子物质。加入不同浓度IL-6(5，15，25μg/mL)旋转30min达到完全混合，得到不同浓度IL-6血液样品溶液。之后的检测过程与IL-6标准溶液相同，测得血液样品中IL-6拉曼光谱。
13)工作曲线：校准后的拉曼谱图选取2172cm-1峰值，做其随浓度对数变化的工作曲线，工作曲线为：y＝296.81x+3872.74，R2＝0.9928，表现出很好的线性。说明本方法具有灵敏性好、特异性强、不受环境干扰等特点，IL-6的检测范围为0.5-50000pg/mL，在血液样品中最低检测限能达到5pg/mL。
本发明的有益效果：
1、本发明利用二维银基底的银纳米粒子和Au@Au核壳纳米粒子来实现等离子体共振，核壳之间的间隙形成拉曼增强热点，对内标信号起到增强作用，内标分子在壳层的包裹下不会被环境所影响。并且加上二维玻璃基底4-MPBA信号峰的校准，使检测结果更加准确稳定。
2、本发明特异性强，Au@Au探针粒子修饰上IL-6抗体能对二维玻璃基底上吸附的IL-6特异性识别，能排除其他与IL-6结构相似物质的干扰。
3、本发明利用IL-6检测探针Au@Au粒子中内标分子PB的拉曼信号峰间接对IL-6进行检测，即随着IL-6浓度的升高，吸附在二维基底的IL-6就越多，Au@Au探针粒子通过表面的IL-6抗体对IL-6进行特异性吸附，使得探针粒子的内标物质拉曼信号就越强，选取特征峰2172cm-1处的峰强度与IL-6浓度的对数作工作曲线，可以获得良好的线性。
附图说明
图1为基于可捕获IL-6的二维拉曼特异性基底与修饰IL-6抗体的Au@Au核壳纳米粒子的IL-6SERS检测基底的制备过程。
图2为实例2中Au NPs、Au@PB NPs和Au@Au NPs的透射电镜图。
图3为实例2中玻璃基底上修饰Ag NPs、银膜上接载上4-MPBA、存在目标分子IL-6后加入对应Au@Au探针的扫描电镜图。
图4为实例2中PB和Au@Au NPs紫外表征图。
图5为实例2中Au NPs、Au@PB NPs、Au@PB@Au NPs的拉曼表征图。
图6为实例1-5中Au@Au NPs修饰上不同浓度SH-PEG-COOH的紫外吸收光谱图。
图7为实例1-5中Au@Au NPs修饰上不同浓度SH-PEG-COOH的拉曼光谱图和Zeta电位。
图8为实例2、实例6-10中银片上修饰4-MPBA的分布情况随修饰时间变化的SERS成像图。
图9为实例2、实例6-10中银片上修饰4-MPBA的1070cm-1特征峰强度随时间变化图。
图10为实例2中基底检测不同浓度IL-6标准溶液的拉曼光谱图。
图11为实例2中利用图10拉曼光谱图所做出的2172cm-1处的信号峰强度对应IL-6浓度对数的工作曲线。
图12为实例2中基底检测不同浓度IL-6标准溶液校准后的拉曼光谱图
图13为实例2中利用图12拉曼光谱图所做出的2172cm-1处的信号峰强度对应IL-6浓度对数的工作曲线。
图14为实例2中基底检测血清中不同浓度IL-6标准溶液的拉曼光谱图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面通过实施例对本发明进一步说明，实施例只用于解释本发明，并不会对本发明构成任何限定。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1(参见图1)
1)Au NPs胶体的制备：99mL水中加入1mL 1％的HAuCl4溶液，加热至沸后加入1mL1％柠檬酸三钠溶液，剧烈搅拌下继续沸腾15min直至还原反应完全，得到酒红色Au NPs纳米胶体，离心洗涤备用。
2)Au@PB纳米颗粒的制备：Au NPs胶体溶液中加入K3[Fe(CN)6]的水溶液(0.5mmol/L)，使CN-在Au NPs纳米颗粒表面形成刻蚀。使用步进电机将适宜体积的K4[Fe(CN)6](0.1mmol/L)和FeCl3·6H2O(0.1mmol/L)以相同的速度(0.1mL/min)同时滴入刻蚀好的AuNPs胶体溶液中，生成普鲁士蓝(PB)。Au@PB纳米粒子溶液离心洗涤后重新分散到超纯水中备用。
3)Au@Au纳米粒子的制备：将上述制备好的Au@PB胶体溶液浓缩10倍后加入1％柠檬酸三钠溶液反应30min，加热至沸，再按10:1的比例加入对应量的1mmol/L HAuCl4溶液反应1h，得到蓝紫色Au@PB@Au NPs(简称Au@Au NPs)纳米胶体，离心洗涤备用。
4)Au@Au表面修饰-COOH：将2mL Au@Au NPs加入10-5M的SH-PEG-COOH，在核壳结构表面修饰上-COOH。离心洗涤后得到Au@Au@COOH NPs。
5)活化-COOH：在Au@Au@COOH NPs中加入20μL,34mmol/L的EDC和17mmol/L的NHS溶液，反应30min，离心后备用。
6)修饰IL-6抗体：活化好的Au@Au NPs加入5ng/mL的IL-6抗体，反应1h，4℃下孵育24h，离心洗涤后重分散在PBS溶液中，得到IL-6检测探针粒子溶液。
7)改性玻璃片的制备：将玻璃片(5mm×5mm×1mm)浸泡于无水乙醇超声后干燥处理，除去玻璃片表面残留的油渍和有机物。再将玻璃片与“食人鱼”溶液(V(H2SO4):V(H2O2)＝7:3)进行反应(95℃，40min)，反应后用乙醇和水冲洗后得到修饰大量-OH基团的玻璃片。再将玻璃片浸没于10％APTES的醇水(10％水)溶液中，反应24h后，用水和乙醇反复冲洗，在110℃下进行30min的缩合反应，玻璃片浸泡在超纯水中备用。
8)Ag NPs胶体的制备：100mL水中加入18mg AgNO3，加热至沸，立即加入10mL 1％柠檬酸三钠，继续反应1h得到灰绿色Ag NPs纳米胶体，离心洗涤后定容至原体积备用。
9)二维银基底的制备：将步骤7)制备出来的改性玻璃片浸泡在步骤8)的Ag NPs胶体溶液(500μL)24h，取出后冲洗去没有修饰上的Ag NPs胶体。
10)特异性吸附IL-6二维银基底的制备：在银基底修饰上可以吸附糖蛋白的4-MPBA，将二维银片玻璃基底浸泡在4-MPBA中，浸泡时间为24h，利用Ag-S键的连接将4-MPBA固载在银膜上，再用乙醇冲去未修饰的4-MPBA，最后再用PBS冲洗，得到捕获IL-6的SERS二维基底。
11)IL-6样品的检测：将不同浓度IL-6标准溶液(0.5、5、50、500、5000、50000pg/mL)与二维SERS基底充分接触1h，PBS溶液冲洗后，加入100μL 0.2％BSA溶液反应20min，减少其他非特异性抗体的吸附。而后加入修饰有IL-6的Au@Au球形核壳结构共孵育1h后，用PBS溶液洗去未结合上目标分子SERS探针，自然干燥后使用雷尼绍拉曼光谱仪进行拉曼信号检测，以IL-6检测探针粒子中PB特征峰2172cm-1作为IL-6检测拉曼信号峰，得到对应浓度的拉曼图谱。再用二维基底上4-MPBA的特征拉曼峰1070cm-1作为标准峰进行校准。
