CN104697977A - 一种硅基sers多功能芯片及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于细菌捕获、细菌检测和抗菌的硅基SERS多功能芯片及其制备方法，将SERS技术与银离子抗菌技术相结合，首先采用氢氟酸辅助的硝酸银还原法制备银纳米颗粒修饰的硅片SERS基底，然后在基底表面修饰上细菌连接分子用于细菌捕获。本发明构建的SERS芯片细菌捕获效率可以达到约60％；该芯片具有较好的SERS信号重现性；根据不同细菌的SERS特征指纹图谱，可以快速有效地检测实际体系中浓度低至1.0×102cell·mL-1的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌；而且该芯片具有优异的抗菌能力，其基底释放的银离子可以抑制细菌生长，其抗菌效率可以达到约97％。
Description
技术领域
本发明属于生物与拉曼光谱检测技术领域，涉及一种表面增强拉曼散射(Surface-Enhanced Raman Scattering，全文简称：SERS)芯片及其制备方法，具体涉及一种用于细菌捕获、检测和抗菌的硅基SERS多功能芯片及其制备方法。
背景技术
每年由病原菌感染引起的严重的乃至危及生命的疾病超过3亿例(例如：肺结核、超级抗药菌等)，导致每年超过200万人为此丧生(参见：Clin.Microbiol.Rev.2005,18,195-204)。目前达成的广泛共识是细菌感染诊断的越早，病人的成活率越高。因此，快速、灵敏同时低成本地检测临床样品(例如：患者唾液、痰和血液)中的病原菌变得十分重要。目前，临床上运用较为成熟、经典的检测病原菌的方法是细菌培养，然而这种方法较为复杂且费时，其流程通常包括选择性培养基中培养数天、细菌菌落的形态观察以及细菌代谢产物的免疫分析等(参见：J.Clin.Microbiol.1999,37,2024-2026)。
为了解决这一问题，研究者们已经采用多种光学分析方法成功实现快速(数十分钟到几小时)和高灵敏(单细胞水平)的细菌分析检测，这些方法包括基于胶体金的比色分析、基于荧光或化学发光的生物探针以及基于表面增强拉曼光谱(SERS)的光谱分析等(参见：Nat.Nanotech.2013,8,369-375；Angew.Chem.Int.Ed.2014,53,13734-13739；Nat.Commun.2013,4,1752)。SERS可以通过电磁场效应(electromagnetic effect)与化学效应(chemical effect)极大地增强拉曼信号(理论上可放大约1012～1014倍)，这种增强使得细菌等分析物在极低浓度也能够得到清晰的SERS指纹谱(参见：Anal.Chem.2014,86,1525-1533)。SERS对于外界因素的抗干扰能力也很强(例如：湿度、氧气等)，该技术能够在各种各样复杂的实际体系中应用。而且SERS检测细菌时操作简单，无需染色或者特异性标记，不会破坏样品本身。
尽管目前已经有不少报道将SERS技术应用于细菌检测中，越来越多的人开始关注发展新的SERS多功能分析平台，期望同时实现细菌的捕获、检测、抗菌。然而，现有技术中尚无关于采用硅基SERS多功能平台对实际体系中细菌进行捕获、检测和抗菌的详细报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种能同时实现细菌捕获、检测和抗菌的硅基SERS多功能芯片及其制备方法。
