CN101880627B

CN101880627B - 同时检测两种木质素降解酶功能基因的生物传感器及其制备和检测方法及电化学检测系统

Info

Publication number: CN101880627B
Application number: CN 201010102312
Authority: CN
Inventors: 汤琳; 李贞�; 曾光明; 范长征; 黎媛萍; 刘灿; 晏铭; 陈耀宁
Original assignee: Hunan University
Current assignee: Hunan University
Priority date: 2010-01-28
Filing date: 2010-01-28
Publication date: 2012-10-10
Anticipated expiration: 2030-01-28
Also published as: CN101880627A

Abstract

本发明提供了一种同时检测两种木质素降解酶功能基因的生物传感器及其制备方法，该生物传感器包括一用作三电极电解池工作电极的金电极，金电极上同时固定有编码MnP、CDH功能基因的巯基修饰捕获探针M₁和捕获探针C₁，金电极表面上除捕获探针以外的剩余结合位点均采用巯基己醇封闭，其制备方法包括配备捕获探针溶液、金电极预处理、捕获探针的固定和封闭剩余结合位点四个步骤。本发明还提供用该生物传感器同时检测两种木质素降解酶功能基因的方法，包括配备响应探针溶液、酶标记溶液、两次杂交和电化学测定步骤，本发明还提供一种该方法中配套用的电化学检测系统。本发明的检测方法具有简便快捷、特异性好、抗干扰性好、稳定性好、成本低等优点。

Description

同时检测两种木质素降解酶功能基因的生物传感器及其制备和检测方法及电化学检测系统

技术领域

本发明涉及一种生物传感器及其制备和检测方法以及该检测方法中用到的检测装置，尤其涉及一种检测木质素降解酶功能基因的生物传感器及其制备和检测方法及该检测方法中用到的检测装置。

背景技术

近年来，以功能基因多样性为核心的分子生态学研究迅速发展，为从功能基因角度了解微生物的生态功能提供了一个新的切入点。研究环境微生物群落功能基因多样性分布与表达对了解微生物降解过程的本质具有重要意义，通过研究功能基因在自然环境中的表达调节，能更好地弄清微生物在环境中的真实状态及其协同降解污染物的机理，同时某些特殊的功能基因也能作为检测特定微生物的靶基因。

黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)是一种白腐真菌，在降解城市生活垃圾堆肥中的木质素及多种有机污染物方面具有重要作用。黄孢原毛平革菌能合成两种木质素降解酶：锰过氧化物酶(manganese peroxidase，MnP)和纤维二糖脱氢酶(cellobiosedehydrogenase，CDH)，MnP合成后被分泌到胞外，经过氧化氢启动一系列自由基链反应，依靠氧化还原反应降解各种结构各异的有机物；CDH产生的羟基自由基能抑制一些中间产物的聚合反应，同时消除某些中间产物对酶的失活作用。在堆肥系统中，微生物降解木质素的代谢过程由一系列酶共同完成，而MnP和CDH在其中起了关键性作用。由于微生物对木质素的降解功能取决于其DNA分子中编码酶的相应功能基因，因此加强木质素生物降解酶功能基因的研究能更好地了解微生物降解木质素的本质及各酶之间的协同作用，有利于木质素降解微生物的筛选，从而促进堆肥充分腐熟，提高堆肥产品的质量。

目前，对于木质素降解酶编码基因的检测多采用Southern印迹杂交法和RT-PCR方法。这些技术对样品和仪器往往要求很高，在灵敏度和选择性方面也有一定的缺陷。基因生物传感器是一种能将目的DNA的存在转变为可检测的电、光、声等信号的传感装置，它与传统的技术相比，具有快速、灵敏、操作简单、无污染的特点，并具有分子识别、分离纯化基因等功能，已被越来越广泛地应用于生物、医药、环境监测和食品等领域。

基于酶标记目标物的方法常应用于酶免疫测定中，如酶标记免疫技术，是一种将试剂抗原或试剂抗体用酶进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，测定复合物中酶的免疫技术。而双酶双标记法常用于医学中的免疫组化染色测定中，如检测同一组织或细胞上不同的抗原，可采用双重染色技术，选择两种酶进行双重标记免疫染色，并采用一些显示色差异较明显的显色系统对双重染色结果进行观察，以此来提高检测的准确性，为疾病的诊断提供更重要的依据。由于采用双酶标记双目标物的方法在基因检测方面暂无应用，因此研制一种基于双酶标记两种木质素降解酶功能基因的生物传感器对两种目标基因同时进行快速、可靠的检测，是本领域技术人员当前面临的一项十分重要且具创新意义的研究课题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种结构简单、制作方便、能同时检测两种木质素降解酶功能基因的生物传感器，相应还提供一种该生物传感器的制备方法；本发明还提供一种简便快捷、特异性好、抗干扰性好、稳定性好、成本低的用该生物传感器同时检测两种木质素降解酶功能基因的方法，并相应提供一种该检测方法中用到的电化学检测系统。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种同时检测两种木质素降解酶功能基因的生物传感器，该生物传感器包括一用作三电极电解池工作电极的金电极，所述金电极上同时固定有编码锰过氧化物酶(MnP)功能基因的巯基修饰捕获探针M₁和编码纤维二糖脱氢酶(CDH)功能基因的巯基修饰捕获探针C₁，所述金电极表面上除所述捕获探针M₁和捕获探针C₁以外的剩余结合位点均采用巯基己醇封闭；

所述捕获探针M₁的DNA序列为5’-HS-(CH₂)₆-CTGATGGTGTCGTGTTTCT-3’；

所述捕获探针C₁的DNA序列为5’-HS-(CH₂)₆-TGTCAAAGTGGCAGTTCCCGT-3’。

上述技术方案中的捕获探针优选是通过Blast N程序在NCBI的BLAST服务器上进行序列比对后，利用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0两个软件并针对MnP和CDH的编码基因自行设计出来，但并不仅限于上述两种序列的捕获探针，以上述软件或其他公知的方法设计出的与上述捕获探针序列相近似的其他捕获探针，均等同于本发明的上述技术方案。