12)血液样品中IL-6的检测：选用白血病患者的血液，离心除去大分子物质。加入不同浓度IL-6(5，15，25μg/mL)旋转30min达到完全混合，得到不同浓度IL-6血液样品溶液。之后的血液样品检测过程与IL-6标准溶液相同，测得血液样品中IL-6拉曼光谱。
13)工作曲线：校准后的拉曼谱图选取2172cm-1峰值，做其随浓度对数变化的工作曲线，工作曲线为：y＝296.81x+3872.74，R2＝0.9928，表现出很好的线性。
实施例2
1)Au NPs胶体的制备：99mL水中加入1mL 1％的HAuCl4溶液，加热至沸后加入1mL1％柠檬酸三钠溶液，剧烈搅拌下继续沸腾15min直至还原反应完全，得到酒红色Au NPs纳米胶体，离心洗涤备用。
2)Au@PB纳米颗粒的制备：Au NPs胶体溶液中加入K3[Fe(CN)6]的水溶液(0.5mmol/L)，使CN-在Au NPs纳米颗粒表面形成刻蚀。使用步进电机将适宜体积的K4[Fe(CN)6](0.1mmol/L)和FeCl3·6H2O(0.1mmol/L)以相同的速度(0.1mL/min)同时滴入刻蚀好的AuNPs胶体溶液中，生成普鲁士蓝(PB)。Au@PB纳米粒子溶液离心洗涤后重新分散到超纯水中备用。
3)Au@Au纳米粒子的制备：将上述制备好的Au@PB胶体溶液浓缩10倍后加入1％柠檬酸三钠溶液反应30min，加热至沸，再按10:1的比例加入对应量的1mmol/L HAuCl4溶液反应1h，得到蓝紫色Au@PB@Au NPs(简称Au@Au NPs)纳米胶体，离心洗涤备用。
4)Au@Au表面修饰-COOH：将2mL Au@Au NPs加入10-6M的SH-PEG-COOH，在核壳结构表面修饰上-COOH。离心洗涤后得到Au@Au@COOH NPs。
5)活化-COOH：在Au@Au@COOH NPs中加入20μL,34mmol/L的EDC和17mmol/L的NHS溶液，反应30min，离心后备用。
6)修饰IL-6抗体：活化好的Au@Au NPs加入5ng/mL的IL-6抗体，反应1h，4℃下孵育24h，离心洗涤后重分散在PBS溶液中，得到IL-6检测探针粒子溶液。
7)改性玻璃片的制备：将玻璃片(5mm×5mm×1mm)浸泡于无水乙醇超声后干燥处理，除去玻璃片表面残留的油渍和有机物。再将玻璃片与“食人鱼”溶液(V(H2SO4):V(H2O2)＝7:3)进行反应(95℃，40min)，反应后用乙醇和水冲洗后得到修饰大量-OH基团的玻璃片。再将玻璃片浸没于10％APTES的醇水(10％水)溶液中，反应24h后，用水和乙醇反复冲洗，在110℃下进行30min的缩合反应，玻璃片浸泡在超纯水中备用。
8)Ag NPs胶体的制备：100mL水中加入18mg AgNO3，加热至沸，立即加入10mL 1％柠檬酸三钠，继续反应1h得到灰绿色Ag NPs纳米胶体，离心洗涤后定容至原体积备用。
9)二维银基底的制备：将步骤7)制备出来的改性玻璃片浸泡在步骤8)的Ag NPs胶体溶液(500μL)24h，取出后冲洗去没有修饰上的Ag NPs胶体。
10)特异性吸附IL-6二维银基底的制备：在银基底修饰上可以吸附糖蛋白的4-MPBA，将二维银片玻璃基底浸泡在4-MPBA中，浸泡时间为24h，利用Ag-S键的连接将4-MPBA固载在银膜上，再用乙醇冲去未修饰的4-MPBA，最后再用PBS冲洗，得到捕获IL-6的SERS二维基底。
11)IL-6样品的检测：将不同浓度IL-6标准溶液(0.5、5、50、500、5000、50000pg/mL)与二维SERS基底充分接触1h，PBS溶液冲洗后，加入100μL 0.2％BSA溶液反应20min，减少其他非特异性抗体的吸附。而后加入修饰有IL-6抗体的Au@Au球形核壳结构共孵育1h后，用PBS溶液洗去未结合上目标分子SERS探针，自然干燥后使用雷尼绍拉曼光谱仪进行拉曼信号检测，以IL-6检测探针粒子中PB特征峰2172cm-1作为IL-6检测拉曼信号峰，得到对应浓度的拉曼图谱。再用二维基底上4-MPBA的特征拉曼峰1070cm-1作为标准峰进行校准。
12)血液样品中IL-6的检测：选用白血病患者的血液，离心除去大分子物质。加入不同浓度IL-6(5，15，25μg/mL)旋转30min达到完全混合，得到不同浓度IL-6血液样品溶液。之后的血液样品检测过程与IL-6标准溶液相同，测得血液样品中IL-6拉曼光谱。
13)工作曲线：校准后的拉曼谱图选取2172cm-1峰值，做其随浓度对数变化的工作曲线，工作曲线为：y＝296.81x+3872.74，R2＝0.9928，表现出很好的线性。
实施例3
1)Au NPs胶体的制备：99mL水中加入1mL 1％的HAuCl4溶液，加热至沸后加入1mL1％柠檬酸三钠溶液，剧烈搅拌下继续沸腾15min直至还原反应完全，得到酒红色Au NPs纳米胶体，离心洗涤备用。
2)Au@PB纳米颗粒的制备：Au NPs胶体溶液中加入K3[Fe(CN)6]的水溶液(0.5mmol/L)，使CN-在Au NPs纳米颗粒表面形成刻蚀。使用步进电机将适宜体积的K4[Fe(CN)6](0.1mmol/L)和FeCl3·6H2O(0.1mmol/L)以相同的速度(0.1mL/min)同时滴入刻蚀好的AuNPs胶体溶液中，生成普鲁士蓝(PB)。Au@PB纳米粒子溶液离心洗涤后重新分散到超纯水中备用。
3)Au@Au纳米粒子的制备：将上述制备好的Au@PB胶体溶液浓缩10倍后加入1％柠檬酸三钠溶液反应30min，加热至沸，再按10:1的比例加入对应量的1mmol/L HAuCl4溶液反应1h，得到蓝紫色Au@PB@Au NPs(简称Au@Au NPs)纳米胶体，离心洗涤备用。
4)Au@Au表面修饰-COOH：将2mL Au@Au NPs加入10-7M的SH-PEG-COOH，在核壳结构表面修饰上-COOH。离心洗涤后得到Au@Au@COOH NPs。
5)活化-COOH：在Au@Au@COOH NPs中加入20μL,34mmol/L的EDC和17mmol/L的NHS溶液，反应30min，离心后备用。
6)修饰IL-6抗体：活化好的Au@Au NPs加入5ng/mL的IL-6抗体，反应1h，4℃下孵育24h，离心洗涤后重分散在PBS溶液中，得到IL-6检测探针粒子溶液。
7)改性玻璃片的制备：将玻璃片(5mm×5mm×1mm)浸泡于无水乙醇超声后干燥处理，除去玻璃片表面残留的油渍和有机物。再将玻璃片与“食人鱼”溶液(V(H2SO4):V(H2O2)＝7:3)进行反应(95℃，40min)，反应后用乙醇和水冲洗后得到修饰大量-OH基团的玻璃片。再将玻璃片浸没于10％APTES的醇水(10％水)溶液中，反应24h后，用水和乙醇反复冲洗，在110℃下进行30min的缩合反应，玻璃片浸泡在超纯水中备用。
8)Ag NPs胶体的制备：100mL水中加入18mg AgNO3，加热至沸，立即加入10mL 1％柠檬酸三钠，继续反应1h得到灰绿色Ag NPs纳米胶体，离心洗涤后定容至原体积备用。
9)二维银基底的制备：将步骤7)制备出来的改性玻璃片浸泡在步骤8)的Ag NPs胶体溶液(500μL)24h，取出后冲洗去没有修饰上的Ag NPs胶体。
