CN102392069A - 基于功能化纳米金电极的快速检测菌落总数的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于功能化纳米金电极的快速检测菌落总数的方法，将纳米功能化金电极应用于牛奶中微生物的快速测定，本发明作为检测器的功能化纳米金电极制备简单、快速、环保；样品无需预处理；测定方法具有操作简便；检测时间短，检测方法的线性范围为：
5.5×10
2
~2.5×10
5
cfu·mL
-1
，检出限为
550cfu·mL
-1
，检测时间缩短至
1h
以内。该方法操作简单、重复性好、灵敏度高、不需要预处理，费用低，除磷酸盐缓冲溶液外，几乎不需要额外检测试剂，有望在牛奶及其它食品的微生物检测中得到应用。
Description
技术领域
本发明属于食品中微生物学检验的技术领域，具体涉及一种基于功能化纳米金电极的快速检测菌落总数的方法。
背景技术
牛奶营养价值高，但易变质、易腐败。在牛奶的生产、运输、销售过程中，还可能受到多种细菌的污染，其中含有很多潜在的有害微生物，这些微生物不仅破坏牛奶质量，而且可能危害饮用者身体健康。传统的微生物检测技术非常繁琐，需要耗费大量的人力物力，而且检测周期长，按国标GB/T4789.2进行检测，菌落总数的结果需要48h才能得出，难以满足食品安全检测的要求。目前，聚合酶链反应法(PCR)，酶联免疫吸附试验(ELISA)等几种快速检测技术被应用于检测致病菌，虽然比传统方法需要的检测时间缩短了不少，但检测费用高、仪器昂贵；传统的电阻抗技术亦可应用于细菌的检测，但在分析含菌量较少样品时，检测时间较长，且只有当微生物数目达到106-107个/ml时这种电阻的变化才能被记录到，不能满足日常检测要求。因此开发一种快速、简易的适合于牛奶样品中细菌检测的方法在现阶段极为迫切，本发明因此而来。
发明内容
本发明目的在于提供一种基于功能化纳米金电极的快速检测菌落总数的方法，该方法不需要预处理，操作简单，结果准确，检测时间短、费用低，解决了现有技术中检测时间长、检测灵敏度低、检测费用高等问题。
为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是：
一种基于功能化纳米金电极的快速检测菌落总数的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
(1)制备功能化纳米金电极：以pH为7的磷酸盐缓冲溶液为修饰液，通过控制电位电解的方法在金电极上施加1.8-2.2V恒电位下电解修饰480～600s，形成金电极表面纳米功能化处理的功能化纳米金电极；
(2)获得标准曲线：对已知浓度的标准样品用计时电流法进行测定，得到电流响应和牛奶中细菌数量的对应关系，根据电流响应和牛奶中细菌数量的对应关系以细菌浓度为横坐标，以电流响应值为纵坐标，建立细菌浓度-响应电流标准曲线；
(3)以步骤(2)获得的细菌浓度-响应电流标准曲线为参照，通过使用功能化纳米金电极为工作电极的检测器用计时电流法测定待测样品的电流响应值，根据步骤(2)获得的细菌浓度-响应电流标准曲线获得待测样品的每毫升样品细菌总数。
优选的，所述方法步骤(2)还包括对获得的细菌浓度-响应电流标准曲线进行验证的步骤；所述对获得的细菌浓度-响应电流标准曲线进行验证的方法包括在对已知浓度的标准样品用计时电流法进行测定的同时通过标准平板计数法对同一标准样品进行测定，得到电流响应和牛奶中细菌数量的对应关系，根据电流响应和牛奶中细菌数量的对应关系对建立的细菌浓度-响应电流标准曲线进行校正得到校正后的细菌浓度-响应电流标准曲线。
优选的，所述方法步骤(2)最后得到的细菌浓度-响应电流标准曲线为一直线，对该细菌浓度-响应电流标准曲线进行拟合得到响应电流与细菌浓度的关系公式为：ΔI＝k＊C，其中，ΔI为样品产生的电流与空白值电流的差值，单位为微安(μA)；k为常数，C为细菌浓度，单位为细菌数/毫升(cfu·mL-1)。
