CN102798617A

CN102798617A - 检测纤维二糖酶活性的方法

Info

Publication number: CN102798617A
Application number: CN2012102749186A
Authority: CN
Inventors: 曾光明; 赖萃; 黄丹莲; 赵美花; 张辰; 危臻; 黄超; 许飘; 李宁杰; 李芳玲
Original assignee: Hunan University
Current assignee: Hunan University
Priority date: 2012-08-03
Filing date: 2012-08-03
Publication date: 2012-11-28
Anticipated expiration: 2032-08-03
Also published as: CN102798617B

Abstract

本发明公开了一种检测纤维二糖酶活性的方法，其是将一种可用于检测纤维二糖酶活性的纳米金探针溶液按照20∶1的体积比加入到待测溶液中，其中每20体积的纳米金探针溶液中含有2～4体积的纳米金探针浓缩液，将检测温度控制在30℃～35℃，检测pH值控制在4.0～4.5，待纳米金探针反应完全后，根据检测后溶液体系中纳米金探针表面等离子体共振吸收峰强度变化，即可判断待测溶液中是否含有纤维二糖酶；纳米金探针包括纳米金颗粒，所述纳米金颗粒上修饰有纤维二糖和6-巯基己-1-醇。本发明的方法具有快速、灵敏、精确、且对环境无害、成本低廉等优点。

Description

检测纤维二糖酶活性的方法

技术领域

本发明涉及一种检测生物酶活性的方法，尤其涉及一种检测纤维二糖酶活性的方法。

背景技术

纤维素酶是一种多组分的复合酶，它包括内切型葡聚糖酶（EC3.2.1.4，也称C_X酶、CMC酶）、外切型葡聚糖酶（EC3.2.1.91，也称C₁、微晶纤维酶）和纤维二糖酶（EC3.2.1.21，也称β-葡萄糖苷酶）等三种主要组分。普遍认为在将天然纤维素降解成葡萄糖的过程中，必须依靠这三种组分的协同作用才能完成。纤维素大分子首先在C₁酶和C_X酶的作用下逐步降解成纤维二糖，而纤维二糖酶则进一步将纤维二糖水解成葡萄糖。

目前应用最广、研究最为深入的纤维素酶生产菌种是里氏木霉（Trichoderma reesei）的优良突变株。在该菌种的纤维素酶制剂中，内切型及外切型-β-葡聚糖酶活力较高，但不足之处是纤维二糖酶产量很低。在利用纤维素酶制剂水解纤维素的过程中，常常由于纤维二糖酶的活力很低造成纤维二糖的累积，而纤维二糖又会对纤维素酶的催化作用形成强烈的反馈抑制。

在纤维素酶解过程中提高纤维二糖酶的活力意味着提高纤维素水解效率和葡萄糖产量。因此，采用纯化的纤维二糖酶、固定化酶技术等多种方法被广泛用于增强反应体系中纤维二糖酶的活力，而纤维二糖酶的活性成为衡量这些方法优越性的重要指标。

目前，对于纤维二糖酶活性的测定普遍采用的方法中，Barush和Swiain法是以水杨苷为酶反应底物，检测水解后产生的极微量的葡萄糖，反应易受干扰，且检测灵敏度不高；荧光法灵敏度高且快速，但是由于实验过程操作复杂，且重现性不好，现在应用不多；比色法是以对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷（pNPG）为酶底物，检测底物水解后释放出来的对硝基苯酚，而对硝基苯酚是一种很难被生物降解的、危害环境的高毒性有机物。因此，研究一种灵敏度及精确度高且对环境无害的纤维二糖酶活性检测方法是亟待解决的问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种更加快速、灵敏、精确、且具有对环境无害、成本低廉的检测纤维二糖酶活性的方法。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种检测纤维二糖酶活性的方法，其步骤包括：将一种可用于检测纤维二糖酶活性的纳米金探针溶液按照20∶1的体积比加入到待测溶液中，其中每20体积的纳米金探针溶液中含有2～4体积的纳米金探针浓缩液（所述浓缩液为纳米金探针制备时高速离心后的含纳米金探针沉淀的浓缩液），将检测温度控制在30℃～35℃，检测pH值控制在4.0～4.5，待纳米金探针反应完全后（一般至少反应10min），根据检测后溶液体系中纳米金探针表面等离子体共振吸收峰强度变化，即可判断待测溶液中是否含有纤维二糖酶（定性检测）（例如，紫外可见分光光度计测定时，当620nm处的吸光度与520nm处的吸光度比值大于0.2631时则可认为含有纤维二糖酶）；所述纳米金探针包括纳米金颗粒，所述纳米金颗粒上修饰有纤维二糖和6-巯基己-1-醇。

