CN114062227B - 一种抗微生物兼具检测效果的半导体涂层及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗微生物兼具检测效果的半导体涂层及其制备方法和用途，具体公开了一种抗微生物且能自测微生物数量的半导体涂层，所述半导体涂层在基底上的生成的环氧基上原位生成的半导体纳米阵列，所述半导体纳米阵列选自氧化锌纳米材料阵列、二氧化钛纳米材料阵列、硅阵列；半导体纳米阵列表面还包括金属纳米颗粒的修饰。并公开了半导体涂层的用途，所述半导体涂层提供基底抗微生物活性的同时能够检测基底表面微生物含量。本发明集监测细菌和抗菌功能于一体，可实现在抗感染过程中对感染状况进行实时监测并提示使用者及时采取相应措施。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及抗微生物兼具检测效果的半导体涂层及其抗微生物以及检测微生物含量中的用途。
背景技术
植入手术是临床常见的改善患者生活质量的治疗方案之一，但是导致植入手术失败的一个关键因素是细菌的感染，将植入体表面进行适当修饰可实现抗菌表面从而有效降低感染率。与此同时，如果抗菌界面可以实现对细菌数量的实时监测，会给医生及时监测病人感染情况带来极大的便利。
电子传递是一种发生于具有电势差的界面的常见的物理现象，研究表明材料与细菌之间的电子传递在该类抗菌过程中起着关键作用。少部分研究表明修饰有电荷的材料表面也可以依赖于电子传递而有效抗菌。以上这些方法都在一步步推进抗菌材料的发展(Wang,G.et al.An antibacterial platform based on capacitive carbon-doped TiO2nanotubes after direct or alternating current charging.Nat.Commun.9,2055(2018).Wang,G.et al.Extracellular electron transfer from aerobic bacteria toAu-loaded TiO2 semiconductor without light:a new bacteria-killing mechanismother than localized surface plasmon resonance or microbial fuel cells.ACSAppl.Mater.Interfaces 8,24509-24516(2016).Chernousova,S.,Epple,M.Silver asantibacterial agent:ion,nanoparticle,and metal.Angew.Chem.Int.Ed.52,1636-1653(2013))。
通过对植入体的表面设计可以实现有效抗菌因而提高其生物医学应用的成功率，但是目前的抗菌材料大都为释放型表面，设计有以下缺陷，例如向材料表面接枝抗生素以及抗菌肽会引起严重的细菌耐药性，而耐药菌株的突变会加重临床感染。同时各种肽类材料易与机体发生免疫反应而增加了植入手术的失败的风险。与释放型抗菌表面相比，依赖于物理作用的非释放型抗菌表面因其可以局部作用从而减少全身性副作用的产生，同时不需要抗菌物质的再补充以及实现对植入部位的精准感染防控。尽管集抗菌检测于一体的表面可以为使用者提供极大便利，但目前的抗菌表面大都只具有单一抗菌功能而缺乏实时监测细菌数量的功能，仅有的可同时监测细菌的抗菌材料由传统细菌传感器和抗生素机械组成，结构冗杂且效率较低。
发明内容
本发明旨在设计一种依赖于电子传递的可实时监测细菌数量的抗菌体系，半导体组成的涂层在与细菌接触时因界面电势差而产生细菌电流，电流的大小可以反映细菌的数量，细菌电流同时可以干扰细菌的生理活动而实现精准的非释放型抗菌过程。这一清洁环保的抗菌体系克服了现有释放型抗菌表面的全身副作用以及需要抗菌物质再补充的缺点。同时，实时监测功能利于医生实时了解感染状况而及时采取相应措施。