10)特异性吸附IL-6二维银基底的制备：在银基底修饰上可以吸附糖蛋白的4-MPBA，将二维银片玻璃基底浸泡在4-MPBA中，浸泡时间为24h，利用Ag-S键的连接将4-MPBA固载在银膜上，再用乙醇冲去未修饰的4-MPBA，最后再用PBS冲洗，得到捕获IL-6的SERS二维基底。
11)IL-6样品的检测：将不同浓度IL-6标准溶液(0.5、5、50、500、5000、50000pg/mL)与二维SERS基底充分接触1h，PBS溶液冲洗后，加入100μL 0.2％BSA溶液反应20min，减少其他非特异性抗体的吸附。而后加入修饰有IL-6的Au@Au球形核壳结构共孵育1h后，用PBS溶液洗去未结合上目标分子SERS探针，自然干燥后使用雷尼绍拉曼光谱仪进行拉曼信号检测，以IL-6检测探针粒子中PB特征峰2172cm-1作为IL-6检测拉曼信号峰，得到对应浓度的拉曼图谱。再用二维基底上4-MPBA的特征拉曼峰1070cm-1作为标准峰进行校准。
12)血液样品中IL-6的检测：选用白血病患者的血液，离心除去大分子物质。加入不同浓度IL-6(5，15，25μg/mL)旋转30min达到完全混合，得到不同浓度IL-6血液样品溶液。之后的血液样品检测过程与IL-6标准溶液相同，测得血液样品中IL-6拉曼光谱。
13)工作曲线：校准后的拉曼谱图选取2172cm-1峰值，做其随浓度对数变化的工作曲线，工作曲线为：y＝296.81x+3872.74，R2＝0.9928，表现出很好的线性。
实施例4
1)Au NPs胶体的制备：99mL水中加入1mL 1％的HAuCl4溶液，加热至沸后加入1mL1％柠檬酸三钠溶液，剧烈搅拌下继续沸腾15min直至还原反应完全，得到酒红色Au NPs纳米胶体，离心洗涤备用。
2)Au@PB纳米颗粒的制备：Au NPs胶体溶液中加入K3[Fe(CN)6]的水溶液(0.5mmol/L)，使CN-在Au NPs纳米颗粒表面形成刻蚀。使用步进电机将适宜体积的K4[Fe(CN)6](0.1mmol/L)和FeCl3·6H2O(0.1mmol/L)以相同的速度(0.1mL/min)同时滴入刻蚀好的AuNPs胶体溶液中，生成普鲁士蓝(PB)。Au@PB纳米粒子溶液离心洗涤后重新分散到超纯水中备用。
3)Au@Au纳米粒子的制备：将上述制备好的Au@PB胶体溶液浓缩10倍后加入1％柠檬酸三钠溶液反应30min，加热至沸，再按10:1的比例加入对应量的1mmol/L HAuCl4溶液反应1h，得到蓝紫色Au@PB@Au NPs(简称Au@Au NPs)纳米胶体，离心洗涤备用。
4)Au@Au表面修饰-COOH：将2mL Au@Au NPs加入10-8M的SH-PEG-COOH，在核壳结构表面修饰上-COOH。离心洗涤后得到Au@Au@COOH NPs。
5)活化-COOH：在Au@Au@COOH NPs中加入20μL,34mmol/L的EDC和17mmol/L的NHS溶液，反应30min，离心后备用。
6)修饰IL-6抗体：活化好的Au@Au NPs加入5ng/mL的IL-6抗体，反应1h，4℃下孵育24h，离心洗涤后重分散在PBS溶液中，得到IL-6检测探针粒子溶液。
7)改性玻璃片的制备：将玻璃片(5mm×5mm×1mm)浸泡于无水乙醇超声后干燥处理，除去玻璃片表面残留的油渍和有机物。再将玻璃片与“食人鱼”溶液(V(H2SO4):V(H2O2)＝7:3)进行反应(95℃，40min)，反应后用乙醇和水冲洗后得到修饰大量-OH基团的玻璃片。再将玻璃片浸没于10％APTES的醇水(10％水)溶液中，反应24h后，用水和乙醇反复冲洗，在110℃下进行30min的缩合反应，玻璃片浸泡在超纯水中备用。
8)Ag NPs胶体的制备：100mL水中加入18mg AgNO3，加热至沸，立即加入10mL 1％柠檬酸三钠，继续反应1h得到灰绿色Ag NPs纳米胶体，离心洗涤后定容至原体积备用。
9)二维银基底的制备：将步骤7)制备出来的改性玻璃片浸泡在步骤8)的Ag NPs胶体溶液(500μL)24h，取出后冲洗去没有修饰上的Ag NPs胶体。
10)特异性吸附IL-6二维银基底的制备：在银基底修饰上可以吸附糖蛋白的4-MPBA，将二维银片玻璃基底浸泡在4-MPBA中，浸泡时间为24h，利用Ag-S键的连接将4-MPBA固载在银膜上，再用乙醇冲去未修饰的4-MPBA，最后再用PBS冲洗，得到捕获IL6的SERS二维基底。
11)IL-6样品的检测：将不同浓度IL-6标准溶液(0.5、5、50、500、5000、50000pg/mL)与二维SERS基底充分接触1h，PBS溶液冲洗后，加入100μL 0.2％BSA溶液反应20min，减少其他非特异性抗体的吸附。而后加入修饰有IL-6抗体的Au@Au球形核壳结构共孵育1h后，用PBS溶液洗去未结合上目标分子SERS探针，自然干燥后使用雷尼绍拉曼光谱仪进行拉曼信号检测，以IL-6检测探针粒子中PB特征峰2172cm-1作为IL-6检测拉曼信号峰，得到对应浓度的拉曼图谱。再用二维基底上4-MPBA的特征拉曼峰1070cm-1作为标准峰进行校准。
12)血液样品中IL-6的检测：选用白血病患者的血液，离心除去大分子物质。加入不同浓度IL-6(5，15，25μg/mL)旋转30min达到完全混合，得到不同浓度IL-6血液样品溶液。之后的血液样品检测过程与IL-6标准溶液相同，测得血液样品中IL-6拉曼光谱。
13)工作曲线：校准后的拉曼谱图选取2172cm-1峰值，做其随浓度对数变化的工作曲线，工作曲线为：y＝296.81x+3872.74，R2＝0.9928，表现出很好的线性。
实施例5
1)Au NPs胶体的制备：99mL水中加入1mL 1％的HAuCl4溶液，加热至沸后加入1mL1％柠檬酸三钠溶液，剧烈搅拌下继续沸腾15min直至还原反应完全，得到酒红色Au NPs纳米胶体，离心洗涤备用。
2)Au@PB纳米颗粒的制备：Au NPs胶体溶液中加入K3[Fe(CN)6]的水溶液(0.5mmol/L)，使CN-在Au NPs纳米颗粒表面形成刻蚀。使用步进电机将适宜体积的K4[Fe(CN)6](0.1mmol/L)和FeCl3·6H2O(0.1mmol/L)以相同的速度(0.1mL/min)同时滴入刻蚀好的AuNPs胶体溶液中，生成普鲁士蓝(PB)。Au@PB纳米粒子溶液离心洗涤后重新分散到超纯水中备用。
3)Au@Au纳米粒子的制备：将上述制备好的Au@PB胶体溶液浓缩10倍后加入1％柠檬酸三钠溶液反应30min，加热至沸，再按10:1的比例加入对应量的1mmol/L HAuCl4溶液反应1h，得到蓝紫色Au@PB@Au NPs(简称Au@Au NPs)纳米胶体，离心洗涤备用。
4)Au@Au表面修饰-COOH：将2mL Au@Au NPs加入10-9M的SH-PEG-COOH，在核壳结构表面修饰上-COOH。离心洗涤后得到Au@Au@COOH NPs。
5)活化-COOH：在Au@Au@COOH NPs中加入20μL,34mmol/L的EDC和17mmol/L的NHS溶液，反应30min，离心后备用。