为实现上述目的，本发明将SERS技术与银离子抗菌技术相结合，首先采用氢氟酸辅助的硝酸银还原法制备银纳米颗粒(AgNPs)修饰的硅片SERS基底(AgNPsSi)，然后在基底表面修饰上细菌连接分子【4-巯基苯硼酸(4-MPBA)或万古霉素】用于细菌捕获。
具体的，本发明提供如下技术方案：
本发明的硅基SERS多功能芯片的制备方法，包括下述步骤：
(1)首先将硅晶片依次用去离子水、丙酮、去离子水进行超声清洗，再放入浓硫酸和过氧化氢混合溶液进一步清洗，然后再用去离子水清洗，得到干净的硅晶片；
优选的，所述的硅晶片为0.01～20Ω*cm的p型或n型硅晶片，尺寸为0.25～10cm2。
优选的，所述的过氧化氢溶液质量浓度为10～40％，浓硫酸和过氧化氢体积比＝1:(0.01～100)。
(2)将步骤(1)清洗干净的硅晶片置入氟化氢溶液中进行振荡反应，得到表面覆盖大量硅-氢键(Si-H)的硅晶片；
优选的，所述的氟化氢溶液质量浓度为1～40％。
进一步的，将步骤(1)清洗干净的硅晶片置入氟化氢溶液中进行振荡反应1～60分钟。
(3)将步骤(2)得到的硅晶片放入硝酸银和氟化氢的混合溶液中振荡反应，得到表面均匀的原位生长一层银纳米粒子的硅晶片(AgNPsSi)；
优选的，所述的硝酸银溶液浓度为1～5M，氟化氢溶液质量浓度为1～40％，硝酸银溶液和氟化氢溶液体积比＝1:(0.01～100)。
进一步的，将步骤(2)得到的硅晶片放入硝酸银和氟化氢的混合溶液中振荡反应1～60分钟。
(4)将步骤(3)得到的银纳米粒子修饰的硅晶片放入含有细菌连接分子的溶液中震荡反应，在银纳米颗粒表面修饰上细菌连接分子；
优选的，所述的细菌连接分子为4-巯基苯硼酸或万古霉素，其浓度为0.01～100mM。
进一步的，将步骤(3)得到的银纳米粒子修饰的硅晶片放入细菌连接分子的溶液中振荡反应1～24小时。
(5)将步骤(4)得到的材料取出，去离子水洗涤后氮气吹干，得到AgNPsSi修饰上细菌连接分子的硅基SERS多功能芯片。
优选的，将步骤(4)得到的材料取出，去离子水洗涤2～5次后氮气吹干。
将通过上述方法制备得到的硅基SERS多功能芯片加入细菌溶液中，缓慢搅动直至细菌较均一地吸附在芯片表面，除去细菌溶液，用PBS缓冲液冲洗芯片多次除去非特异吸附的细菌，拉曼分析细菌特征图谱；
优选的，所述的细菌浓度为1.0×102～1.0×108cell·mL-1；
优选的，PBS缓冲液冲洗芯片的次数为2～5次；
进一步的，将制备得到的硅基SERS多功能芯片置入细菌溶液中缓慢搅动5～40min。
将通过上述方法制备得到的硅基SERS多功能芯片与细菌溶液在37℃的恒温振荡仪中培养，随后转移到其他的圆底试管中，用数码相机对样品拍照记录，然后取一定量的菌液，经过适当的稀释后，均匀的涂布在LB琼脂板上，然后将琼脂板倒置，在37℃下培养24小时，随后用凝胶成像仪对生长在琼脂板上的菌落进行成像，然后对琼脂板上的菌落进行计数来考察芯片抗菌能力。
优选的，所述的细菌浓度为1.0×102～1.0×104cell·mL-1；
进一步的，将制备得到的硅基SERS多功能芯片与细菌溶液在37℃的恒温振荡仪中培养12～24小时。
本发明也提供了一种基于上述方法制备得到的硅基SERS多功能芯片。
本发明构建的SERS芯片细菌捕获效率可以达到约60％；该芯片具有较好的SERS信号重现性(RSD：约11.0％)；根据不同细菌的SERS特征指纹图谱，可以快速有效地检测实际体系中浓度低至1.0×102cell·mL-1的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌；而且该芯片具有优异的抗菌能力，其基底释放的银离子可以抑制细菌生长，其抗菌效率可以达到约97％。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的有关本发明的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明的硅基SERS多功能芯片用于细菌捕获、检测和抗菌的原理图；