上述的检测方法中，所述纤维二糖酶活性与纳米金探针表面等离子体共振吸收峰强度呈线性关系，所述线性回归方程为A=0.3642n+0.6273，其中A优选为紫外可见光吸收图谱中620nm处的吸光度与520nm处的吸光度比值（A620/A520），根据检测得到的吸光度比值A即可得到酶活相关值n，再根据表达式C=1.5×10ⁿ即可定量测得待测溶液中的纤维二糖酶酶活C，C的量纲为U/mL（定量检测）。在定量检测中，所述纤维二糖酶酶活C的检测范围优选为0.15 U/mL～150 U/mL。

上述的检测方法中，所述纳米金探针的粒径优选为30 nm～80 nm。

上述的检测方法中，所述纳米金探针的Zeta电位优选为-30 mV～-40 mV。

上述本发明的纳米金探针主要是基于纳米金颗粒能够在不破坏生命物质结构和功能的前提下提供光电检测信号，纳米金颗粒的粒径大小以及颗粒间的相对距离会影响其稳定性以及光学性质，从而提供可供检测的光学信号。本发明的纳米金探针表面修饰的纤维二糖使纳米金颗粒之间增加了排斥力，从而使得纳米金颗粒之间的距离稳定而不聚集沉降，具有稳定剂的作用；而纳米金探针表面修饰的MCH则一端通过硫醇基与纳米金颗粒连接，另一端的羟基暴露在外。当本发明的纳米金探针未被用于检测纤维二糖酶时，其表面修饰的纤维二糖能保持体系的稳定，而当纳米金探针用于检测纤维二糖酶时，纤维二糖作为纤维二糖酶的底物被分解，这时MCH暴露在外的羟基之间的吸引力会促使纳米金颗粒之间距离变近、聚集沉降，从而使得纳米金探针提供相应的可供检测的光学信号。

上述的检测方法中，优选的，所述纳米金探针主要由以下方法制备得到：在配好的纤维二糖溶液中加入氯金酸溶液和硼氢化钠溶液，充分混匀且反应完全后，将得到的反应产物低速离心纯化以去除沉积颗粒，再于上清液中加入6-巯基己-1-醇进行培养，培养完成后高速离心纯化，将高速离心后的沉淀（含少量水，即上述的纳米金探针浓缩液）重溶于超纯水中，得到含有可用于检测纤维二糖酶活性的纳米金探针的溶液。

上述的检测方法中，所述氯金酸、硼氢化钠、纤维二糖的摩尔用量比优选为1∶（16.3～18.4）∶（1.2～6）。更优选的，所述氯金酸与6-巯基己-1-醇的摩尔用量比为1∶（0.002～0.004）。

上述原料摩尔用量的确定是通过以下各组反复的优化实验进行确定的。

1. 纤维二糖用量的优化：于20mL不同质量浓度的纤维二糖溶液中加入0.2mL、质量浓度为1%的氯金酸溶液，振荡混匀后加向上述反应体系中加入0.2mL、质量浓度为1.5%的硼氢化钠溶液充分反应0.5h；低速离心纯化去除沉积颗粒后使用激光粒度分析仪检测不同纤维二糖用量对所制纳米金-纤维二糖复合物粒径分布以及Zata电位的影响，检测结果如下表1所示。

表1：纤维二糖用量对纳米金-纤维二糖复合物的影响

编号	纤维二糖质量浓度	平均粒径（nm）	PDI指数	Zata电位（mV）
					1	0%	31.3	0.512	-35.2
2	0.005%	42.8	0.581	-33.5
					3	0.01%	33.8	0.081	-36.4
4	0.05%	33.6	0.138	-33.3
					5	0.1%	40.6	0.497	-31.5
6	0.2%	64.5	0.488	-30.6
					7	0.5%	81.4	0.289	-32.2
8	1%	38.6	0.276	-34.1