本发明包括两部分内容。首先在植入体表面设计半导体涂层，然后将细菌与涂层接触，并将整个体系接入电化学工作站或微电流计，电流的大小可以反映细菌的数量，而细菌电流可以在短时间内实现对细菌呼吸链电子传递的干扰而抑制其生长繁殖。
本发明一个方面提供了一种抗微生物且能自测微生物数量的半导体涂层，所述半导体涂层在基底上原位生成的半导体纳米阵列，所述半导体纳米阵列选自氧化锌纳米材料阵列、二氧化钛纳米材料阵列、硅阵列等。
在本发明的技术方案中，半导体纳米阵列表面还包括金属纳米颗粒的修饰，优选地，所述的金属纳米颗粒选自金纳米颗粒、银纳米颗粒、铂纳米颗粒、钯纳米颗粒等。
在本发明的技术方案中，所述的基底选自金属基底、非金属基底；
优选地，所述金属基底选自钛基底、镁基底、铝基底等；所述非金属基底选自硅基底等。
在本发明的技术方案中，半导体纳米阵列的纳米材料尺寸为10-500nm，优选为80-150nm。
在本发明的技术方案中，所述半导体涂层在基底上原位生成的半导体纳米阵列的方法为：1)在基底表面形成环氧基；2)以水热法或者阳极氧化法在环氧基上生成半导体纳米阵列。
在本发明的技术方案中，在基底表面形成环氧基的方法为将基底与硅烷偶联剂，优选为γ―(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷进行反应，获得环氧基。
在本发明的技术方案中，以水热法在环氧基上生成氧化锌半导体纳米阵列的方法为锌盐溶液和氢氧化钠的醇溶液在100-150℃下反应制备种子层；然后加入环六亚甲基四胺和六水合醋酸锌的混合水溶液中水热处理生成氧化锌半导体纳米阵列。
在本发明的技术方案中，半导体纳米阵列表面上金属纳米颗粒的修饰方法为以磁控溅射方法沉积金属纳米颗粒。
在本发明的技术方案中，所述的微生物为细菌、真菌、病毒、优选地，所述的细菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。
在本发明一个优选的技术方案中，所述的半导体纳米阵列为氧化锌纳米棒阵列，且其表面修饰有金纳米颗粒。
本发明另一个方面提供另一种半导体涂层的制备方法，其包括如下步骤：
1)在基底表面形成环氧基；
2)以水热法或者阳极氧化法在环氧基上生成半导体纳米阵列；
3)在半导体纳米阵列表面上修饰金属纳米颗粒。
在本发明的技术方案中，在基底表面形成环氧基的方法为将基底与硅烷偶联剂，优选为γ―(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷进行反应，获得环氧基。
在本发明的技术方案中，以水热法在环氧基上生成氧化锌半导体纳米阵列的方法为锌盐溶液和氢氧化钠的醇溶液在100-150℃下反应制备种子层；然后加入环六亚甲基四胺和六水合醋酸锌的混合水溶液中水热处理生成氧化锌半导体纳米阵列。
在本发明的技术方案中，半导体纳米阵列表面上金属纳米颗粒的修饰方法为以磁控溅射方法沉积金属纳米颗粒。
本发明再一个方面提供所述半导体涂层的用途，所述半导体涂层提供基底抗微生物活性的同时能够检测基底表面微生物含量。
在本发明的技术方案中，所述半导体涂层的用途中提供基底抗微生物活性为在空气环境中，而非液体环境中。
本发明再一个方面提供了一种植入物，所述植入物具有上述半导体涂层。
本发明再一个方面提供了一种物体表面微生物的检测方法，其包括以下步骤：
1)在物体表面生成上述半导体涂层；
2)将已知浓度的微生物液体涂覆在上述包含半导体涂层的物体表面，并检测该表面的电流，并绘制电流与微生物浓度之间的曲线；
3)检测物体表面的电流，根据上述曲线计算物体表面微生物数量。
在本发明的技术方案中，所述的检测方法中，已知浓度的微生物液体为至少3个不同已知浓度的微生物液体，优选为3-6个不同已知浓度的微生物液体。
在本发明的技术方案中，所述的检测方法中，已知浓度的微生物液体的浓度为1-106CFU mL-1。
在本发明的优选技术方案中，所述的微生物为大肠杆菌，电流与大肠杆菌浓度之间的关系为电流(μA)＝-1.43+0.56*log CFU。其中CFU为大肠杆菌浓度。