上述技术方案中，所述的MnP和CDH一般是指由黄孢原毛平革菌合成。黄孢原毛平革菌是目前研究得最透彻、最有效的木质素降解菌，已成为研究木质素降解的一种模式菌，因为其同时分泌MnP和CDH，且这两种酶在木质素降解方面起到了关键性作用。上述技术方案通过设计出编码黄孢原毛平革菌内两种木质素降解酶的功能基因探针，并制作相应的生物传感器进行特异性检测，这对分析MnP和CDH两种酶之间的分工协同作用具有重要意义；与此同时，我们也可将MnP和CDH这两种酶的编码基因作为检测黄孢原毛平革菌的靶基因，以利于此高效木质素降解菌的筛选和分离。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述同时检测两种木质素降解酶功能基因的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)配备捕获探针溶液：准备上述技术方案中所列DNA序列的捕获探针M₁和捕获探针C₁，并配制成浓度为60～100μM的捕获探针M₁溶液和浓度为60～100μM的捕获探针C₁溶液；

(2)金电极预处理：将金电极浸入Piranha溶液中浸泡，然后抛光至镜面，再对抛光后的金电极进行超声清洗，洗净后干燥金电极表面；以干燥后的金电极为工作电极，在电化学工作站进行循环伏安法扫描，直至得到稳定闭合的循环伏安图，完成金电极的预处理；

(3)捕获探针的固定：将制备得到的捕获探针M₁溶液和捕获探针C₁溶液混匀，再滴加到预处理后的所述金电极表面进行自组装，自组装完成后进行清洗除去未组装的捕获探针M₁和捕获探针C₁；

(4)封闭剩余结合位点：将固定有所述捕获探针M₁和捕获探针C₁后的金电极浸入1～2mM的巯基己醇中，室温下对所述金电极表面剩余的结合位点进行封闭，封闭完成后冲洗该金电极表面，得到同时检测两种木质素降解酶功能基因的生物传感器。

上述的制备方法中，滴加在所述金电极表面的捕获探针M₁和捕获探针C₁的用量均优选为3～5μL；所述自组装过程优选是在0℃～4℃的恒温条件下进行，自组装的时间为10～14h。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种用上述生物传感器同时检测两种木质素降解酶功能基因的方法，包括以下步骤：

(1)配备响应探针溶液：准备生物素标记的响应探针M₂和响应探针C₂，并配制成浓度为30～50μM的响应探针M₂溶液和浓度为30～50μM的响应探针C₂溶液；

所述响应探针M₂的DNA序列为5’-GATGCCGTTGTTGGCGGAGAA-Biotin-3’；

所述响应探针C₂的DNA序列为5’-CAGCGAGTGGAGGAAACAA-Biotin-3’；

所述响应探针优选是通过Blast N程序在NCBI的BLAST服务器上进行序列比对后，利用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0两个软件并针对MnP和CDH的编码基因自行设计出来，但并不仅限于上述两种序列的响应探针，以上述软件或其他公知的方法设计出的与上述响应探针序列相近似的其他响应探针，均等同于本发明的上述技术特征；

(2)配备辣根过氧化物酶-链霉亲和素溶液和漆酶-链霉亲和素溶液：其中辣根过氧化物酶-链霉亲和素可直接外购；漆酶-链霉亲和素则可用公知的方法制备；

(3)标记响应探针：将上述配备的响应探针M₂溶液与配备的10～20μM的辣根过氧化物酶-链霉亲和素溶液按(2～3)∶1的体积比混合，混合反应完成后得到酶标响应探针M₂-HRP溶液；另将上述配备的响应探针C₂溶液与配备的10～20μM的漆酶-链霉亲和素溶液按(2～3)∶1的体积比混合，混合反应后得到酶标响应探针C₂-LAC溶液；将反应后得到的酶标响应探针M₂-HRP溶液和酶标响应探针C₂-LAC溶液分别透析过夜，保存备用；由于生物素与链霉亲和素间的结合具有极高的亲和力，其反应呈高度的专一性，且一个链霉亲和素分子能与四个生物素分子紧密结合，因此使标记了生物素的响应探针过量，保证酶标记的链霉亲和素充分与标记了生物素的响应探针结合，过量的响应探针则用分子截留量为20000～25000的透析膜进行透析处理即可；

(4)一次杂交：将所述生物传感器浸入待测杂交液中进行一次杂交反应，杂交完成后冲洗所述生物传感器的金电极表面；

(5)二次杂交：将上述一次杂交后的生物传感器分别浸入到酶标响应探针M₂-HRP溶液中和酶标响应探针C₂-LAC溶液中进行二次杂交反应(优选的杂交反应次序为：先将上述一次杂交后的生物传感器浸入酶标响应探针C₂-LAC溶液中进行杂交反应，再将该杂交反应后的生物传感器浸入酶标响应探针M₂-HRP溶液中进行杂交反应，因为漆酶和辣根过氧化物酶维持活性的最适pH值不同，采用优选的两种响应探针分步杂交的方法可以保证后续检测过程中两种酶标物的活性)，再对该二次杂交反应后的生物传感器的金电极表面进行冲洗并干燥；

(6)电化学测定：采用一电化学检测系统进行电化学测定，其中以所述二次杂交后的生物传感器作为该电化学检测系统的工作电极，所述电化学测定的方法为交流阻抗法或循环伏安法中至少一种以及计时电流法，通过电化学测定产生的电化学信号即可确定出编码锰过氧化物酶的功能基因和编码纤维二糖脱氢酶的功能基因在待测杂交液中的检测结果。