6)修饰IL-6抗体：活化好的Au@Au NPs加入5ng/mL的IL-6抗体，反应1h，4℃下孵育24h，离心洗涤后重分散在PBS溶液中，得到IL-6检测探针粒子溶液。
7)改性玻璃片的制备：将玻璃片(5mm×5mm×1mm)浸泡于无水乙醇超声后干燥处理，除去玻璃片表面残留的油渍和有机物。再将玻璃片与“食人鱼”溶液(V(H2SO4):V(H2O2)＝7:3)进行反应(95℃，40min)，反应后用乙醇和水冲洗后得到修饰大量-OH基团的玻璃片。再将玻璃片浸没于10％APTES的醇水(10％水)溶液中，反应24h后，用水和乙醇反复冲洗，在110℃下进行30min的缩合反应，玻璃片浸泡在超纯水中备用。
8)Ag NPs胶体的制备：100mL水中加入18mg AgNO3，加热至沸，立即加入10mL 1％柠檬酸三钠，继续反应1h得到灰绿色Ag NPs纳米胶体，离心洗涤后定容至原体积备用。
9)二维银基底的制备：将步骤7)制备出来的改性玻璃片浸泡在步骤8)的Ag NPs胶体溶液(500μL)24h，取出后冲洗去没有修饰上的Ag NPs胶体。
10)特异性吸附IL-6二维银基底的制备：在银基底修饰上可以吸附糖蛋白的4-MPBA，将二维银片玻璃基底浸泡在4-MPBA中，浸泡时间为24h，利用Ag-S键的连接将4-MPBA固载在银膜上，再用乙醇冲去未修饰的4-MPBA，最后再用PBS冲洗，得到捕获IL6的SERS二维基底。
11)IL-6样品的检测：将不同浓度IL-6标准溶液(0.5、5、50、500、5000、50000pg/mL)与二维SERS基底充分接触1h，PBS溶液冲洗后，加入100μL 0.2％BSA溶液反应20min，减少其他非特异性抗体的吸附。而后加入修饰有IL-6抗体的Au@Au球形核壳结构共孵育1h后，用PBS溶液洗去未结合上目标分子SERS探针，自然干燥后使用雷尼绍拉曼光谱仪进行拉曼信号检测，以IL-6检测探针粒子中PB特征峰2172cm-1作为IL-6检测拉曼信号峰，得到对应浓度的拉曼图谱。再用二维基底上4-MPBA的特征拉曼峰1070cm-1作为标准峰进行校准。
12)血液样品中IL-6的检测：选用白血病患者的血液，离心除去大分子物质。加入不同浓度IL-6(5，15，25μg/mL)旋转30min达到完全混合，得到不同浓度IL-6血液样品溶液。之后的血液样品检测过程与IL-6标准溶液相同，测得血液样品中IL-6拉曼光谱。
13)工作曲线：校准后的拉曼谱图选取2172cm-1峰值，做其随浓度对数变化的工作曲线，工作曲线为：y＝296.81x+3872.74，R2＝0.9928，表现出很好的线性。
实施例6
1)Au NPs胶体的制备：99mL水中加入1mL 1％的HAuCl4溶液，加热至沸后加入1mL1％柠檬酸三钠溶液，剧烈搅拌下继续沸腾15min直至还原反应完全，得到酒红色Au NPs纳米胶体，离心洗涤备用。
2)Au@PB纳米颗粒的制备：Au NPs胶体溶液中加入K3[Fe(CN)6]的水溶液(0.5mmol/L)，使CN-在Au NPs纳米颗粒表面形成刻蚀。使用步进电机将适宜体积的K4[Fe(CN)6](0.1mmol/L)和FeCl3·6H2O(0.1mmol/L)以相同的速度(0.1mL/min)同时滴入刻蚀好的AuNPs胶体溶液中，生成普鲁士蓝(PB)。Au@PB纳米粒子溶液离心洗涤后重新分散到超纯水中备用。
3)Au@Au纳米粒子的制备：将上述制备好的Au@PB胶体溶液浓缩10倍后加入1％柠檬酸三钠溶液反应30min，加热至沸，再按10:1的比例加入对应量的1mmol/L HAuCl4溶液反应1h，得到蓝紫色Au@PB@Au NPs(简称Au@Au NPs)纳米胶体，离心洗涤备用。
4)Au@Au表面修饰-COOH：将2mL Au@Au NPs加入10-6M的SH-PEG-COOH，在核壳结构表面修饰上-COOH。离心洗涤后得到Au@Au@COOH NPs。
5)活化-COOH：在Au@Au@COOH NPs中加入20μL,34mmol/L的EDC和17mmol/L的NHS溶液，反应30min，离心后备用。
6)修饰IL-6抗体：活化好的Au@Au NPs加入5ng/mL的IL-6抗体，反应1h，4℃下孵育24h，离心洗涤后重分散在PBS溶液中，得到IL-6检测探针粒子溶液。
7)改性玻璃片的制备：将玻璃片(5mm×5mm×1mm)浸泡于无水乙醇超声后干燥处理，除去玻璃片表面残留的油渍和有机物。再将玻璃片与“食人鱼”溶液(V(H2SO4):V(H2O2)＝7:3)进行反应(95℃，40min)，反应后用乙醇和水冲洗后得到修饰大量-OH基团的玻璃片。再将玻璃片浸没于10％APTES的醇水(10％水)溶液中，反应24h后，用水和乙醇反复冲洗，在110℃下进行30min的缩合反应，玻璃片浸泡在超纯水中备用。
8)Ag NPs胶体的制备：100mL水中加入18mg AgNO3，加热至沸，立即加入10mL 1％柠檬酸三钠，继续反应1h得到灰绿色Ag NPs纳米胶体，离心洗涤后定容至原体积备用。
9)二维银基底的制备：将步骤7)制备出来的改性玻璃片浸泡在步骤8)的Ag NPs胶体溶液(500μL)24h，取出后冲洗去没有修饰上的Ag NPs胶体。
10)特异性吸附IL-6二维银基底的制备：在银基底修饰上可以吸附糖蛋白的4-MPBA，将二维银片玻璃基底浸泡在4-MPBA中，浸泡时间为1h，利用Ag-S键的连接将4-MPBA固载在银膜上，再用乙醇冲去未修饰的4-MPBA，最后再用PBS冲洗，得到捕获IL-6的SERS二维基底。
11)IL-6样品的检测：将不同浓度IL-6标准溶液(0.5、5、50、500、5000、50000pg/mL)与二维SERS基底充分接触1h，PBS溶液冲洗后，加入100μL 0.2％BSA溶液反应20min，减少其他非特异性抗体的吸附。而后加入修饰有IL-6抗体的Au@Au球形核壳结构共孵育1h后，用PBS溶液洗去未结合上目标分子SERS探针，自然干燥后使用雷尼绍拉曼光谱仪进行拉曼信号检测，以IL-6检测探针粒子中PB特征峰2172cm-1作为IL-6检测拉曼信号峰，得到对应浓度的拉曼图谱。再用二维基底上4-MPBA的特征拉曼峰1070cm-1作为标准峰进行校准。
12)血液样品中IL-6的检测：选用白血病患者的血液，离心除去大分子物质。加入不同浓度IL-6(5，15，25μg/mL)旋转30min达到完全混合，得到不同浓度IL-6血液样品溶液。之后的血液样品检测过程与IL-6标准溶液相同，测得血液样品中IL-6拉曼光谱。
13)工作曲线：校准后的拉曼谱图选取2172cm-1峰值，做其随浓度对数变化的工作曲线，工作曲线为：y＝296.81x+3872.74，R2＝0.9928，表现出很好的线性。
实施例7
1)Au NPs胶体的制备：99mL水中加入1mL 1％的HAuCl4溶液，加热至沸后加入1mL1％柠檬酸三钠溶液，剧烈搅拌下继续沸腾15min直至还原反应完全，得到酒红色Au NPs纳米胶体，离心洗涤备用。
