CN102618622B

CN102618622B - 一种检测纤维二糖脱氢酶活性的方法

Info

Publication number: CN102618622B
Application number: CN 201210102860
Authority: CN
Inventors: 赖萃; 曾茁桐; 曾光明; 黄丹莲; 赵美花; 危臻; 黄超; 李宁杰; 许飘; 张辰; 李芳玲
Original assignee: Hunan University
Current assignee: Hunan University
Priority date: 2012-04-10
Filing date: 2012-04-10
Publication date: 2013-08-28
Anticipated expiration: 2032-04-10
Also published as: CN102618622A

Abstract

本发明公开了一种检测纤维二糖脱氢酶活性的方法，包括以下步骤：首先取HAuCl₄水溶液加热搅拌至沸腾，然后加入柠檬酸钠溶液，至混合溶液颜色转为清亮橘红色后停止加热，得含纳米金颗粒的溶液；将该溶液加入到缓冲溶液中，再加入纤维二糖溶液、氯金酸溶液和表面活性剂溶液，使纳米金、纤维二糖在混合溶液中的浓度分别控制在0.3～0.4nM和0.4～0.5mM，配得检测体系；将待测溶液按照体积比添加到检测体系中，反应后对产物体系进行光谱扫描，测得纳米金颗粒的表面等离子体共振吸收峰强度，再根据测得的强度数值和已建立的线性回归方程，得到待测溶液中纤维二糖脱氢酶的酶活。本发明的方法具有灵敏度更高、抗干扰能力更强等优点。

Description

一种检测纤维二糖脱氢酶活性的方法

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域中测定酶活性的方法，尤其涉及一种检测纤维二糖脱氢酶活性的方法。

背景技术

纤维二糖脱氢酶（Cellobiose Dehydrogenase，CDH）是一种双辅助因子的黄素血红素蛋白。CDH是很多木质纤维素降解真菌在纤维素降解条件下产生的细胞外酶，它可以氧化纤维二糖和纤维寡糖生成相应的内酯，同时利用糖所衍生的电子还原醌、苯氧自由基等。CDH具有较宽的底物范围，在以纤维二糖为电子供体时，可以还原多种电子受体，如醌、细胞色素c、三碘离子，Fe³⁺及O₂等。CDH被认为可以通过还原Fe³⁺和O₂生成Fenton试剂来氧化降解纤维素，同时由于CDH还可以还原木质素相关的醌和苯氧自由基，从而可以阻止木质素降解酶在氧化木质素时生成的自由基的再聚合反应。因此CDH被认为是连接纤维素降解和木质素降解的关键酶，在木质素降解中起重要作用。

纤维二糖脱氢酶的研究日益受到重视，不仅因为该酶独特的性能及结构，更在于它在木质素降解方面的大规模应用前景。然而目前研究较多的产CDH的黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）产量较低，限制了其应用。因此，菌种产酶条件的优化研究成为热点，而建立一种能快速、灵敏地检测CDH活性的方法不仅能协助菌种产酶条件的优化，还能进一步拓宽该酶的应用范围。

目前，对于CDH活性的检测普遍采用测定CDH对3,5-二叔丁基-1,4-苯醌或者对2,6-二氯吲哚酚钠（DCIP）的还原消耗。而许多产CDH的木素降解菌会同时产其它木素降解酶而影响对CDH活性的检测，例如漆酶（Laccase）的存在会重新氧化DCIP被CDH还原后的产物，从而降低了CDH活性的检测精确度。此外，其它被报道的CDH活性的检测方法（如细胞色素c还原法）的检测精确度也受上述因素干扰。据此，研究一种能克服其它堆肥功能酶干扰的纤维二糖脱氢酶活性检测方法是本领域亟待解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种灵敏度更高、抗干扰能力更强的检测纤维二糖脱氢酶活性的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为一种检测纤维二糖脱氢酶活性的方法，包括以下步骤：

（1）纳米金颗粒的制备：取HAuCl₄水溶液加热搅拌至沸腾，然后边搅拌边加入柠檬酸钠溶液，直至混合溶液颜色转为清亮橘红色后停止加热，继续搅拌，室温冷却，得含纳米金颗粒的溶液；

（2）检测体系的制备：将上述含纳米金颗粒的溶液加入到缓冲溶液中（该缓冲液优选为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液），再加入纤维二糖溶液、氯金酸溶液和表面活性剂溶液，调节混合溶液中各组分的浓度，使所述纳米金颗粒、纤维二糖在混合溶液中的浓度分别控制在0.3nM～0.4nM和0.4mM～0.5mM（氯金酸和表面活性剂的浓度可由本领域技术人员根据实际情况在较大范围内进行调整，无特别要求，但氯金酸的浓度优选为0.2mM，表面活性剂的浓度优选为2mM），配得检测体系；

（3）酶活测定：将待测溶液按照1∶（4.5～5.5）的体积比添加到所述的检测体系中，混合均匀，待充分反应完全后，用紫外可见分光光度计对反应后的产物体系进行光谱扫描，测得产物体系中纳米金颗粒的表面等离子体共振吸收峰强度，再根据测得的表面等离子体共振吸收峰强度数值和已经建立的线性回归方程，得到待测溶液中纤维二糖脱氢酶的酶活。

