CN103890168A - 用于蛋白质分泌和木质纤维素降解的突变细胞 - Google Patents
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Abstract
本发明提供用于分泌蛋白质和用于降解木质纤维素类生物质的突变细胞。还提供利用这些细胞的方法。具体地，公开了真菌和酵母细胞中，β-葡萄糖苷酶和代谢阻遏基因creA/cre-1的组合型基因缺失在蛋白分泌中的利用。
Description
相关申请的交叉引用
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技术领域
本发明涉及用于产生蛋白质，比如纤维素酶，和用于降解木质纤维素类生物质的突变细胞。具体地，提供用于产生蛋白质，比如纤维素酶，的突变细胞和方法。
背景技术
木质纤维素类生物质是用于生物燃料生产的、丰富的和可再生的原料。然而，将不溶性的木质纤维素类生物质初始转化为可透过细胞的和便于发酵的糖在生物燃料生产过程中存在重大的技术挑战和主要瓶颈。因此，需要改善方法，解锁木质纤维素类生物质作为多用途能源的全部潜力，来克服该瓶颈。
生物质的自然降解是通过真菌微生物分泌的木质纤维素降解酶实现的。例如，在新近烧焦的植物中，经常发现野生的丝状真菌和实验室模型生物粗糙脉孢菌（N.crassa），其分泌纤维素酶，并由此引发植物细胞壁的解聚作用。基于它们在木质纤维素降解中的天然角色，丝状真菌及其木质纤维素降解酶作为生物技术生产过程中的生物质降解的催化剂具有很大的潜力。
但是，鉴于在丝状真菌中纤维素酶的分泌是通过不溶性植物细胞壁成分，如纤维素，半纤维素，和木聚糖有效诱导的，可溶性诱导剂是不太有效的。例如，纤维二糖，作为纤维素酶的主要的可溶性最终产品，能够在若干种丝状真菌，包括红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)（里氏木霉（Trichoderma reesei）；T.reesei）和曲霉（黑曲霉，构巢曲霉，米曲霉）中诱导纤维素酶，但其诱导水平远低于纤维素本身。然而，不溶性诱导剂存在的一个问题是，纤维素酶能粘住不溶性诱导剂，导致分泌的酶活性的产量减少。
不溶性生物质的处理是异质加工并且进入生物质表面受真菌细胞的限制。因此，在丰富的真菌培养中，由于缺乏与产生诱导作用的植物表面的接触，大量的细胞将是自由浮动的，并且不分泌高水平的活化纤维素酶。为了在这种细胞悬浮液中优化蛋白质，包括纤维素酶，的生产并因此促进生物质的降解，需要这样的细胞系统：在用可溶性小分子，比如纤维糊精，诱导后，分泌高水平的活性蛋白。
发明内容
在此提供用于增加蛋白的分泌和用于木质纤维素类生物质的降解的突变细胞。也提供使用在此描述的突变细胞增加蛋白质的分泌和降解木质纤维素类生物质的方法。此外，本发明至少一部分是基于意外发现在丝状真菌，如粗糙脉孢菌中，突变型β-葡萄糖苷酶基因和/或分解代谢物阻遏基因cre-1，导致被纤维素类生物质，比如纤维二糖诱导时，增加蛋白质的分泌。不希望受限于理论，应该认为β-葡萄糖苷酶基因的活性和cre-1参与蛋白质的转录调控（图1）。
因此，本发明的一个方面提供一种增加来自细胞的蛋白质的分泌的方法，通过：（a）提供突变细胞，该突变细胞在两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因中含有失活性突变；以及（b）将该突变细胞与纤维素类生物质接触，该纤维素类生物质诱导该突变细胞分泌蛋白质。在某些实施例中，该突变细胞在细胞的cre-1基因中进一步含有失活性突变。本发明的另一方面提供一种增加来自细胞的蛋白质的分泌的方法，通过：（a）提供突变细胞，该突变细胞在细胞的cre-1基因中含有失活性突变；以及（b）将该突变细胞与纤维素类生物质接触，该纤维素类生物质诱导该突变细胞分泌蛋白质。在某些实施例中，该突变细胞在两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因中进一步含有失活性突变。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该纤维素类生物质包括多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖，和纤维六糖中的一种或更多种。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该纤维素类生物质包括纤维二糖。
因此，本发明的一个方面提供一种增加来自细胞的蛋白质的分泌的方法，通过：（a）提供突变细胞，该突变细胞在两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因中含有失活性突变；以及（b）将该突变细胞与糖类接触，该糖类诱导该突变细胞分泌蛋白质。在某些实施例中，该突变细胞进一步在细胞的cre-1基因中含有失活性突变。本发明的另一方面提供一种增加来自细胞的蛋白质的分泌的方法，通过：（a）提供突变细胞，该突变细胞在细胞的cre-1基因中含有失活性突变；以及（b）将该突变细胞与糖类接触，该糖类诱导该突变细胞分泌蛋白质。在某些实施例中，该突变细胞在两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因中进一步含有失活性突变。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该糖类选自多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖，和纤维六糖。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该糖类为纤维二糖。
在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，分泌蛋白为纤维素诱导蛋白。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该分泌蛋白选自：纤维素酶、GH61酶、纤维二糖脱氢酶、内酯酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶，和含有纤维素结合结构域的蛋白质，及其组合。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该分泌蛋白为纤维素酶。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该分泌蛋白由选自以下的基因编码：NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764，和NCU05137。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该突变细胞在至少一种β-甘露糖苷酶基因中进一步含有失活性突变。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该突变细胞在至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因中进一步含有失活性突变。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该失活性突变为缺失。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该细胞为重组细胞。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该细胞为真菌或酵母细胞。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该细胞为真菌或酵母细胞。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该细胞选自粗糙脉孢菌（Neurospora crassa，N.crassa）细胞、构巢曲霉（Aspergillus nidulans）细胞、里氏木霉（Trichoderma reesei）细胞、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)细胞、嗜热侧孢霉（Sporotrichum thermophile）（嗜热毁丝霉（Myceliophthorathermophila））细胞、玉米赤霉（Gibberella zeae）细胞、核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）细胞、灰葡萄孢霉（Botryotinia fuckeliana）细胞、黑曲霉（Aspergillus niger）细胞、产黄青霉（Penicillium chrysogenum）细胞、裂褶菌（Schizophyllum commune）细胞、褐腐菌（Postia placenta）细胞、米曲霉（Aspergillus oryzae）细胞和解纤维顶孢霉（Acremonium cellulolyticus）细胞。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为三种或更多种β-葡萄糖苷酶基因。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为四种或更多种β-葡萄糖苷酶基因。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为五种或更多种β-葡萄糖苷酶基因。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为六种或更多种β-葡萄糖苷酶基因。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为七种或更多种β-葡萄糖苷酶基因。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该三种或更多种β-葡萄糖苷酶基因、四种或更多种β-葡萄糖苷酶基因、五种或更多种β-葡萄糖苷酶基因、六种或更多种β-葡萄糖苷酶基因，或七种或更多种β-葡萄糖苷酶基因包括NCU00130、NCU04952，和NCU08755。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，至少一种β-葡萄糖苷酶基因编码胞内β-葡萄糖苷酶。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该至少一种β-葡萄糖苷酶基因编码胞外β-葡萄糖苷酶。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该至少一种β-甘露糖苷酶基因为NCU00890。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因为NCU06650。
本发明的另一个方面提供一种增加来自细胞的蛋白质的分泌的方法，通过：（a）提供重组细胞，与相应非重组细胞中至少两种β-葡萄糖苷酶基因的表达相比，该重组细胞显示了该至少两种β-葡萄糖苷酶基因的表达下降；以及（b）将该重组细胞与纤维素类生物质接触，该纤维素类生物质诱导该重组细胞分泌蛋白质。在某些实施例中，与相应非重组细胞中cre-1基因的表达相比，该重组细胞进一步显示了cre-1基因的表达下降。本发明的另一方面提供一种增加来自细胞的蛋白质的分泌的方法，通过：（a）提供重组细胞，与相应非重组细胞中cre-1基因的表达相比，该重组细胞显示了cre-1基因的表达下降；以及（b）将该重组细胞与纤维素类生物质接触，该纤维素类生物质诱导该重组细胞分泌蛋白质。在某些实施例中，与相应非重组细胞中至少两种β-葡萄糖苷酶基因的表达相比，该重组细胞进一步显示了该至少两种β-葡萄糖苷酶基因的表达下降。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该纤维素类生物质包括多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖，和纤维六糖中的一种或更多种。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该纤维素类生物质包括纤维二糖。
本发明的另一个方面提供一种增加来自细胞的蛋白质的分泌的方法，通过：（a）提供重组细胞，与相应非重组细胞中至少两种β-葡萄糖苷酶基因的表达相比，该重组细胞显示了该至少两种β-葡萄糖苷酶基因的表达下降；以及（b）将该重组细胞与糖类接触，该糖类诱导该重组细胞分泌蛋白质。在某些实施例中，与相应非重组细胞中cre-1基因的表达相比，该重组细胞进一步显示了cre-1基因的表达下降。本发明的另一方面提供一种增加来自细胞的蛋白质的分泌的方法，通过：（a）提供重组细胞，与相应非重组细胞中cre-1基因的表达相比，该重组细胞显示了cre-1基因的表达下降；以及（b）将该重组细胞与糖类接触，该糖类诱导该重组细胞分泌蛋白质。在某些实施例中，与相应非重组细胞中至少两种β-葡萄糖苷酶基因的表达相比，该重组细胞进一步显示了该至少两种β-葡萄糖苷酶基因的表达下降。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该糖类选自多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖，和纤维六糖。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该糖类为纤维二糖。