优选的，所述方法步骤(1)中金电极进行电解修饰前需要进行抛光清洗处理，其工序包括依次用0.3μm和0.05μm的Al2O3粉在绒布上对金电极进行抛光，然后用二次蒸馏水冲洗，依次在HNO3溶液、无水乙醇及二次蒸馏水中超声波清洗处理，清洗后的金电极烘干备用。
优选的，所述方法步骤(1)制备的功能化纳米金电极在进行使用前需要在0V～1.5V的范围内循环伏安扫描至电流稳定，完成后用二次蒸馏水反复冲洗，储存在二次蒸馏水中待用。
优选的，所述方法步骤(2)对已知浓度的标准样品进行测定的工作条件是：以功能化纳米金修饰电极为工作电极，铂电极为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极，以经高压灭菌的0.05～0.15mol·L-1、pH6.8～7.40的磷酸缓冲溶液为电解质，工作电压为0.8～1.2V，测定时将电解池置于30～40℃的恒温水浴中，待基线电流稳定后，用无菌微量注射器将已知细菌浓度的菌悬液连续加入检测池中进行测定。
优选的，所述方法步骤(3)的检测条件与步骤(2)的条件相同，等基线电流稳定后，用微量注射器连续加入10～20μL时待测样品进行检测。
本发明技术方案以功能化纳米金修饰电极为检测器，利用该电极在一定的电位下能从H2O或OH-中获得羟基自由基，使细菌细胞膜发生脂质过氧化而产生电流，电流值与样品中细菌总数成线性关系，从而实现食品中细菌总数的快速测定。检测结果表明：优选的检测条件是：微生物浓度在5.5×102～2.5×105cfu·mL-1响应电流与细菌浓度成良好的线性关系，检测限为550cfu·mL-1，检测时间在1h以内。
该方法操作简单、重复性好、灵敏度高、不需要预处理，费用低，除磷酸盐缓冲溶液外，几乎不需要额外检测试剂，有望在牛奶及其它食品的微生物检测中得到应用。
具体的，可以按照如下步骤进行：
第一步：功能化纳米金电极的制备
先将金电极分别用0.3μm和0.05μm的Al2O3粉在绒布上抛光，用二次蒸馏水冲洗，然后依次在HNO3、无水乙醇及二次蒸馏水中超声清洗5min，HNO3溶液中，硝酸与水的体积比为1∶1，将处理后的电极置于红外灯下烘干，以金电极为工作电极，饱和甘汞电极，即SCE电极为参比电极，铂电极为辅助电极，采用CHI660C型电化学工作站对金电极进行修饰，修饰液为pH为7的磷酸盐缓冲溶液，磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.05～0.15mol·L-1，修饰液的体积为10mL，在1.8-2.2V恒电位下电解480～600s，再在0V～1.5V的范围内循环伏安扫描至电流稳定，完成后用二次蒸馏水反复冲洗，得功能化纳米金电极，储存在二次蒸馏水中待用；
第二步：细菌浓度与修饰电极电流响应值关系的建立
功能化纳米金电极快速检测牛奶中细菌总数，以功能化纳米金修饰电极为工作电极，铂电极为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极，以经高压灭菌的0.05～0.15mol·L-1、pH6.8～7.40的磷酸缓冲溶液为电解质，工作电压为0.8～1.2V，测定时将电解池置于30～40℃的恒温水浴中，待基线电流稳定后，用无菌微量注射器将不同的浓度的已知浓度的菌悬液连续加入检测池中，用计时电流法测定电流响应值，得到电流响应和细菌数量的对应关系，以细菌浓度为横坐标，以电流响应值为纵坐标，建立细菌浓度-响应电流曲线，该曲线为一直线，确定细菌浓度与功能化纳米电极响应电流的依从关系为线性关系；
对同一样品用标准平板计数法进行验证，得到电流响应和牛奶中细菌数量的对应关系，以细菌浓度为横坐标，以电流响应值为纵坐标，建立细菌浓度-响应电流曲线，该曲线为一直线，确定细菌浓度与功能化纳米电极响应电流的依从关系为线性关系；
第三步：细菌总数的快速检测
