CN103411928B - 检测纤维二糖酶抑制剂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测纤维二糖酶抑制剂的方法，包括将一种纳米金探针溶液加入含待测物质的纤维二糖酶溶液中，检测温度控制在30℃～35℃，检测pH值控制在4.0～4.5，待纳米金探针反应完全后，检测含待测物质的溶液体系中纳米金探针吸收峰在620nm处的吸光度与520nm处的吸光度比值A620/A520，设为A₂；同等条件下，检测不含待测物质的溶液体系中纳米金探针的吸光度比值A620/A520，设为A₁；比较A₂和A₁的大小，即可判断待测物质是否为纤维二糖酶抑制剂，并计算出抑制率。本发明的方法快速、灵敏、成本低廉、且对环境无害。

Description

检测纤维二糖酶抑制剂的方法

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域中检测酶抑制剂的方法，尤其涉及一种检测纤维二糖酶抑制剂的方法。

背景技术

纤维素酶是由能降解木质素的微生物分泌的一种多组分复合酶，它包括内切型葡聚糖酶（EC3.2.1.4，也称CX酶、CMC酶）、外切型葡聚糖酶（EC3.2.1.91，也称C₁酶、微晶纤维酶）和纤维二糖酶（EC3.2.1.21，也称β-葡萄糖苷酶）三种主要组分。普遍认为在将天然纤维素降解成葡萄糖的过程中，必须依靠这三种组分的协同作用才能完成。纤维素大分子首先在C₁酶和C_X酶的作用下逐步降解成纤维二糖，而纤维二糖酶则进一步将纤维二糖水解成葡萄糖。在利用纤维素酶制剂水解纤维素的过程中，常常由于纤维二糖酶的活力很低造成纤维二糖的累积，而纤维二糖又会对纤维素酶的催化作用形成强烈的反馈抑制。因此在纤维素酶解过程中提高纤维二糖酶的活力意味着提高纤维素水解效率和葡萄糖产量。

实际应用中纤维二糖酶的活性会受到环境因素的抑制，例如土壤中的汞、铜等重金属会通过富集作用进入植物体内，而木质素降解功能微生物在处理这些含重金属的植物残体时，由于这些重金属存在，会抑制木质素降解功能微生物的生物活性，并且这些重金属能使纤维二糖酶的必需基团或活性部位的性质和结构发生改变，导致酶活性降解或丧失，从而抑制纤维素的降解效率。因此一种特异性高效检测纤维二糖酶活性抑制剂的方法能有效提高纤维二糖酶的实际应用价值。

目前，检测纤维二糖酶活性抑制剂的方法普遍是基于纤维二糖酶活性测定方法，其中Barush和Swiain法是以水杨苷为酶反应底物，检测水解后产生的极微量的葡萄糖，反应易受干扰，且检测灵敏度不高；荧光法灵敏度高且快速，但是由于实验过程操作复杂，且重现性不好，现在应用不多；比色法是以对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷（pNPG）为酶底物，检测底物水解后释放出来的对硝基苯酚，而对硝基苯酚是一种很难被生物降解的、危害环境的高毒性有机物。因此，研究一种简便高效且对环境无害的纤维二糖酶抑制剂检测方法是亟待解决的问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种更加快速、灵敏、且对环境无害、成本低廉的检测纤维二糖酶抑制剂的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为一种检测纤维二糖酶抑制剂的方法，该方法包括以下步骤：将一种可用于检测纤维二糖酶抑制剂的纳米金探针溶液加入含待测物质的纤维二糖酶溶液中，所述纳米金探针溶液与所述纤维二糖酶溶液的体积比为20∶1，其中每20体积的纳米金探针溶液中含有2～4体积的纳米金探针浓缩液（所述浓缩液为纳米金探针制备时高速离心后的含纳米金探针沉淀的浓缩液），将检测温度控制在30℃～35℃，检测pH值控制在4.0～4.5，待纳米金探针反应完全后（一般至少反应10min），检测含待测物质的溶液体系中纳米金探针表面等离子体共振吸收峰强度变化，得到吸收峰在620nm处的吸光度与520nm处的吸光度比值A620/A520，设为A₂；同等条件下，即纳米金探针溶液与纤维二糖酶溶液的体积比、检测温度、检测pH值、反应时间等条件均相同的情况下，将所述纳米金探针溶液加入不含待测物质的纤维二糖酶溶液中，检测不含待测物质的溶液体系中纳米金探针表面等离子体共振吸收峰强度变化，得到吸收峰在620nm处的吸光度与520nm处的吸光度比值A620/A520，设为A1；比较含待测物质的溶液体系中纳米金探针表面等离子体共振吸收峰强度变化（以A₂为代表）和不含待测物质的溶液体系中纳米金探针表面等离子体共振吸收峰强度变化（以A₁为代表）的大小，即可判断待测物质是否为纤维二糖酶抑制剂（定性检测）；