在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，分泌蛋白为纤维素诱导蛋白。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该分泌蛋白选自：纤维素酶、GH61酶、纤维二糖脱氢酶、内酯酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶，和含有纤维素结合结构域的蛋白质，及其组合。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该分泌蛋白为纤维素酶。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该分泌蛋白由选自以下的基因编码：NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764，和NCU05137。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，creA/cre-1的功能通过使显性失活突变（dominantnegative mutant）或蛋白抑制剂过表达降低。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，与相应非重组细胞中至少一种β-甘露糖苷酶基因的表达相比，该重组细胞进一步显示了该至少一种β-甘露糖苷酶基因的表达下降。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，与相应非重组细胞中磷脂酶基因或磷脂酶类基因的表达相比，该重组细胞进一步显示了该磷脂酶基因或磷脂酶类基因的表达下降。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，通过siRNA、反义DNA、抑制，或减数分裂沉默降低基因表达。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为三种或更多种β-葡萄糖苷酶基因。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为四种或更多种β-葡萄糖苷酶基因。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为五种或更多种β-葡萄糖苷酶基因。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为六种或更多种β-葡萄糖苷酶基因。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为七种或更多种β-葡萄糖苷酶基因。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该三种或更多种β-葡萄糖苷酶基因、四种或更多种β-葡萄糖苷酶基因、五种或更多种β-葡萄糖苷酶基因、六种或更多种β-葡萄糖苷酶基因，或七种或更多种β-葡萄糖苷酶基因包括NCU00130、NCU04952，和NCU08755。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，至少一种β-葡萄糖苷酶基因编码胞内β-葡萄糖苷酶。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该至少一种β-葡萄糖苷酶基因编码胞外β-葡萄糖苷酶。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该至少一种β-甘露糖苷酶基因为NCU00890。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因为NCU06650。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该细胞为稳定细胞系或瞬时转染的细胞。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该细胞为真菌或酵母细胞。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该细胞为子囊菌和担子菌物种的丝状真菌。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该细胞选自粗糙脉孢菌（Neurosporacrassa，N.crassa）细胞、构巢曲霉（Aspergillus nidulans）细胞、里氏木霉（Trichoderma reesei）细胞、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)细胞、嗜热侧孢霉（Sporotrichum thermophile）（嗜热毁丝霉（Myceliophthora thermophila））细胞、玉米赤霉（Gibberella zeae）细胞、核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）细胞、灰葡萄孢霉（Botryotinia fuckeliana）细胞、黑曲霉（Aspergillus niger）细胞、产黄青霉（Penicilliumchrysogenum）细胞、裂褶菌（Schizophyllum commune）细胞、褐腐菌（Postia placenta）细胞、米曲霉（Aspergillusoryzae）细胞和解纤维顶孢霉（Acremonium cellulolyticus）细胞。
本发明的另一个方面提供在两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因中含有失活性突变的突变细胞，其中比起在两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因中缺乏所述突变的相应细胞，纤维素类生物质诱导该细胞分泌更高水平的蛋白。在一些实施例中，该突变细胞在细胞cre-1基因中进一步含有失活性突变，其中比起在cre-1基因中缺乏所述突变的相应细胞，纤维素类生物质诱导该细胞分泌更高水平的蛋白。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该突变细胞在至少一种β-甘露糖苷酶基因中进一步含有失活性突变，其中比起在至少一种β-甘露糖苷酶基因中缺乏所述突变的相应细胞，纤维素类生物质诱导该细胞分泌更高水平的蛋白。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该突变细胞在至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因中进一步含有失活性突变，其中比起在至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因中缺乏所述突变的相应细胞，纤维素类生物质诱导该细胞分泌更高水平的蛋白。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该纤维素类生物质包括多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖，和纤维六糖中的一种或更多种。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该纤维素类生物质包括纤维二糖。
本发明的另一个方面提供在两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因中含有失活性突变的突变细胞，其中比起在两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因中缺乏所述突变的相应细胞，糖类诱导该细胞分泌更高水平的蛋白。在一些实施例中，该突变细胞在细胞cre-1基因中进一步含有失活性突变，其中比起在cre-1基因中缺乏所述突变的相应细胞，糖类诱导该细胞分泌更高水平的蛋白。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该突变细胞在至少一种β-甘露糖苷酶基因中进一步含有失活性突变，其中比起在至少一种β-甘露糖苷酶基因中缺乏所述突变的相应细胞，糖类诱导该细胞分泌更高水平的蛋白。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该突变细胞在至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因中进一步含有失活性突变，其中比起在至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因中缺乏所述突变的相应细胞，糖类诱导该细胞分泌更高水平的蛋白。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该糖类选自多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖，和纤维六糖。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该糖类为纤维二糖。
在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，分泌蛋白为纤维素诱导蛋白。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该分泌蛋白选自：纤维素酶、GH61酶、纤维二糖脱氢酶、内酯酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶，和含有纤维素结合结构域的蛋白质，及其组合。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该分泌蛋白为纤维素酶。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该分泌蛋白由选自以下的基因编码：NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764，和NCU05137。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该失活性突变为缺失。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该细胞为重组细胞。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该细胞为真菌或酵母细胞。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该细胞为子囊菌和担子菌物种的丝状真菌。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该细胞选自粗糙脉孢菌（Neurospora crassa，N.crassa）细胞、构巢曲霉（Aspergillus nidulans）细胞、里氏木霉（Trichoderma reesei）细胞、黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)细胞、嗜热侧孢霉（Sporotrichum thermophile）（嗜热毁丝霉（Myceliophthora thermophila））细胞、玉米赤霉（Gibberella zeae）细胞、核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）细胞、灰葡萄孢霉（Botryotiniafuckeliana）细胞、黑曲霉（Aspergillus niger）细胞、产黄青霉（Penicillium chrysogenum）细胞、裂褶菌（Schizophyllum commune）细胞、褐腐菌（Postia placenta）细胞、米曲霉（Aspergillus oryzae）细胞和解纤维顶孢霉（Acremonium cellulolyticus）细胞。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为三种或更多种β-葡萄糖苷酶基因。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为四种或更多种β-葡萄糖苷酶基因。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为五种或更多种β-葡萄糖苷酶基因。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为六种或更多种β-葡萄糖苷酶基因。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为七种或更多种β-葡萄糖苷酶基因。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该三种或更多种β-葡萄糖苷酶基因、四种或更多种β-葡萄糖苷酶基因、五种或更多种β-葡萄糖苷酶基因、六种或更多种β-葡萄糖苷酶基因，或七种或更多种β-葡萄糖苷酶基因包括NCU00130、NCU04952，和NCU08755。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，至少一种β-葡萄糖苷酶基因编码胞内β-葡萄糖苷酶。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该至少一种β-葡萄糖苷酶基因编码胞外β-葡萄糖苷酶。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该至少一种β-甘露糖苷酶基因为NCU00890。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因为NCU06650。