上述检测方法的基本原理是：利用巯基自组装技术，将两种不同的捕获探针(M₁和C₁)同时固定在一金电极表面，并用巯基己醇封闭剩余的结合位点得到本发明的生物传感器；然后将辣根过氧化物酶和漆酶分别标记在两种不同的响应探针上，然后使两种不同的木质素降解酶(MnP和CDH)的目标基因序列与其捕获探针和响应探针先后两次杂交，从而将辣根过氧化物酶和漆酶分别标记在两种不同的目标基因上，这样目标基因浓度便可用不同酶标物催化反应产生的电化学信号进行表征。

上述的生物传感器同时检测两种木质素降解酶功能基因的方法，所述标记响应探针步骤中：混合反应时的温度优选控制在35℃～40℃，混合反应的时间优选为30～50min；所述透析时优选采用pH值为7.2～7.4、浓度为0.05～0.1M的磷酸盐缓冲液，透析时的温度为0℃～4℃。

上述的生物传感器同时检测两种木质素降解酶功能基因的方法，所述漆酶-链霉亲和素优选是采用改进后的过碘酸钠法合成，具体包括以下步骤：

将5～10mg漆酶溶于1～2mL超纯水中，加入0.2～0.5mL的0.05～0.15M NaIO₄，于室温下避光搅拌15～25min，在pH4.2～4.6醋酸钠缓冲液中透析过夜；然后向透析过夜后的混合液加入pH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液使pH值升高到9.0～9.2，加入含4～10mg链霉亲和素的pH9.0～9.2的碳酸盐缓冲液，室温避光搅拌1～2h，再加入3～5mg/mL NaBH₄混匀后继续置于0℃～4℃下反应1～2h，在磷酸盐缓冲液中透析过夜；继续向透析过夜后的混合液中加入等体积的饱和硫酸铵，0℃～4℃作用1～2h后离心；离心后的沉淀溶于少量磷酸盐缓冲液中，并在该磷酸盐缓冲液中透析过夜，最后将透析过夜后的产物离心，去除沉淀，上清液即为漆酶-链霉亲和素的结合物；所述透析过夜时的温度为0℃～4℃；所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.05～0.1M、pH为7.2～7.4。

链霉亲和素因表面所带正电荷少，且不含糖基，在实验中的非特异性结合远低于亲和素，因此目前以链霉亲和素标记的酶结合物更为常用，而用于标记的酶常见的为辣根过氧化物酶。本发明所用的两种酶标结合物之一即为辣根过氧化物酶标记链霉亲和素。由于漆酶同样具备纯度高、催化转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰富、标记后稳定等酶标物的特性，因此上述优选的技术方案采用改进后的过碘酸钠法对漆酶-链霉亲和素进行合成，用作本发明上述检测方法中的另一种酶标结合物。

上述的生物传感器同时检测两种木质素降解酶功能基因的方法，所述一次杂交、二次杂交步骤中：所述的各杂交反应均是在35℃～40℃条件下进行，所述各杂交反应的反应时间均为60～80min。如果待测杂交液中含有两种目标基因(编码MnP和CDH的功能基因)，则两次杂交完成后，即可实现双酶标记各自的靶基因序列。由于两种目标基因首尾分别与其相应的捕获探针和响应探针互补杂交，而两种响应探针末端又分别标记了辣根过氧化物酶和漆酶，因此一旦两次杂交成功，目标基因即可分别用两种标记物进行区分。

上述的生物传感器同时检测两种木质素降解酶功能基因的方法中，所述交流阻抗法、循环伏安法均是在5～10mM Fe(CN)₆ ^3-溶液中进行；

所述计时电流法具体操作优选为：

(1)以所述生物传感器的金电极为工作电极，还原电位在-0.09～-0.11V条件下，在pH值为4.8～5.5(最优选5.29)的磷酸盐缓冲液中加入对苯二酚后测定产生的电流信号(即加入对苯二酚后漆酶发生催化反应引起的电流信号)，并根据测得的电流值I₁和线性回归方程I确定待测杂交液中编码纤维二糖脱氢酶的功能基因浓度C_a的大小，所述线性回归方程I为I₁＝0.0886lg(C_a)-0.0359，其中I₁的单位为μA，C_a的单位为10^-12M，该线性回归方程I应用的线性检测范围为1.0×10^-10～4.0×10^-8M，相关系数r²为0.9881，检测下限分别为5.0×10^-11M；

(2)同一电解池中，加入NaOH调节pH至6.8～7.4(最优选6.98)，向该电解池中通入氮气以除去其中的溶解氧，还原电位在-0.15～-0.17V条件下，加入过氧化氢后测定产生的电流信号，(即加入过氧化氢后辣根过氧化物酶发生催化反应引起的电流信号)，并根据测得的电流值I₂和线性回归方程II确定待测杂交液中编码锰过氧化物酶的功能基因浓度C_b的大小；所述线性回归方程II为I₂＝0.0141lg(C_b)-0.0230，其中I₂的单位为μA，C_b的单位为10^-12M，该线性回归方程II应用的线性检测范围为1.0×10^-11～4.0×10^-8M，相关系数r²为0.9884，检测下限分别为1.0×10^-11M。