根据我们反复的实验观察和分析比对，当反应体系中纤维二糖用量过小时，纤维二糖与氯金酸结合位点较少，在纳米金形成过程中，起稳定剂作用的纤维二糖过少则容易造成较大粒径的纳米金-纤维二糖复合物形成；而当反应体系中纤维二糖用量过大时，过多的纤维二糖吸附于纳米金颗粒上，阻止了纳米金颗粒形成过程中的进一步增长，反而形成了较小粒径的纳米金-纤维二糖复合物。可见，过多或过少的纤维二糖吸附于纳米金颗粒表面都可能会对后续制备的纳米金探针的灵敏度造成影响，所以我们优选粒径适中、分散均匀、体系稳定的纳米金-纤维二糖复合物；具体而言，我们优选选择平均粒径为30～40 nm、PDI数值小于0.4、Zeta电位数值绝对值大于30 mV的纳米金-纤维二糖复合物；并且通过在下一步的纳米金探针应用实验中得到验证，采用前述优化标准的纤维二糖量制备的纳米金探针检测灵敏，且纤维二糖酶活性的检测幅度及检测下限都达到了预期效果。据此，由上表1可见，当纤维二糖溶液的浓度优选为0.01%～0.05%时，制得的纳米金-纤维二糖复合物的平均粒径适中，粒径分布指数PDI、Zata电位数值显示所制复合物颗粒分布均匀，体系稳定。在此优选的纤维二糖溶液浓度下，所述氯金酸与纤维二糖的摩尔用量比优选为1∶（1.2～6）。

2. 硼氢化钠用量的优化：于20mL、质量浓度0.05%的纤维二糖溶液中加入0.2mL、质量浓度1%的氯金酸溶液，振荡混匀后向上述反应体系中加入不同体积的质量浓度为1.5%硼氢化钠溶液充分反应0.5h；低速离心纯化去除沉积颗粒后使用激光粒度分析仪检测不同硼氢化钠添加量对所制纳米金-纤维二糖复合物粒径分布以及Zata电位的影响，检测结果如下表2所示。

表2：硼氢化钠用量对纳米金-纤维二糖复合物的影响

编号	硼氢化钠添加量（mL）	平均粒径(nm)	PDI指数	Zata电位（mV）
					1	0.175	87.2	0.771	-32.8
2	0.2	31.7	0.123	-35.5
					3	0.225	30.4	0.352	-36.5
4	0.25	34.2	0.435	-33.2

根据我们反复的实验观察和分析比对，硼氢化钠作为还原剂，其添加量决定着制备的纳米金的质量，我们优选粒径适中、分散均匀、体系稳定的纳米金-纤维二糖复合物；即以上文中提到的粒径为30～40 nm、PDI数值小于0.4、Zeta电位数值绝对值大于30 mV的纳米金-纤维二糖复合物作为筛选标准；并且通过在后续的纳米金探针应用实验中进行验证，采用前述筛选标准下的硼氢化钠量制备的纳米金探针检测灵敏，纤维二糖酶活性的检测幅度及检测下限都达到了预期效果。据此，由上表2可见，质量浓度为1.5%的硼氢化钠溶液优选的添加量为0.2mL～0.225mL时，制备的纳米金-纤维二糖复合物的粒径分布指数PDI数值表明体系中颗粒分布均匀，Zata电位数值也显示所制体系较稳定，平均颗粒粒径适中。在此优选的硼氢化钠溶液添加量下，所述氯金酸与硼氢化钠的摩尔用量比优选为1∶（16.3～18.4）。

3. MCH添加量的确定：取10mL制得的纳米金-纤维二糖复合物加入不同体积的1mmol/L的MCH，于37℃下静置反应2h后于12000rpm离心5min，去除上清液并将沉淀重溶于5mL超纯水中（体积减小为离心前的1/2）；使用激光粒度分析仪检测不同MCH添加量对所制纳米金探针粒径分布以及Zata电位的影响，检测结果如下表3所示。