当A₂＜A₁时，表明待测物质为纤维二糖酶抑制剂，所述纤维二糖酶抑制剂对纤维二糖酶活性的抑制率计算方程为：

$I=1-C_2/C_1=(1-{10}^{\frac{A_2-A_1}{0.3642}})\×100\%$

其中，I为纤维二糖酶抑制剂对纤维二糖酶活性的抑制率，C₁为不含纤维二糖酶抑制剂时纤维二糖酶的活性数值，C₂为含纤维二糖酶抑制剂时纤维二糖酶的活性数值；

所述纳米金探针包括纳米金颗粒，所述纳米金颗粒上修饰有纤维二糖和6-巯基己-1-醇。

上述的抑制效率计算方程主要基于以下原理得到：纤维二糖酶溶液中不含抑制剂时，纤维二糖酶的活性与纳米金探针表面等离子体共振吸收峰强度呈线性关系，线性回归方程为A=0.3642n+0.6273，其中A优选为紫外可见吸收光谱图中620nm处的吸光度与520nm处的吸光度比值（A620/A520），根据检测得到的吸光度比值即可得到酶活相关值n，再根据表达式C=1.5×10ⁿ即可定量测得溶液中纤维二糖酶的酶活C，C的量纲为U/mL（定量检测）。在定量检测中，所述纤维二糖酶酶活C的检测范围优选为0.15U/mL～150U/mL。通过上述回归方程和酶活表达式，得出本发明方法中纤维二糖酶溶液里抑制剂存在时，该抑制剂对纤维二糖酶的抑制率。

上述的检测方法中，所述纳米金探针的粒径优选为40nm～60nm。

上述的检测方法中，所述纳米金探针的Zeta电位优选为-30mV～-40mV。

上述本发明的纳米金探针主要是基于纳米金颗粒能够在不破坏生命物质结构和功能的前提下提供光电检测信号，纳米金颗粒的粒径大小以及颗粒间的相对距离会影响其稳定性以及光学性质，从而提供可供检测的光学信号。本发明的纳米金探针表面修饰的纤维二糖使纳米金颗粒之间增加了排斥力，从而使得纳米金颗粒之间的距离稳定而不聚集沉降，具有稳定剂的作用；而纳米金探针表面修饰的6-巯基己-1-醇（MCH）则一端通过硫醇基与纳米金颗粒连接，另一端的羟基暴露在外。当本发明的纳米金探针检测的纤维二糖酶溶液中不含抑制剂时，纤维二糖作为纤维二糖酶的底物被分解，这时MCH暴露在外的羟基之间的吸引力会促使纳米金颗粒之间距离变近、聚集沉降，从而使得纳米金探针提供相应的可供检测的光学信号。而当本发明的纳米金探针检测的纤维二糖酶溶液中含有抑制剂时，抑制剂会抑制纤维二糖酶的活性，干扰其与纳米金探针表面的纤维二糖的酶促反应，这种情况下纳米金探针表面修饰的纤维二糖能保持体系的稳定，从而出现与抑制剂不存在时不同的光学信号，达到检测目的。

上述的检测方法中，优选的，所述纳米金探针主要由以下方法制备得到：在配好的纤维二糖溶液中加入氯金酸溶液和硼氢化钠溶液，充分混匀且反应完全后，将得到的反应产物低速离心纯化以去除沉积颗粒，再于上清液中加入6-巯基己-1-醇进行培养，培养完成后高速离心纯化，将高速离心后的沉淀（含少量水，即上述的纳米金探针浓缩液）重溶于超纯水中，得到含有可用于检测纤维二糖酶抑制剂的纳米金探针的溶液。