本发明的另一个方面提供重组细胞，与相应非重组细胞中至少两种β-葡萄糖苷酶基因的表达相比，该重组细胞显示了该至少两种β-葡萄糖苷酶基因的表达下降，其中通过siRNA、反义DNA、抑制，或减数分裂沉默降低该表达，并且其中比起至少两种β-葡萄糖苷酶基因表达不下降的相应非重组细胞，纤维素类生物质诱导该细胞分泌更高水平的蛋白。在某些实施例中，与相应非重组细胞中cre-1基因的表达相比，该细胞进一步显示了cre-1基因的表达下降，其中通过siRNA、反义DNA、抑制，或减数分裂沉默降低该表达，并且其中比起cre-1基因表达不下降的相应非重组细胞，纤维素类生物质诱导该细胞分泌更高水平的蛋白。在某些实施例中，creA/cre-1的功能通过显性失活突变或蛋白抑制剂的过表达而降低，其中比起显性失活突变没有过表达的相应细胞，纤维素类生物质诱导该细胞分泌更高水平的蛋白。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，与相应非重组细胞中至少一种β-甘露糖苷酶基因的表达相比，该细胞显示了该至少一种β-甘露糖苷酶基因的表达下降，其中通过siRNA、反义DNA、抑制，或减数分裂沉默降低该表达，并且其中比起至少一种β-甘露糖苷酶基因表达不下降的相应非重组细胞，纤维素类生物质诱导该细胞分泌更高水平的蛋白。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，与相应非重组细胞中至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因的表达相比，该细胞进一步显示了至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因的表达下降，其中通过siRNA、反义DNA、抑制，或减数分裂沉默降低该表达，并且其中比起该至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因的表达不下降的非重组细胞，纤维素类生物质诱导该细胞分泌更高水平的蛋白。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该纤维素类生物质包括多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖，和纤维六糖中的一种或更多种。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该纤维素类生物质包括纤维二糖。
本发明的另一个方面提供重组细胞，与相应非重组细胞中至少两种β-葡萄糖苷酶基因的表达相比，该重组细胞显示了该至少两种β-葡萄糖苷酶基因的表达下降，其中通过siRNA、反义DNA、抑制，或减数分裂沉默降低该表达，并且其中比起至少两种β-葡萄糖苷酶基因表达不下降的相应非重组细胞，糖类诱导该细胞分泌更高水平的蛋白。在某些实施例中，与相应非重组细胞中cre-1基因的表达相比，该细胞显示了cre-1基因的表达下降，其中通过siRNA、反义DNA、抑制，或减数分裂沉默降低该表达，并且其中比起cre-1基因表达不下降的相应非重组细胞，糖类诱导该细胞分泌更高水平的蛋白。在某些实施例中，creA/cre-1的功能通过使显性失活突变或蛋白抑制剂过表达降低，其中比起显性失活突变没有过表达的相应细胞，糖类诱导该细胞分泌更高水平的蛋白。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，与相应非重组细胞中至少一种β-甘露糖苷酶基因的表达相比，该细胞显示了该至少一种β-甘露糖苷酶基因的表达下降，其中通过siRNA、反义DNA、抑制，或减数分裂沉默降低该表达，并且其中比起至少一种β-甘露糖苷酶基因表达不下降的相应非重组细胞，糖类诱导该细胞分泌更高水平的蛋白。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，与相应非重组细胞中至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因的表达相比，该细胞进一步显示了至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因的表达下降，其中通过siRNA、反义DNA、抑制，或减数分裂沉默降低该表达，并且其中比起该至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因的表达不下降的非重组细胞，糖类诱导该细胞分泌更高水平的蛋白。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该糖类选自多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖，和纤维六糖。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该糖类为纤维二糖。
在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，分泌蛋白为纤维素诱导蛋白。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该分泌蛋白选自：纤维素酶、GH61酶、纤维二糖脱氢酶、内酯酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶，和含有纤维素结合结构域的蛋白质，及其组合。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该分泌蛋白为纤维素酶。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该分泌蛋白由选自以下的基因编码：NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764，和NCU05137。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为三种或更多种β-葡萄糖苷酶基因。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为四种或更多种β-葡萄糖苷酶基因。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为五种或更多种β-葡萄糖苷酶基因。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为六种或更多种β-葡萄糖苷酶基因。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为七种或更多种β-葡萄糖苷酶基因。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该三种或更多种β-葡萄糖苷酶基因、四种或更多种β-葡萄糖苷酶基因、五种或更多种β-葡萄糖苷酶基因、六种或更多种β-葡萄糖苷酶基因，或七种或更多种β-葡萄糖苷酶基因包括NCU00130、NCU04952，和NCU08755。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，至少一种β-葡萄糖苷酶基因编码胞内β-葡萄糖苷酶。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，至少一种β-葡萄糖苷酶基因编码胞外β-葡萄糖苷酶。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该至少一种β-甘露糖苷酶基因为NCU00890。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因为NCU06650。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该细胞为稳定细胞系或瞬时转染的细胞。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该细胞为真菌或酵母细胞。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该细胞为子囊菌和担子菌物种的丝状真菌。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该细胞选自粗糙脉孢菌（Neurospora crassa，N.crassa）细胞、构巢曲霉（Aspergillus nidulans）细胞、里氏木霉（Trichoderma reesei）细胞、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)细胞、嗜热侧孢霉（Sporotrichumthermophile）（嗜热毁丝霉（Myceliophthora thermophila））细胞、玉米赤霉（Gibberella zeae）细胞、核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）细胞、灰葡萄孢霉（Botryotinia fuckeliana）细胞、黑曲霉（Aspergillus niger）细胞、产黄青霉（Penicillium chrysogenum）细胞、裂褶菌（Schizophyllum commune）细胞、褐腐菌（Postiaplacenta）细胞、米曲霉（Aspergillus oryzae）细胞和解纤维顶孢霉（Acremonium cellulolyticus）细胞。
本发明的另一方面涉及一种降解生物质的方法，通过：(a)提供木质纤维素类生物质；(b)提供之前的任何实施例中的细胞，或在cre-1基因中含有失活性突变的细胞；(c)通过用纤维素类生物质接触该细胞诱导该细胞分泌蛋白；以及(d)用木质纤维素类生物质接触诱导的细胞，其中分泌的蛋白降解木质纤维素类生物质。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该纤维素类生物质包括多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖，和纤维六糖中的一种或更多种。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该纤维素类生物质包括纤维二糖。本发明的另一方面涉及一种降解生物质的方法，通过：(a)提供木质纤维素类生物质；(b)提供之前的任何实施例中的细胞，或在cre-1基因中含有失活性突变的细胞；(c)通过用糖类接触该细胞诱导该细胞分泌蛋白；以及(d)用木质纤维素类生物质接触诱导的细胞，其中分泌的蛋白降解木质纤维素类生物质。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该糖类选自多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖，和纤维六糖。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该糖类为纤维二糖。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，分泌蛋白为纤维素诱导蛋白。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该分泌蛋白选自：纤维素酶、GH61酶、纤维二糖脱氢酶、内酯酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶，和含有纤维素结合结构域的蛋白质，及其组合。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该分泌蛋白为纤维素酶。在可以与之前的实施例结合的某些实施例中，该分泌蛋白由选自以下的基因编码：NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764，和NCU05137。