上述检测纤维二糖脱氢酶活性的方法，所述检测体系中，所述纤维二糖、氯金酸和纳米金的摩尔比优选为（2～2.5）∶1∶（1.5×10^-6～2×10^-6）。一般而言，检测体系中所述（柠檬酸-柠檬酸钠）缓冲溶液浓度优选为0.1mol/L。

上述检测纤维二糖脱氢酶活性的方法，所述酶活测定步骤中，所述反应的测定条件优选为：反应温度控制在30℃～37℃，反应pH值为4.5～5.0，反应时间为10min～15min。

上述检测纤维二糖脱氢酶活性的方法，所述表面活性剂优选为十六烷基三甲基氯化铵（简称，CTAC）。

上述检测纤维二糖脱氢酶活性的方法优选应用于检测黄孢原毛平革菌培养后产出的粗酶液，即所述待测溶液优选为黄孢原毛平革菌培养后产出的粗酶液。

上述检测纤维二糖脱氢酶活性的方法，所述线性回归方程优选为A=0.0349x+0.5793，其中，A为测得的表面等离子体共振吸收峰强度数值，x为所述待测溶液中含有的纤维二糖脱氢酶的酶活，单位为U/L。

上述检测纤维二糖脱氢酶活性的方法，所述待测溶液中纤维二糖脱氢酶酶活的检测范围优选为1.3 U/L～9.5U/L。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明的技术方案排除了其他木质素降解酶对CDH活性检测的影响，使检测结果更加精确；本发明的检测方法比传统的检测方法更加快速和灵敏，利用紫外可见分光光度计操作简单、方便，成本低廉。

附图说明

图1 为纤维二糖脱氢酶活性检测的原理示意图。

图2为加入黄孢原毛平革菌粗酶液后检测体系的紫外可见光谱示意图。

图3为 CDH的活性与检测体系中纳米金表面等离子体共振吸收峰强度的线性关系图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步描述。

实施例：

一种本发明的检测纤维二糖脱氢酶活性的方法，其原理如图1所示，即纤维二糖脱氢酶以检测体系中的纤维二糖为电子供体，可以还原O₂生成H₂O₂，反应同时生成相应的纤维二糖内酯；而纳米金粒子能做为催化剂促进上述反应生成的H₂O₂与氯金酸之间的氧化还原反应；反应结果是氯金酸被还原出新的纳米金颗粒，从而增加了体系中原有的纳米金颗粒的粒径并改变了其表面等离子体共振吸收峰强度（反应机制见图1），因此CDH的加入会使检测体系产生可以测定的纳米金表面等离子体共振吸收峰强度变化。

本实施例的检测方法具体包括以下步骤：

（1）纳米金颗粒的制备

取质量浓度为0.01 %的HAuCl₄水溶液100 mL于恒温磁力搅拌器上加热至沸腾并保持2 min，在1000 r/min的转速的搅拌条件下，快速加入质量浓度为10 g/L的柠檬酸钠溶液6 mL；保持温度与转速，至溶液颜色转为清亮橘红色后停止加热，继续搅拌15 min，室温冷却后，用去离子水将溶液调节到原体积，制得含纳米金颗粒的溶液。

（2）检测体系的制备

将上述制得的含纳米金颗粒的溶液加入到0.1mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中，并加入纤维二糖溶液、氯金酸溶液与CTAC溶液混合均匀，调节混合溶液中纤维二糖、氯金酸和CTAC的浓度分别至0.45mmol/L、0.2mmol/L和2mmol/L，并调节混合溶液中纳米金颗粒浓度至0.3nmol/L。

（3）建立线性回归方程

从斜面培养基上刮取黄孢原毛平革菌（在中国典型培养物保藏中心保藏编号为CCTCC AF96007，市购）接种至主要由α-纤维素、酵母浸膏、MgSO₄·7H₂O和微量元素溶液制成的pH为5.0的液体培养基中，以上四种组分在液体培养基中的浓度分别为30g/L、30g/L、1g/L和0.3ml/L。其中微量元素溶液包括0.6g/L的氨基乙酸、0.5g/L的MnSO₄·H₂O、1.0 g/L的NaCl、0.1g/L 的FeSO₄·7H₂O、0.22g/L的CoSO₄·7H₂O、1.56g/L的CaCl₂·2H₂O、0.1g/L的ZnSO₄·7H₂O、0.01g/L的CuSO₄·5H₂O、0.01g/L的AlK(SO₄)₂·12H₂O、0.01g/L的HBO₃、0.01g/L的Na₂MoO₄·2H₂O和0.1g/L的VB₁。100mL的液体培养基装在500mL的锥形瓶中，接种后控制培养温度为30℃～37℃，于100rpm～120rpm转速下振荡培养7天后过滤收集菌液，滤出液即为含纤维二糖脱氢酶的粗酶液。