在本发明的优选技术方案中，所述的微生物为大肠杆菌与金黄色葡萄球菌，电流与大肠杆菌浓度之间的关系为电流(μA)＝0.179+0.290*log CFU。其中CFU为大肠杆菌与金黄色葡萄球菌混合浓度。
在本发明的技术方案中，所述的检测方法中，检测物体表面的电流时，电流读取时间在5min以内。
在本发明的技术方案中，检测物体表面的电流的设备选自电化学工作站或微电流计。
在本发明的技术方案中，检测物体表面的电流的设备为能够检测100μA以下电流的设备。
在本发明的技术方案中，检测物体表面的电流的设备中所使用的电解液选自肉汤培养基、生理盐水以及磷酸盐缓冲液(PBS)。
本发明再一个方面提供了一种物体表面微生物控制和检测系统，其包括电流检测设备、至少3个已知浓度的微生物液体以及在物体表面形成权利要求1-3任一项所述的半导体涂层的材料；
优选地，检测物体表面的电流的设备为能够检测为100μA以下电流的设备；
优选地，在物体表面形成权利要求1-3任一项所述的半导体涂层的材料包括硅烷偶联剂、锌盐溶液、氢氧化钠、环六亚甲基四胺、六水合醋酸锌和金属纳米颗粒。
本发明半导体特性的涂层与微生物相互作用而产生的电流既可以作为实时监测微生物数量的参数，同时又是对细菌呼吸链的干扰而实现快速非释放型抗菌的因素。该抗菌体系可以在不干扰植入体生物相容性前提下进行抗菌和对细菌数量进行实时监控，具有环保可控的优势。
本发明涉及一种基于电子传递的同时具有实时监测细菌数量的抗菌表面。与以往抗菌表面设计相比具有以下优点：
1、本发明提供的半导体涂层能够实现抗微生物活性的同时提供该涂层基底产品的微生物污染情况，首次实现了集抗微生物和检测功能于一体。
2、本发明采用的半导体涂层制备工艺简单，抗菌效率高，能够实现短时间内的高效灭活，由于其利用物理特性灭菌，避免了抗生素的使用，进而避免了抗生素引起的耐药性发生。且由于其具有局限性，灭活仅局限在半导体涂层表面，其依赖于与微生物的接触，与释放离子或药物的抗菌表面相比可以精准杀死植入手术创口附近微生物达到高效抗感染避免了使用抗菌肽、抗生素等作用于人体后会产生全身循环，因而产生安全隐患。
3、本发明直接在植入体表面原位生长半导体纳米阵列，表面修饰与基底结合更牢，不会发生修饰物的泄露。
4、通常金属氧化物例如氧化锌具有抗微生物活性，是基于锌离子的抗菌活性，而本发明并非利用锌离子的抗菌活性，而是基于材料表面微生物产生的电流，因此，本发明的半导体涂料抗微生物活性不依赖于液体环境，而在空气环境中也可以实现抗微生物活性。
5、本发明集监测微生物和抗微生物功能于一体，可实现在抗感染过程中对感染状况进行实时监测并提示使用者及时采取相应措施。
6、该抗菌体系监测及杀菌机理均基于材料与细菌之间的电子传递，与以往集传统细菌传感器件和药物释放于一体的双功能表面相比工作机理更为简单，工作体系更为简洁。
7、本发明半导体涂层可以与可穿戴能源装置相结合，可利用自体机械运动能量监测细菌数量及抗菌。
本发明集监测细菌和抗菌功能于一体，可实现在抗感染过程中对感染状况进行实时监测并提示使用者及时采取相应措施。
附图说明
图1a扫描电子显微镜下纳米金修饰的氧化锌纳米棒阵列。
图1b能谱图谱显示纳米金修饰的氧化锌阵列表面元素分布情况。
图2细菌数量与细菌电流散点图以及线性拟合。
图3a细菌与材料作用1h内细菌电流变化曲线。
图3b细菌与材料作用1h内抗菌效果。
图4由大肠杆菌与金黄色葡萄球菌组成的混合菌液细菌数量与细菌电流散点图及线性拟合。
具体实施方式
为了使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
本发明一个方面提供了一种抗微生物且能自测微生物数量的半导体涂层，所述半导体涂层在基底上原位生成的半导体纳米阵列，所述半导体纳米阵列选自氧化锌纳米材料阵列、二氧化钛纳米材料阵列、硅纳米阵列等。
在本发明一些具体实施例中，半导体纳米阵列表面还包括金属纳米颗粒的修饰，优选地，所述的金属纳米颗粒选自金纳米颗粒、银纳米颗粒、铂纳米颗粒、钯纳米颗粒等。