上述的检测方法中，所述氯金酸、硼氢化钠、纤维二糖的摩尔用量比优选为1∶（16.3～18.4）∶（1.2～6）。

上述的检测方法中，所述氯金酸与6-巯基己-1-醇的摩尔用量比优选为1∶（0.002～0.004）。

上述原料摩尔用量的确定是通过以下各组反复的优化实验进行确定的。

1.纤维二糖用量的优化：于20mL不同质量浓度的纤维二糖溶液中加入0.2mL、质量浓度为1%的氯金酸溶液，振荡混匀后再加入0.2mL、质量浓度为1.5%的硼氢化钠溶液充分反应0.5h；低速离心纯化去除沉积颗粒后使用激光粒度分析仪检测不同纤维二糖用量对所制纳米金-纤维二糖复合物粒径分布以及Zeta电位的影响，检测结果如下表1所示。

表1：纤维二糖用量对纳米金-纤维二糖复合物的影响

编号	纤维二糖质量浓度	平均粒径（nm）	PDI指数	Zeta电位（mV）
					1	0%	31.3	0.512	-35.2
2	0.005%	42.8	0.581	-33.5
					3	0.01%	33.8	0.081	-36.4
4	0.05%	33.6	0.138	-33.3
					5	0.1%	40.6	0.497	-31.5
6	0.2%	64.5	0.488	-30.6

7	0.5%	81.4	0.289	-32.2
					8	1%	38.6	0.276	-34.1

根据我们反复的实验观察和分析比对，当反应体系中纤维二糖用量过小时，纤维二糖与氯金酸结合位点较少，在纳米金形成过程中，起稳定剂作用的纤维二糖过少则容易造成较大粒径的纳米金-纤维二糖复合物形成；而当反应体系中纤维二糖用量过大时，过多的纤维二糖吸附于纳米金颗粒上，阻止了纳米金颗粒形成过程中的进一步增长，反而形成了较小粒径的纳米金-纤维二糖复合物。可见，过多或过少的纤维二糖吸附于纳米金颗粒表面都可能会对后续制备的纳米金探针的灵敏度造成影响，所以我们优选粒径适中、分散均匀、体系稳定的纳米金-纤维二糖复合物；具体而言，我们优选选择平均粒径为30～40nm、PDI数值小于0.4、Zeta电位数值绝对值大于30mV的纳米金-纤维二糖复合物；并且通过在下一步的纳米金探针应用实验中得到验证，采用前述优化标准的纤维二糖量制备的纳米金探针检测灵敏，且纤维二糖酶活性的检测幅度及检测下限都达到了预期效果。据此，由上表1可见，当纤维二糖溶液的浓度优选为0.01%～0.05%时，制得的纳米金-纤维二糖复合物的平均粒径适中，粒径分布指数PDI、Zeta电位数值显示所制复合物颗粒分布均匀，体系稳定。在此优选的纤维二糖溶液浓度下，所述氯金酸与纤维二糖的摩尔用量比优选为1∶（1.2～6）。

2.硼氢化钠用量的优化：于20mL、质量浓度0.05%的纤维二糖溶液中加入0.2mL、质量浓度1%的氯金酸溶液，振荡混匀后向上述反应体系中加入不同体积的质量浓度为1.5%硼氢化钠溶液充分反应0.5h；低速离心纯化去除沉积颗粒后使用激光粒度分析仪检测不同硼氢化钠添加量对所制纳米金-纤维二糖复合物粒径分布以及Zeta电位的影响，检测结果如下表2所示。

表2：硼氢化钠用量对纳米金-纤维二糖复合物的影响

编号	硼氢化钠添加量（mL）	平均粒径(nm)	PDI指数	Zeta电位（mV）
					1	0.175	87.2	0.771	-32.8
2	0.2	31.7	0.123	-35.5
					3	0.225	30.4	0.352	-36.5
4	0.25	34.2	0.435	-33.2

根据我们反复的实验观察和分析比对，硼氢化钠作为还原剂，其添加量决定着制备的纳米金的质量，我们优选粒径适中、分散均匀、体系稳定的纳米金-纤维二糖复合物；即以上提到的粒径为30～40nm、PDI数值小于0.4、Zeta电位数值绝对值大于30mV的纳米金-纤维二糖复合物作为筛选标准；并且通过在后续的纳米金探针应用实验中进行验证，采用前述筛选标准下的硼氢化钠量制备的纳米金探针检测灵敏，纤维二糖酶活性的检测幅度及检测下限都达到了预期效果。据此，由上表2可见，质量浓度为1.5%的硼氢化钠溶液优选的添加量为0.2mL～0.225mL时，制备的纳米金-纤维二糖复合物的粒径分布指数PDI数值表明体系中颗粒分布均匀，Zeta电位数值也显示所制体系较稳定，平均颗粒粒径适中。在此优选的硼氢化钠溶液添加量下，所述氯金酸与硼氢化钠的摩尔用量比优选为1∶（16.3～18.4）。