图2是本发明制备得到的硅基SERS多功能芯片的扫描电镜(a)和原子力显微镜(b)表征照片；
图3是本发明制备得到的硅基SERS多功能芯片对大肠杆菌(a)和金黄色葡萄球菌(b)捕获的扫描电镜表征照片；
图4是本发明制备得到的硅基SERS多功能芯片对大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)检测的SERS图谱；
图5是本发明制备得到的硅基SERS多功能芯片抑制大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)生长的图片。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行详细的描述。
本发明所用的原料可由市场自由购得，均为分析纯；
实施例1
取1cm2大小单硅晶片3～6片置于洁净烧杯中于超声仪中依次用去离子水、丙酮、去离子水超声15分钟，得到表面无杂质无有机物的硅片备用。取40mL 98wt％硫酸和30wt％的过氧化氢体积比3：1的混合溶液，边加边缓慢摇匀。然后将硅片投入其中浸泡30分钟后以去除难溶杂质，然后去离子水清洗3～5次去除反应溶液备用。
用10wt％氢氟酸浸泡硅片20分钟去除硅片表面的二氧化硅氧化层，使硅片表面形成Si-H键，然后将硅片平铺于培养皿中，光面朝上，向其中迅速加入15mL硝酸银溶液(2.5mM)进行反应20分钟，根据电化学反应原理，银离子被Si-H键还原，在硅片表面原位生长一层均匀银纳米粒子，从而得到表面修饰银纳米颗粒的硅晶片，放入含有1mM 4-巯基苯硼酸的溶液中震荡反应6h，最后用氮气吹干表面，即可得到硅基SERS多功能芯片。
将得到的硅基SERS多功能芯片加入1.0×103cell·mL-1细菌的溶液中，缓慢搅动20min，确保细菌较均一地吸附在芯片表面，除去细菌溶液，用PBS缓冲液冲洗芯片3次除去非特异吸附的细菌，拉曼分析细菌特征图谱；将得到的硅基SERS多功能芯片与1.0×103cell·mL-1细菌溶液在37℃的恒温振荡仪中培养18小时，随后转移到其他的圆底试管中，用数码相机对样品拍照记录，然后取一定量的菌液，经过适当的稀释后，均匀的涂布在LB琼脂板上，然后将琼脂板倒置，在37℃下培养24小时，随后用凝胶成像仪对生长在琼脂板上的菌落进行成像，然后对琼脂板上的菌落进行计数来考察芯片抗菌能力。
实施例2
取1cm2大小单硅晶片3～6片置于洁净烧杯中于超声仪中依次用去离子水、丙酮、去离子水超声15分钟，得到表面无杂质无有机物的硅片备用。取40mL 98wt％硫酸和30wt％的过氧化氢体积比3：1的混合溶液，边加边缓慢摇匀。然后将硅片投入其中浸泡30分钟后以去除难溶杂质，然后去离子水清洗3～5次去除反应溶液备用。
用15wt％氢氟酸浸泡硅片20分钟去除硅片表面的二氧化硅氧化层，使硅片表面形成Si-H键，然后将硅片平铺于培养皿中，光面朝上，向其中迅速加入15mL硝酸银溶液(3.0mM)进行反应30分钟，根据电化学反应原理，银离子被Si-H键还原，在硅片表面原位生长一层均匀银纳米粒子，从而得到表面修饰银纳米颗粒的硅晶片，放入含有5mM 4-巯基苯硼酸的溶液中震荡反应12h，最后用氮气吹干表面，即可得到硅基SERS多功能芯片。