在本发明一些具体实施例中，所述的基底选自金属基底、非金属基底；优选地，所述金属基底选自钛基底、镁基底、铝基底等；所述非金属基底选自硅基底等。
在本发明一些具体实施例中，半导体纳米阵列的纳米材料尺寸为10-500nm，优选为80-150nm。
在本发明一些具体实施例中，所述半导体涂层在基底上原位生成的半导体纳米阵列的方法为：1)在基底表面形成环氧基；2)以水热法或者阳极氧化法在环氧基上生成半导体纳米阵列。
在本发明一些具体实施例中，在基底表面形成环氧基的方法为将基底与硅烷偶联剂，优选为γ―(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷进行反应，获得环氧基。
在本发明一些具体实施例中，以水热法在环氧基上生成氧化锌半导体纳米阵列的方法为锌盐溶液和氢氧化钠的醇溶液在100-150℃下反应制备种子层；然后加入环六亚甲基四胺和六水合醋酸锌的混合水溶液中水热处理生成氧化锌半导体纳米阵列。
在本发明一些具体实施例中，半导体纳米阵列表面上金属纳米颗粒的修饰方法为以磁控溅射方法沉积金属纳米颗粒。
在本发明一些具体实施例中，所述的微生物为细菌、真菌、病毒，优选地，所述的细菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。
在本发明一个优选的实施例中，所述的半导体纳米阵列为氧化锌纳米棒阵列，且其表面修饰有金纳米颗粒。
本发明另一个方面提供半导体涂层的制备方法，其包括如下步骤：
1)在基底表面形成环氧基；
2)以水热法或者阳极氧化法在环氧基上生成半导体纳米阵列；
3)在半导体纳米阵列表面上修饰金属纳米颗粒。
在本发明一些具体实施例中，在基底表面形成环氧基的方法为将基底与硅烷偶联剂，优选为γ―(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷进行反应，获得环氧基。通过环氧基可以使得半导体纳米阵列与基底接触更密切，从而加强了电子传递过程，有利于提高抗菌效果。
在本发明一些具体实施例中，以水热法在环氧基上生成氧化锌半导体纳米阵列的方法为锌盐溶液和氢氧化钠的醇溶液在100-150℃下反应制备种子层；然后加入环六亚甲基四胺和六水合醋酸锌的混合水溶液中水热处理生成氧化锌半导体纳米阵列。
在本发明一些具体实施例中，半导体纳米阵列表面上金属纳米颗粒的修饰方法为以磁控溅射方法沉积金属纳米颗粒。
本发明再一个方面提供所述半导体涂层的用途，所述半导体涂层提供基底抗微生物活性的同时能够检测基底表面微生物含量。
本发明再一个方面提供了一种植入物，所述植入物具有上述半导体涂层。
本发明再一个方面提供了一种物体表面微生物的检测方法，其包括以下步骤：
1)在物体表面生成上述半导体涂层；
2)将已知浓度的微生物液体涂覆在上述包含半导体涂层的物体表面，并检测该表面的电流，然后绘制电流与细菌浓度之间的曲线；
3)检测物体表面的电流，根据上述曲线计算物体表面细菌数量。
在本发明一些具体实施例中，所述的检测方法中，已知浓度的微生物液体为至少3个不同已知浓度的微生物液体，优选为3-6个不同已知浓度的微生物液体。
在本发明一些具体实施例中，所述的检测方法中，已知浓度的微生物液体的浓度为1-106CFU mL-1。
在本发明一些具体实施例中，所述的检测方法中，检测物体表面的电流时，电流读取时间在5min以内。
在本发明一些具体实施例中，检测物体表面的电流的设备选自电化学工作站或微电流计。
在本发明一些具体实施例中，检测物体表面的电流的设备为能够检测为100μA以下电流的设备。
在本发明一些具体实施例中，检测物体表面的电流的设备中所使用的电解液选自肉汤培养基、生理盐水以及磷酸盐缓冲液(PBS)。
一种物体表面微生物浓度评估的建立方法，其包括以下步骤：
1)在物体表面生成上述半导体涂层；
2)将已知浓度的微生物液体涂覆在上述包含半导体涂层的物体表面，并检测该表面的电流，然后绘制电流与细菌浓度之间的曲线；