3.MCH添加量的确定：取10mL制得的纳米金-纤维二糖复合物加入不同体积的1mmol/L的MCH，于37℃下静置反应2h后于12000rpm离心5min，去除上清液并将沉淀重溶于5mL超纯水中（体积减小为离心前的1/2）；使用激光粒度分析仪检测不同MCH添加量对所制纳米金探针粒径分布以及Zeta电位的影响，检测结果如下表3所示。

表3：MCH用量对纳米金探针的影响

编号	MCH添加量（mL）	平均粒径（nm）	PDI指数	Zeta电位（mV）
					1	0.01	37.1	0.561	-33.4
2	0.02	57.4	0.289	-36.5
					3	0.03	173	0.195	-35.2
4	0.04	196	0.257	-33.2
					5	0.05	340	0.257	-30.9

根据我们反复的实验观察和分析比对，6-巯基己-1-醇（MCH）在本发明的技术思路中是起着增加纳米金探针灵敏度的作用，而过量的6-巯基己-1-醇（MCH）的加入会影响体系的稳定性，所以在不影响体系稳定性的前提下，选取最大程度的MCH添加量。与前述相对应，我们优选粒径适中、分散均匀、体系稳定的纳米金探针；即粒径小于100nm、PDI数值小于0.6、Zeta电位数值绝对值大于30mV的纳米金探针作为筛选标准；通过在后续纳米金探针应用实验中进行验证，采用优选比例的6-巯基己-1-醇添加量制备的纳米金探针检测灵敏，纤维二糖酶活性的检测幅度及检测下限都达到了预期效果。据此，由上表3可见，当MCH用量高于0.02mL时制备的纳米金探针平均粒径显著上升，表示6-巯基己-1-醇（MCH）用量过高导致颗粒间聚集，而MCH用量小于0.02mL时纳米金探针的平均粒径适中、且粒径分布指数PDI数值、Zeta电位显示该6-巯基己-1-醇添加量下制备的纳米金探针较为稳定、颗粒分布均匀，适用于检测体系的要求。在此优选的6-巯基己-1-醇添加量下，所述氯金酸与6-巯基己-1-醇摩尔用量比优选为1∶（0.002～0.004）。

上述的制备方法中，所述加入6-巯基己-1-醇进行培养时的温度优选控制在30℃～37℃，培养时间优选为2h～2.5h。

上述的制备方法中，所述低速离心时的转速优选为1200rpm～1500rpm，所述高速离心时的转速优选为12000rpm～15000rpm。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1.本发明检测方法中选用的检测纤维二糖酶抑制剂的纳米金探针具有较高的检测灵敏度，拓宽了纤维二糖酶抑制剂检测方法的选择范围；

2.本发明检测方法中选用的纳米金探针的制备工艺简单，不需要使用昂贵复杂的仪器设备，制备成本低廉，且具有对环境无害的特点，易于推广；

3.本发明的检测方法更加快捷、灵敏、精确，操作方便，可有效应用于纤维二糖酶抑制剂的定性和抑制率定量检测，利于指导菌种产纤维二糖酶条件优化，以及拓宽该酶在木质纤维素降解领域的应用范围。