利用第二步得到的响应电流-细菌总数的线性关系，快速检测牛奶中的细菌总数，操作步骤：(1)量取经高压灭菌的10mL pH为6.8～7.4，浓度为0.05～0.15mol·L-1的磷酸盐缓冲溶液加入电解池中，(2)等基线电流稳定后，用微量注射器连续加入10～20μL时样品，用第二步所描述的工作条件用计时电流法测定其电流响应值，(3)用第二步所建立的细菌总数-电流响应的线性关系及(2)步得到的电流值计算出该电流响应值所对应的细菌浓度，从而得到样品中细菌含量。
本发明应用控制电位电解的方法在抛光洗净的金盘电极上施加1.8～2V电压，所使用电解质为磷酸盐缓冲液，只需一步操作即可完成金电极表面的纳米功能化，使其表面形成了一层蓬松的纳米级粗糙层，表面金原子具有很高的活性，在一定的电位下，能从H2O或OH-中获得羟基自由基，并吸附在电极表面，形成Au＊/Au＊OHads(Au＊为活化金原子)层。·OH具有极高的反应活性，能够引起微生物细胞膜脂质过氧化，在电极上产生氧化电流。
电流的增加主要是因为在纳米功能层的催化下生成了羟基自由基，亚甲基蓝检验法可验证产生的·OH。通常情况下亚甲蓝溶液显蓝色，遇到强氧化剂时失电子形成无色的3，7-双二甲氨基吩噻嗪离子，通过亚甲蓝溶液吸光度的变化可确定·OH的含量。将0.15mmol·L-1亚甲蓝溶液8mL和H2PO4--HPO4 2-缓冲溶液10mL稀释至100mL，分别以裸金电极和NPG电极为工作电极，在1.0V恒电位电解30min，取电解后的溶液测定其吸光度。发现裸金电极电解30min后亚甲基蓝的吸光度略有下降，而以纳米功能化金电极电解后亚甲基蓝溶液吸光度值较电解前峰值明显减小，说明在此条件下，修饰电极产生了·OH，使亚甲基蓝失电子形成无色的3，7-双二甲氨基吩噻嗪离子。
电极上强烈的氧化还原电流对应于从水或OH-获得·OH的过程，且·OH被吸附于电极表面，占据着电极表面的活性位点，其反应如下
Au＊+H2O→Au＊OHads+H++e-
Au＊+OH-→Au＊OHads+e-
细菌细胞膜主要是由脂类和蛋白质组成的双层膜结构，其脂质分子相当稳定，但有活泼自由基存在时，就可以导致脂质过氧化的发生，从而在电极上产生电流。当将修饰电极置于含菌的PBS溶液中，电极表面活性位点的羟基自由基将会引起细菌细胞膜的脂质过氧化，细菌数量越多，产生的氧化电流越大。因此，可以根据氧化电流的变化与细菌数量变化的关系可以对牛奶中细菌总数进行快速检测。
本发明进行牛奶样品总菌数的测定的同时，用平板计数法进行标定，建立如下校准曲线，细菌浓度在5.5×102～2.5×105cfu·mL-1范围内呈良好的线性关系，R＝0.9959；检出限为550cfu·mL-1，比文献的报道值要低。优选的，细菌浓度在1.1×103～2.5×107cfu·mL-1范围内，检出限为1100cfu·mL-1以上检测效果更好。
相对于现有技术中的方案，本发明的优点是：
本发明首次将纳米功能化金电极应用于牛奶中微生物的快速测定。本发明作为检测器的功能化纳米金电极制备简单、快速、环保；样品无需预处理；测定方法具有操作简便；检测时间短，检测方法的线性范围为：5.5×102～2.5×105cfu·mL-1，检出限为550cfu·mL-1，检测时间缩短至1h以内。该方法操作简单、重复性好、灵敏度高、不需要预处理，费用低，除磷酸盐缓冲溶液外，几乎不需要额外检测试剂，有望在牛奶及其它食品的微生物检测中得到应用。
附图说明
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
图1为功能化纳米金电极的性能，其中A：裸金电极(a)，纳米功能化金电极(b)在0.1mol·L-1PBS(pH7.0)中扫速为100mV/s的循环伏安图；B：·OH与浓度为1.2×10-5mol·L-1的亚甲基蓝作用的紫外吸收曲线；(a)，裸金电极，(b)1.0V电位下氧化30分钟的纳米功能化金电极在1.2×10-5mol·L-1的亚甲基蓝的紫外吸收曲线。
图2为测定条件的优化实验结果；A：不同电位条件纳米功能化金电极对细菌检测的影响；B：不同PH值条件纳米功能化金电极对细菌检测的影响；
图3为电流变化的I-t曲线；
图4为培养基成分对测定的影响。
具体实施方式