附图说明
图1展示了粗糙脉胞菌的β-葡萄糖苷酶缺失菌株中纤维素酶的转录调节模型。需要转录去抑制和特异性诱导来实现纤维素酶基因表达的转录激活的最大化。箭头表明纤维素代谢物的可能途径。蓝线表示被认为是Δ3βG和Δ3βGΔcre缺失菌株中最弱化的途径；红线表示被认为是Δ3βG和Δ3βGΔcre缺失菌株中最具活性的途径。
图2展示了粗糙脉孢菌中纤维素酶的基因表达时间进程。图2A展示了纤维二糖水解酶I(cbh-1,NCU07340)的时间进程。图2B展示了内切葡聚糖酶2(gh5-1,NCU00762)的时间进程。当用2%蔗糖诱导时，所有基因的表达水平标准化至1。菌株在含有2%蔗糖的基本培养基中生长16小时，接着在含有
的基本培养基中生长4小时。在所有样品以肌动蛋白(NCU04173)基因表达水平作为内源性对照。每个反应以一式三份进行并且误差条表示95%置信区间。
图3展示了在WT、Δ3βG和Δ3βGΔcre中用0.2%纤维二糖或
诱导4小时后，选择的纤维素酶的基因表达。当用1%蔗糖诱导时，cbh-1、gh6-2，和gh5-1的基因表达水平标准化至1。在所有样品中以肌动蛋白作为内源性对照。每种菌株以一式三份生长并且误差条表示1标准偏差。
图4表示转移至含有2%蔗糖的基本培养基4小时后，Δcre-1中纤维素酶纤维二糖水解酶I(cbh-1,NCU07340)和内切葡聚糖酶2(gh5-1,NCU00762)的基因表达水平。对于用2%蔗糖诱导的野生型，两种基因的表达水平标准化至1。肌动蛋白(NCU04173)基因表达水平作为内源性对照。每个反应以一式三份进行并且误差条表示95%置信区间。
图5展示了饥饿状态下，野生型(WT)、Δcre-1、Δ4952Δ8755Δ130，和Δ4952Δ8755Δ130Δcre-1中纤维素酶纤维二糖水解酶I(cbh-1,NCU07340)和内切葡聚糖酶2(gh5-1,NCU00762)的基因表达水平。当用2%蔗糖诱导时，所有基因的表达水平标准化至1。菌株在含有2%蔗糖的基本培养基中生长16小时，接着在没有添加碳源的基本培养基中生长4小时。在所有的样品中，肌动蛋白(NCU04173)基因表达水平作为内源性对照。每个反应以一式三份进行并且误差条表示95%置信区间。
图6表示用10mM或1mM纤维二糖诱导4小时后，纤维素酶纤维二糖水解酶I(cbh-1,NCU07340)和内切葡聚糖酶2(gh5-1,NCU00762)的基因表达水平。图6A展示了野生型的结果。图6B展示了Δ4952Δ8755Δ130缺失突变体的结果。图6C展示了Δ4952Δ8755Δ130Δcre-1缺失突变体的结果。当用2%蔗糖诱导时，所有基因的表达水平标准化至1。菌株在含有2%蔗糖的基本培养基中生长16小时，接着在含有1mM纤维二糖、10mM纤维二糖，或2%蔗糖的基本培养基中生长4小时。在所有的样品中，肌动蛋白(NCU04173)基因表达水平作为内源性对照。每个反应以一式三份进行并且误差条表示95%置信区间。
图7概述了用纤维二糖或诱导后，WT、Δ3βG，和Δ3βGΔcre菌株中的蛋白质的产量和酶活性。图7A展示了利用以纤维二糖诱导的Δ3βG的生物反应器中纤维素酶的产量。图7B展示了利用以纤维二糖诱导的Δ3βGΔcre的生物反应器中纤维素酶的产量。图7C展示了利用以纤维二糖诱导的WT的生物反应器中纤维素酶的产量。图7D展示了利用在
上生长5天的WT的生物反应器中纤维素酶的产量。在用0.2%纤维二糖诱导36小时前，纤维二糖诱导的菌株在含有1%蔗糖的基本培养基中预生长24小时。测量蔗糖、葡萄糖、果糖（按葡萄糖当量，三角形）、纤维二糖（圆）、蛋白质产量（正方形），和生物质累积量（菱形）的浓度。图7E展示了来自7A、7B，和7D的24小时诱导的上清液对
的活性。比较用纤维二糖诱导24小时的Δ3βG(正方形)和Δ3βGΔcre(三角形)的培养物上清液与在
上生长5天的WT（菱形）的培养物上清液的纤维素酶活性。误差条为1标准偏差。图7F展示了来自7A和7B中生物反应器培养物上清液的Azo-CMC(内切葡聚糖酶)活性的时间进程。Azo-CMC活性表示为在
上生长5天的WT培养物上清液的活性的百分比。
图8比较来自野生型(WT)、Δcre-1、Δ4952Δ8755Δ130，和Δ4952Δ8755Δ130Δcre-1的培养物滤液的MuLac活性(纤维二糖水解酶I)。图8A展示了以在
上生长4天后的野生型在
上的活性的百分比表示的MuLac活性。图8B展示了以μg纯化的重组Cbh-1当量表示的MuLac活性。菌株在2%蔗糖生长16小时，接着在2%蔗糖、2%纤维二糖，或中生长4天，并且取时间点2天和4天。用4-甲基伞形酮基-β-D-纤维二糖糖苷(4-Methylumbelliferyl-β-D-cellobioside，MuLac)试验测量培养物上清液中外切葡聚糖酶活性。
图9比较来自野生型(WT)、Δcre-1、Δ4952Δ8755Δ130，和Δ4952Δ8755Δ130Δcre-1的培养物滤液中的Azo-CM-纤维素活性(内切-1,4-β-葡聚糖酶)。菌株在1%蔗糖生长24小时，接着在2%蔗糖、
或2%纤维二糖中生长4天。以4天后野生型在
上的活性的百分比表示内切-1,4-β-葡聚糖酶活性。注意，没有展示蔗糖培养物的数据，因为不能检测到4种菌株中的任何一种的Azo-CM-纤维素活性。
图10比较粗糙脉胞菌野生型(WT)和Δcre-1菌株的表型。图10A展示了来自在
上生长7天的WT和Δcre-1菌株的培养物滤液中的分泌蛋白的SDS-PAGE分析。标记代表β-葡萄糖苷酶(NCU04952)、纤维二糖水解酶1(cbh-1,NCU07340)和2(cbh-2,NCU09680)，以及内切葡聚糖酶2(gh5-1,NCU00762)的蛋白带。图10B比较由来自WT和Δcre-1菌株的7天培养物上清液的微晶纤维素酶（Avicelase）试验确定的内切葡聚糖酶在Azo-CMC、蛋白质浓度，以及葡萄糖和纤维二糖浓度上的活性。
图11展示了来自野生型(WT)、Δcre-1、Δ4952Δ8755Δ130，和Δ4952Δ8755Δ130Δcre-1缺失突变体的培养物滤液中的分泌蛋白的SDS-PAGE分析。菌株在1%蔗糖中生长24小时，接着在2%蔗糖、2%纤维二糖、1%蔗糖和1%纤维二糖，或1%蔗糖和
中生长4天，在24小时时间点取出样品。在标准的10%Tris-HCl（Criterion10%Tris-HCl）聚丙烯酰胺凝胶上跑15μl过滤后的培养物上清液并用Thermo ScientificGelCode蓝色染色试剂染色。注意：在蔗糖上的Δcre-1和Δ4952Δ8755Δ130Δcre-1的跑至72kDa的蛋白质已经用质谱分析法鉴定为NCU01517（葡糖淀粉酶1）。
图12展示了来自野生型粗糙脉胞菌和Δ4952Δ8755Δ130(β-G tKO)的培养物滤液中的分泌蛋白的SDS-PAGE分析。菌株在1%蔗糖中生长24小时，接着在2%蔗糖、2%纤维二糖，或
中生长5天。标记代表纤维二糖水解酶1(cbh-1,NCU07340)、纤维二糖水解酶2(cbh-2,NCU09680)，和内切葡聚糖酶2(gh5-2,NCU00762)的蛋白带。此外，在野生型中标记β-葡萄糖苷酶(NCU04952)并且在三重缺失Δ4952Δ8755Δ130中描述了不存在β-葡萄糖苷酶。
图13展示了密切相关真菌中NCU00130(SEQ ID NO:1)、NCU04952(SEQ ID NO:2)，和NCU08755(SEQID NO:3)直系同源物的ClustalW比对。提供粗糙脉胞菌基因的整条序列，并且直系同源物仅展示不同的氨基酸。“.”表示相同的残基，而“-”表示插入或缺失。
图14展示了β-葡萄糖苷酶NCU00130直系同源物的进化关系。用邻接法(Saitou N.和Nei M.,1987)推断进化史。展示了树枝长度总和=1.56132503的最优树。该树按比例绘制，并且树枝长度的单位与用于推断系统树的进化距离的单位相同。用泊松校正法（Poisson correction method）(Zuckerkandl E.和Pauling L.,1965)计算进化距离，并且该进化距离以每个位点中氨基酸替换数为单位。分析涉及11条氨基酸序列。排除含有间隙和缺失数据的所有位置。最终的数据集中总共有447个位置。在MEGA5(Tamura K.,Dudley J.,Nei M.,和Kumar S.,2007)中进行进化分析。
图15展示了β-葡萄糖苷酶NCU04952直系同源物的进化关系。展示了树枝长度总和=2.84018960的最优树。分析涉及11条氨基酸序列。最终的数据集中总共有690个位置。
图16展示了β-葡萄糖苷酶NCU08755直系同源物的进化关系。展示了树枝长度总和=2.37353896的最优树。分析涉及11条氨基酸序列。最终的数据集中总共有709个位置。
图17展示了用纤维糊精诱导后，WT和Δ3βG中的纤维素酶诱导。图17A展示了用
纤维二糖、纤维三糖，或纤维四糖诱导4小时后，WT中cbh-1、gh5-1，和gh6-2的表达。图17B展示了用
纤维二糖、纤维三糖，或纤维四糖诱导4小时后，Δ3βG中cbh-1、gh5-1，和gh6-2的表达。当用1%蔗糖诱导时，cbh-1、gh5-1，和gh6-2的基因表达水平标准化至1。在所有的样品中，肌动蛋白(NCU04173)基因表达水平作为内源性对照。误差条表示1标准偏差。
图18展示了用纤维二糖或
诱导后，WT和β-葡萄糖苷酶缺失菌株中纤维素酶的表达水平。图18A展示了来自WT、Δ3βG，和Δ3βGΔcre菌株的培养物滤液中分泌蛋白的SDS-PAGE分析。标记代表CBH-1、GH6-2，和GH5-1的蛋白带。此外，在三重敲除中标记不存在胞外β-葡萄糖苷酶(NCU04952)。葡糖淀粉酶I(NCU01517)的存在与cre-1基因的缺失相关。培养物在1%蔗糖中生长24小时，接着添加2%蔗糖或0.2%纤维二糖。在24小时(WT、Δ3βG和Δ3βGΔcre)或72小时(Δ3βG)后，收集上清液。WT的
培养物在上生长5天，Δ3βG在1%蔗糖中生长24小时，接着在
中生长48小时，而Δ3βGΔcre在1%蔗糖中生长24小时，接着在
中生长24小时。图18B展示了来自18A的上清液对
的活性。在50℃用
诱导24小时后，测量葡萄糖（深灰色）和纤维二糖（浅灰色）。误差条表示1标准偏差。
图19展示了用槐糖、乳糖或D-(+)-半乳糖诱导后，WT和Δ3βG中的纤维素酶诱导。图19A展示了用1mM槐糖、1mM乳糖，或1mM D-(+)-半乳糖诱导4小时后，WT和Δ3βG中cbh-1的表达。图19B展示了用1mM槐糖、1mM乳糖，或1mM D-(+)-半乳糖诱导4小时后，WT和Δ3βG中gh6-2的表达。当用1%蔗糖诱导时，cbh-1和gh6-2的基因表达水平标准化至1。在所有的样品中，肌动蛋白(NCU04173)基因表达水平作为内源性对照。误差条表示1标准偏差。
图20展示了WT和Δ3βG菌株的RNA测序。图20A展示了与用纤维二糖诱导相比，在WT粗糙脉胞菌中用
有差别地诱导的318种基因的分层聚类分析。浅色表示更高的相关表达，而深色表示更低的相关表达。图20B展示了与用纤维二糖诱导的Δ3βG相比，用纤维二糖或
诱导的WT以FPKM（每百万片段映射的每千个碱基的外显子的片段）表示的纤维素酶表达。所有的菌株在2%蔗糖上生长16小时，接着转移至无碳源（仅有Vogels盐溶液）、0.2%纤维二糖或
中培养4小时。
图21展示了用纤维二糖或
诱导后，WT、Δ3βG，和Δ3βGΔcre菌株的酶活性。图21A展示了24小时诱导的上清液对
的活性。比较来自用纤维二糖诱导24小时的Δ3βG(正方形)和Δ3βGΔcre(菱形)的培养物上清液与来自在
上生长5天的WT（三角形）培养物上清液的纤维素酶活性。图21B展示了在
水解试验（来自于21A）中，36小时后，纤维二糖（浅灰色）和葡萄糖（深灰色）的分解。误差条表示1标准偏差。
图22总结了在野生型
Δ3βG(纤维二糖)，和Δ3βGΔcre(纤维二糖)粗糙脉胞菌菌株中通过质谱分析鉴定的蛋白质。
图23比较来自粗糙脉胞菌菌株Δ3βG、Δ3βGΔcre、Δ3βGΔ890、Δ3βGΔ6650、Δ3βGΔ6650Δ890、Δ3βGΔcreΔ6650、Δ3βGΔcreΔ890，和Δ3βGΔcreΔ6650Δ890的培养物滤液中MuLac活性（纤维素酶活性）。带有Δ890的菌株缺失β-甘露糖苷酶基因NCU00890。带有Δ6650的菌株缺失磷脂酶基因或磷脂酶类基因NCU06650。菌株在2%蔗糖中生长36小时，接着在0.2%纤维二糖中生长24小时。用4-甲基伞形酮基-β-D-纤维二糖糖苷(MuLac)试验测量培养物上清液中外切葡聚糖酶活性。在菌株之间，以相对荧光显示结果。
具体实施例
概述
本发明涉及突变细胞和重组细胞，该突变细胞和重组细胞显示了蛋白，比如纤维素酶，的分泌增加，以响应纤维素类生物质或糖类的诱导；并且涉及利用这种细胞以增加蛋白分泌的方法。该分泌蛋白可以用于降解木质纤维素类生物质。在此公布的本发明的突变细胞在至少一种基因，比如β-葡萄糖苷酶基因、cre-1基因、β-甘露糖苷酶基因，或者磷脂酶或磷脂酶类基因，中含有失活性突变。如在此公布，与相应非重组细胞中至少一种基因的表达相比，本发明的重组细胞显示至少一种基因，比如β-葡萄糖苷酶基因、cre-1基因、β-甘露糖苷酶基因，或者磷脂酶或磷脂酶类基因，的表达下降。