上述计时电流法为定量测量待测杂交液中编码CDH和MnP的功能基因浓度的方法，通过所述的交流阻抗法或者循环伏安法可以先定性分析出工作电极上是否固定上了两种捕获探针，以及两次杂交后目标基因及响应探针在电极表面的富集情况；通过定性分析后则可采用上述操作方法对两种功能基因进行定量分析。我们通过实验对两种酶标物发生催化反应的pH值进行优化后，发现漆酶在酸性条件下活性较大，而在中性条件下活性很微弱，且漆酶与对苯二酚反应时需要有氧条件；而辣根过氧化物酶在中性条件下活性最大，其与对苯二酚反应时需有过氧化氢的存在。因此在检测时，先将所述的工作电极置于酸性条件的缓冲液中，漆酶在有氧条件下与底物对苯二酚迅速发生反应产生电流信号；然后在同一电解池中用NaOH调节pH至中性条件，接着通入氮气除去电解池中的溶解氧，即可最大限度抑制漆酶再与对苯二酚发生反应；加入过氧化氢后，辣根过氧化物酶即与对苯二酚发生反应产生电流信号，根据加入底物前后电流的变化值即可很好地表征各目标基因序列的浓度大小。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种应用于上述检测方法中的电化学检测系统，所述电化学检测系统包括一电化学分析仪和与该电化学分析仪分别相连接的三电极电解池和显示器；所述三电极电解池是以上述的生物传感器作为工作电极，以饱和甘汞电极作为参比电极，以铂片电极作为对电极，所述生物传感器上的捕获探针M₁、捕获探针C₁通过与其(即捕获探针)杂交的功能基因还分别连接有相应的响应探针M₂、响应探针C₂，所述三电极电解池中添加有对苯二酚(定量检测编码CDH的功能基因时)或者添加有过氧化氢和对苯二酚(定量检测编码MnP的功能基因时)作为底物。

上述的电化学检测系统中，所述作为底物的对苯二酚在磷酸盐缓冲液中的浓度优选为3.0～8.0mM；所述作为底物的过氧化氢在磷酸盐缓冲液中的浓度优选为0.5～2.0mM。

与现有技术相比，本发明的优点在于：将微生物功能基因的研究与基于双酶标记双目标物的基因生物传感技术相结合，研制出一种基于辣根过氧化物酶和漆酶标记两种编码木质素降解酶功能基因的生物传感器及其制备和检测方法，该生物传感器利用巯基自组装及目标链与两种探针间夹心式杂交，通过双酶信号放大来实现对两种功能基因进行同时检测。本发明的生物传感器结构简单、制作方便，本发明的检测方法不仅操作简便、快速，而且特异性高、可重复性好，为城市生活垃圾堆肥处理中微生物功能基因的跟踪监测提供了技术支持，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例1中的生物传感器结构示意图；

图2为图1在A处的局部放大图；

图3为本发明实施例2中裸金电极、ssDNA/Au电极及dsDNA/Au电极经交流阻抗法测得的电化学表征图；其中，a₁表示裸金电极，b₁表示ssDNA/Au电极，c₁表示dsDNA/Au电极；

图4为本发明实施例2中裸金电极、ssDNA/Au电极及dsDNA/Au电极经循环伏安法测得的电化学表征图；其中，a₂表示裸金电极，b₂表示ssDNA/Au电极，c₂表示dsDNA/Au电极；

图5为本发明实施例2中电流变化值与编码CDH功能基因浓度的常用对数值之间的线性回归图；

图6为本发明实施例2中电流变化值与编码MnP功能基因浓度的常用对数值之间的线性回归图；

图7为本发明实施例2中编码CDH的目标链和错配链在特异性测试条件下的电流响应对比图；其中，a₃表示CDH目标链的两碱基错配链的电流响应结果，b₃为编码CDH目标链的电流响应结果；

图8为本发明实施例2中编码MnP的目标链和错配链在特异性测试条件下的电流响应对比图；其中，a₄表示MnP目标链的两碱基错配链的电流响应结果，b₄为编码MnP目标链的电流响应结果；

图9为本发明实施例2中抗干扰测试条件下单独检测一种编码CDH的靶基因序列和同时检测两种基因序列时编码CDH的靶基因产生的电流响应对比图；其中，a₅表示单独检测编码CDH的靶基因序列的结果，b₅表示同时检测两种基因序列时编码CDH的靶基因序列的结果；

图10为本发明实施例2中抗干扰测试条件下单独检测一种编码MnP的靶基因序列和同时检测两种基因序列时编码MnP的靶基因产生的电流响应对比图；其中，a₆表示单独检测编码MnP的靶基因序列的结果，b₆表示同时检测两种基因序列时编码MnP的靶基因序列的结果；

图11为本发明生物传感器的制备到用该生物传感器完成整个检测过程的全流程简图；

图12为本发明实施例2中电化学检测系统的结构示意图；

图13为本发明实施例2中电化学检测系统工作电极表面的局部放大图(图中只画出两条探针示意)。

图例说明：

1、金电极 2、捕获探针M₁

21、响应探针M₂ 22、MnP目标链M₃

3、捕获探针C₁ 31、响应探针C₂

32、CDH目标链C₃ 4、巯基己醇

5、电化学分析仪 6、三电极电解池

61、饱和甘汞电极 62、铂片电极

7、显示器 8、生物素

81、链霉亲和素 82、辣根过氧化物酶

83、漆酶

具体实施方式

实施例1：

一种如图1、图2所示本发明的同时检测两种木质素降解酶功能基因的生物传感器，该生物传感器包括一用作三电极电解池工作电极的金电极1，金电极1上同时固定有编码锰过氧化物酶功能基因的巯基修饰捕获探针M₁2和编码纤维二糖脱氢酶功能基因的巯基修饰捕获探针C₁3，金电极1表面上除捕获探针M₁2和捕获探针C₁3以外的剩余结合位点均采用巯基己醇4封闭；

其中捕获探针M₁2的DNA序列为5’-HS-(CH₂)₆-CTGATGGTGTCGTGTTTCT-3’；

捕获探针C₁3的DNA序列为5’-HS-(CH₂)₆-TGTCAAAGTGGCAGTTCCCGT-3’。

本实施例的生物传感器是通过以下步骤制备得到：

(1)制备捕获探针溶液：首先，搜寻出黄孢原毛平革菌分泌的MnP和CDH在GenBank中对应存在的所有基因序列，并用DNAman软件进行同种酶各序列相似性比较，然后确定出MnP和CDH分别对应的基因序列的保守区域，用Primer Premier 5.0及Oligo6.0两个软件对编码MnP和CDH的功能基因进行捕获探针序列设计，设计结果见下表1：