2)Au@PB纳米颗粒的制备：Au NPs胶体溶液中加入K3[Fe(CN)6]的水溶液(0.5mmol/L)，使CN-在Au NPs纳米颗粒表面形成刻蚀。使用步进电机将适宜体积的K4[Fe(CN)6](0.1mmol/L)和FeCl3·6H2O(0.1mmol/L)以相同的速度(0.1mL/min)同时滴入刻蚀好的AuNPs胶体溶液中，生成普鲁士蓝(PB)。Au@PB纳米粒子溶液离心洗涤后重新分散到超纯水中备用。
3)Au@Au纳米粒子的制备：将上述制备好的Au@PB胶体溶液浓缩10倍后加入1％柠檬酸三钠溶液反应30min，加热至沸，再按10:1的比例加入对应量的1mmol/L HAuCl4溶液反应1h，得到蓝紫色Au@PB@Au NPs(简称Au@Au NPs)纳米胶体，离心洗涤备用。
4)Au@Au表面修饰-COOH：将2mL Au@Au NPs加入10-6M的SH-PEG-COOH，在核壳结构表面修饰上-COOH。离心洗涤后得到Au@Au@COOH NPs。
5)活化-COOH：在Au@Au@COOH NPs中加入20μL,34mmol/L的EDC和17mmol/L的NHS溶液，反应30min，离心后备用。
6)修饰IL-6抗体：活化好的Au@Au NPs加入5ng/mL的IL-6抗体，反应1h，4℃下孵育24h，离心洗涤后重分散在PBS溶液中，得到IL-6检测探针粒子溶液。
7)改性玻璃片的制备：将玻璃片(5mm×5mm×1mm)浸泡于无水乙醇超声后干燥处理，除去玻璃片表面残留的油渍和有机物。再将玻璃片与“食人鱼”溶液(V(H2SO4):V(H2O2)＝7:3)进行反应(95℃，40min)，反应后用乙醇和水冲洗后得到修饰大量-OH基团的玻璃片。再将玻璃片浸没于10％APTES的醇水(10％水)溶液中，反应24h后，用水和乙醇反复冲洗，在110℃下进行30min的缩合反应，玻璃片浸泡在超纯水中备用。
8)Ag NPs胶体的制备：100mL水中加入18mg AgNO3，加热至沸，立即加入10mL 1％柠檬酸三钠，继续反应1h得到灰绿色Ag NPs纳米胶体，离心洗涤后定容至原体积备用。
9)二维银基底的制备：将步骤7)制备出来的改性玻璃片浸泡在步骤8)的Ag NPs胶体溶液(500μL)24h，取出后冲洗去没有修饰上的Ag NPs胶体。
10)特异性吸附IL-6二维银基底的制备：在银基底修饰上可以吸附糖蛋白的4-MPBA，将二维银片玻璃基底浸泡在4-MPBA中，浸泡时间为3h，利用Ag-S键的连接将4-MPBA固载在银膜上，再用乙醇冲去未修饰的4-MPBA，最后再用PBS冲洗，得到捕获IL-6的SERS二维基底。
11)IL-6样品的检测：将不同浓度IL-6标准溶液(0.5、5、50、500、5000、50000pg/mL)与二维SERS基底充分接触1h，PBS溶液冲洗后，加入100μL 0.2％BSA溶液反应20min，减少其他非特异性抗体的吸附。而后加入修饰有IL-6抗体的Au@Au球形核壳结构共孵育1h后，用PBS溶液洗去未结合上目标分子SERS探针，自然干燥后使用雷尼绍拉曼光谱仪进行拉曼信号检测，以IL-6检测探针粒子中PB特征峰2172cm-1作为IL-6检测拉曼信号峰，得到对应浓度的拉曼图谱。再用二维基底上4-MPBA的特征拉曼峰1070cm-1作为标准峰进行校准。
12)血液样品中IL-6的检测：选用白血病患者的血液，离心除去大分子物质。加入不同浓度IL-6(5，15，25μg/mL)旋转30min达到完全混合，得到不同浓度IL-6血液样品溶液。之后的血液样品检测过程与IL-6标准溶液相同，测得血液样品中IL-6拉曼光谱。
13)工作曲线：校准后的拉曼谱图选取2172cm-1峰值，做其随浓度对数变化的工作曲线，工作曲线为：y＝296.81x+3872.74，R2＝0.9928，表现出很好的线性。
实施例8
1)Au NPs胶体的制备：99mL水中加入1mL 1％的HAuCl4溶液，加热至沸后加入1mL1％柠檬酸三钠溶液，剧烈搅拌下继续沸腾15min直至还原反应完全，得到酒红色Au NPs纳米胶体，离心洗涤备用。
2)Au@PB纳米颗粒的制备：Au NPs胶体溶液中加入K3[Fe(CN)6]的水溶液(0.5mmol/L)，使CN-在Au NPs纳米颗粒表面形成刻蚀。使用步进电机将适宜体积的K4[Fe(CN)6](0.1mmol/L)和FeCl3·6H2O(0.1mmol/L)以相同的速度(0.1mL/min)同时滴入刻蚀好的AuNPs胶体溶液中，生成普鲁士蓝(PB)。Au@PB纳米粒子溶液离心洗涤后重新分散到超纯水中备用。
3)Au@Au纳米粒子的制备：将上述制备好的Au@PB胶体溶液浓缩10倍后加入1％柠檬酸三钠溶液反应30min，加热至沸，再按10:1的比例加入对应量的1mmol/L HAuCl4溶液反应1h，得到蓝紫色Au@PB@Au NPs(简称Au@Au NPs)纳米胶体，离心洗涤备用。
4)Au@Au表面修饰-COOH：将2mL Au@Au NPs加入10-6M的SH-PEG-COOH，在核壳结构表面修饰上-COOH。离心洗涤后得到Au@Au@COOH NPs。
5)活化-COOH：在Au@Au@COOH NPs中加入20μL,34mmol/L的EDC和17mmol/L的NHS溶液，反应30min，离心后备用。
6)修饰IL-6抗体：活化好的Au@Au NPs加入5ng/mL的IL-6抗体，反应1h，4℃下孵育24h，离心洗涤后重分散在PBS溶液中，得到IL-6检测探针粒子溶液。
7)改性玻璃片的制备：将玻璃片(5mm×5mm×1mm)浸泡于无水乙醇超声后干燥处理，除去玻璃片表面残留的油渍和有机物。再将玻璃片与“食人鱼”溶液(V(H2SO4):V(H2O2)＝7:3)进行反应(95℃，40min)，反应后用乙醇和水冲洗后得到修饰大量-OH基团的玻璃片。再将玻璃片浸没于10％APTES的醇水(10％水)溶液中，反应24h后，用水和乙醇反复冲洗，在110℃下进行30min的缩合反应，玻璃片浸泡在超纯水中备用。
8)Ag NPs胶体的制备：100mL水中加入18mg AgNO3，加热至沸，立即加入10mL 1％柠檬酸三钠，继续反应1h得到灰绿色Ag NPs纳米胶体，离心洗涤后定容至原体积备用。
9)二维银基底的制备：将步骤7)制备出来的改性玻璃片浸泡在步骤8)的Ag NPs胶体溶液(500μL)24h，取出后冲洗去没有修饰上的Ag NPs胶体。
10)特异性吸附IL-6二维银基底的制备：在银基底修饰上可以吸附糖蛋白的4-MPBA，将二维银片玻璃基底浸泡在4-MPBA中，浸泡时间为8h，利用Ag-S键的连接将4-MPBA固载在银膜上，再用乙醇冲去未修饰的4-MPBA，最后再用PBS冲洗，得到捕获IL-6的SERS二维基底。
11)IL-6样品的检测：将不同浓度IL-6标准溶液(0.5、5、50、500、5000、50000pg/mL)与二维SERS基底充分接触1h，PBS溶液冲洗后，加入100μL 0.2％BSA溶液反应20min，减少其他非特异性抗体的吸附。而后加入修饰有IL-6抗体的Au@Au球形核壳结构共孵育1h后，用PBS溶液洗去未结合上目标分子SERS探针，自然干燥后使用雷尼绍拉曼光谱仪进行拉曼信号检测，以IL-6检测探针粒子中PB特征峰2172cm-1作为IL-6检测拉曼信号峰，得到对应浓度的拉曼图谱。再用二维基底上4-MPBA的特征拉曼峰1070cm-1作为标准峰进行校准。