蛋白分泌诱导物
从含有多糖及多糖成分的生物，如植物，藻类，真菌，细菌，和细菌生物膜，大量获得纤维素类生物质。纤维素是纤维素类生物质中的主要多糖。纤维素是脱水纤维二糖（anhydrocellobiose）（线性β-(1-4)-D-葡聚糖）的均聚物，并包括以β-糖苷键连接在一起的葡萄糖单位。虽然一般是多形的，但植物组织中的纤维素主要为平行葡聚糖链的不溶性的结晶基质。纤维素类生物质可以为未加工的生物质、预处理的生物质，或加工的生物质。纤维素类生物质也可以包括一种或更多种糖类。
本发明的合适的纤维素类生物质可以包括，但不限于，糖类、多糖、低聚糖、纯化的纤维素，和纤维素衍生物。纯化的纤维素包括全纤维素，如Solka Flok，和微晶纤维素，比如和纤维素衍生物包括，但不限于，纤维糊精、β-甲基伞形酮基-低聚糖（β-methylumbelliferyl-oligosaccharides）、对硝基苯酚低聚糖（p-nitrophenol-oligosaccharides）、长链的纤维素衍生物、羧甲基纤维素（CMC），和羟乙基纤维素（HEC）。
在此使用的“纤维糊精”指的是不同长度的β(1→4)葡萄糖聚合物，包括，但不限于，纤维二糖（2个葡萄糖单体）、纤维三糖（3个葡萄糖单体）、纤维四糖（4个葡萄糖单体）、纤维五糖（5个葡萄糖单体），和纤维六糖（6个葡萄糖单体）。有利的是，短链纤维糊精，如纤维二糖，是可溶的。此外，本发明的分泌蛋白不附着短链纤维糊精，如纤维二糖。
在某些方面，本发明的纤维素类生物质可以为未加工的生物质材料，该生物质材料可以通过本发明的细胞降解。降解的生物质可以包括，但不限于，多糖，如纤维素和微晶纤维素；或低聚糖，如纤维糊精和纤维二糖。在其它方面，本发明的纤维素类生物质可以包括纯化的多糖，如纤维素和微晶纤维素；或低聚糖，如纤维糊精和纤维二糖。在另外的其它方面，本发明的生物质可以包括多糖的混合物，如纤维素和微晶纤维素；和低聚糖，如纤维糊精和纤维二糖。
在某些方面，本发明的纤维素类生物质直接加入到本发明的突变细胞或重组细胞中以诱导蛋白分泌。
在其它方面，通过一种或更多种纤维素衍生物，比如纤维糊精或纤维二糖从本发明的突变细胞或重组细胞诱导蛋白分泌，其中该纤维素衍生物通过细胞降解纤维素类生物质在原位产生。在某些方面，纤维素类生物质的数量足以产生诱导细胞分泌的纤维素衍生物，但该纤维素衍生物不附着，或相反，隔离从细胞分泌的一类或更多类蛋白。
此外，糖类可以用于诱导本发明的突变细胞或重组细胞分泌蛋白。合适的糖类包括，但不限于，多糖、低聚糖、槐糖、纤维素、微晶纤维素、纤维糊精、纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖，和纤维六糖。
分泌蛋白
在某些方面，本发明的突变细胞和重组细胞显示了至少一类、至少两类、至少三类、至少四类、至少五类，或更多类蛋白分泌增加，以响应纤维素类生物质或糖类的诱导。
在此使用的，增加分泌指的是提高本发明的蛋白的分泌水平。分泌涉及从细胞内到细胞外的蛋白运动。分泌水平提高可以是感兴趣的蛋白的表达或产量增加的结果。可选地，分泌水平提高可以是感兴趣的蛋白来自细胞的转运增加的结果。本发明的方法还可以通过改变参与蛋白产生和分泌，导致该蛋白的总分泌水平提高的途径提高蛋白的分泌水平。
本发明的可以分泌的蛋白质的类型，包括，但不限于，内源蛋白和外源蛋白。本发明的内源蛋白为本发明的细胞的内源的，或由本发明的细胞自然产生的蛋白。本发明的外源蛋白是不在本发明的细胞中自然表达的蛋白。外源蛋白可以通过本领域已知的任何方法在细胞中的重组表达。通常，编码外源蛋白质的重组核酸可操作地连接到调控序列，如启动子。可以使用本领域已知的任何合适的调控序列。合适的启动子包括，但不限于，组成型启动子或诱导型启动子。此外，外源蛋白可以含有直接从细胞分泌的分泌型肽。可以使用本领域已知的适用于本发明的方法的任何分泌型肽。
在某些方面，分泌蛋白为纤维素诱导蛋白。在此使用的“纤维素诱导蛋白”指的是在野生型细胞（例如，非突变或非重组细胞）中通过纤维素诱导表达和分泌的蛋白。例如，2011年，C.M.Phillips等人(Phillips,CMet al.,Proteome Res.2011Sep2;10(9):4177-85.Epub2011Aug1)描述的纤维素诱导蛋白。
本发明的纤维素诱导的分泌蛋白包括，但不限于：纤维素酶、GH61酶、纤维二糖脱氢酶、内酯酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶，和含有纤维素结合结构域的蛋白质。
在此使用的，“纤维素酶”或“纤维素酶多肽”指的是具有催化纤维素、地衣多糖，和谷物β-D-葡聚糖水解的酶活性的多肽。例如，纤维素酶可以水解纤维素中的1,4-β-D-糖苷键。本发明的纤维素酶包括，但不限于，内切纤维素酶，内切葡聚糖酶、内切-1,4-β-葡聚糖酶、内切-1,4-β-D-葡聚糖酶、羧甲基纤维素酶（(CMCase）、β-1,4-葡聚糖酶、β-1,4-内切葡聚糖水解酶（β-1,4-endoglucan hydrolase），和纤维糊精酶；外切纤维素酶如外切葡聚糖酶，纤维二糖酶、纤维二糖水解酶、氧化的纤维素酶比如纤维二糖脱氢酶；和纤维素磷酸化酶。
在此使用的，“GH61酶”指的是糖苷水解酶家族61的酶。本发明的GH61酶能够提高纤维素酶的活性。GH61酶的例子包括，但不限于，多糖单加氧酶。在某些方面，本发明的GH61酶由GH61-1基因、GH61-2基因、GH61-5基因、NCU07898基因、NCU08760基因、其同源物，及其直系同源物编码。
纤维二糖脱氢酶是具有氧化还原酶活性的酶，并包括具有EC1.1.99.18活性的酶。在某些方面，本发明的纤维二糖脱氢酶由NCU00206、cdh-1基因、其同源物，及其直系同源物编码。
内酯酶为可以水解酰化的高丝氨酸内酯的高丝氨酸内酯环的酯键的酶。在某些方面，本发明的内酯酶由NCU07143、lac-2基因、其同源物，及其直系同源物编码。
碳水化合物酯酶为具有EC3.1.1和EC3.1.2活性的酶。碳水化合物酯酶的例子包括，但不限于，乙酰木聚糖酶，肉桂酰酯酶（cinnamoyl esterase），阿魏酸酯酶，羧酸酯酶，和S-甲酰谷胱甘肽水解酶（S-formylglutathione hydrolase）。在某些方面，本发明的碳水化合物酯酶由NCU09491、NCU09664、其同源物，及其直系同源物编码。
多糖裂解酶为具有EC4.2.2活性的酶。在某些方面，本发明的多糖裂解酶由NCU05598、其同源物，及其直系同源物编码。
在此使用的的“含有纤维素结合结构域的蛋白”指的是含有纤维素结合结构域的蛋白纤维素结合结构域是在有纤维素活性的酶，如糖苷水解酶中发现的蛋白质结构域。一般地，纤维素结合结构域具有碳水化合物结合活性。在某些方面，本发明的含有纤维素结合结构域的蛋白由NCU09764、其同源物，及其直系同源物编码。
在某些方面，本发明的分泌的纤维素诱导蛋白是由NCU05137、其同源物，及其直系同源物编码的蛋白。
突变细胞
本发明的一个方面涉及突变细胞，该突变细胞显示了蛋白质分泌增加以响应纤维素类生物质或糖类；并涉及用这种细胞增加来自该细胞的蛋白的分泌和涉及降解木质纤维素类生物质的方法。在此使用的，本发明的突变细胞在至少一个基因中包含失活性突变。合适的失活性突变的例子包括，但不限于，引起抑制该基因编码的蛋白功能的缺失、点突变、功能丧失型突变、截断、重复、扩增、易位，和/或倒位。在感兴趣的基因中产生一个或更多个失活性突变的方法在本领域中是众所周知的，包括，但不限于，PCR诱变、插入诱变、化学诱变，和辐射。
在本发明的一个方面，该突变细胞为真菌或酵母细胞。在本发明的另一发明，该突变细胞可以为子囊菌担子菌真菌细胞，粗糙脉孢菌（Neurospora crassa，N.crassa）细胞、构巢曲霉（Aspergillus nidulans）细胞、里氏木霉（Trichoderma reesei）细胞、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)细胞、嗜热侧孢霉（Sporotrichum thermophile）（嗜热毁丝霉（Myceliophthora thermophila））细胞、玉米赤霉（Gibberella zeae）细胞、核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）细胞、灰葡萄孢霉（Botryotinia fuckeliana）细胞、黑曲霉（Aspergillusniger）细胞、产黄青霉（Penicillium chrysogenum）细胞、裂褶菌（Schizophyllum commune）细胞、褐腐菌（Postia placenta）细胞、米曲霉（Aspergillus oryzae）细胞，或解纤维顶孢霉（Acremonium cellulolyticus）细胞。优选地，该突变细胞为突变的粗糙脉孢菌细胞。在本发明的另一个方面，该突变细胞为重组细胞的。优选地，突变，重组细胞为粗糙脉孢菌突变、重组细胞。
β-葡萄糖苷酶突变细胞
β-葡萄糖苷酶基因编码β-葡萄糖苷酶。在此使用的“β-葡萄糖苷酶”指的是催化末端非还原性β-D-葡萄糖残基水解并释放葡萄糖的β-D-糖苷葡糖水解酶。β-葡萄糖苷酶是高度保守的酶。
在一个方面，本发明的突变细胞在至少两种β-葡萄糖苷酶基因中包含失活性突变，这导致由该至少两个基因编码的β-葡萄糖苷酶的功能丧失。该至少两种β-葡萄糖苷酶基因的失活性突变包括，但不限于，缺失突变、点突变、无义突变、截断，和插入。失活性突变可以完全消除β-葡萄糖苷酶的活性或抑制β-葡萄糖苷酶至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%，或更多的活性。失活性突变可以影响突变基因的表达水平或影响由该突变基因编码的蛋白质或RNA的功能活性。失活性突变也可以是顺式或反式作用。失活性突变可以通过随机突变，包括辐射或暴露于化学诱变剂，而引入，或者失活性突变能以有针对性的方式，包括含有失活性突变的菌株同源重组和杂交，而引入。
含有失活性突变的本发明的β-葡萄糖苷酶可以为胞内β-葡萄糖苷酶或胞外（即，分泌型）β-葡萄糖苷酶。合适的含有失活性突变的β-葡萄糖苷酶的例子包括，但不限于，粗糙脉孢菌基因NCU00130、NCU04952、NCU08755、其同源物，及其直系同源物编码的那些β-葡萄糖苷酶。NCU00130直系同源物、NCU04952直系同源物，和NCU08755直系同源物的例子包括，但不限于，图13-16列举的那些。
在本发明的一个具体方面，相比缺乏失活的β-葡萄糖苷酶突变的细胞，纤维素类生物质或糖类可以诱导突变细胞转录水平高10、50、100、500、1,000、5,000、10,000、50,000，或100,000倍的至少一类蛋白。
在本发明的一个具体方面，相比缺乏失活的β-葡萄糖苷酶突变的细胞，纤维素类生物质或糖类在两天诱导后可以诱导突变细胞分泌水平高1.2、1.4、1.6、1.8、2、4、6、8、10、50、100、500、1,000、5,000，或10,000倍的至少一类蛋白。
在本发明的另一具体方面，相比缺乏失活的β-葡萄糖苷酶突变的细胞，纤维素类生物质或糖类在两天诱导后可以诱导突变细胞分泌水平高1.2、1.4、1.6、1.8、2、3、4、5、6、7、8、9，或10倍的总蛋白。
在本发明的另一具体方面，相比缺乏失活的β-葡萄糖苷酶突变的细胞，用至少1nM、至少5nM、至少10nM,15nM、至少20nM、至少25nM、30nM、至少35nM、至少40nM、45nM、至少50nM、至少55nM、60nM、至少65nM、至少70nM、至少75nM、80nM、至少85nM、90nM、至少95nM、至少100nM、至少125nM、150nM、至少175nM、200nM、至少225nM、至少250nM、至少275nM、300nM、至少325nM、350nM、至少375nM、至少400nM、至少425nM、至少450nM、至少475nM、500nM、至少525nM、至少550nM、至少575nM、600nM、至少625nM、650nM、至少675nM、至少700nM、至少725nM、至少750nM、至少775nM、800nM、至少825nM、至少850nM、至少875nM、900nM、至少925nM、950nM、至少975nM、至少1μM、至少2μM、至少3μM、至少4μM、至少5μM、至少6μM、至少7μM、至少8μM、至少9μM、至少10μM、至少15μM、至少20μM、至少25μM、至少30μM、至少35μM、至少40μM、至少45μM、至少50μM、至少55μM、至少60μM、至少65μM、至少70μM、至少75μM、至少80μM、至少85μM、至少90μM、至少95μM、至少100μM、至少125μM、至少150μM、至少175μM、至少200μM、至少225μM、至少250μM、至少275μM、至少300μM、至少325μM、至少350μM、至少375μM、至少400μM、至少425μM、至少450μM、至少475μM、至少500μM、至少525μM、至少550μM、至少575μM、至少600μM、至少625μM、至少650μM、至少675μM、至少700μM、至少725μM、至少750μM、至少775μM、至少800μM、至少825μM、至少850μM、至少875μM、至少900μM、至少925μM、至少950μM、至少975μM、至少1mM、至少2mM、至少3mM、至少4mM、至少5mM、至少6mM、至少7mM、至少8mM、至少9mM、至少10mM、至少11mM、至少12mM、至少13mM、至少14mM、至少15mM、至少16mM、至少17mM、至少18mM、至少19mM、至少20mM，或更多纤维素类生物质或糖类诱导后，突变细胞可以转录水平高10、50、100、500、1,000、5,000、10,000、50,000，或100,000倍的至少一类蛋白。