表1：针对编码MnP和CDH的功能基因设计的捕获探针序列

捕获探针	DNA序列
		MnP捕获探针M₁	5’-HS-(CH₂)₆-CTGATGGTGTCGTGTTTCT-3’
CDH捕获探针C₁	5’-HS-(CH₂)₆-TGTCAAAGTGGCAGTTCCCGT-3’

准备好上述经巯基修饰过的捕获探针M₁和捕获探针C₁(上海生工生物工程公司合成)，并用磷酸盐缓冲液(以下简称PBS)配制成浓度为80μM的捕获探针M₁溶液和浓度为80μM的捕获探针C₁溶液；

(2)金电极预处理：将一金电极1浸入Piranha溶液中浸泡2h，然后用Al₂O₃粉末抛光至镜面，再分别用乙醇、超纯水对抛光后的金电极1进行超声清洗，每次10min，洗净后用高纯氮气干燥金电极表面；以干燥后的金电极1为工作电极，以0.5M H₂SO₄溶液为工作底液，在电化学工作站进行循环伏安法(CV)扫描，扫描速度为100mV/s，电压为-0.8～1.0V，灵敏度1×10^-5，直至得到稳定闭合的循环伏安图，完成对金电极1的预处理；

(3)捕获探针的固定：将上述步骤(1)中制备得到的80μM的捕获探针M₁溶液和80μM的捕获探针C₁溶液各5μL混匀，再滴加到经过预处理后的金电极1表面进行自组装，4℃下恒温自组装12h，自组装完成后依次用Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、超纯水冲洗，以除去未组装的捕获探针M₁和捕获探针C₁；

(4)封闭剩余结合位点：将固定有捕获探针M₁2和捕获探针C₁3后的金电极1浸入到400μL 1mM的巯基己醇中，室温(20℃±5℃)下对金电极1表面剩余的结合位点进行封闭，封闭完成后依次用Tris缓冲液(pH8.0)、0.1M NaCl(pH8.0)、超纯水冲洗该金电极1表面，得到本实施例的同时检测两种木质素降解酶功能基因的生物传感器。

实施例2：

一种用本发明的生物传感器同时检测两种木质素降解酶功能基因的方法，包括以下步骤：

(1)制备响应探针溶液和待测杂交液：在搜寻出黄孢原毛平革菌分泌的MnP和CDH在GenBank中对应存在的所有基因序列后，确定出MnP和CDH分别对应的基因序列的保守区域，然后用Primer Premier 5.0及Oligo 6.0两个软件对编码MnP和CDH的功能基因进行响应探针、目标链及错配链的序列设计，设计结果见下表2：

表2：针对编码MnP和CDH的功能基因设计的响应探针、目标链及错配链序列

响应探针及目标链	DNA序列
		MnP响应探针M₂	5’-GATGCCGTTGTTGGCGGAGAA-Biotin-3’
MnP目标链M₃	5’-TTCTCCGCCAACAACGGCATCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGAAACACGACACCATCAG-3’
		MnP错配链M₄	5’-TTCTCCTCCAACAACGGCATCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGAAACACCACACCATCAG-3’
CDH响应探针C₂	5’-CAGCGAGTGGAGGAAACAA-Biotin-3’
		CDH目标链C₃	5’-TTGTTTCCTCCACTCGCTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACGGGAACTGCCACTTTGACA-3’
CDH错配链C₄	5’-TTGTTTCCTCCACTCACTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACGGGAACTGCCACTTTGATA-3’

准备好上述生物素标记的响应探针M₂和响应探针C₂(上海生工生物工程公司合成)，并用PBS配制成浓度为40μM的响应探针M₂溶液和浓度为40μM的响应探针C₂溶液；

准备好上述MnP目标链M₃和CDH目标链C₃(上海生工生物工程公司合成)，并用PBS配制成含目标链M₃浓度为1.0×10^-11～4.0×10^-8M和含目标链C₃浓度为1.0×10^-10～4.0×10^-8M的混合待测杂交液。

(2)准备辣根过氧化物酶-链霉亲和素和漆酶-链霉亲和素，其中辣根过氧化物酶-链霉亲和素通过外购得到，漆酶-链霉亲和素通过以下改进后的碘酸钠法合成：

将10mg漆酶溶于1mL超纯水中，加入0.2mL 0.1M NaIO₄溶液，室温下避光搅拌20min，在1mM(pH4.4)的醋酸钠缓冲液中4℃透析过夜；然后向透析过夜后的混合液中加入50μL 0.2M(pH9.5)的碳酸盐缓冲液，使pH值升高到9.0，边搅拌边滴加1mL含4mg链霉亲和素的0.02M(pH9.0)的碳酸盐缓冲液，室温避光轻轻搅拌2h；再加入0.1mL 4mg/mL的NaBH₄，混匀后再置于4℃条件下反应2h，在1/15M(pH7.4)的PBS中4℃透析过夜；继续向透析过夜后的混合液中边搅拌边逐滴加入等体积的饱和硫酸铵，置于4℃作用2h后在9000rpm的转速下离心15min，离心后的沉淀溶于少量1/15M(pH7.4)的PBS中，并在1/15M(pH7.4)的PBS中4℃透析过夜；最后将透析过夜后的产物在10000rpm的转速下离心30min，去除沉淀，上清液即为漆酶-链霉亲和素结合物，分装后冰冻保存。