3)检测物体表面的电流，根据上述曲线计算物体表面细菌数量；
其中所述的已知浓度的微生物液体为混合微生物液体，所述已知浓度的微生物液体为100种不同已知浓度的微生物液体。
优选地，所述已知浓度的微生物液体为1000种以上不同已知浓度的微生物液体。
在本抗菌体系建立过程中，首先设计由半导体组成的涂层，然后将材料与细菌相互作用，接入电化学工作站或微电流计测试界面电流，通过电流大小可得知细菌数量，细菌电流同时在短时间内实现对细菌呼吸链电子传递的干扰而抑制其生长繁殖。
具体实施方案包括：
对植入体预处理并对表面进行半导体涂层设计
植入体以钛合金为例，将钛合金加工成长宽高各为30mm、30mm、0.5mm的长方体并将其抛光打磨，然后依次在丙酮、乙醇、水中超声清洗10min，用氮气吹干备用。将以上钛合金材料浸泡于NaOH水溶液(10M)2h,与γ―(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷KH-560(2％v/v)作用10h以形成环氧功能基团。然后准备Zn(CH3COO)2·2H2O(10mM)和NaOH(30mM)的甲醇溶液，吸取10μL滴至样品表面并在120℃处理5min并重复三次以制备种子层。接下来将以上样品置于环六亚甲基四胺(50mM)和六水合醋酸锌(50mM)的混合水溶液中，于96℃水热处理1-24h以生成氧化锌纳米棒半导体。反应后将样品用5mL水冲洗2min并用氮气吹干。然后用磁控溅射方法向纳米棒沉积金纳米颗粒从而增强半导体的电子传输能力。
将材料与细菌进行作用并绘制细菌电流与细菌数量关系的标准关系式
将上述载有纳米金修饰的氧化锌纳米棒的钛合金接入电化学工作站，并在材料表面加入菌液，菌液浓度为1-106CFU mL-1，记录细菌电流的大小同时绘制细菌电流与细菌数量的关系式。二者关系为电流(μA)＝-1.43+0.56*log CFU。
将材料与细菌进行作用检测杀菌结果
向上述材料表面滴入菌液，菌液浓度为1-106CFU mL-1，将材料与细菌相互作用一定时间(1-180min)，对细菌进行涂板及生理活性检测以验证抗菌效果。
实施例1
将钛合金加工成长宽高各为30mm、30mm、0.5mm的长方体并将其抛光打磨，然后依次在丙酮、乙醇、水中超声清洗10min，用氮气吹干备用。将以上钛合金材料浸泡于NaOH水溶液(10M)2h,与KH-560(2％v/v)作用10h以形成环氧功能基团。然后准备Zn(CH3COO)2·2H2O(10mM)和NaOH(30mM)的甲醇溶液，吸取10μL滴至样品表面并在120℃处理5min并重复三次以制备种子层。接下来将以上样品置于环六亚甲基四胺(50mM)和六水合醋酸锌(50mM)的混合水溶液中，于96℃水热处理10-12h以生成ZnO纳米棒半导体。反应后将样品用5mL水冲洗2min并用氮气吹干。然后用磁控溅射方法向纳米棒沉积金纳米颗粒从而增强半导体的电子传输能力。通过扫描电子显微镜对样品表面微观形态进行观察，得到如图1a所示微观形貌。由图可见，氧化锌纳米棒的直径为100nm，纳米金颗粒贴附在纳米棒上或者填充在纳米棒之间(如图1箭头所示)。
实施例2
对实施例1中处理得到的样品表面进行元素含量分析。能谱图谱(图1b)显示锌、氧、金、钛元素均匀分布与样品表面，表明氧化锌涂层及金纳米颗粒均匀分布。
实施例3
将实施例1中所得样品与不同浓度大肠杆菌(浓度为1、103、105和106CFU mL-1)作用，制作细菌数量与细菌电流的散点图，进行拟合。结果如图2所示。细菌数量的对数值与细菌电流成线性关系，相关系数高达0.98。说明采用检测得到的电流与细菌含量有线性关系，可以通过电流检测预测细菌含量。
实施例4
向实施例1中样品表面平铺100μL大肠杆菌(细菌数量设为N0)，使样品与大肠杆菌作用，作用时间1h，吸取10μL菌液至固体培养基，用涂板计数方法检测细菌数量(N1)，抗菌效率
R＝(10N1-N0/N1)*100％