在本发明的另一具体方面，相比缺乏失活的β-葡萄糖苷酶突变的细胞，用至少1nM、至少5nM、至少10nM、15nM、至少20nM、至少25nM、30nM、至少35nM、至少40nM、45nM、至少50nM、至少55nM、60nM、至少65nM、至少70nM、至少75nM、80nM、至少85nM、90nM、至少95nM、至少100nM、至少125nM、150nM、至少175nM、200nM、至少225nM、至少250nM、至少275nM、300nM、至少325nM、350nM、至少375nM、至少400nM、至少425nM、至少450nM、至少475nM、500nM、至少525nM、至少550nM、至少575nM、600nM、至少625nM、650nM、至少675nM、至少700nM、至少725nM、至少750nM、至少775nM、800nM、至少825nM、至少850nM、至少875nM、900nM、至少925nM、950nM、至少975nM、至少1μM、至少2μM、至少3μM、至少4μM、至少5μM、至少6μM、至少7μM、至少8μM、至少9μM、至少10μM、至少15μM、至少20μM、至少25μM、至少30μM、至少35μM、至少40μM、至少45μM、至少50μM、至少55μM、至少60μM、至少65μM、至少70μM、至少75μM、至少80μM、至少85μM、至少90μM、至少95μM、至少100μM、至少125μM、至少150μM、至少175μM、至少200μM、至少225μM、至少250μM、至少275μM、至少300μM、至少325μM、至少350μM、至少375μM、至少400μM、至少425μM、至少450μM、至少475μM、至少500μM、至少525μM、至少550μM、至少575μM、至少600μM、至少625μM、至少650μM、至少675μM、至少700μM、至少725μM、至少750μM、至少775μM、至少800μM、至少825μM、至少850μM、至少875μM、至少900μM、至少925μM、至少950μM、至少975μM、至少1mM、至少2mM、至少3mM、至少4mM、至少5mM、至少6mM、至少7mM、至少8mM、至少9mM、至少10mM、至少11mM、至少12mM、至少13mM、至少14mM、至少15mM、至少16mM、至少17mM、至少18mM、至少19mM、至少20mM，或更多纤维素类生物质或糖类诱导后，突变细胞可以分泌水平高2、4、8、16、32、64、128，或256倍的至少一类蛋白。
在本发明的另一具体方面，该至少两种β-葡萄糖苷酶为至少三种β-葡萄糖苷酶、至少四种β-葡萄糖苷酶、至少五种β-葡萄糖苷酶、至少六种β-葡萄糖苷酶、至少七种β-葡萄糖苷酶，或更多种β-葡萄糖苷酶。
在本发明的一个优选实施例中，在粗糙脉孢菌细胞中缺失β-葡萄糖苷酶基因NCU00130、NCU04952，以及NCU08755。
在本发明的另一方面，包括降低至少两种β-葡萄糖苷酶活性的失活性突变的突变细胞在cre-1基因中进一步包括失活性突变，其中比起在cre-1基因中缺乏突变的细胞，纤维素类生物质或糖类诱导该细胞分泌更高水平的至少一种蛋白。失活性突变可以影响突变基因的表达水平或影响由该突变基因编码的蛋白质或RNA的功能活性。失活性突变可以是顺式或反式作用。失活性突变可以通过随机突变，包括辐射或暴露于化学诱变剂，而引入，或者失活性突变能以有针对性的方式，包括含有单一或多重失活性突变的菌株同源重组和杂交，而引入。
在本发明的一个具体方面，相比缺乏失活的creA/cre-1突变的细胞，纤维素类生物质或糖类可以诱导该突变细胞转录水平高2、4、6、8、10、50、100、500、1,000、5,000、10,000、50,000，或100,000倍的至少一类蛋白。
在本发明的一个具体方面，相比缺乏β-葡萄糖苷酶突变或cre-1突变的细胞，纤维素类生物质或糖类可以诱导该突变细胞分泌水平高1.2、1.4、1.6、1.8、2、4、6、8、10、50、100、500、1,000、5,000，或10,000倍的至少一类蛋白。
在本发明的另一具体方面，相比缺乏β-葡萄糖苷酶突变或cre-1突变的细胞，纤维素类生物质或糖类在两天诱导后可以诱导该突变细胞分泌水平高1.2、1.4、1.6、1.8、2、3、4、5、6、7、8、9，或10倍的总蛋白。
在本发明的另一具体方面，相比缺乏β-葡萄糖苷酶突变或cre-1突变的细胞，用至少1nM、至少5nM、至少10nM、15nM、至少20nM、至少25nM、30nM、至少35nM、至少40nM、45nM、至少50nM、至少55nM、60nM、至少65nM、至少70nM、至少75nM、80nM、至少85nM、90nM、至少95nM、至少100nM、至少125nM、150nM、至少175nM、200nM、至少225nM、至少250nM、至少275nM、300nM、至少325nM、350nM、至少375nM、至少400nM、至少425nM、至少450nM、至少475nM、500nM、至少525nM、至少550nM、至少575nM、600nM、至少625nM、650nM、至少675nM、至少700nM、至少725nM、至少750nM、至少775nM、800nM、至少825nM、至少850nM、至少875nM、900nM、至少925nM、950nM、至少975nM、至少1μM、至少2μM、至少3μM、至少4μM、至少5μM、至少6μM、至少7μM、至少8μM、至少9μM、至少10μM、至少15μM、至少20μM、至少25μM、至少30μM、至少35μM、至少40μM、至少45μM、至少50μM、至少55μM、至少60μM、至少65μM、至少70μM、至少75μM、至少80μM、至少85μM、至少90μM、至少95μM、至少100μM、至少125μM、至少150μM、至少175μM、至少200μM、至少225μM、至少250μM、至少275μM、至少300μM、至少325μM、至少350μM、至少375μM、至少400μM、至少425μM、至少450μM、至少475μM、至少500μM、至少525μM、至少550μM、至少575μM、至少600μM、至少625μM、至少650μM、至少675μM、至少700μM、至少725μM、至少750μM、至少775μM、至少800μM、至少825μM、至少850μM、至少875μM、至少900μM、至少925μM、至少950μM、至少975μM、至少1mM、至少2mM、至少3mM、至少4mM、至少5mM、至少6mM、至少7mM、至少8mM、至少9mM、至少10mM、至少11mM、至少12mM、至少13mM、至少14mM、至少15mM、至少16mM、至少17mM、至少18mM、至少19mM、至少20mM，更多纤维素类生物质或糖类诱导后，突变细胞可以转录水平高10、50、100、500、1,000、5,000、10,000、50,000，或100,000倍的至少一类蛋白。
在本发明的另一具体方面，相比缺乏β-葡萄糖苷酶突变或cre-1突变的细胞，用至少1nM、至少5nM、至少10nM、15nM、至少20nM、至少25nM、30nM、至少35nM、至少40nM、45nM、至少50nM、至少55nM、60nM、至少65nM、至少70nM、至少75nM、80nM、至少85nM、90nM、至少95nM、至少100nM、至少125nM、150nM、至少175nM、200nM、至少225nM、至少250nM、至少275nM、300nM、至少325nM、350nM、至少375nM、至少400nM、至少425nM、至少450nM、至少475nM、500nM、至少525nM、至少550nM、至少575nM、600nM、至少625nM、650nM、至少675nM、至少700nM、至少725nM、至少750nM、至少775nM、800nM、至少825nM、至少850nM、至少875nM、900nM、至少925nM、950nM、至少975nM、至少1μM、至少2μM、至少3μM、至少4μM、至少5μM、至少6μM、至少7μM、至少8μM、至少9μM、至少10μM、至少15μM、至少20μM、至少25μM、至少30μM、至少35μM、至少40μM、至少45μM、至少50μM、至少55μM、至少60μM、至少65μM、至少70μM、至少75μM、至少80μM、至少85μM、至少90μM、至少95μM、至少100μM、至少125μM、至少150μM、至少175μM、至少200μM、至少225μM、至少250μM、至少275μM、至少300μM、至少325μM、至少350μM、至少375μM、至少400μM、至少425μM、至少450μM、至少475μM、至少500μM、至少525μM、至少550μM、至少575μM、至少600μM、至少625μM、至少650μM、至少675μM、至少700μM、至少725μM、至少750μM、至少775μM、至少800μM、至少825μM、至少850μM、至少875μM、至少900μM、至少925μM、至少950μM、至少975μM、至少1mM、至少2mM、至少3mM、至少4mM、至少5mM、至少6mM、至少7mM、至少8mM、至少9mM、至少10mM、至少11mM、至少12mM、至少13mM、至少14mM、至少15mM、至少16mM、至少17mM、至少18mM、至少19mM、至少20mM，或更多纤维素类生物质或糖类诱导后，突变细胞可以分泌水平高1.2、1.4、1.6、1.8、2、4、8、16、32、64、128，或256倍的至少一类蛋白。
在本发明的另一具体方面，该至少两种β-葡萄糖苷酶为至少三种β-葡萄糖苷酶。
在本发明的一个优选实施例中，在粗糙脉孢菌细胞中缺失β-葡萄糖苷酶基因NCU00130、NCU04952，以及NCU08755，和cre-1基因。
CreA/cre-1突变细胞
在一个方面，本发明的突变细胞在creA/cre-1基因中包含失活性突变，这导致由该基因编码的CreA/CRE-1功能丧失。creA/cre-1基因的失活性突变包括，但不限于，缺失突变、点突变、无义突变、截断，和插入。失活性突变可以完全消除CreA/CRE-1活性或抑制CreA/CRE-1至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%，或更多的活性。失活性突变可以影响突变基因的表达水平或影响由该突变基因编码的蛋白质或RNA的功能活性。失活性突变也可以是顺式或反式作用。失活性突变可以通过随机突变，包括辐射或暴露于化学诱变剂，而引入，或者失活性突变能以有针对性的方式，包括含有失活性突变的菌株同源重组和杂交，而引入。在此“cre-1基因”和“creA/cre-1基因”能交替使用。
在本发明的一个具体方面，相比缺乏失活的cre-1突变的细胞，纤维素类生物质或糖类可以诱导该突变细胞转录水平高2、4、6、8、10、50、100、500、1,000、5,000、10,000、50,000，或100,000倍的至少一类蛋白。
在本发明的一个具体方面，相比缺乏cre-1突变的细胞，纤维素类生物质或糖类可以诱导包括cre-1失活性突变的突变细胞分泌水平高1.2、1.4、1.6、1.8、2、4、6、8、10、50、100、500、1,000、5,000，或10,000倍的至少一类蛋白。
在本发明的另一具体方面，与缺乏cre-1突变的细胞相比，突变细胞显示了参与C化合物/碳水化合物代谢、胞外代谢、具有结合的功能或辅助因子要求的蛋白质、C化合物/碳水化合物的运输、运输设施，和蛋白质合成的基因的表达基础水平升高。
在本发明的一个优选实施例中，粗糙脉孢菌细胞中缺失cre-1基因。
在本发明的另一方面，在cre-1基因中包括失活性突变的突变细胞进一步包括消除由至少两种β-葡萄糖苷酶基因编码的β-葡萄糖苷酶活性的失活性突变。该至少两种β-葡萄糖苷酶基因的失活性突变包括缺失、点突变、无义突变、截断，和插入。失活性突变可以完全消除β-葡萄糖苷酶活性或抑制至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%，或更多的活性。失活性突变可以影响突变基因的表达水平或影响由该突变基因编码的蛋白质或RNA的功能活性。失活性突变也可以是顺式或反式作用。失活性突变可以通过随机突变，包括辐射或暴露于化学诱变剂，而引入，或者失活性突变能以有针对性的方式，包括含有失活性突变的菌株同源重组和杂交，而引入。β-葡萄糖苷酶可以是胞内或胞外（即，分泌的）β-葡萄糖苷酶。