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
实施例1牛奶中细菌数量的快速测定
1材料、试剂与仪器
磷酸盐缓冲溶液的总浓度0.1mol·L-1，pH为7.0和7.4。LB培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。大肠杆菌、嗜热链球菌、金黄色葡萄球菌由本校生物与食品工程学院发酵工程技术研究中心提供。牛奶样品由常熟市圣力乳业有限公司提供。实验所用水均为二次蒸馏水。
CHI660C电化学工作站(上海辰华仪器公司)，金电极(Φ2mm)为工作电极，铂电极(Φ2mm)为对电极，饱和甘汞电极(SCE)为参比电极。
全自动不锈钢双层立式电热蒸汽压力消毒器YX.400Z型(上海三申医疗器械有限公司)，超净工作台S·SW-CJ·2F型(上海博泰实验设备有限公司)，电热恒温干燥培养箱303A-3S型(上海浦东荣丰科学仪器有限公司)。
2纳米功能化金电极的制备
先将金电极分别用0.3μm和0.05μm的Al2O3粉在绒布上抛光，然后依次在体积比为1∶1的HNO3、无水乙醇及二次蒸馏水中超声清洗5min，置于红外灯下烘干。将清洁干燥的电极置于修饰液为pH为7的磷酸盐缓冲溶液，磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.1mol/L中恒电位(2.0V)电解600s，再在0V-1.5V的范围内循环伏安扫描至电流稳定，完成后用二次蒸馏水反复冲洗，得功能化纳米金电极；将功能化纳米金电极储存在二次蒸馏水中待用。
3细菌总数的测定方法
3.1平板计数法
参照GB 4789.2-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》进行。
3.2计时电流法
以功能化纳米金修饰电极为工作电极，铂电极为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极，以经高压灭菌的0.1mol·L-1、pH7.40的磷酸缓冲溶液为电解质，体积为10mL，工作电压为1V，用无菌的移液管准确移取10mL经高压灭菌的磷酸缓冲溶液测定，将电解池置于37℃的恒温水浴中，待基线电流稳定后，用无菌微量注射器将已知细菌浓度的菌悬液连续加入检测池中，用计时电流法测定电流响应值，结果列于表1中，在拟合公式中，k＝1.761×10-8。
对同一样品分别用标准平板计数法和计时电流法同时进行测定，通过标准平板计数法的数值对计时电流法测定的电流响应和牛奶中细菌数量的对应关系进行校正，建立校正工作曲线。
表1响应电流与细菌浓度之间的线性关系
4待测样品的测定：
根据仪器测定的电流响应值与相应样品的校正工作曲线相对照，计算每毫升样品细菌总数。
实验过程中，二次蒸馏水、培养皿、培养基在使用前均用高压蒸汽灭菌，在超净工作台接种。图1为所制备电极在0.1mol·L-1、pH7.0的PBS溶液中的循环伏安图。可以观察到在修饰电极上，除了在电位约为1.5V处因析氧而出现电流增大外，还出现一对很强的氧化还原峰，而普通金电极几乎不出峰。
图3为在选定的工作条件下，向盛有10mL磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4，0.1mol·L-1)的电解池中，连续加入含1.1×106cfu·mL-1细菌悬浊液10μL时修饰电极对细菌响应电流的I-t曲线。图3表明修饰电极对细菌脂质过氧化产物电催化响应很快，因此可用于细菌的快速检测。
培养基中的共存组分并不产生干扰，可从图4得到证明，NaCl、琼脂对测定无影响；10ml PBS溶液中加入100μL(相当于菌悬液的10倍体积)的蛋白胨、牛肉膏、牛奶时电流响应略有波动，因加入的菌悬液为牛奶与细菌的混和物，故不影响测定。
实施例2牛奶中细菌数量的快速测定
步骤过程类似于实施例1，只是工作条件和试剂进行了修改。