12)血液样品中IL-6的检测：选用白血病患者的血液，离心除去大分子物质。加入不同浓度IL-6(5，15，25μg/mL)旋转30min达到完全混合，得到不同浓度IL-6血液样品溶液。之后的血液样品检测过程与IL-6标准溶液相同，测得血液样品中IL-6拉曼光谱。
13)工作曲线：校准后的拉曼谱图选取2172cm-1峰值，做其随浓度对数变化的工作曲线，工作曲线为：y＝296.81x+3872.74，R2＝0.9928，表现出很好的线性。
实施例9
1)Au NPs胶体的制备：99mL水中加入1mL 1％的HAuCl4溶液，加热至沸后加入1mL1％柠檬酸三钠溶液，剧烈搅拌下继续沸腾15min直至还原反应完全，得到酒红色Au NPs纳米胶体，离心洗涤备用。
2)Au@PB纳米颗粒的制备：Au NPs胶体溶液中加入K3[Fe(CN)6]的水溶液(0.5mmol/L)，使CN-在Au NPs纳米颗粒表面形成刻蚀。使用步进电机将适宜体积的K4[Fe(CN)6](0.1mmol/L)和FeCl3·6H2O(0.1mmol/L)以相同的速度(0.1mL/min)同时滴入刻蚀好的AuNPs胶体溶液中，生成普鲁士蓝(PB)。Au@PB纳米粒子溶液离心洗涤后重新分散到超纯水中备用。
3)Au@Au纳米粒子的制备：将上述制备好的Au@PB胶体溶液浓缩10倍后加入1％柠檬酸三钠溶液反应30min，加热至沸，再按10:1的比例加入对应量的1mmol/L HAuCl4溶液反应1h，得到蓝紫色Au@PB@Au NPs(简称Au@Au NPs)纳米胶体，离心洗涤备用。
4)Au@Au表面修饰-COOH：将2mL Au@Au NPs加入10-6M的SH-PEG-COOH，在核壳结构表面修饰上-COOH。离心洗涤后得到Au@Au@COOH NPs。
5)活化-COOH：在Au@Au@COOH NPs中加入20μL,34mmol/L的EDC和17mmol/L的NHS溶液，反应30min，离心后备用。
6)修饰IL-6抗体：活化好的Au@Au NPs加入5ng/mL的IL-6抗体，反应1h，4℃下孵育24h，离心洗涤后重分散在PBS溶液中，得到IL-6检测探针粒子溶液。
7)改性玻璃片的制备：将玻璃片(5mm×5mm×1mm)浸泡于无水乙醇超声后干燥处理，除去玻璃片表面残留的油渍和有机物。再将玻璃片与“食人鱼”溶液(V(H2SO4):V(H2O2)＝7:3)进行反应(95℃，40min)，反应后用乙醇和水冲洗后得到修饰大量-OH基团的玻璃片。再将玻璃片浸没于10％APTES的醇水(10％水)溶液中，反应24h后，用水和乙醇反复冲洗，在110℃下进行30min的缩合反应，玻璃片浸泡在超纯水中备用。
8)Ag NPs胶体的制备：100mL水中加入18mg AgNO3，加热至沸，立即加入10mL 1％柠檬酸三钠，继续反应1h得到灰绿色Ag NPs纳米胶体，离心洗涤后定容至原体积备用。
9)二维银基底的制备：将步骤7)制备出来的改性玻璃片浸泡在步骤8)的Ag NPs胶体溶液(500μL)24h，取出后冲洗去没有修饰上的Ag NPs胶体。
10)特异性吸附IL-6二维银基底的制备：在银基底修饰上可以吸附糖蛋白的4-MPBA，将二维银片玻璃基底浸泡在4-MPBA中，浸泡时间为12h，利用Ag-S键的连接将4-MPBA固载在银膜上，再用乙醇冲去未修饰的4-MPBA，最后再用PBS冲洗，得到捕获IL-6的SERS二维基底。
11)IL-6样品的检测：将不同浓度IL-6标准溶液(0.5、5、50、500、5000、50000pg/mL)与二维SERS基底充分接触1h，PBS溶液冲洗后，加入100μL 0.2％BSA溶液反应20min，减少其他非特异性抗体的吸附。而后加入修饰有IL-6抗体的Au@Au球形核壳结构共孵育1h后，用PBS溶液洗去未结合上目标分子SERS探针，自然干燥后使用雷尼绍拉曼光谱仪进行拉曼信号检测，以IL-6检测探针粒子中PB特征峰2172cm-1作为IL-6检测拉曼信号峰，得到对应浓度的拉曼图谱。再用二维基底上4-MPBA的特征拉曼峰1070cm-1作为标准峰进行校准。
12)血液样品中IL-6的检测：选用白血病患者的血液，离心除去大分子物质。加入不同浓度IL-6(5，15，25μg/mL)旋转30min达到完全混合，得到不同浓度IL-6血液样品溶液。之后的血液样品检测过程与IL-6标准溶液相同，测得血液样品中IL-6拉曼光谱。
13)工作曲线：校准后的拉曼谱图选取2172cm-1峰值，做其随浓度对数变化的工作曲线，工作曲线为：y＝296.81x+3872.74，R2＝0.9928，表现出很好的线性。
实施例10
1)Au NPs胶体的制备：99mL水中加入1mL 1％的HAuCl4溶液，加热至沸后加入1mL1％柠檬酸三钠溶液，剧烈搅拌下继续沸腾15min直至还原反应完全，得到酒红色Au NPs纳米胶体，离心洗涤备用。
2)Au@PB纳米颗粒的制备：Au NPs胶体溶液中加入K3[Fe(CN)6]的水溶液(0.5mmol/L)，使CN-在Au NPs纳米颗粒表面形成刻蚀。使用步进电机将适宜体积的K4[Fe(CN)6](0.1mmol/L)和FeCl3·6H2O(0.1mmol/L)以相同的速度(0.1mL/min)同时滴入刻蚀好的AuNPs胶体溶液中，生成普鲁士蓝(PB)。Au@PB纳米粒子溶液离心洗涤后重新分散到超纯水中备用。
3)Au@Au纳米粒子的制备：将上述制备好的Au@PB胶体溶液浓缩10倍后加入1％柠檬酸三钠溶液反应30min，加热至沸，再按10:1的比例加入对应量的1mmol/L HAuCl4溶液反应1h，得到蓝紫色Au@PB@Au NPs(简称Au@Au NPs)纳米胶体，离心洗涤备用。
4)Au@Au表面修饰-COOH：将2mL Au@Au NPs加入10-6M的SH-PEG-COOH，在核壳结构表面修饰上-COOH。离心洗涤后得到Au@Au@COOH NPs。
5)活化-COOH：在Au@Au@COOH NPs中加入20μL,34mmol/L的EDC和17mmol/L的NHS溶液，反应30min，离心后备用。
6)修饰IL-6抗体：活化好的Au@Au NPs加入5ng/mL的IL-6抗体，反应1h，4℃下孵育24h，离心洗涤后重分散在PBS溶液中，得到IL-6检测探针粒子溶液。
7)改性玻璃片的制备：将玻璃片(5mm×5mm×1mm)浸泡于无水乙醇超声后干燥处理，除去玻璃片表面残留的油渍和有机物。再将玻璃片与“食人鱼”溶液(V(H2SO4):V(H2O2)＝7:3)进行反应(95℃，40min)，反应后用乙醇和水冲洗后得到修饰大量-OH基团的玻璃片。再将玻璃片浸没于10％APTES的醇水(10％水)溶液中，反应24h后，用水和乙醇反复冲洗，在110℃下进行30min的缩合反应，玻璃片浸泡在超纯水中备用。