附图说明

图1为本发明实施例1中纳米金探针用于检测含Hg²⁺的纤维二糖酶溶液和不含Hg²⁺的纤维二糖酶溶液的紫外可见吸收光谱比较示意图。

图2为本发明实施例1中制得的纳米金探针在Hg²⁺存在时，与纤维二糖酶反应后的透射电镜图。

图3为本发明实施例2中纳米金探针用于检测含Cu²⁺的纤维二糖酶溶液和不含Cu²⁺的纤维二糖酶溶液的紫外可见吸收光谱比较示意图。

图4为本发明实施例1中不同浓度的纤维二糖酶溶液加入纳米金探针溶液后反应体系的紫外可见吸收光谱图。

图5为本发明实施例1中纤维二糖酶的活性与纳米金探针表面等离子体共振吸收峰强度变化的线性关系图。

图6为本发明实施例1中制备纳米金探针的对比例1中未经修饰的纳米金颗粒直接用于检测纤维二糖酶的紫外可见吸收光谱图。

图7为本发明实施例1中制备纳米金探针的对比例2中只修饰MCH的纳米金颗粒用于检测纤维二糖酶的紫外可见吸收光谱图。

图8为本发明实施例1中纳米金、纳米金-纤维二糖复合物、纳米金探针、以及纳米金探针-纤维二糖酶的紫外可见吸收光谱比较示意图。

图9为本发明实施例1中的纳米金探针用于检测漆酶的紫外可见吸收光谱图。

图10为本发明实施例1中制备纳米金探针的对比例1中未经任何修饰的纳米金颗粒的透射电镜图。

图11为本发明实施例1中制得的纳米金探针的透射电镜图。

图12为本发明实施例1中制得的纳米金探针与纤维二糖酶反应后的透射电镜图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。

实施例1：

一种本发明的检测纤维二糖酶抑制剂的方法，包括以下步骤：

取0.1mL含2.5U/mL纤维二糖酶的磷酸盐缓冲溶液，添加到2.0mL纳米金探针溶液（含0.2mL纳米金探针浓缩液）中混合均匀，将检测温度控制在35℃，检测pH值控制在4.5，此检测条件下待纳米金探针反应10min后，用紫外可见分光光度计对反应后的产物体系进行光谱扫描，根据检测后溶液体系中纳米金探针表面等离子体共振吸收峰强度变化，计算得出620nm处的吸光度与520nm处的吸光度比值A₁为0.7038；同样，取0.1mL上述含纤维二糖酶的溶液，向溶液中加入HgCl₂（模拟纤维二糖酶降解含Hg²⁺的木质纤维素），使溶液中Hg²⁺的浓度达到1mM，将所得溶液添加到2.0mL纳米金探针溶液（含0.2mL纳米金探针浓缩液）中混合均匀，在温度为35℃、pH值为4.5时反应10min，用紫外可见分光光度计对反应产物进行光谱扫描，根据检测后纳米金探针表面等离子体共振吸收峰强度变化，计算得出620nm处的吸光度与520nm处的吸光度比值A₂为0.3914，A2小于A1，即可判断待测溶液中含有纤维二糖酶抑制剂。

上述1mM的Hg²⁺对纤维二糖酶产生的抑制效果可通过抑制率来反映，抑制率是通过以下方法计算得到：首先，建立纳米金探针对纤维二糖酶进行定量检测的线性回归方程，Sigma-Aldrich生产的从黑曲霉提取的纤维二糖酶的酶活为300U/mL，用20mM的磷酸盐缓冲溶液稀释纤维二糖酶，使其浓度分别为0.1U/mL、0.15U/mL、1.5U/mL、15U/mL、30U/mL、60U/mL、150U/mL，分别将0.1mL上述不同浓度的纤维二糖酶溶液加入到2.0mL纳米金探针溶液（含0.2mL纳米金探针浓缩液）中，利用紫外可见分光光度计测定出加入不同浓度纤维二糖酶溶液的各反应体系中纳米金探针表面等离子体共振吸收峰的强度，如图4所示，纳米金探针表面等离子体共振吸收峰强度由于加入不同浓度的纤维二糖酶溶液，发生了不同程度的变化。如图5所示，通过测定一系列不同浓度的纤维二糖酶活性，得出加入纳米金探针的纤维二糖酶活性与纳米金探针表面等离子体共振吸收峰强度之间呈线性关系的范围为0.15U/mL～150U/mL，回归方程为y=0.3642x+0.6273，即A=0.3642n+0.6273：A为紫外可见吸收光谱图中620nm处的吸光度与520nm处的吸光度比值（A620/A520），纤维二糖酶活C=1.5×10ⁿ（U/mL），n即为x，相关系数为0.9688。

将不含Hg²⁺的纤维二糖酶溶液及加入1mM的Hg²⁺的纤维二糖酶溶液后计算得到的A₁及A₂值代入上述得到的回归方程，则1mM的Hg²⁺对纤维二糖酶的抑制率I为：

$I=1-C_2/C_1=(1-{10}^{\frac{A_2-A_1}{0.3642}})\×100\%$

采用常规方法作为对比来测定1mM的Hg²⁺对纤维二糖酶抑制效果，以验证本发明检测方法的检测效果。取上述0.1mL，浓度为2.5U/mL的含纤维二糖酶溶液，用Barush法、比色法以及本发明的纳米金探针法测定两种状态下（不加及加入1mM的Hg²⁺）的纤维二糖酶活性，测定结果见下表4。