第一步中，修饰液为pH为7的磷酸盐缓冲溶液，磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.15mol·L-1，修饰液的体积为10mL，在2.2V恒电位下电解480s，再在0V～1.5V的范围内循环伏安扫描至电流稳定，完成后用二次蒸馏水反复冲洗，得功能化纳米金电极；第二步中，以功能化纳米金修饰电极为工作电极，铂电极为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极，以经高压灭菌的0.15mol·L-1、pH7.40的磷酸缓冲溶液为电解质，工作电压为1.2V，测定时将电解池置于30～40℃的恒温水浴中，待基线电流稳定后，用无菌微量注射器将已知细菌浓度的菌悬液连续加入检测池中，用计时电流法测定电流响应值，结果列于表2中，在拟合公式中，k＝7.156×10-8，第三步，快速检测得到样品中细菌的浓度。
表2响应电流与细菌浓度之间的线性关系
实施例3牛奶中细菌数量的快速测定
步骤过程类似于实施例1，只是工作条件和试剂进行了修改。
第一步中，修饰液为pH为7的磷酸盐缓冲溶液，磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.05mol·L-1，修饰液的体积为10mL，在1.8V恒电位下电解480s，再在0V～1.5V的范围内循环伏安扫描至电流稳定，完成后用二次蒸馏水反复冲洗，得功能化纳米金电极；第二步中，以功能化纳米金修饰电极为工作电极，铂电极为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极，以经高压灭菌的0.05mol·L-1、pH6.8的磷酸缓冲溶液为电解质，工作电压为0.8V，测定时将电解池置于30～40℃的恒温水浴中，待基线电流稳定后，用无菌微量注射器将已知细菌浓度的菌悬液连续加入检测池中，用计时电流法测定电流响应值，结果列于表3中，在拟合公式中，k＝3.234×10-8，第三步，快速检测得到样品中细菌的浓度。
表3响应电流与细菌浓度之间的线性关系
实施例4牛奶中细菌数量的快速测定条件优化
实验分别选取在-0.5V、0.0V、0.5V、1.0V、1.5V下，在25℃、在0.1mol·L-1，pH＝7.0的10mL磷酸缓冲溶液中，加入10μL已知含菌浓度的牛奶悬浊液(含菌量约为1.1×106cfu·mL-1)，测定了在不同工作电位下电流变化的情况。结果发现：随着电压的增大，响应电流随之变大，但当电位超过1V时虽然响应电流较大但电流不稳定。工作电位为1.0V为最佳的测定稳定性。
加入与上述实验相同数量的细菌，试验了不同pH值下细菌被氧化的情况。结果表明，随pH增大，氧化电流变化值也随之增大，至pH值为8时达到一个平台，但此时稳定性变差。pH值7.4为测定反应的缓冲溶液最佳pH值。
实施例5电极分析性能及对实际样品中总菌数的测定
由于电极表面是纳米粗糙结构，具有较强的吸附性，氧化产物会吸附在电极上，所以测定中电流响应会略有减小。因此，每次测定时必须对电极进行活化再生处理。处理方法是用磷酸盐缓冲液冲洗后再在0.1mol·L-1的PBS溶液中，加2V工作电压电解，使水在电极上产生氧气，利用氧气带走细菌被氧化的中间产物，从而使电极重新活化。将电极在0.1mol·L-1、pH为7.4的PBS的溶液中，以扫速为100mV·s-1、工作电位0至2V连续扫描100圈，相对标准偏差(RSD)为2.93％，表明活化再生处理可以得到很好的重现性。
制备5份牛奶样品，用按实施例1方法进行测定，由电流响应值对应的工作曲线上的细菌总数值可推算出样品的细菌总数含量。对每个样品进行5次平行测定，并与GB4789平板菌落计数法相对照，结果见表4。从表4数据可以看出用两种方法测定5个样品其最大的相对误差为8.01％；同时也可计算出t＝1.3749，当自由度v＝n-1＝4，由v＝4查t值表得t值：t0.05(4)＝2.776，t0.01(4)＝4.604，本例t＜t0.05，两种方法差异不显著，说明本修饰电极用于牛奶中细菌总数的测定是可行的。
表4本文方法与平板计数法检测大肠杆菌样品结果的比较