表3：MCH用量对纳米金探针的影响

编号	MCH添加量（mL）	平均粒径（nm）	PDI指数	Zata电位（mV）
					1	0.01	37.1	0.561	-33.4
2	0.02	57.4	0.289	-36.5
					3	0.03	173	0.195	-35.2
4	0.04	196	0.257	-33.2
					5	0.05	340	0.257	-30.9

根据我们反复的实验观察和分析比对，6-巯基己-1-醇（MCH）在本发明的技术思路中是起着增加纳米金探针灵敏度的作用，而过量的6-巯基己-1-醇（MCH）的加入会影响体系的稳定性，所以在不影响体系稳定性的前提下，选取最大程度的MCH添加量。与上文的描述相对应，我们优选粒径适中、分散均匀、体系稳定的纳米金探针；即粒径小于100 nm、PDI数值小于0.6、Zeta电位数值绝对值大于30 mV的纳米金探针作为筛选标准；通过在后续纳米金探针应用实验中进行验证，采用优选比例的6-巯基己-1-醇添加量制备的纳米金探针检测灵敏，纤维二糖酶活性的检测幅度及检测下限都达到了预期效果。据此，由上表3可见，当MCH用量高于0.02mL时制备的纳米金探针平均粒径显著上升，表示6-巯基己-1-醇（MCH）用量过高导致颗粒间聚集，而MCH用量小于0.02mL时纳米金探针的平均粒径适中、且粒径分布指数PDI数值、Zata电位显示该6-巯基己-1-醇添加量下制备的纳米金探针较为稳定、颗粒分布均匀，适用于检测体系的要求。在此优选的6-巯基己-1-醇添加量下，所述氯金酸与的6-巯基己-1-醇摩尔用量比优选为1∶（0.002～0.004）。

上述的制备方法中，所述低速离心时的转速优选为1200rpm～1500rpm，所述高速离心时的转速优选为12000rpm～15000rpm。

上述的制备方法中，所述加入6-巯基己-1-醇进行培养时的温度优选控制在30℃～37℃，培养时间优选为2h～2.5h。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1. 本发明检测方法中选用的检测纤维二糖酶活性的纳米金探针具有较高的检测灵敏度，大大拓宽了纤维二糖酶活性检测方法的选择范围；

2. 本发明检测方法中选用的纳米金探针的制备工艺简单，制备成本低廉，且具有对环境无害的特点；

3. 本发明的检测方法检测更加快捷、灵敏、精确，且检测成本低，操作方便，可有效应用于纤维二糖酶的定性和定量检测。

附图说明

图1为本发明实施例中未经修饰的纳米金直接用于检测纤维二糖酶的紫外可见光吸收图谱。

图2为本发明实施例中只修饰MCH的纳米金用于检测纤维二糖酶的紫外可见光吸收图谱。

图3为本发明实施例中纳米金-纤维二糖复合物与纳米金探针的紫外可见光吸收图谱比较示意图。

图4为本发明实施例中的纳米金探针用于检测漆酶的紫外可见光吸收图谱。

图5为本发明实施例中加入不同浓度的纤维二糖酶液后检测体系的紫外可见光谱扫描图。

图6为本发明实施例中纤维二糖酶的活性与检测体系中纳米金探针表面等离子体共振吸收峰强度的线性关系图。

图7为本发明实施例中的未经任何修饰的纳米金颗粒的透射电镜图。

图8为本发明实施例中制得的纳米金探针的透射电镜图。

图9为本发明实施例中制得的纳米金探针在与纤维二糖酶反应后的透射电镜图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步描述。

实施例：

一种本发明的检测纤维二糖酶活性的方法，取0.1mL待测溶液添加到2.0mL纳米金探针溶液（含0.2mL～0.4mL纳米金探针浓缩液）中混合均匀，将检测温度控制在35℃，检测pH值控制在4.5，此检测条件待纳米金探针反应10min，再用紫外可见分光光度计对反应后的产物体系进行光谱扫描，根据检测后溶液体系中纳米金探针表面等离子体共振吸收峰强度变化，当620nm处的吸光度与520nm处的吸光度比值大于0.2631时，即可判断待测溶液中含有纤维二糖酶。