将得到的硅基SERS多功能芯片加入1.0×103cell·mL-1细菌的溶液中，缓慢搅动20min，确保细菌较均一地吸附在芯片表面，除去细菌溶液，用PBS缓冲液冲洗芯片3次除去非特异吸附的细菌，拉曼分析细菌特征图谱；将得到的硅基SERS多功能芯片与1.0×103cell·mL-1细菌溶液在37℃的恒温振荡仪中培养18小时，随后转移到其他的圆底试管中，用数码相机对样品拍照记录，然后取一定量的菌液，经过适当的稀释后，均匀的涂布在LB琼脂板上，然后将琼脂板倒置，在37℃下培养24小时，随后用凝胶成像仪对生长在琼脂板上的菌落进行成像，然后对琼脂板上的菌落进行计数来考察芯片抗菌能力。
实施例3
取1cm2大小单硅晶片3～6片置于洁净烧杯中于超声仪中依次用去离子水、丙酮、去离子水超声15分钟，得到表面无杂质无有机物的硅片备用。取40mL 98wt％硫酸和30wt％的过氧化氢体积比3：1的混合溶液，边加边缓慢摇匀。然后将硅片投入其中浸泡30分钟后以去除难溶杂质，然后去离子水清洗3～5次去除反应溶液备用。
用30wt％氢氟酸浸泡硅片20分钟去除硅片表面的二氧化硅氧化层，使硅片表面形成Si-H键，然后将硅片平铺于培养皿中，光面朝上，向其中迅速加入15mL硝酸银溶液(4.0mM)进行反应40分钟，根据电化学反应原理，银离子被Si-H键还原，在硅片表面原位生长一层均匀银纳米粒子，从而得到表面修饰银纳米颗粒的硅晶片，放入含有10mM 4-巯基苯硼酸的溶液中震荡反应18h，最后用氮气吹干表面，即可得到硅基SERS多功能芯片。
将得到的硅基SERS多功能芯片加入1.0×103cell·mL-1细菌的溶液中，缓慢搅动20min，确保细菌较均一地吸附在芯片表面，除去细菌溶液，用PBS缓冲液冲洗芯片3次除去非特异吸附的细菌，拉曼分析细菌特征图谱；将得到的硅基SERS多功能芯片与1.0×103cell·mL-1细菌溶液在37℃的恒温振荡仪中培养18小时，随后转移到其他的圆底试管中，用数码相机对样品拍照记录，然后取一定量的菌液，经过适当的稀释后，均匀的涂布在LB琼脂板上，然后将琼脂板倒置，在37℃下培养24小时，随后用凝胶成像仪对生长在琼脂板上的菌落进行成像，然后对琼脂板上的菌落进行计数来考察芯片抗菌能力。
实施例4
取1cm2大小单硅晶片3～6片置于洁净烧杯中于超声仪中依次用去离子水、丙酮、去离子水超声15分钟，得到表面无杂质无有机物的硅片备用。取40mL 98wt％硫酸和30wt％的过氧化氢体积比3：1的混合溶液，边加边缓慢摇匀。然后将硅片投入其中浸泡30分钟后以去除难溶杂质，然后去离子水清洗3～5次去除反应溶液备用。
用40wt％氢氟酸浸泡硅片40分钟去除硅片表面的二氧化硅氧化层，使硅片表面形成Si-H键，然后将硅片平铺于培养皿中，光面朝上，向其中迅速加入15mL硝酸银溶液(5.0mM)进行反应20分钟，根据电化学反应原理，银离子被Si-H键还原，在硅片表面原位生长一层均匀银纳米粒子，从而得到表面修饰银纳米颗粒的硅晶片，放入含有40mM 4-巯基苯硼酸的溶液中震荡反应24h，最后用氮气吹干表面，即可得到硅基SERS多功能芯片。
将得到的硅基SERS多功能芯片加入5.0×102cell·mL-1细菌的溶液中，缓慢搅动30min，确保细菌较均一地吸附在芯片表面，除去细菌溶液，用PBS缓冲液冲洗芯片3次除去非特异吸附的细菌，拉曼分析细菌特征图谱；将得到的硅基SERS多功能芯片与1.0×103cell·mL-1细菌溶液在37℃的恒温振荡仪中培养18小时，随后转移到其他的圆底试管中，用数码相机对样品拍照记录，然后取一定量的菌液，经过适当的稀释后，均匀的涂布在LB琼脂板上，然后将琼脂板倒置，在37℃下培养24小时，随后用凝胶成像仪对生长在琼脂板上的菌落进行成像，然后对琼脂板上的菌落进行计数来考察芯片抗菌能力。