上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1. 一种基于功能化纳米金电极的快速检测菌落总数的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
（1）制备功能化纳米金电极：以pH为7的磷酸盐缓冲溶液为修饰液，通过控制电位电解的方法在金电极上施加1.8-2.2V恒电位下电解修饰480～600s，形成金电极表面纳米功能化处理的功能化纳米金电极；
（2）获得标准曲线：对已知浓度的标准样品用计时电流法进行测定，得到电流响应和牛奶中细菌数量的对应关系，根据电流响应和牛奶中细菌数量的对应关系以细菌浓度为横坐标，以电流响应值为纵坐标，建立细菌浓度-响应电流标准曲线；
（3）以步骤（2）获得的细菌浓度-响应电流标准曲线为参照，通过使用功能化纳米金电极为工作电极的检测器用计时电流法测定待测样品的电流响应值，根据步骤（2）获得的细菌浓度-响应电流标准曲线获得待测样品的每毫升样品细菌总数。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法步骤（2）还包括对获得的细菌浓度-响应电流标准曲线进行验证的步骤；所述对获得的细菌浓度-响应电流标准曲线进行验证的方法包括在对已知浓度的标准样品用计时电流法进行测定的同时通过标准平板计数法对同一标准样品进行测定，得到电流响应和牛奶中细菌数量的对应关系，根据电流响应和牛奶中细菌数量的对应关系对建立的细菌浓度-响应电流标准曲线进行校正得到校正后的细菌浓度-响应电流标准曲线。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述方法步骤（2）最后得到的细菌浓度-响应电流标准曲线为一直线，对该细菌浓度-响应电流标准曲线进行拟合得到响应电流与细菌浓度的关系公式为：ΔI= k*C，其中，ΔI为样品产生的电流与空白值电流的差值，单位为微安（μA）；k为常数，C为细菌浓度，单位为细菌数/毫升（cfu·mL-1）。
4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述方法步骤（1）中金电极进行电解修饰前需要进行抛光清洗处理，其工序包括依次用0.3μm和0.05μm的A12O3粉在绒布上对金电极进行抛光，然后用二次蒸馏水冲洗，依次在HNO3溶液、无水乙醇及二次蒸馏水中超声波清洗处理，清洗后的金电极烘干备用。
5. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述方法步骤（1）制备的功能化纳米金电极在进行使用前需要在0V～1.5V的范围内循环伏安扫描至电流稳定，完成后用二次蒸馏水反复冲洗，储存在二次蒸馏水中待用。
6. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述方法步骤（2）对已知浓度的标准样品进行测定的工作条件是：以功能化纳米金修饰电极为工作电极，铂电极为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极，以经高压灭菌的0.05～0.15mol·L-1、pH6.8～7.40 的磷酸缓冲溶液为电解质，工作电压为0.8～1.2V，测定时将电解池置于30～40℃的恒温水浴中，待基线电流稳定后，用无菌微量注射器将已知细菌浓度的菌悬液连续加入检测池中进行测定。
7. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述方法步骤（3）的检测条件与步骤（2）的条件相同，等基线电流稳定后，用微量注射器连续加入10～20μL时待测样品进行检测。
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2011
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