8)Ag NPs胶体的制备：100mL水中加入18mg AgNO3，加热至沸，立即加入10mL 1％柠檬酸三钠，继续反应1h得到灰绿色Ag NPs纳米胶体，离心洗涤后定容至原体积备用。
9)二维银基底的制备：将步骤7)制备出来的改性玻璃片浸泡在步骤8)的Ag NPs胶体溶液(500μL)24h，取出后冲洗去没有修饰上的Ag NPs胶体。
10)特异性吸附IL-6二维银基底的制备：在银基底修饰上可以吸附糖蛋白的4-MPBA，将二维银片玻璃基底浸泡在4-MPBA中，浸泡时间为48h，利用Ag-S键的连接将4-MPBA固载在银膜上，再用乙醇冲去未修饰的4-MPBA，最后再用PBS冲洗，得到捕获IL-6的SERS二维基底。
11)IL-6样品的检测：将不同浓度IL-6标准溶液(0.5、5、50、500、5000、50000pg/mL)与二维SERS基底充分接触1h，PBS溶液冲洗后，加入100μL 0.2％BSA溶液反应20min，减少其他非特异性抗体的吸附。而后加入修饰有IL-6抗体的Au@Au球形核壳结构共孵育1h后，用PBS溶液洗去未结合上目标分子SERS探针，自然干燥后使用雷尼绍拉曼光谱仪进行拉曼信号检测，以IL-6检测探针粒子中PB特征峰2172cm-1作为IL-6检测拉曼信号峰，得到对应浓度的拉曼图谱。再用二维基底上4-MPBA的特征拉曼峰1070cm-1作为标准峰进行校准。
12)血液样品中IL-6的检测：选用白血病患者的血液，离心除去大分子物质。加入不同浓度IL-6(5，15，25μg/mL)旋转30min达到完全混合，得到不同浓度IL-6血液样品溶液。之后的血液样品检测过程与IL-6标准溶液相同，测得血液样品中IL-6拉曼光谱。
13)工作曲线：校准后的拉曼谱图选取2172cm-1峰值，做其随浓度对数变化的工作曲线，工作曲线为：y＝296.81x+3872.74，R2＝0.9928，表现出很好的线性。
实验数据：
1、图2测试步骤：各取20μL实施例2制备的Au NPs、Au@PB NPs和Au@Au NPs滴在碳涂层铜网格上，室温下干燥，用透射电子显微镜对Au NPs、Au@PB NPs和Au@Au NPs进行形貌表征。
由图2我们可知根据实验配方制备出来的AuNPs纳米胶体大小20-30nm，纳米粒子大小分布均匀，胶体溶液均一稳定，溶液呈酒红色。修饰上PB分子后，可以观察到Au粒子上成功修饰上了PB分子，Au@PB纳米粒子呈现大小均匀的状态。再经过金壳的包裹后，合成了大小约30-40nm的Au@Au NPs。壳层厚度均匀。
2、图3测试步骤：各取20μL实施例2制备的玻璃基底上修饰Ag NPs、银膜上接载上4-MPBA、存在目标分子IL-6后加入对应Au@Au探针滴在专用铝板上，在样品表面镀上一层金膜，用扫描电子显微镜进行扫描。
由图3我们可以知道本方案合成的SERS基底分布均匀，银纳米粒子基本呈单分子层分布。由于4-MPBA是小分子物质，在扫面电镜下观察不到明显现象，因此修饰上4-MPBA后，银膜在电镜图里基本没有很大差别。随后加入IL-6抗原，识别上对应的Au@Au探针后，冲洗多余的探针，发现有IL-6存在的情况下，探针被吸附在二维基底上，实现特异性检测IL-6的目的，证明该方案有效。
3、图4测试步骤：各移取实施例2中制备的Au NPs、Au@PB NPs、PB和Au@Au NPs 500μL滴入石英皿中，在室温下用紫外分光光度计记录紫外-可见吸收光谱，扫描范围350-800nm。
由图4可知修饰上PB分子后，Au纳米粒子的等离子共振峰从529nm蓝移至523nm，同时在701nm处出现了新的共振峰，而这处峰属于PB分子的吸收峰，这就意味着，PB分子成功刻蚀在Au纳米粒子上。而随着金壳的形成，Au@PB@Au NPs的共振吸收峰红移至554nm，胶体也从酒红色变成蓝紫色，这表明纳米粒子的粒径变大，侧面证明成功包裹上金壳。由图中的插图也能看出胶体溶液颜色的变化。
4、图5测试步骤：取实施例2中制备的Au NPs、Au@PB NPs、Au@PB@Au NPs离心后滴在铝片上，用雷尼绍拉曼光谱仪进行拉曼信号检测，得到对应SERS光谱。
由图5可知，PB分子信号峰比较清晰，没有其他拉曼峰存在干扰，并且在包裹上金壳后，Au@PB@Au NPs SERS信号比起单纯的Au@PB NPs增强4倍左右。此外，金壳除了能达到良好的增强效果之外，还能保护PB分子，排除其他环境因素的干扰。选用此核壳纳米粒子作为探针可以很好地进行定量检测。
5、图6测试步骤：各移取500μL实施例1-5中制备的Au@Au NPs和没有修饰SH-PEG-COOH的Au@Au NPs滴入石英皿中，在室温下用紫外分光光度计记录紫外-可见吸收光谱，扫描范围400-800nm。
6、图7测试步骤：取实施例1-5中制备的Au@Au NPs和没有修饰SH-PEG-COOH的Au@Au NPs离心后滴在铝片上，用雷尼绍拉曼光谱仪进行拉曼信号检测，选取2172cm-1处的特征峰做对应浓度的变化图。再用Malvern-Zetasizer纳米仪器测定三种粒子的zeta电位，做对应浓度的变化图。
由图6可得，在核壳纳米粒子上修饰不同浓度的SH-PEG-COOH溶液，(a-e分别代表10-5、10-6、10-7、10-8、10-9M)的SH-PEG-COOH修饰的核壳结构纳米粒子的紫外共振峰，发现紫外峰几乎没有发生变化，只有当浓度为10-6M时，在676nm处出现了新的振动峰，同时，观察它们对应的zeta电位和拉曼信号强度(图7)也可以看出，修饰上SH-PEG-COOH后，Au@Au NPs的电位从-33.4±3.2mv下降到-41.1mv±2.1mv，而拉曼信号也有所减弱，这可能是因为SH-PEG-COOH在纳米粒子表面形成分子层，造成不同程度的粒子排斥，从而使信号有所减弱，这些结果表明它们成功地附着在Au@Au NPs的表面。但可以看出，当修饰浓度为10-6M时，SERS的增强信号最好，这是由于该浓度下，SH-PEG-COOH分子正好形成饱和状态，控制粒子与粒子间的间隙，形成共振增强。因此，选用该浓度修饰的Au@Au@COOH NPs做接下来的探针合成。
7、图8测试步骤：取实例2、实例6-10制备的修饰有4-MPBA的银片基底，选用4-MPBA的拉曼特征峰1070cm-1处的峰强作为成像条件，扫描30μm×30μm区域不同银片上的1070cm-1处的峰强分布情况。
由图8可知，银片基底随着4-MPBA修饰时间的增长，4-MPBA在银膜上的吸附量逐渐增多，当修饰时间达到24h时，达到分布均匀的效果，当时间再提高到48小时，强度基本没有变化。说明24h可以让4-MPBA的修饰达到饱和。
8、图9测试步骤：取实例2、实例6-10制备的修饰有4-MPBA的银片基底离心后滴在铝片上，用雷尼绍拉曼光谱仪进行拉曼信号检测，选取1070cm-1处的特征峰做对应浸泡时间的变化图。
由图9得出的结论与图8相符，当修饰时间达到12h时，标准偏差为2.8％，强度变化逐渐变小。但是这时候分布还不够均匀，当修饰时间达到24h时，分布均匀，而且RSD只有5.8％。而后，随着修饰时间的增加，强度基本没有变化，说明24h时，4-MPBA的修饰已经达到饱和状态。