实施例5
取5cm2大小单硅晶片3～6片置于洁净烧杯中于超声仪中依次用去离子水、丙酮、去离子水超声15分钟，得到表面无杂质无有机物的硅片备用。取40mL 98wt％硫酸和30wt％的过氧化氢体积比3：1的混合溶液，边加边缓慢摇匀。然后将硅片投入其中浸泡30分钟后以去除难溶杂质，然后去离子水清洗3～5次去除反应溶液备用。
用10wt％氢氟酸浸泡硅片30分钟去除硅片表面的二氧化硅氧化层，使硅片表面形成Si-H键，然后将硅片平铺于培养皿中，光面朝上，向其中迅速加入15mL硝酸银溶液(2.0mM)进行反应30分钟，根据电化学反应原理，银离子被Si-H键还原，在硅片表面原位生长一层均匀银纳米粒子，从而得到表面修饰银纳米颗粒的硅晶片，放入含有50mM 4-巯基苯硼酸的溶液中震荡反应24h，最后用氮气吹干表面，即可得到硅基SERS多功能芯片。
将得到的硅基SERS多功能芯片加入5.0×102cell·mL-1细菌的溶液中，缓慢搅动30min，确保细菌较均一地吸附在芯片表面，除去细菌溶液，用PBS缓冲液冲洗芯片3次除去非特异吸附的细菌，拉曼分析细菌特征图谱；将得到的硅基SERS多功能芯片与1.0×103cell·mL-1细菌溶液在37℃的恒温振荡仪中培养18小时，随后转移到其他的圆底试管中，用数码相机对样品拍照记录，然后取一定量的菌液，经过适当的稀释后，均匀的涂布在LB琼脂板上，然后将琼脂板倒置，在37℃下培养24小时，随后用凝胶成像仪对生长在琼脂板上的菌落进行成像，然后对琼脂板上的菌落进行计数来考察芯片抗菌能力。
实施例6
取1cm2大小单硅晶片3～6片置于洁净烧杯中于超声仪中依次用去离子水、丙酮、去离子水超声15分钟，得到表面无杂质无有机物的硅片备用。取40mL 98wt％硫酸和30wt％的过氧化氢体积比3：1的混合溶液，边加边缓慢摇匀。然后将硅片投入其中浸泡30分钟后以去除难溶杂质，然后去离子水清洗3～5次去除反应溶液备用。
用10wt％氢氟酸浸泡硅片20分钟去除硅片表面的二氧化硅氧化层，使硅片表面形成Si-H键，然后将硅片平铺于培养皿中，光面朝上，向其中迅速加入15mL硝酸银溶液(2.5mM)进行反应20分钟，根据电化学反应原理，银离子被Si-H键还原，在硅片表面原位生长一层均匀银纳米粒子，从而得到表面修饰银纳米颗粒的硅晶片，放入含有0.1mM万古霉素的溶液中震荡反应6h，最后用氮气吹干表面，即可得到硅基SERS多功能芯片。
将得到的硅基SERS多功能芯片加入5.0×102cell·mL-1细菌的溶液中，缓慢搅动30min，确保细菌较均一地吸附在芯片表面，除去细菌溶液，用PBS缓冲液冲洗芯片3次除去非特异吸附的细菌，拉曼分析细菌特征图谱；将得到的硅基SERS多功能芯片与1.0×103cell·mL-1细菌溶液在37℃的恒温振荡仪中培养18小时，随后转移到其他的圆底试管中，用数码相机对样品拍照记录，然后取一定量的菌液，经过适当的稀释后，均匀的涂布在LB琼脂板上，然后将琼脂板倒置，在37℃下培养24小时，随后用凝胶成像仪对生长在琼脂板上的菌落进行成像，然后对琼脂板上的菌落进行计数来考察芯片抗菌能力。
实施例7
取1cm2大小单硅晶片3～6片置于洁净烧杯中于超声仪中依次用去离子水、丙酮、去离子水超声15分钟，得到表面无杂质无有机物的硅片备用。取40mL 98wt％硫酸和30wt％的过氧化氢体积比3：1的混合溶液，边加边缓慢摇匀。然后将硅片投入其中浸泡30分钟后以去除难溶杂质，然后去离子水清洗3～5次去除反应溶液备用。