在本发明的一个具体方面，相比缺乏失活的β-葡萄糖苷酶突变的细胞，纤维素类生物质或糖类可以诱导突变细胞转录水平高2、4、6、8、10、50、100、500、1,000、5,000、10,000、50,000，或100,000倍的至少一类蛋白。
在本发明的一个具体方面，相比缺乏至少两种β-葡萄糖苷酶突变的细胞，纤维素类生物质或糖类可以诱导突变细胞分泌水平高1.2、1.4、1.6、1.8、2、4、6、8、10、50、100、500、1,000、5,000，或10,000倍的至少一类蛋白。
在本发明的另一具体方面，该至少两种β-葡萄糖苷酶为至少三种β-葡萄糖苷酶。
在本发明的一个优选实施例中，该突变细胞为包括β-葡萄糖苷酶基因NCU00130、NCU04952，以及NCU08755缺失和cre-1缺失的粗糙脉孢菌细胞。
β-甘露糖苷酶突变细胞
在本发明的另一方面，含有降低至少两种β-葡萄糖苷酶活性的失活性突变的本发明的突变细胞、在cre-1基因中含有失活性突变的本发明的突变细胞，和/或含有降低至少两种β-葡萄糖苷酶活性的失活性突变和在cre-1基因中含有失活性突变的突变细胞进一步包括降低至少一种β-甘露糖苷酶基因活性的失活性突变。
本发明的β-甘露糖苷酶基因编码β-甘露糖苷酶。在此使用的“β-甘露糖苷酶”、“甘露聚糖内切-1,6-β-甘露糖苷酶”、“内切-1,4-β-甘露聚糖酶”、“内切-β-1,4-甘露聚糖酶（endo-β-1,4-mannase）”、“β-甘露聚糖酶B”、“β-1,4-甘露聚糖4-甘露聚糖水解酶”、“内切-β-甘露聚糖酶”、“β-D-甘露聚糖酶”，和”1,4-β-D-甘露聚糖甘露聚糖水解酶”可以交替使用并且指的是能随机水解甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖(EC3.2.1.78)中的1,4-β-D-甘露糖苷键的酶。在某些发明，该至少一种β-甘露糖苷酶基因为NCU00890、里氏木霉蛋白ID62166、里氏木霉蛋白ID57857、其同源物，及其直系同源物。
在一个方面，本发明的突变细胞在至少一种β-甘露糖苷酶基因中包含失活性突变，这导致由该基因编码的β-甘露糖苷酶的功能丧失。该至少一种β-甘露糖苷酶基因的失活性突变包括，但不限于，缺失突变、点突变、无义突变、截断，和插入。失活性突变可以完全消除β-甘露糖苷酶的活性或抑制β-甘露糖苷酶至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%，或更多的活性。失活性突变可以影响突变基因的表达水平或影响由该突变基因编码的蛋白质或RNA的功能活性。失活性突变也可以是顺式或反式作用。失活性突变可以通过随机突变，包括辐射或暴露于化学诱变剂，而引入，或者失活性突变能以有针对性的方式，包括含有失活性突变的菌株同源重组和杂交，而引入。
在本发明的一个具体方面，相比缺乏至少一种β-甘露糖苷酶基因失活性突变的细胞，纤维素类生物质或糖类可以诱导进一步含有至少一种β-甘露糖苷酶基因失活性突变的突变细胞转录水平高2、4、6、8、10、50、100、500、1,000、5,000、10,000、50,000，或100,000倍的至少一类蛋白。
在本发明的一个具体方面，相比缺乏至少一种β-甘露糖苷酶失活性突变的细胞，纤维素类生物质或糖类可以诱导进一步含有至少一种β-甘露糖苷酶失活性突变的突变细胞分泌水平高1.2、1.4、1.6、1.8、2、4、6、8、10、50、100、500、1,000、5,000，或10,000倍的至少一类蛋白。
在本发明一个优选实施例中，在粗糙脉孢菌细胞中缺失至少一种β-甘露糖苷酶基因。
磷脂酶突变细胞
本发明的另一方面，含有降低至少两种β-葡萄糖苷酶活性的失活性突变的本发明的突变细胞、含有creA/cre-1基因中的失活性突变的本发明的突变细胞、含有降低至少两种β-葡萄糖苷酶活性的失活性突变和含有creA/cre-1基因中失活性突变的突变细胞，和/或含有降低至少两种β-葡萄糖苷酶活性的失活性突变，creA/cre-1基因中的失活性突变，和降低至少一种β-甘露糖苷酶活性的失活性突变的本发明的突变细胞进一步包括降低至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因活性的失活性突变。
在此使用的“磷脂酶类基因”是与磷脂酶基因具有序列同源性的基因，或编码与磷脂酶具有氨基酸序列同源性的蛋白的基因。例如，本发明的磷脂酶类基因可以为NCU06650。虽然NCU06650没有展示编码具有磷脂酶活性的蛋白，但编码的氨基酸序列的最接近的同源物为磷脂酶。
本发明的磷脂酶基因编码磷脂酶。在此使用的磷脂酶包括，但不限于，将磷脂水解成，例如，脂肪酸和其他亲脂性分子，的酶。编码磷脂酶的基因可以包括，但不限于，编码磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶B、磷脂酶C、磷脂酶D，或磷酸二酯酶的基因。
因此，在某些方面，该至少一种磷脂酶具有或磷脂酶类基因为NCU06650、里氏木霉蛋白ID67579、其同源物，及其直系同源物。
在一个方面，本发明的突变细胞在至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因中包含失活性突变，该失活性突变导致由该基因编码的蛋白的功能丧失。该至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因的失活性突变包括，但不限于，缺失突变、点突变、无义突变、截断，和插入。失活性突变可以完全消除磷脂酶的活性或抑制磷脂酶至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%，或更多的活性。失活性突变可以影响突变基因的表达水平或影响由该突变基因编码的蛋白质或RNA的功能活性。失活性突变也可以是顺式或反式作用。失活性突变可以通过随机突变，包括辐射或暴露于化学诱变剂，而引入，或者失活性突变能以有针对性的方式，包括含有失活性突变的菌株同源重组和杂交，而引入。
在本发明的一个具体方面，相比缺乏至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因失活性突变的细胞，纤维素类生物质或糖类可以诱导进一步含有至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因失活性突变的突变细胞转录水平高2、4、6、8、10、50、100、500、1,000、5,000、10,000、50,000，或100,000倍的至少一类蛋白。
在本发明一个具体方面，相比缺乏至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因失活性突变的细胞，纤维素类生物质或糖类可以诱导进一步含有至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因失活性突变的突变细胞分泌水平高1.2、1.4、1.6、1.8、2、4、6、8、10、50、100、500、1,000、5,000，或10,000倍的至少一类蛋白。
在本发明一个优选实施例中，在粗糙脉孢菌细胞中缺失至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因。
重组细胞
本发明的另一方面涉及重组细胞，该重组细胞显示了在细胞中至少两种β-葡萄糖苷酶具有或cre-1基因的表达下降，也显示了至少一类，至少两类，至少三类，至少四类，至少五类，或更多类蛋白的分泌增加以响应纤维素类生物质或糖类；以及涉及用这种细胞增加来自细胞的蛋白的分泌，和降解木质纤维素类生物质的方法。本发明的重组细胞可以是稳定细胞系或瞬时转染的细胞。
显示感兴趣的基因（例如，β-葡萄糖苷酶基因、cre-1基因、β-甘露糖苷酶基因，或者磷脂酶基因或磷脂酶类基因）的表达下降本发明的重组细胞可以含有降低感兴趣基因的表达的突变。本领域周知产生和塑造突变的方法，比如突变筛选。可选地，本发明的重组细胞可以为含有靶向并降低感兴趣基因的表达的重组构建体，比如抑制性寡核苷酸的转基因细胞。抑制性寡核苷酸的非限制性来自包括siRNA、miRNA、反义DNA。此外，可以通过基因沉默技术，比如抑制或减数分裂沉默降低感兴趣基因的表达。基因沉默技术可以靶向感兴趣基因、感兴趣基因的RNA、感兴趣基因的调控蛋白。
本发明的重组细胞分泌的蛋白质的类型包括，但不限于，纤维素诱导蛋白。纤维素诱导蛋白的非限制性例子包括，但不限于，纤维素酶、GH61酶、纤维二糖脱氢酶、内酯酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶，和含有纤维素结合结构域的蛋白质。在某些方面，本发明的分泌蛋白由以下的基因编码：NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764，和NCU05137。在某些方面，本发明的重组细胞增加至少一类、至少两类、至少三类、至少四类、至少五类，或更多类蛋白分泌。
在某些发明，与相应非重组细胞中至少两种β-葡萄糖苷酶基因的表达相比，本发明的重组细胞显示了该至少两种β-葡萄糖苷酶基因的表达下降。在其它实施例中，与相应非重组细胞中cre-1基因的表达相比，本发明的重组细胞显示了cre-1基因的表达下降。
在此使用的“相应非重组细胞”指的是这样的细胞：与重组细胞的物种相同并在与重组细胞相同的条件下培养，但缺乏导致在重组细胞中降低基因表达的对重组细胞的修饰。本发明的基因的“表达下降”指的是与相应非修饰细胞中基因的表达水平相比，在修饰的细胞中该基因的表达水平降低。
在某些方面，该至少两种β-葡萄糖苷酶基因的表达可能会降低至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%，或100%。在其它方面，该CRE-1基因的表达可以降低至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%，或100%。
在本发明的具体方面，显示至少两种葡萄糖苷酶基因的蛋白下降的重组细胞进一步显示基因creA/cre-1的表达下降。降低creA/cre-1表达的方法可以为基因沉默技术，包括siRNA、miRNA、反义DNA、抑制或减数分裂沉默。基因沉默技术可以靶向creA/cre-1或creA/cre-1调控蛋白，或RNA。CreA/cre-1表达可以降低至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%，或100%。
在本发明的另一具体方面，显示至少两种β-葡萄糖苷酶基因的表达下降的重组细胞可以是通过显性失活突变或蛋白抑制剂的过表达使CreA/CRE-1转录因子的功能活性降低的细胞。CreA/CRE-1的功能可以降低至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%，或100%。
在本发明另一具体方面，显示至少两种β-葡萄糖苷酶基因的表达下降的重组细胞，和/或显示至少两种β-葡萄糖苷酶基因的表达水平下降和基因creA/cre-1的表达水平下降的重组细胞可以进一步显示本发明的至少一种β-甘露糖苷酶基因的表达下降。降低β-甘露糖苷酶的方法包括，但不限于，基因沉默技术，包括siRNA、miRNA、反义DNA、抑制或减数分裂沉默。基因沉默技术可以靶向至少一种β-甘露糖苷酶基因或β-甘露糖苷酶基因调控蛋白或RNA。β-甘露糖苷酶基因表达可以降低至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%，或100%。在某些发明。在重组粗糙脉孢菌细胞中β-甘露糖苷酶基因NCU00890的表达降低。
在本发明另一具体方面，显示至少两种β-葡萄糖苷酶基因的表达下降的重组细胞、显示至少两种β-葡萄糖苷酶基因的表达水平下降和基因creA/cre-1的表达水平下降的重组细胞，和/或显示至少两种β-葡萄糖苷酶基因的表达水平下降、基因creA/cre-1的表达水平下降，和至少一种β-甘露糖苷酶基因的表达下降的重组细胞可以进一步展示本发明的至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因的表达下降。降低磷脂酶表达的方法包括，但不限于，基因沉默技术，包括siRNA、miRNA、反义DNA、抑制或减数分裂沉默。基因沉默技术可以靶向至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因或基因调控蛋白或RNA。磷脂酶基因或磷脂酶类基因表达可以降低至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%，或100%。在某些发明。在重组粗糙脉孢菌细胞中β-甘露糖苷酶基因NCU00890的表达降低。在某些方面，在重组粗糙脉孢菌细胞中降低基因NCU06650的表达。