9、图10-11测试步骤：将不同浓度IL-6标准溶液(0.5、5、50、500、5000、50000pg/mL)与二维SERS基底充分接触1h，PBS溶液冲洗后，加入100μL 0.2％BSA溶液反应20min，减少其他非特异性抗体的吸附。而后加入修饰有IL-6抗体的Au@Au球形核壳结构共孵育1h后，用PBS溶液洗去未结合上目标分子IL-6的SERS探针，自然干燥后使用雷尼绍拉曼光谱仪进行拉曼信号检测，得到对应浓度的拉曼图谱。以特征峰2172cm-1强度做对应浓度对数的曲线。图中i-vi分别对应的是实施例2中不同浓度(0.5、5、50、500、5000、50000pg/mL)的IL6的拉曼光谱图。
10、图12-13测试步骤：与上述相同，再用二维基底上4-MPBA的特征拉曼峰1070cm-1作为标准峰进行校准。
由图10-13可以得出，随着IL-6浓度的增加，2172cm-1处的SERS信号就越强，这表明IL-6加入的越多，二维基板上吸附下来的IL-6检测探针粒子就越多。为了防止后续实际样品检测过程中，其他杂质的干扰，利用二维基底上4-MPBA的特征拉曼峰1070cm-1处作为标准峰，对图10光谱进行校准，得到图12的光谱图。校准后的谱图在2172cm-1处的峰值随浓度变化情况更加有规律。将图10与12中2172cm-1处的峰值选出，分别做起随浓度对数变化的工作曲线(图11和13)。其中经过1070cm-1归一化后的工作曲线(图13)线性(R2＝0.9928)明显比未校准的工作曲线线性(R2＝0.9163)要好。所以，选用归一化后的工作曲线作为后续真实样品中IL-6的检测模型。
图14测试步骤：将处理好的IL-6血液样品(5，15，25μg/mL)如上述IL-6标准溶液测试方式进行检测，得到血液中不同IL-6含量的拉曼光谱图。
如图14可得，随着IL-6添加量的增多，2172cm-1处的强度也同时增强。证明该方案具有实际应用的特点。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种基于SERS技术检测血液中IL-6的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)改性Au@Au球形核壳结构的制备：带普鲁士蓝内标的Au@Au NPs溶液活化后修饰上用于识别IL-6的IL-6抗体，得到改性Au@Au球形纳米粒子；
2)捕获IL-6的SERS二维基底的制备：将修饰有氨基的玻璃片没入Ag NPs胶体中，浸泡24h后取出，用超纯水冲去多余Ag NPs胶体，得到二维银片基底；利用Ag-S键的连接将4-MPBA固载在银膜上，再用乙醇冲去未修饰的4-MPBA，最后再用PBS冲洗，得到捕获IL-6的SERS二维基底；
3)IL-6标准样品的检测：将不同浓度的IL-6标准溶液与二维SERS基底充分接触1h，PBS溶液冲洗后，加入100μL 0.2％BSA溶液反应20min，；而后加入修饰有IL-6抗体的改性Au@Au球形核壳结构共孵育1h后，用PBS溶液洗去未结合上目标分子IL-6的SERS探针，自然干燥后进行SERS检测，建立工作曲线和进行成像检测；
4)血液样品中IL-6的检测：选用白血病患者的血液，离心除去大分子物质；加入浓度为5-25μg/mL的IL-6旋转30min达到完全混合，得到IL-6血液样品溶液；检测过程与步骤(3)中IL-6标准溶液检测步骤相同，测得血液样品中IL-6拉曼光谱，带入步骤(3)获得的标准曲线进行计算，求出血液样品中IL-6浓度。
2.根据权利要求1所述的一种基于SERS技术检测血液中IL-6的方法，其特征在于，步骤1)具体步骤如下：将2mL的Au@Au NPs胶体加入等体积浓度分别为10-5、10-6、10-7、10-8、10-9M的SH-PEG-COOH溶液中，在核壳结构表面修饰上-COOH；离心洗涤后得到Au@Au@COOH NPs，活化-COOH以便于修饰抗体；活化好的Au@Au NPs加入5ng/mL的IL-6抗体，反应1h，4℃下孵育24h，离心洗涤后重分散在PBS溶液中，得到改性的Au@Au球形纳米粒子。
3.根据权利要求2所述的一种基于SERS技术检测血液中IL-6的方法，其特征在于，Au@Au NPs核壳胶体溶液制备方法如下：将2mL的Au NPs胶体中加入浓度为0.5mmol/L的K3[Fe(CN)6]的水溶液，用于刻蚀Au NPs纳米颗粒表面；均速将浓度均为0.1mmol/L的0.2-2mL的K4[Fe(CN)6]和等量的FeCl3·6H2O同时滴入刻蚀好的Au NPs胶体溶液中，生成普鲁士蓝；Au@PB纳米粒子溶液离心洗涤后重新分散到超纯水中，浓缩10倍体积后加入1％柠檬酸三钠溶液反应30min，加热至沸，按10:1的体积比加入对应量的1mmol/L HAuCl4溶液反应1h，得到蓝紫色Au@Au NPs纳米胶体，离心洗涤备用。
4.根据权利要求3所述的一种基于SERS技术检测血液中IL-6的方法，其特征在于，AuNPs胶体溶液制备方法如下：99mL水中加入1mL 1％质量百分比的HAuCl4溶液，加热至沸后加入1mL 1％柠檬酸三钠溶液，剧烈搅拌下继续沸腾15min直至还原反应完全，得到酒红色Au NPs纳米胶体，离心洗涤备用。
5.根据权利要求2所述的一种基于SERS技术检测血液中IL-6的方法，其特征在于，活化-COOH的方法如下：在Au@Au@COOH NPs中加入20μL,34mmol/L的EDC和17mmol/L的NHS溶液，反应30min，离心后备用。
6.根据权利要求1所述的一种基于SERS技术检测血液中IL-6的方法，其特征在于，步骤2)中修饰有氨基的玻璃片制备方法如下：将玻璃片浸泡于无水乙醇超声后干燥处理，除去玻璃片表面残留的油渍和有机物；再将玻璃片与“食人鱼”溶液进行反应；，反应后用乙醇和水冲洗后得到修饰大量-OH基团的玻璃片；再将玻璃片浸没于体积百分比10％3-氨丙基三乙氧基硅烷的醇水溶液中，反应24h后，用水和乙醇反复冲洗，在110℃下进行30min的缩合反应，玻璃片浸泡在超纯水中备用。
7.根据权利要求1所述的一种基于SERS技术检测血液中IL-6的方法，其特征在于，步骤2)中Ag NPs胶体制备方法如下：100mL水中加入18mg AgNO3，加热至沸，立即加入10mL1％柠檬酸三钠，继续反应1h得到灰绿色Ag NPs纳米胶体，离心洗涤后备用。
8.根据权利要求6所述的一种基于SERS技术检测血液中IL-6的方法，其特征在于：食人鱼为体积比为3:7的过氧化氢与浓硫酸。
9.根据权利要求1所述的一种基于SERS技术检测血液中IL-6的方法，其特征在于：步骤3)的工作曲线为y＝296.81x+3872.74。
10.根据权利要求1所述的一种基于SERS技术检测血液中IL-6的方法，其特征在于：IL-6的检测范围为0.5-50000pg/mL。
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