用15wt％氢氟酸浸泡硅片20分钟去除硅片表面的二氧化硅氧化层，使硅片表面形成Si-H键，然后将硅片平铺于培养皿中，光面朝上，向其中迅速加入15mL硝酸银溶液(3.0mM)进行反应30分钟，根据电化学反应原理，银离子被Si-H键还原，在硅片表面原位生长一层均匀银纳米粒子，从而得到表面修饰银纳米颗粒的硅晶片，放入含有1mM万古霉素的溶液中震荡反应12h，最后用氮气吹干表面，即可得到硅基SERS多功能芯片。
将得到的硅基SERS多功能芯片加入5.0×102cell·mL-1细菌的溶液中，缓慢搅动30min，确保细菌较均一地吸附在芯片表面，除去细菌溶液，用PBS缓冲液冲洗芯片3次除去非特异吸附的细菌，拉曼分析细菌特征图谱；将得到的硅基SERS多功能芯片与4.0×103cell·mL-1细菌溶液在37℃的恒温振荡仪中培养24小时，随后转移到其他的圆底试管中，用数码相机对样品拍照记录，然后取一定量的菌液，经过适当的稀释后，均匀的涂布在LB琼脂板上，然后将琼脂板倒置，在37℃下培养24小时，随后用凝胶成像仪对生长在琼脂板上的菌落进行成像，然后对琼脂板上的菌落进行计数来考察芯片抗菌能力。
实施例8
取1cm2大小单硅晶片3～6片置于洁净烧杯中于超声仪中依次用去离子水、丙酮、去离子水超声15分钟，得到表面无杂质无有机物的硅片备用。取40mL 98wt％硫酸和30wt％的过氧化氢体积比3：1的混合溶液，边加边缓慢摇匀。然后将硅片投入其中浸泡30分钟后以去除难溶杂质，然后去离子水清洗3～5次去除反应溶液备用。
用30wt％氢氟酸浸泡硅片20分钟去除硅片表面的二氧化硅氧化层，使硅片表面形成Si-H键，然后将硅片平铺于培养皿中，光面朝上，向其中迅速加入15mL硝酸银溶液(4.0mM)进行反应40分钟，根据电化学反应原理，银离子被Si-H键还原，在硅片表面原位生长一层均匀银纳米粒子，从而得到表面修饰银纳米颗粒的硅晶片，放入含有10mM万古霉素的溶液中震荡反应18h，最后用氮气吹干表面，即可得到硅基SERS多功能芯片。
将得到的硅基SERS多功能芯片加入5.0×102cell·mL-1细菌的溶液中，缓慢搅动30min，确保细菌较均一地吸附在芯片表面，除去细菌溶液，用PBS缓冲液冲洗芯片3次除去非特异吸附的细菌，拉曼分析细菌特征图谱；将得到的硅基SERS多功能芯片与4.0×103cell·mL-1细菌溶液在37℃的恒温振荡仪中培养24小时，随后转移到其他的圆底试管中，用数码相机对样品拍照记录，然后取一定量的菌液，经过适当的稀释后，均匀的涂布在LB琼脂板上，然后将琼脂板倒置，在37℃下培养24小时，随后用凝胶成像仪对生长在琼脂板上的菌落进行成像，然后对琼脂板上的菌落进行计数来考察芯片抗菌能力。
实施例9
取1cm2大小单硅晶片3～6片置于洁净烧杯中于超声仪中依次用去离子水、丙酮、去离子水超声15分钟，得到表面无杂质无有机物的硅片备用。取40mL 98wt％硫酸和30wt％的过氧化氢体积比3：1的混合溶液，边加边缓慢摇匀。然后将硅片投入其中浸泡30分钟后以去除难溶杂质，然后去离子水清洗3～5次去除反应溶液备用。
用40wt％氢氟酸浸泡硅片40分钟去除硅片表面的二氧化硅氧化层，使硅片表面形成Si-H键，然后将硅片平铺于培养皿中，光面朝上，向其中迅速加入15mL硝酸银溶液(5.0mM)进行反应20分钟，根据电化学反应原理，银离子被Si-H键还原，在硅片表面原位生长一层均匀银纳米粒子，从而得到表面修饰银纳米颗粒的硅晶片，放入含有40mM万古霉素的溶液中震荡反应24h，最后用氮气吹干表面，即可得到硅基SERS多功能芯片。