表4：1mM的Hg²⁺对纤维二糖酶抑制的检测结果

上述本实施例中，当抑制剂存在时，纤维二糖酶与纳米金探针反应后的紫外可见吸收光谱图如图1所示，抑制剂的存在会抑制纤维二糖酶的活性，干扰纤维二糖酶与纳米金探针表面纤维二糖的酶促反应，这种情况下纳米金探针表面修饰的纤维二糖能保持纳米金探针体系的稳定，从而出现与抑制剂不存在时不同的光学信号，达到检测目的，并可通过所得不同的紫外可见吸收光谱图计算抑制剂存在时，对纤维二糖酶的抑制率。

图2是本实施例中纳米金探针在Hg²⁺存在时，与纤维二糖酶反应后的透射电镜图。由于Hg²⁺的存在干扰了纤维二糖酶与纳米金探针表面纤维二糖的酶促反应，这种情况下纳米金探针表面修饰的纤维二糖能保持其稳定，从图2可以看到颗粒之间的聚集程度远远小于未加入抑制剂时，这也证明了本发明的检测纤维二糖酶抑制剂的方法可以达到预期检测效果。

本实施例中纳米金探针的制备方法包括以下步骤：

1.纳米金-纤维二糖复合物的制备

于20mL、质量浓度0.05%的纤维二糖溶液中加入0.2mL、质量浓度1%的氯金酸溶液，将所得溶液于200rpm、4℃下振荡混匀，保持振荡条件并向前述混匀后的溶液中加入0.2mL、质量浓度1.5%的硼氢化钠溶液充分反应0.5h，溶液立刻由无色变为酒红色，相同条件下继续振荡反应0.5h后于1200rpm下离心纯化得到的溶液20min，去除未结合的沉积颗粒，即得到含纳米金-纤维二糖复合物的溶液。

2．纳米金探针的制备

于每10mL上述含纳米金-纤维二糖复合物的溶液中加入0.02mL、1mmol/L的MCH，并于37℃静置反应2h后于15000rpm、4℃下离心5min，去上清液并将离心纯化后的沉淀重溶于5mL超纯水中，即制备得到可检测纤维二糖酶活性的纳米金探针。

本实施例中氯金酸、硼氢化钠、纤维二糖、MCH的摩尔比为1∶16.3∶6∶0.004。

使用激光粒度分析仪检测所制得的纳米金探针粒径为62.8nm，粒径分布指数PDI为0.256，Zeta电位为-35.1mV，这充分证明所制纳米金探针颗粒分布均匀，且纳米金探针体系稳定。

对比例1：使用紫外可见光分光光度计分析检测上述纳米金探针的制备方法中未经任何修饰的纳米金颗粒（即直接用本实施例中的氯金酸溶液和硼氢化钠溶液反应得到的纳米金颗粒），检测结果如图6所示，未经任何修饰的纳米金颗粒溶液加入纤维二糖酶溶液后，整体的紫外可见光吸收峰型与纯纳米金颗粒溶液的吸收峰型相比，没有显著变化；吸光度整体有所降低，这是由于纤维二糖酶溶液的加入减小了溶液中纳米金颗粒的浓度所致，由图6可看出，未经任何修饰的纳米金颗粒溶液对纤维二糖酶几乎没有响应。

对比例2：使用紫外可见光分光光度计分析检测只修饰MCH的纳米金（MCH的添加量为上述实施例中制备纳米金探针时MCH添加量的1/10，即采用0.02mL、0.1mmol/L的MCH加入10mL纳米金颗粒溶液中，检测结果如图7所示，由图7可见，MCH修饰纳米金颗粒会轻微地影响纳米金颗粒的稳定性，因此在600nm左右的波长处，修饰MCH后的纳米金颗粒的吸光度比修饰前有所增加；但只修饰MCH的纳米金颗粒用于检测纤维二糖酶时，吸光度只因为纳米金颗粒浓度的减小而稍微降低，这表明MCH修饰纳米金颗粒对纤维二糖酶同样几乎没有响应。