结果如图3a,3b所示。在作用1h内，细菌电流越来越小，杀菌率越来越高，1h作用可达到80％的抗菌效果。证明本发明的半导体涂层具有良好的抗菌效果，能够在短时间内实现高效的抗菌。同时证实了本发明的产品是通过电流获得的抗菌效果。
实施例5
将实施例1中所得样品与不同浓度大肠杆菌与金黄色葡萄球菌混合菌液(浓度为1、103、105和106CFU mL-1)作用，制作细菌数量与细菌电流的散点图，进行拟合。结果如图4所示。混合细菌数量的对数值与细菌电流成线性关系，相关系数高达0.96。说明采用检测得到的电流与混合细菌含量有线性关系，可以通过电流检测预测多种菌种混合菌液中细菌数量。
Claims (5)
1.一种物体表面微生物浓度评估的建立方法，其包括以下步骤：
1）在物体表面生成半导体涂层；
2）将已知浓度的微生物液体涂覆在包含所述半导体涂层的物体表面，并检测该表面的电流，然后绘制电流与细菌浓度之间的曲线；
3）检测物体表面的电流，根据上述曲线计算物体表面细菌数量；
其中所述的已知浓度的微生物液体为混合微生物液体，所述已知浓度的微生物液体为100种不同已知浓度的微生物液体；
其中，所述半导体涂层为在基底上的生成的环氧基上原位生成的半导体纳米阵列，所述半导体纳米阵列选自氧化锌纳米材料阵列；
半导体纳米阵列表面还包括金属纳米颗粒的修饰；
所述半导体涂层制备方法包括如下步骤：
1）在基底表面形成环氧基；
2）以水热法或者阳极氧化法在环氧基上生成半导体纳米阵列；
3）在半导体纳米阵列表面上修饰金属纳米颗粒；
以水热法在环氧基上生成氧化锌半导体纳米阵列的方法为锌盐溶液和氢氧化钠的醇溶液在100-150°C下反应制备种子层；然后加入环六亚甲基四胺和六水合醋酸锌的混合水溶液中水热处理生成氧化锌半导体纳米阵列；
半导体纳米阵列表面上金属纳米颗粒的修饰方法为以磁控溅射方法沉积金属纳米颗粒；
所述的基底选自金属基底；
所述金属基底选自钛基底、镁基底、铝基底。
2.根据权利要求1所述的建立方法，在基底表面形成环氧基的方法为将基底与硅烷偶联剂进行反应，获得环氧基。
3.根据权利要求2所述的建立方法，硅烷偶联剂为γ-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷。
4.根据权利要求1所述的建立方法，所述已知浓度的微生物液体为1000种以上不同已知浓度的微生物液体。
5.根据权利要求4所述的建立方法，所述已知浓度的微生物液体为10000种以上不同已知浓度的微生物液体。
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| Extracellular Electron Transfer from Aerobic Bacteria to Au-Loaded TiO2 Semiconductor without Light: A New Bacteria-Killing Mechanism Other than Localized Surface Plasmon Resonance or Microbial Fuel Cells;Guomin Wang等;《ACS Applied Material&Interfaces》;第8卷(第37期);第24509-24516页 * |
| Guomin Wang等.Extracellular Electron Transfer from Aerobic Bacteria to Au-Loaded TiO2 Semiconductor without Light: A New Bacteria-Killing Mechanism Other than Localized Surface Plasmon Resonance or Microbial Fuel Cells.《ACS Applied Material&Interfaces》.2016,第8卷(第37期),第24509-24516页. * |
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