建立线性回归方程，对待测溶液中的纤维二糖酶进行定量检测。

Sigma-Aldrich生产的从黑曲霉提取的纤维二糖酶的酶活为300U/mL，稀释纤维二糖酶，使其浓度分别为0.1 U/mL、0.15 U/mL、0.5 U/mL、1.5 U/mL、15 U/mL、30 U/mL、60 U/mL、150 U/mL，分别将0.1mL上述不同浓度的纤维二糖酶溶液加入2.0 mL纳米金探针溶液中，利用紫外可见分光光度计测定出加入不同浓度纤维二糖酶后反应体系中纳米金探针表面等离子体共振吸收峰的强度，如图5所示，纳米金探针表面等离子体共振吸收峰强度由于加入不同浓度的纤维二糖酶液，而发生不同程度的变化，也因此证实了可以使用其吸收峰强度作为纤维二糖酶活性的检测指标。

纤维二糖酶浓度为0.1 U/mL的纳米金探针紫外可见光吸收图谱较浓度为0.15 U/mL的纳米金探针紫外可见光吸收图谱变化微小，故0.15 U/mL为该纳米金探针检测纤维二糖酶活的检测下限。而当纤维二糖酶浓度大于150U/mL时，紫外可见光吸收图谱变化较小，故150U/mL为该纳米金探针检测纤维二糖酶活的检测上限。

如图6所示，通过测定一系列不同浓度的纤维二糖酶活，得出加入检测体系的酶活与纳米金探针表面等离子体共振吸收峰强度之间呈线性关系的范围为0.15U/mL～150U/mL，回归方程为A=0.3642n+0.6273：A为紫外可见光吸收图谱中620nm处的吸光度与520nm处的吸光度比值（A620/A520），纤维二糖酶活C=1.5×10ⁿ（U/mL），相关系数为0.9688。

采用常规方法对比测定纤维二糖酶活，以验证本发明定量检测方法的检测效果。

a）培养基

保存菌种采用斜面培养基：PDA（马铃薯-葡萄糖-琼脂）培养基。

用于培养菌种产酶的固态发酵培养基组成：麦麸70%，玉米棒芯26%，（NH₄）SO₄2.6%，KH₂PO₄0.75%，吐温-80 0.15%，MgSO₄0.5%，超纯水100%，自然pH值。

b）固态发酵

在5个三角瓶中分别装入固态发酵培养基约5cm厚。用无菌水将黑曲霉孢子配制成悬浮液（每mL悬浮液约含孢子10¹⁰个），每瓶分别接入0.1mL，0.5mL，1mL，5mL，10mL菌种，搅拌均匀后将三角瓶于30℃～37℃培养5天。

取1g固态发酵基质溶于超纯水中，用Barush法、比色法以及本发明的纳米金探针法测定五种不同浓度的固态发酵基质中的纤维二糖酶活性，测定结果见下表4。

表4：粗酶液中纤维二糖酶活的检测结果

Barush法测定的纤维二糖酶活（U/mL）	比色法测定的纤维二糖酶活（U/mL）	纳米金探针法测定的纤维二糖酶活（U/mL）
			0.5213	0.4925	0.5011
4.6254	4.4832	4.4975
			15.0544	13.7221	14.8925
68.2567	69.4742	68.742
			111.4584	117.2561	116.1156

从上述对比测定结果也可以清楚地看出，本方法与传统Barush法、比色法相比，检测结果非常接近。本方法较传统的检测方法更加快速、灵敏和精确，且具有对环境无害、成本低廉、制备工艺简单和操作方便的特点。

上述本实施例用到的检测纤维二糖酶活性的纳米金探针如图8所示，其平均粒径为62.8 nm，包括有纳米金颗粒，纳米金颗粒上修饰有纤维二糖和6-巯基己-1-醇，6-巯基己-1-醇的一端通过硫醇基与纳米金颗粒连接，另一端的羟基暴露在外（纤维二糖可使纳米金探针之间增加的排斥力大于6-巯基己-1-醇因羟基作用使纳米金探针之间产生的吸引力）。

本实施例的纳米金探针的制备方法包括以下步骤：

1. 纳米金-纤维二糖复合物的制备

于20mL、0.05%的纤维二糖溶液中加入0.2mL、1%的氯金酸溶液，将上述溶液于150～200 rpm、4℃下振荡混匀，保持振荡条件并向前述混匀后的溶液中加入0.2mL、1.5%的硼氢化钠溶液充分反应0.5h；溶液立刻由无色变为酒红色，相同条件下继续振荡反应0.5h后于1200rpm下离心纯化上述溶液20min，去除未结合的沉积颗粒，即制得纳米金-纤维二糖复合物。