图8为纳米金颗粒、纳米金-纤维二糖复合物、纳米金探针、以及纳米金探针-纤维二糖酶（即纳米金探针与纤维二糖酶反应后的体系）的紫外可见吸收光谱图对比示意图。由图8可见，所制纳米金-纤维二糖复合物与未经任何修饰的纳米金颗粒相比，峰型没有显著变化，只在520nm处吸光度有轻微的增加；修饰MCH后的纳米金探针在600nm处的吸光度有所增加，这是因为MCH的修饰会使得纳米金探针的稳定性有轻微的下降；将本实施例所制的纳米金探针加入纤维二糖酶后，620nm波长处的吸光度显著上升，峰型整体红移，且在520nm处纳米金颗粒的特征吸收峰值显著降低，这充分说明纤维二糖酶的加入引起了纳米金探针的特异性反应，产生了聚集沉降，这充分证明了纳米金探针可对纤维二糖酶响应。根据我们理论分析的结果，在纳米金探针的制备过程中纤维二糖连接在纳米金颗粒上使颗粒之间增加了空间斥力，而制备纳米金探针所加入的MCH量是经过优化实验得到的，在该MCH添加量下，MCH的加入所致颗粒间增加的引力、纳米金颗粒间自身的分子引力与纤维二糖加入所致颗粒间增加的斥力、纳米金颗粒间自身的分子斥力形成平衡。当纤维二糖被溶液中的纤维二糖酶消耗后，体系颗粒间的平衡被打破，MCH暴露于纳米金颗粒外的羟基之间产生的引力促使纳米金探针进一步聚集沉降产生可被检测的光学信号，而将该添加量下的MCH直接加于未经任何修饰的纳米金颗粒体系中可能会直接造成纳米金颗粒的沉降，但并不会对纤维二糖酶产生任何响应。

图9为将检测温度控制在35℃，检测pH值控制在4.5，此检测条件下待纳米金探针与漆酶反应10min后的紫外可见吸收光谱图，由图9可见，1mg/ml的漆酶溶液加入纳米金探针体系后只是使得探针的浓度减小，从而整体降低了纳米金探针的吸光度，几乎没有任何响应。由此证明了本发明的纳米金探针对木质素降解过程中可能存在的其它木质素降解酶类不具备响应反应，本发明纳米金探针对纤维二糖酶有特异性反应。

图10和图11分别为对比例中未经任何修饰的纳米金颗粒、本实施例中的纳米金探针的透射电镜图谱。由图10、图11可见，纳米金探针周围的一圈阴影为连接的纤维二糖，而MCH的修饰对纳米金探针的稳定性造成了轻微的影响，颗粒分散均匀度稍差于未经任何修饰的纳米金颗粒。图12为纳米金探针与纤维二糖酶反应后的透射电镜图谱，由图12可知，与纤维二糖酶反应后的纳米金探针明显可见聚集，在外观上则由酒红色变为紫蓝色，这也进一步印证了本发明的纳米金探针可对纤维二糖酶发生响应。

实施例2：

一种本发明的检测纤维二糖酶抑制剂的方法，包括以下步骤：

取0.1mL含25U/mL纤维二糖酶的磷酸盐缓冲溶液，添加到2.0mL纳米金探针溶液（含0.2mL纳米金探针浓缩液，制备方法同实施例1）中混合均匀，将检测温度控制在35℃，检测pH值控制在4.5，此检测条件下待纳米金探针反应10min后，再用紫外可见分光光度计对反应后的产物体系进行光谱扫描，根据检测后溶液体系中纳米金探针表面等离子体共振吸收峰强度变化，计算得出620nm处的吸光度与520nm处的吸光度比值A₁为1.0699；同样，取0.1mL上述含纤维二糖酶的溶液，向溶液中加入CuSO₄（模拟纤维二糖酶降解含Cu²⁺的木质纤维素），使溶液中Cu²⁺的浓度达到1mM，将所得溶液添加到2.0mL纳米金探针溶液（含0.2mL纳米金探针浓缩液）中混合均匀，在温度为35℃、pH值为4.5时反应10min后，用紫外可见分光光度计对反应产物进行光谱扫描，根据检测后纳米金探针表面等离子体共振吸收峰强度变化，计算得出620nm处的吸光度与520nm处的吸光度比值A₂为0.825，A₂小于A₁，即可判断待测溶液中含有纤维二糖酶抑制剂。