用DCIP法测定三种不同浓度的粗酶液中纤维二糖脱氢酶活性，测定结果分别为1.9U/L, 5.3U/L和8.4U/L。分别将上述不同浓度的粗酶液加入检测体系中，利用紫外可见分光光度计测定出加入粗酶液后检测体系中纳米金表面等离子体共振吸收峰的强度，如图2所示，其中，a、空白样； b、1.9U/L，c、5.3U/L和d、8.4U/L。纳米金颗粒表面等离子体共振吸收峰强度由于加入的粗酶液中纤维二糖脱氢酶活性的不同，而发生不同程度的变化，也因此证实了可以使用其吸收峰强度作为纤维二糖脱氢酶活性的检测指标。

如图3所示，通过测定一系列不同酶活的粗酶液中CDH的酶活，得出加入检测体系的酶活与纳米金颗粒表面等离子体共振吸收峰强度之间呈线性关系的范围为1.3 U/L～9.5U/L，回归方程为A=0.0349x+0.5793，其中A为检测体系中纳米金颗粒表面等离子体共振吸收峰强度，x为纤维二糖脱氢酶酶活（U/L），相关系数为0.9867。

（4）测定酶活

取稻草粉末、岳麓山表层土壤、菜叶、麸皮各30g混匀后制成堆料，加入去离子水调节堆料含水率为75%，并接种黄孢原毛平革菌质量比为0.8%。上述堆料置于30℃通风环境中自然发酵30天后，取四份堆料各10g堆料置于锥形瓶中，分别加入50mL、100mL、150mL和200mL去离子水，于150rpm转速下振荡1h，过滤后取滤液得到粗酶液。

将所得四份粗酶液以1：5的体积比分别加入上述检测体系中，调节溶液pH为4.5，混合均匀并使溶液在37℃下充分反应10min后在紫外可见分光光度计中测定纳米金颗粒表面等离子体共振吸收峰强度。根据上述线性回归方程，得出各粗酶液中CDH酶活见下表1。由表可见，采用本发明测定的CDH酶活结果与浸取比例呈线性关系。

表1：粗酶液中CDH酶活的检测结果

堆料（g）与水（mL）的浸取比例	本发明方法测定的CDH酶活（U/L）	DCIP法测定的CDH酶活（U/L）
			1∶5	5.31	4.85
1∶10	2.52	2.19
			1∶15	1.87	1.76
1∶20	1.41	1.35

由于本实施例中黄孢原毛平革菌的培养条件有限，产生的CDH活性不高，故而所建立的回归模型的酶活线性范围受到限制，在大规模的黄孢原毛平革菌的培养实验中，本实施例的线性范围完全能够有所扩展。

从上述本实施例的测定结果也可以清楚地看出，本方法与传统CDH活性测定方法相比，检测结果非常接近，但是由于本方法不受其它木素降解酶的干扰，使检测结果有一定的修正。本方法操作简便，灵敏度高，解决了复杂环境中其它木素降解酶的干扰问题，使本方法成为一套快速、低成本的纤维二糖脱氢酶酶活检测技术，可以应用于优化菌种产纤维二糖脱氢酶条件的研究，并拓宽纤维二糖脱氢酶在木素降解方面的应用范围。

Claims

1.一种检测纤维二糖脱氢酶活性的方法，包括以下步骤：

（2）检测体系的制备：将上述含纳米金颗粒的溶液加入到缓冲溶液中，再加入纤维二糖溶液、氯金酸溶液和表面活性剂溶液，调节混合溶液中各组分的浓度，使所述纳米金颗粒、纤维二糖在混合溶液中的浓度分别控制在0.3nM～0.4nM和0.4 mM～0.5mM，配得检测体系；

（3）酶活测定：将待测溶液按照1∶（4.5～5.5）的体积比添加到所述的检测体系中，混合均匀，待充分反应完全后，用紫外可见分光光度计对反应后的产物体系进行光谱扫描，测得产物体系中纳米金颗粒的表面等离子体共振吸收峰强度，再根据测得的表面等离子体共振吸收峰强度数值和已经建立的线性回归方程，得到待测溶液中纤维二糖脱氢酶的酶活；

所述检测体系中，所述纤维二糖、氯金酸和纳米金的摩尔比为（2～2.5）∶1∶（1.5×10^-6～2×10^-6）；

所述酶活测定步骤中，所述反应的测定条件为：反应温度控制在30℃～37℃，反应pH值为4.5～5.0，反应时间为10min～15min；

所述待测溶液为黄孢原毛平革菌培养后产出的粗酶液；

所述线性回归方程为A=0.0349x+0.5793，其中，A为测得的表面等离子体共振吸收峰强度数值，x为所述待测溶液中含有的纤维二糖脱氢酶的酶活，单位为U/L。

2.根据权利要求1所述的检测纤维二糖脱氢酶活性的方法，其特征在于，所述表面活性剂为十六烷基三甲基氯化铵。

3.根据权利要求1或2所述的检测纤维二糖脱氢酶活性的方法，其特征在于：所述待测溶液中纤维二糖脱氢酶酶活的检测范围为1.3 U/L～9.5U/L。