2．纳米金探针的制备

于每10mL上述制得的纳米金-纤维二糖复合物中加入0.02mL、1mmol/L的MCH，并于37℃静置反应2h后于15000rpm、4℃下离心5min，去上清液并将离心纯化后的沉淀重溶于5mL超纯水中，即制备得到可检测纤维二糖酶活性的纳米金探针。

本实施例中氯金酸、硼氢化钠、纤维二糖、MCH的摩尔比为1∶16.3∶6∶0.004。

使用激光粒度分析仪检测所制得的纳米金探针粒径为62.8 nm，粒径分布指数PDI为0.256，Zeta电位为-35.1 mV，这充分证明所制纳米金探针颗粒分布均匀，且体系稳定。

使用激光粒度分析仪检测本实施例所制得的纳米金探针粒径为62.8 nm，粒径分布指数PDI为0.256，Zeta电位为-35.1 mV，这充分证明所制纳米金探针颗粒分布均匀，且体系稳定。

对比例1：使用紫外可见光分光光度计分析检测本实施例的上述制备方法中未经任何修饰的纳米金颗粒（即直接用本实施例中的氯金酸溶液和硼氢化钠溶液反应得到的纳米金颗粒），检测结果如图1所示，未经任何修饰的纳米金探针溶液加入纤维二糖酶后，整体的紫外可见光吸收峰型没有显著变化；吸光度整体有所降低，这是由于纤维二糖酶溶液的加入减小了溶液中纳米金颗粒的浓度所致，由图1可看出，未经任何修饰的纳米金颗粒溶液对纤维二糖酶的检测没有任何作用和效果。

对比例2：使用紫外可见光分光光度计分析检测只修饰MCH的纳米金（MCH的添加量为上述实施例中制备纳米金探针时MCH添加量的1/10，即采用0.02mL、0.1mmol/L的MCH加入10mL纳米金颗粒体系中），检测结果如图2所示，由图2可见，MCH修饰纳米金颗粒会轻微地影响其稳定性，因此在600nm左右的波长处，连接MCH后的纳米金颗粒的吸光度比连前有所增加；但只修饰MCH的纳米金颗粒用于检测纤维二糖酶时，吸光度只因为纳米金颗粒浓度的减小而稍微降低，这表明MCH修饰纳米金颗粒对纤维二糖酶同样没有任何检测作用。

图3为本实施例中纳米金-纤维二糖复合物与纳米金探针的紫外可见光吸收图谱比较示意图。由图3可见，所制纳米金-纤维二糖复合物与未经任何修饰的纳米金颗粒相比，峰型没有显著变化，只在520nm处吸光度有轻微的增加；修饰MCH后的纳米金探针在600nm处的吸光度有所增加，这是因为MCH的修饰会使得纳米金探针的稳定性有轻微的下降；将本实施例所制的纳米金探针加入纤维二糖酶后，620nm波长处的吸光度显著上升，峰型整体红移，且在520nm处纳米金颗粒的特征吸收峰值显著降低，这充分说明纤维二糖酶的加入引起了纳米金探针的特异性反应，产生了聚集沉降，这充分证明了纳米金探针对纤维二糖酶的检测效果。根据我们理论分析的结果，在纳米金探针的制备过程中纤维二糖连接在纳米金颗粒上使颗粒之间增加了空间斥力，而制备纳米金探针所加入的MCH量是经过上述优化实验得到的，在该MCH添加量下，MCH的加入所致颗粒间增加的引力、纳米金颗粒间自身的分子引力与纤维二糖加入所致颗粒间增加的斥力、纳米金颗粒间自身的分子斥力形成平衡。当纤维二糖被待测溶液中含有的纤维二糖酶消耗后，体系颗粒间的平衡被打破，MCH暴露于纳米金颗粒外的羟基之间产生的引力促使纳米金探针进一步聚集沉降产生可被检测的光学信号，而将该添加量下的MCH直接加于未经任何修饰的纳米金颗粒体系中可能会直接造成纳米金颗粒的沉降，但并不具有任何的检测效果。