将得到的硅基SERS多功能芯片加入5.0×102cell·mL-1细菌的溶液中，缓慢搅动30min，确保细菌较均一地吸附在芯片表面，除去细菌溶液，用PBS缓冲液冲洗芯片3次除去非特异吸附的细菌，拉曼分析细菌特征图谱；将得到的硅基SERS多功能芯片与4.0×103cell·mL-1细菌溶液在37℃的恒温振荡仪中培养24小时，随后转移到其他的圆底试管中，用数码相机对样品拍照记录，然后取一定量的菌液，经过适当的稀释后，均匀的涂布在LB琼脂板上，然后将琼脂板倒置，在37℃下培养24小时，随后用凝胶成像仪对生长在琼脂板上的菌落进行成像，然后对琼脂板上的菌落进行计数来考察芯片抗菌能力。
实施例10
取5cm2大小单硅晶片3～6片置于洁净烧杯中于超声仪中依次用去离子水、丙酮、去离子水超声15分钟，得到表面无杂质无有机物的硅片备用。取40mL 98wt％硫酸和30wt％的过氧化氢体积比3：1的混合溶液，边加边缓慢摇匀。然后将硅片投入其中浸泡30分钟后以去除难溶杂质，然后去离子水清洗3～5次去除反应溶液备用。
用10wt％氢氟酸浸泡硅片30分钟去除硅片表面的二氧化硅氧化层，使硅片表面形成Si-H键，然后将硅片平铺于培养皿中，光面朝上，向其中迅速加入15mL硝酸银溶液(2.0mM)进行反应30分钟，根据电化学反应原理，银离子被Si-H键还原，在硅片表面原位生长一层均匀银纳米粒子，从而得到表面修饰银纳米颗粒的硅晶片，放入含有80mM万古霉素的溶液中震荡反应24h，最后用氮气吹干表面，即可得到硅基SERS多功能芯片。
将得到的硅基SERS多功能芯片加入5.0×102cell·mL-1细菌的溶液中，缓慢搅动30min，确保细菌较均一地吸附在芯片表面，除去细菌溶液，用PBS缓冲液冲洗芯片3次除去非特异吸附的细菌，拉曼分析细菌特征图谱；将得到的硅基SERS多功能芯片与4.0×103cell·mL-1细菌溶液在37℃的恒温振荡仪中培养24小时，随后转移到其他的圆底试管中，用数码相机对样品拍照记录，然后取一定量的菌液，经过适当的稀释后，均匀的涂布在LB琼脂板上，然后将琼脂板倒置，在37℃下培养24小时，随后用凝胶成像仪对生长在琼脂板上的菌落进行成像，然后对琼脂板上的菌落进行计数来考察芯片抗菌能力。
图2是本发明制备得到的硅基SERS多功能芯片的扫描电镜(a)和原子力显微镜(b)表征照片，扫描电镜和原子力显微镜表征的结果显示制备的硅基SERS多功能芯片中银纳米颗粒(AgNPs)的尺寸约为100nm,且较均一地分布在硅片表面。
图3是本发明制备得到的硅基SERS多功能芯片对大肠杆菌(a)和金黄色葡萄球菌(b)捕获的扫描电镜表征照片，通过电镜照片显示所制备的硅基SERS多功能芯片可以大量捕获大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。
图4是本发明制备得到的硅基SERS多功能芯片对大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)检测的SERS图谱，其中图A为随机记录芯片上100个点所对应的4-MPBA的SERS图谱，结果显示该芯片具有较好的重现性；图B为E.coli在AgNPsSi上的SERS图谱(I)，S.aureus在AgNPsSi上的SERS图谱(II)，E.coli在4-MPBA-AgNPsSi上的SERS图谱(III)，S.aureus在4-MPBA-AgNPsSi上的SERS图谱(IV)以及单纯4-MPBA-AgNPsSi的SERS图谱；图C-F为芯片浸泡在不同浓度的E.coli的SERS谱图(mapping):1×102(C),1×103(D),1×105(E),1×107cell/mL(F)；图G-J为芯片浸泡在不同浓度的S.aureus的SERS谱图(mapping):1×102(G),1×103(H),1×105(I),1×107cell/mL(J)；实验结果表明制备的芯片可以有效地检测浓度低至1.0×102cell·mL-1的细菌。