(3)标记响应探针：将本实施例步骤(1)制得的响应探针M₂溶液与准备的20μM的辣根过氧化物酶-链霉亲和素按体积比3∶1混合，于37℃温度下反应30min，混合反应完成后得到酶标响应探针M₂-HRP溶液；另将本实施例步骤(1)制得的响应探针C₂溶液与准备的20μM漆酶-链霉亲和素按体积比3∶1混合，于37℃温度下反应30min，混合反应后得到酶标响应探针C₂-LAC溶液；将反应后得到的酶标响应探针M₂-HRP溶液和酶标响应探针C₂-LAC溶液分别在1/15M(pH7.4)的PBS中4℃透析过夜，保存于4℃环境中备用。

(4)一次杂交：将实施例1制得的生物传感器浸入400μL本实施例步骤(1)准备的混合待测杂交液中进行一次杂交反应，于37℃温度下杂交1h，杂交完成后用Tris-HCl缓冲溶液(pH8.0)、超纯水依次冲洗该生物传感器的金电极1表面，并干燥电极表面。

(5)二次杂交：将上述一次杂交后的生物传感器先浸入到400μL酶标响应探针C₂-LAC溶液中，37℃下杂交1h；再浸入到400μL酶标响应探针M₂-HRP溶液中，37℃下杂交1h；最后再用Tris-HCl缓冲溶液(pH8.0)、超纯水依次冲洗生物传感器的金电极1表面，干燥电极表面后开始进行电化学测定。

(6)电化学测定：采用一如图12所示的电化学检测系统进行电化学测定，该电化学检测系统包括一电化学分析仪5(上海辰华仪器公司生产，CHI660B)以及与该电化学分析仪5分别相连接的三电极电解池6(25ml)和显示器7，三电极电解池6连接于电化学分析仪5的输入端口，显示器7连接于电化学分析仪5的输出端口；三电极电解池6是以上述二次杂交后的生物传感器的金电极1(直径2mm)作为工作电极(即基底电极)，以饱和甘汞电极61作为参比电极，以铂片电极62作为对电极；金电极1表面固定的捕获探针M₁2通过与其杂交的MnP目标链M₃22连接有相应的响应探针M₂21，响应探针M₂21通过生物素8和链霉亲和素81标记有辣根过氧化物酶82；金电极1表面固定的捕获探针C₁3通过与其杂交的CDH目标链C₃32还连接有相应的响应探针C₂31，响应探针C₂31通过生物素8和链霉亲和素81标记有漆酶83；当检测CDH时，三电极电解池6中添加对苯二酚作为底物；当检测MnP时，三电极电解池6中再添加过氧化氢与之前加入的对苯二酚共同作为底物；以上述的电化学检测系统进行稳定地测量：

首先，分别将未经修饰的裸金电极、实施例1的生物传感器(即ssDNA/Au电极)以及经过上述两次杂交反应后的生物传感器(即dsDNA/Au)在5mM Fe(CN)₆ ^3-溶液中进行交流阻抗法和循环伏安法扫描，扫描结果如图3和图4所示；

交流阻抗技术是在频率变化过程中测量电化学系统阻抗值的方法，可以提供电极与溶液界面的多种性质；由图3可见，随着金电极表面附着的物质不断增加，膜层不断增厚，阻碍电子传递的作用越大，因此阻抗不断增大；图4表明，随着修饰层增厚，Fe(CN)₆ ^3-在电极表面的电子转移速率下降，阻碍了Fe(CN)₆ ^3-向电极表面进一步扩散，使得其氧化还原峰电流差值逐渐减小，而峰电位差值却依次增大。这两种方法均能较好地表征金电极表面的修饰程度，据此我们也可定性地判断出待测杂交液中同时含有编码锰过氧化物酶的功能基因和编码纤维二糖脱氢酶的功能基因。

通过上述方法判断出待测杂交液中同时含有编码锰过氧化物酶的功能基因和编码纤维二糖脱氢酶的功能基因后，再采用计时电流法对两种功能基因的浓度进行定量分析；

以经过上述两次杂交反应后的生物传感器为工作电极，在10mL(pH5.29)磷酸盐缓冲液中，加入对苯二酚作为底物，还原电位在-0.09～-0.11V条件下测定产生的电流信号，通过改变编码CDH功能基因的浓度大小，我们发现产生的电流变化值(下简称电流值)I₁与编码CDH功能基因浓度C_a的常用对数值成线性关系，线性回归图如图5所示；同一电解池中，加入NaOH调节pH至6.98，向该电解池中通入氮气以除去其中的溶解氧，还原电位在-0.15～-0.17V条件下，加入过氧化氢后测定产生的电流信号，通过改变编码MnP功能基因的浓度大小，我们发现产生的电流值I₂与编码MnP功能基因浓度C_b的常用对数值也成良好的线性关系，线性回归图如图6所示。

通过采用上述的计时电流法，使本发明的生物传感器对一系列不同浓度的编码CDH和MnP的功能基因进行同时测定，用酶标物产生的电流信号进行表征后，得出的定量分析结果如下：

电流值I₁与待测杂交液中编码CDH的功能基因浓度C_a的线性关系可用线性回归方程I表示为：I₁＝0.0886lg(C_a)-0.0359，其中I₁的单位为μA，C_a的单位为10^-12M，该线性回归方程I应用的线性检测范围为1.0×10^-10～4.0×10^-8M，相关系数r²为0.9881，检测下限分别为5.0×10^-11M；

电流值I₂与待测杂交液中编码MnP的功能基因浓度C_b的线性关系可用线性回归方程II表示为I₂＝0.0141lg(C_b)-0.0230，其中I₂的单位为μA，C_b的单位为10^-12M，该线性回归方程II应用的线性检测范围为1.0×10^-11～4.0×10^-8M，相关系数r²为0.9884，检测下限分别为1.0×10^-11M。