图4为本实施例中的纳米金探针用于检测漆酶的紫外可见光吸收图谱，由图4可见，将所制备的纳米金探针用于检测1mg/ml的漆酶溶液，漆酶溶液加入检测体系后只是使得探针的浓度减小，从而整体降低了纳米金探针的吸光度，并没有起到检测作用。由此证明了本发明的纳米金探针对其它酶类不具备响应反应，本发明纳米金探针对纤维二糖酶有特异性反应。

图7、图8和图9分别为本实施例中纳米金颗粒、纳米金探针及检测纤维二糖酶后的纳米金探针的透射电镜图谱。由图7、图8可见，纳米金探针颗粒周围的一圈阴影为连接的纤维二糖，而MCH的连接使纳米金探针的稳定性造成了轻微的影响，颗粒分散均匀度稍差于未经任何修饰的纳米金颗粒。而检测过纤维二糖酶的纳米金探针明显可见聚集，在外观上则由酒红色变为紫蓝色，这也进一步印证了本发明的纳米金探针达到了检测效果。

Claims

1.一种检测纤维二糖酶活性的方法，该方法包括以下步骤：将一种可用于检测纤维二糖酶活性的纳米金探针溶液按照20∶1的体积比加入到待测溶液中，其中每20体积的纳米金探针溶液中含有2～4体积的纳米金探针浓缩液，将检测温度控制在30℃～35℃，检测pH值控制在4.0～4.5，待纳米金探针反应完全后，根据检测后溶液体系中纳米金探针表面等离子体共振吸收峰强度变化，即可判断待测溶液中是否含有纤维二糖酶；所述纳米金探针包括纳米金颗粒，所述纳米金颗粒上修饰有纤维二糖和6-巯基己-1-醇。

2.根据权利要求1所述的检测纤维二糖酶活性的方法，其特征在于：所述纤维二糖酶活性与纳米金探针表面等离子体共振吸收峰强度呈线性关系，所述线性回归方程为A=0.3642n+0.6273，其中A为紫外可见光吸收图谱中620nm处的吸光度与520nm处的吸光度比值，根据检测得到的吸光度比值A即可得到酶活相关值n，再根据表达式C=1.5×10ⁿ即可定量测得待测溶液中的纤维二糖酶酶活C，C的量纲为U/mL。

3.根据权利要求2所述的检测纤维二糖酶活性的方法，其特征在于：所述纤维二糖酶酶活C的检测范围为0.15 U/mL～150 U/mL。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的检测纤维二糖酶活性的方法，其特征在于：所述纳米金探针的粒径为30 nm～80 nm。

5.根据权利要求1～3中任一项所述的检测纤维二糖酶活性的方法，其特征在于：所述纳米金探针的Zeta电位为-30 mV～-40 mV。

6.根据权利要求1～3中任一项所述的检测纤维二糖酶活性的方法，其特征在于，所述纳米金探针主要由以下方法制备得到：在配好的纤维二糖溶液中加入氯金酸溶液和硼氢化钠溶液，充分混匀且反应完全后，将得到的反应产物低速离心纯化以去除沉积颗粒，再于上清液中加入6-巯基己-1-醇进行培养，培养完成后高速离心纯化，将高速离心后的沉淀重溶于超纯水中，得到含有可用于检测纤维二糖酶活性的纳米金探针的溶液。

7.根据权利要求6所述的检测纤维二糖酶活性的方法，其特征在于：所述氯金酸、硼氢化钠、纤维二糖的摩尔用量比为1∶（16.3～18.4）∶（1.2～6）。

8.根据权利要求6所述的检测纤维二糖酶活性的方法，其特征在于：所述氯金酸与6-巯基己-1-醇的摩尔用量比为1∶（0.002～0.004）。

9.根据权利要求6所述的检测纤维二糖酶活性的方法，其特征在于：所述低速离心时的转速为1200rpm～1500rpm，所述高速离心时的转速为12000rpm～15000rpm。

10.根据权利要求6所述的检测纤维二糖酶活性的方法：所述加入6-巯基己-1-醇进行培养时的温度控制在30℃～37℃，培养时间为2h～2.5h。