将未加入Cu²⁺的纤维二糖酶溶液及加入1mM Cu²⁺的纤维二糖酶溶液后计算得到的A₁及A₂值代入回归方程，得出1mM的Cu²⁺对纤维二糖酶的抑制效果，即抑制率I。采用常规方法作为对比来测定1mM的Cu²⁺对纤维二糖酶抑制效果，以验证本发明检测方法的检测效果。取上述0.1mL，浓度为10U/mL的含纤维二糖酶溶液，用Barush法、比色法以及本发明的纳米金探针法测定两种状态下（不加及加入1mM的Cu²⁺）的纤维二糖酶活性，测定结果见下表5。

表5：1mM的Cu²⁺对纤维二糖酶抑制的检测结果

上述本实施例中，当抑制剂存在时，纤维二糖酶与纳米金探针反应后的紫外可见吸收光谱图如图3所示。从上述对比测定结果也可以清楚地看出，本方法与传统Barush法、比色法相比，检测结果非常接近。本方法较传统的检测方法更加快速、灵敏和精确，且具有对环境无害、成本低廉、制备工艺简单和操作方便的特点。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应该指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下的改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种检测纤维二糖酶抑制剂的方法，该方法包括以下步骤：将一种用于检测纤维二糖酶活性的纳米金探针溶液加入含待测物质的纤维二糖酶溶液中，所述纳米金探针溶液与所述纤维二糖酶溶液的体积比为20∶1，其中每20体积的纳米金探针溶液中含有2～4体积的纳米金探针浓缩液，将检测温度控制在30℃～35℃，检测pH值控制在4.0～4.5，待纳米金探针反应完全后，检测含待测物质的溶液体系中纳米金探针表面等离子体共振吸收峰强度变化，得到吸收峰在620nm处的吸光度与520nm处的吸光度比值A620/A520，设为A₂；同等条件下，将所述纳米金探针溶液加入不含待测物质的纤维二糖酶溶液中，检测不含待测物质的溶液体系中纳米金探针表面等离子体共振吸收峰强度变化，得到吸收峰在620nm处的吸光度与520nm处的吸光度比值A620/A520，设为A₁；比较A₂和A₁的大小，即可判断待测物质是否为纤维二糖酶抑制剂；

当A₂＜A₁时，表明待测物质为纤维二糖酶抑制剂，所述纤维二糖酶抑制剂对纤维二糖酶活性的抑制率计算方程为：

其中，I为纤维二糖酶抑制剂对纤维二糖酶活性的抑制率，C₁为不含纤维二糖酶抑制剂时纤维二糖酶的活性数值，C₂为含纤维二糖酶抑制剂时纤维二糖酶的活性数值；

所述纳米金探针包括纳米金颗粒，所述纳米金颗粒上修饰有纤维二糖和6-巯基己-1-醇；

所述纳米金探针的粒径为40nm～60nm；

所述纳米金探针主要由以下方法制备得到：在配好的纤维二糖溶液中加入氯金酸溶液和硼氢化钠溶液，充分混匀且反应完全后，将得到的反应产物低速离心纯化以去除沉积颗粒，再于上清液中加入6-巯基己-1-醇进行培养，培养完成后高速离心纯化，将高速离心后的沉淀重溶于超纯水中，得到含有用于检测纤维二糖酶活性的纳米金探针的溶液。

2.根据权利要求1所述的检测纤维二糖酶抑制剂的方法，其特征在于：所述纳米金探针的Zeta电位为-30mV～-40mV。

3.根据权利要求1所述的检测纤维二糖酶抑制剂的方法，其特征在于：所述氯金酸、硼氢化钠、纤维二糖的摩尔用量比为1∶(16.3～18.4)∶(1.2～6)。

4.根据权利要求1所述的检测纤维二糖酶抑制剂的方法，其特征在于：所述氯金酸与6-巯基己-1-醇的摩尔用量比为1∶(0.002～0.004)。

5.根据权利要求1所述的检测纤维二糖酶抑制剂的方法：所述加入6-巯基己-1-醇进行培养时的温度控制在30℃～37℃，培养时间为2h～2.5h。

6.根据权利要求1所述的检测纤维二糖酶抑制剂的方法，其特征在于：所述低速离心时 的转速为1200rpm～1500rpm，所述高速离心时的转速为12000rpm～15000rpm。