从实施例1生物传感器的制备到用该生物传感器完成上述整个检测过程的全流程简图如图11所示。

重复性测试：

用本实施例的生物传感器及检测方法对浓度为4.0×10^-8M、4.0×10^-9M和4.0×10^-10M的目标链杂交后连续三次测定其电流响应值，考察该生物传感器的重复性，测定结果为：编码CDH功能基因的相对标准偏差平均值(RSD)为3.52％，编码MnP功能基因的相对标准偏差平均值为4.31％，可见实施例1的生物传感器及本实施例的检测方法重复性好。

稳定性测试：

在潮湿条件下，将本实施例用到的生物传感器置于4℃下存放15d，再按照本实施例的检测方法和步骤对浓度为4.0×10^-8M的目标链杂交液进行检测，电流响应值仍约为初始电流的86.53％，说明实施例1的生物传感器及本实施例的检测方法具有良好的稳定性和使用寿命。

特异性测试：

在本实施例其他工艺条件、参数和步骤均不变的情况下，用计时电流法测定含两种浓度为4.0×10^-8M目标链的杂交液杂交后的电流响应值；另将两种目标链基因序列分别替换成各自的浓度为4.0×10^-8M两碱基错配链(见表2中MnP错配链M₄和CDH错配链C₄)，两次杂交后同样用计时电流法测定其电流响应值，其中编码CDH功能基因的电化学测试结果如图7所示，编码MnP功能基因的电化学测试结果如图8所示。由图7可见，编码CDH功能基因完全杂交时电流响应变化值为0.4218μA，该功能基因的两碱基错配链杂交后电流变化值为0.0728μA，杂交信号减少为完全杂交时的17.25％；由图8可见，编码MnP功能基因完全杂交时电流响应值为0.6783μA，该功能基因的两碱基错配链杂交信号为0.1301μA，杂交信号减少为完全杂交时的19.18％。由此可见，实施例1的生物传感器及本实施例的检测方法对这两种木质素降解酶的功能基因同时检测时，具有较强的特异性。

抗干扰测试：

保持本实施例中各检测方法和检测条件均不变，在同一目标链浓度下单独检测一种靶基因序列，比较杂交后电流响应值与两功能基因序列同时检测时的变化情况，检测结果如图9和图10所示。

由图9可见，在编码CDH的目标链浓度为5.0×10^-11M时，单独检测的电流响应值比同时检测的电流响应值大0.0369μA；由图10可见，在编码MnP的目标链浓度为3.5×10^-8M时，单独检测的电流响应值比同时检测的电流响应值大0.0457μA。由此可见，两种酶标记物同时存在时对彼此的干扰性较小，这充分说明使用本发明的生物传感器和检测方法能较好地对两种目标基因进行区分，产生的信号稳定可靠，从而实现快速、准确地对两种靶基因同时进行检测。

实施例3：

将一组未知浓度的编码MnP和CDH的靶基因序列分别用本发明实施例2的检测方法和传统的紫外分光光度法进行测定，结果如下表3所示：

表3：本发明的生物传感器法和紫外分光光度法检测效果对比

由上表3可见，本发明同时对编码两种木质素降解酶MnP和CDH的功能基因进行检测的方法是可行和有效的，本发明方法有望成为城市生活垃圾堆肥系统中的一套快速、低成本的微生物功能基因跟踪监测技术。

<110>湖南大学

<120>同时检测两种木质素降解酶功能基因的生物传感器及其制备和检测方法及电化

学检测系统

<160>8

<210>1

<211>19bp

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

ctgatggtgt cgtgtttct 19

<210>2

<211>21bp

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

tgtcaaagtg gcagttcccg t 21

<210>3

<211>21bp

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

gatgccgttg ttggcggaga a 21

<210>4

<211>19bp

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

cagcgagtgg aggaaacaa 19

<210>5

<211>74bp

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

ttctccgcca acaacggcat cttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttagaaa 60

cacgacacca tcag 74

<210>6

<211>71bp

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

ttgtttcctc cactcgctgt tttttttttt tttttttttt tttttttttt acgggaactg 60

ccactttgac a 71

<210>7

<211>74bp

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

ttctcctcca acaacggcat cttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttagaaa 60

caccacacca tcag 74

<210>8

<211>71bp

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

ttgtttcctc cactcactgt tttttttttt tttttttttt tttttttttt acgggaactg 60

ccactttgat a 71

Claims

1.一种同时检测两种木质素降解酶功能基因的生物传感器，该生物传感器包括一用作三电极电解池工作电极的金电极，其特征在于：所述金电极上同时固定有编码锰过氧化物酶功能基因的巯基修饰捕获探针M₁和编码纤维二糖脱氢酶功能基因的巯基修饰捕获探针C₁，所述金电极表面上除所述捕获探针M₁和捕获探针C₁以外的剩余结合位点均采用巯基己醇封闭；

2.一种如权利要求1所述的同时检测两种木质素降解酶功能基因的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)配备捕获探针溶液：准备所述DNA序列的捕获探针M₁和捕获探针C₁，并配制成浓度为60～100μM的捕获探针M₁溶液和浓度为60～100μM的捕获探针C₁溶液；

(2)金电极预处理：将一金电极浸入Piranha溶液中浸泡，然后抛光至镜面，再对抛光后的金电极进行超声清洗，洗净后干燥金电极表面；以干燥后的金电极为工作电极，在电化学工作站进行循环伏安法扫描，直至得到稳定闭合的循环伏安图，完成金电极的预处理；

(4)封闭剩余结合位点：将固定有所述捕获探针M₁和捕获探针C₁后的金电极浸入1～2mM的巯基己醇中，室温下对所述金电极表面剩余的结合位点进行封闭，封闭完成后清洗该金电极表面，得到同时检测两种木质素降解酶功能基因的生物传感器。