图5是本发明制备得到的硅基SERS多功能芯片抑制大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)生长的图片，其中A图为通过液体培养基细菌生长浊度分析对三种基底：硅片(I)，NPsSi(II)和4-MPBA-AgNPsSi(III)抗菌能力的考察；B图为通过细菌菌落计数法定量考察三种基底在液体培养基中的抗菌能力；C图为考察三种基底在固体培养基中的抗菌能力；抗菌结果表明制备的芯片(4-MPBA-AgNPsSi)具有优异的抗菌能力，其抗菌效率可以达到约97％。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (10)
1.一种硅基SERS多功能芯片的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：
(1)首先将硅晶片依次用去离子水、丙酮、去离子水进行超声清洗，再放入浓硫酸和过氧化氢混合溶液进一步清洗，然后再用去离子水清洗，得到干净的硅晶片；
(2)将步骤(1)清洗干净的硅晶片置入氟化氢溶液中进行振荡反应，得到表面覆盖大量硅-氢键的硅晶片；
(3)将步骤(2)得到的硅晶片放入硝酸银和氟化氢的混合溶液中振荡反应，得到表面均匀的原位生长一层银纳米粒子的硅晶片；
(4)将步骤(3)得到的银纳米粒子修饰的硅晶片放入含有细菌连接分子的溶液中震荡反应，在银纳米颗粒表面修饰上细菌连接分子；
(5)将步骤(4)得到的材料取出，去离子水洗涤后氮气吹干，得到AgNPsSi修饰上细菌连接分子的硅基SERS多功能芯片。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的硅晶片为0.01～20Ω*cm的p型或n型硅晶片，尺寸为0.25～10cm2。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的过氧化氢溶液质量浓度为10～40％，浓硫酸和过氧化氢体积比＝1:(0.01～100)。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的氟化氢溶液质量浓度为1～40％。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：将步骤(1)清洗干净的硅晶片置入氟化氢溶液中进行振荡反应1～60分钟。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的硝酸银溶液浓度为1～5M，氟化氢溶液质量浓度为1～40％，硝酸银溶液和氟化氢溶液体积比＝1:(0.01～100)。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：将步骤(2)得到的硅晶片放入硝酸银和氟化氢的混合溶液中振荡反应1～60分钟。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的细菌连接分子为4-巯基苯硼酸或万古霉素，其浓度为0.01～100mM。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：将步骤(3)得到的银纳米粒子修饰的硅晶片放入细菌连接分子的溶液中振荡反应1～24小时。
10.一种硅基SERS多功能芯片，其特征在于：由权利要求1～9任一项所述的制备方法制备而成。
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