3.根据权利要求2所述的同时检测两种木质素降解酶功能基因的生物传感器的制备方法，其特征在于：滴加在所述金电极表面的捕获探针M₁和捕获探针C₁的用量均为3～5μL；所述自组装过程是在0℃～4℃的恒温条件下进行，自组装的时间为10～14h。

4.一种用权利要求1所述生物传感器同时检测两种木质素降解酶功能基因的方法，包括以下步骤：

所述响应探针M₂的DNA序列为5’-GATGCCGTTGTTGGCGGAGAA-Biotin-3’；

所述响应探针C₂的DNA序列为5’-CAGCGAGTGGAGGAAACAA-Biotin-3’；

(2)配备辣根过氧化物酶-链霉亲和素溶液和漆酶-链霉亲和素溶液；

(3)标记响应探针：将上述配备的响应探针M₂溶液与配备的10～20μM的辣根过氧化物酶-链霉亲和素溶液按(2～3)∶1的体积比混合，混合反应完成后得到酶标响应探针M₂-HRP溶液；另将上述配备的响应探针C₂溶液与配备的10～20μM的漆酶-链霉亲和素溶液按(2～3)∶1的体积比混合，混合反应后得到酶标响应探针C₂-LAC溶液；将反应后得到的酶标响应探针M₂-HRP溶液和酶标响应探针C₂-LAC溶液分别透析过夜，保存备用；

(4)一次杂交：将所述生物传感器浸入待测杂交液中进行一次杂交反应，杂交完成后清洗所述生物传感器的金电极表面；

(5)二次杂交：将上述一次杂交后的生物传感器分别浸入到备用的酶标响应探针M₂-HRP溶液中和酶标响应探针C₂-LAC溶液中进行二次杂交反应，再对该二次杂交反应后的生物传感器的金电极表面进行清洗并干燥；

5.根据权利要求4所述的生物传感器同时检测两种木质素降解酶功能基因的方法，其特征在于，所述标记响应探针步骤中：混合反应时的温度控制在35℃～40℃，混合反应的时间为30～50min；所述透析时采用pH值为7.2～7.4、浓度为0.05～0.1M的磷酸盐缓冲液，透析时的温度为0℃～4℃。

6.根据权利要求4所述的生物传感器同时检测两种木质素降解酶功能基因的方法，其特征在于，所述漆酶-链霉亲和素是采用过碘酸钠法合成，具体包括以下步骤：

将5～10mg漆酶溶于1～2mL超纯水中，加入0.2～0.5mL、0.05～0.15M的NaIO₄，于室温下避光搅拌15～25min，在pH 4.2～4.6的醋酸钠缓冲液中透析过夜；然后向透析过夜后的混合液加入pH 9.0～9.5的碳酸盐缓冲液使pH值升高到9.0～9.2，加入含4～10mg链霉亲和素的pH 9.0～9.2的碳酸盐缓冲液，室温避光搅拌1～2h，再加入3～5mg/mLNaBH₄混匀后继续置于0℃～4℃下反应1～2h，在磷酸盐缓冲液中透析过夜；继续向透析过夜后的混合液中加入等体积的饱和硫酸铵，0℃～4℃作用1～2h后离心；离心后的沉淀溶于磷酸盐缓冲液中，并在磷酸盐缓冲液中透析过夜，最后将透析过夜后的产物离心，去除沉淀，上清液即为漆酶-链霉亲和素的溶液；

所述透析过夜时的温度为0℃～4℃；所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.05～0.1M、pH为7.2～7.4。

7.根据权利要求4所述的生物传感器同时检测两种木质素降解酶功能基因的方法，其特征在于，所述一次杂交、二次杂交步骤中：所述的各杂交反应均是在35℃～40℃条件下进行，所述各杂交反应的反应时间均为60～80min。

8.根据权利要求4～7中任一项所述的生物传感器同时检测两种木质素降解酶功能基因的方法，其特征在于：所述交流阻抗法、循环伏安法均是在5～10mM Fe(CN)₆ ^3-溶液中进行；

所述计时电流法的具体操作为：

(1)以所述生物传感器的金电极为工作电极，还原电位在-0.09～-0.11V条件下，在pH值为4.8～5.5的磷酸盐缓冲液中加入对苯二酚后测定产生的电流信号，并根据测得的电流值I₁和线性回归方程I确定待测杂交液中编码纤维二糖脱氢酶的功能基因浓度C_a的大小，所述线性回归方程I为I₁＝0.0886lg(C_a)-0.0359，其中I₁的单位为μA，C_a的单位为10^-12M，该线性回归方程I应用的线性检测范围为1.0×10^-10～4.0×10^-8M；

(2)同一电解池中，加入NaOH调节pH至6.8～7.4，向该电解池中通入氮气以除去其中的溶解氧，还原电位在-0.15～-0.17V条件下，加入过氧化氢后测定产生的电流信号，并根据测得的电流值I₂和线性回归方程II确定待测杂交液中编码锰过氧化物酶的功能基因浓度C_b的大小；所述线性回归方程II为I₂＝0.0141lg(C_b)-0.0230，其中I₂的单位为μA，C_b的单位为10^-12M，该线性回归方程II应用的线性检测范围为1.0×10^-11～4.0×10^-8M。

9.一种应用于权利要求4～8任一项所述方法中的电化学检测系统，其特征在于：所述电化学检测系统包括电化学分析仪和与该电化学分析仪分别连接的三电极电解池和显示器；所述三电极电解池是以权利要求1所述的生物传感器的金电极作为工作电极，以饱和甘汞电极作为参比电极，以铂片电极作为对电极，所述生物传感器上的捕获探针M₁、捕获探针C₁通过与其杂交的功能基因还分别连接有相应的响应探针M₂、响应探针C₂，所述三电极电解池中添加有对苯二酚或者添加有过氧化氢和对苯二酚作为底物。