在本发明优选实施例中，在重组粗糙脉孢菌细胞中降低β-葡萄糖苷酶基因NCU00130、NCU04952，和NCU08755的表达。在本发明另一优选实施例中，在重组粗糙脉孢菌细胞中降低β-葡萄糖苷酶基因NCU00130、NCU04952，和NCU08755的表达，以及cre-1基因的表达。在本发明另一优选实施例中，在重组粗糙脉孢菌细胞中降低β-葡萄糖苷酶基因NCU00130、NCU04952，和NCU08755的表达，cre-1基因的表达，以及β-甘露糖苷酶基因NCU00890的表达。在本发明进一步优选实施例中，在重组粗糙脉孢菌细胞中降低β-葡萄糖苷酶基因NCU00130、NCU04952，和NCU08755的表达，cre-1基因的表达、β-甘露糖苷酶基因NCU00890的表达，以及基因NCU06650的表达。
在本发明的一个方面，该重组细胞显示了基因cre-1基因的表达下降。降低cre-1表达的方法包括，但不限于基因沉默技术，包括siRNA、miRNA、反义DNA、抑制或减数分裂沉默。基因沉默技术可以靶向cre-1或cre-1调控蛋白，或RNA。在重新细胞中，Cre-1表达可以降低至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%，或100%。
在本发明的另一方面，在重组细胞中通过显性失活突变或蛋白抑制剂的过表达降低CreA/CRE-1转录因子的功能活性。CreA/CRE-1的功能可以降低至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%，或100%。
变体、序列一致性，和序列相似性
本领域周知用于比较的序列比对方法。例如，确定任何两条序列之间的序列一致性百分比可以用数学算法实现。这种数学算法的非限制性来自为Myers和Miller(1988)CABIOS4:1117算法、Smith等人(1981)Adv.Appl.Math.2:482的局部同源算法、Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443453的同源比对算法、Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:24442448的搜索相似性算法、在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:58735877中修改的Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264算法。
这些数学算法的计算机执行可以用于序列比较以确定序列一致性。这些执行包括，但不限于，PC/Gene程序中的CLUSTAL(可从加州山景城的Intelligenetics获得)、ALIGN程序（第2版），和Wisconsin Genetics软件包中的GAP,BESTFIT,BLAST,FASTA，和TFASTA，第8版（可从美国威斯康星州麦迪逊市575ScienceDrive的Genetics Computer Group(GCG)获得）可以用缺省参数以这些程序进行比对。Higgins等人(1988)Gene73:237244(1988)、Higgins等人(1989)CABIOS5:151153、Corpet等人(1988)Nucleic Acids Res.16:1088190、Huang等人(1992)CABIOS8:15565，和Pearson等人(1994)Meth.Mol.Biol.24:307331中详细描述了CLUSTAL程序。ALIGN程序是基于上述Myers和Miller(1988)的算法。当比较氨基酸序列时，可以将PAM120权重残基表、间隙长度罚分12，和间隙罚分4与ALIGN程序一起使用。Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403的BLAST程序是基于上述Karlin和Altschul(1990)的算法。BLAST核苷酸搜索能以BLASTN程序，得分=100，字长=12执行，以获得与编码本发明的蛋白的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白搜索能以BLASTX程序，得分=50，字长=3执行，以获得与本发明的蛋白或多肽同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的间隙比对，可以利用Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3389中描述的Gapped BLAST(在BLAST2.0中)。可选地，PSI-BLAST(在BLAST2.0中)可以用于执行迭代搜索，迭代搜索检测分子间的距离关系。参见上述Altschul等人(1997)的文献。当利用BLAST、Gapped BLAST，或PSI-BLAST时，可以利用各个程序（例如，用于核苷酸序列的BLASTN，用于蛋白的BLASTX）的缺省参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。比对也可以通过审视手动执行。
在此使用的序列一致性或在两条核酸或多肽序列的背景下的一致性指的是当在指定的比较窗口比对最大相符度时，两条序列的残基相同。当序列一致性的百分比与蛋白相关时，不一致的并且通常是因保守的氨基酸替换而不同的残基位置不改变该分子的功能特性，其中氨基酸被具有相似化学性质（例如，电荷或疏水性）的其它氨基酸残基替换，这是公认的。当保守替换中的序列有区别时，可将序列一致性百分比向上调节以修正替换的保守性。在这些保守替换中有区别的序列被认为是具有序列相似性或相似性。本领域技术人员周知进行调节的方法。通常，这涉及将保守替换作为部分而不是完全错配打分，从而提高序列一致性百分比。因此，例如，一致的氨基酸给1分，而非保守替换给0分，保守替换给0和1之间的分数。例如，在程序PC/GENE中执行保守替换的打分(加州山景城的Intelligenetics)
用比如在Sambrook,J.等人2000年Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第三版)中所述的标准分子生物技术可以合成、分离，或操作核酸。技术可以包括克隆、cDNA文库表达，和mRNA或基因组DNA扩增。本发明的核酸或其序列可以并入包括表达盒或载体的克隆载体中。克隆载体可以是病毒载体、质粒、噬菌体、噬菌粒、柯斯质粒（cosmid）、福斯质粒（fosmid）、细菌噬菌体，或人工染色体。该病毒载体可包括腺病毒载体，逆转录病毒载体，或腺相关病毒载体。克隆载体可包括细菌人工染色体（BAC）、质粒、细菌噬菌体P1衍生载体（PAC）、酵母人工染色体（YAC），或哺乳动物人工染色体（MAC）。
核酸能可操作地连接到启动子。启动子可以是病毒、细菌、哺乳动物或植物启动子。启动子可以是组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子，或环境调控和发育调控启动子。
增加蛋白分泌的方法
本发明的其它方面涉及通过提供能分泌至少一类、至少两类、展示三类、至少四类、至少五类，或更多类蛋白以响应纤维素类生物质或糖类的本发明的细胞增加来自细胞的蛋白的分泌的方法，及通过使该细胞与纤维素类生物质或糖类接触诱导该细胞分泌至少两类、展示三类、至少四类、至少五类，或更多类蛋白。可与本发明的方法一起使用的纤维素类生物质可以包括，但不限于，多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖，和纤维六糖中的一种或更多种。在某些优选实施例中，该纤维素类生物质包括纤维二糖。
可与本发明的方法一起使用的糖类包括，但不限于多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖、纤维六糖，和槐糖。在某些优选实施例中，该糖类为纤维二糖。本发明的重组细胞分泌的蛋白的类型包括，但不限于：纤维素诱导蛋白。纤维素诱导蛋白的非限制性例子包括，但不限于：纤维素酶、GH61酶、纤维二糖脱氢酶、内酯酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶，和含有纤维素结合结构域的蛋白质。在某些方面，本发明的分泌蛋白由以下的基因编码：NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764，或NCU05137。
因此，本发明的某些方面提供增加来自细胞的蛋白的分泌的方法，通过：提供突变细胞，其中该突变细胞在两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因中含有失活性突变，或在该细胞中的cre-1基因中含有失活性突变；以及使该突变细胞与纤维素类生物质或糖类接触，其中该纤维素类生物质或糖类诱导该突变细胞分泌蛋白。在某些方面，该纤维素类生物质或糖类诱导该细胞分泌至少两类、展示三类、至少四类、至少五类，或更多类蛋白。
在一些方面，增加来自细胞的蛋白分泌的方法包括在存在β-葡萄糖苷酶抑制剂的情况下，诱导该蛋白分泌。优选地，该β-葡萄糖苷酶抑制剂为野尻霉素。
本发明的其它方面提供增加来自细胞的蛋白的分泌的方法，通过：提供重组细胞，其中与相应非重组细胞中的至少两种β-葡萄糖苷酶基因的表达相比，该重组细胞显示该两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因的表达下降，或与相应非重组细胞中的cre-1基因的表达相比，显示cre-1基因的表达下降；以及使该重组细胞与纤维素类生物质或糖类接触，其中该纤维素类生物质或糖类诱导该重组细胞分泌蛋白。在某些方面，该纤维素类生物质或糖类诱导该细胞分泌至少两类、展示三类、至少四类、至少五类，或更多类蛋白。
降解木质纤维素类生物质的方法
本发明另外的方面涉及通过提供木质纤维素类生物质、提供本发明的任何突变或重组细胞、通过使该细胞与纤维素类生物质或糖类接触诱导该细胞分泌至少一类、至少两类、展示三类、至少四类、至少五类，或更多类蛋白，和使诱导的细胞与木质纤维素类生物质接触，降解生物质的方法，其中分泌的至少一类、至少两类、展示三类、至少四类、至少五类，或更多类蛋白降解木质纤维素类生物质。
木质纤维素类生物质一般指的是含纤维素和紧密结合至木质素的其它碳水化合物的聚合物的植物生物质。合适的木质纤维素类生物质的例子包括，但不限于，植物材料，城市固体废弃物，城市废纸，木屑，锯木厂和造纸厂的废物，和农业残余物。适宜的植物材料的例子包括，但不限于，芒草、能源草、象草、柳枝稷、大米草（cord grass）、黑麦草、草芦(reed canary grass)、芦苇、麦秸(wheat straw)、大麦秆（barley straw）、油菜秸秆、燕麦秸秆、玉米秸、大豆秸、燕麦壳、燕麦（oat spelt）、高粱、稻壳、甘蔗渣、玉米纤维、大麦、燕麦、亚麻、亚麻、小麦、亚麻籽、柑橘渣、棉籽、落花生、油菜籽、向日葵、豌豆、羽扇豆属植物（lupines）、棕榈仁、椰子、魔芋、刺槐豆胶、瓜尔豆胶（gum guar）、黄豆、干酒糟可溶物（Distillers DriedGrains with Solubles、DDGS）、蓝茎（Blue Stem）、玉米芯、松树、针叶树软木（conifer softwood）、桉树、桦木、柳树、山杨（aspen）、白杨（poplar wood）、杂交白杨（hybrid poplar）、能源甘蔗、短周期木本作物、作物残渣、庭园废物，及其组合。
可与本发明的方法一起使用的纤维素类生物质包括，但不限于：多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖，和纤维六糖中的一种或更多种。在某些优选实施例中，该纤维素类生物质包括纤维二糖。
可以与本发明的方法一起使用的糖类包括，但不限于多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖、纤维六糖，和槐糖。在某些优选实施例中，该糖类为纤维二糖。本发明的重组细胞分泌的蛋白质的类型包括，但不限于纤维素诱导蛋白。纤维素诱导蛋白的非限制性例子包括，但不限于：纤维素酶、GH61酶、纤维二糖脱氢酶、内酯酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶，和含有纤维素结合结构域的蛋白质。在某些方面，本发明的分泌蛋白由以下的基因编码：NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764，或NCU05137。
在本发明的一些方面，降解木质纤维素类生物质的方法包括在存在β-葡萄糖苷酶抑制剂的情况下，用如上所述的本发明的突变细胞与木质纤维素类生物质接触的步骤。优选地，该β-葡萄糖苷酶抑制剂为野尻霉素。
应用
在此描述的方法可以结合降解木质纤维素类生物质的其它方法一起实行。
例如，木质纤维素类生物质可以进行预处理，该预处理包括氨纤维膨胀（AFEX）、蒸汽爆破、用碱性水溶液、酸性溶液、有机溶剂、离子液体（IL）、电解水、磷酸处理，及其组合。将木质素从植物材料移除的预处理可以增加从半纤维素中释放的糖的总量。
实施例
以下的实施例仅仅用于说明，并且不以任何方式限制本发明的任何方面。
实施例1
以下实施例涉及在粗糙脉胞菌三个β-葡萄糖苷酶基因缺失菌株和三个β-葡萄糖苷酶和cre-1基因缺失菌株中纤维素酶的转录和纤维素分解酶的产量的特征。
材料和方法
菌株
从真菌遗传库存中心(Fungal Genetics Stock Center，FGSC)获得的菌株包括粗糙脉胞菌野生型(WT)(FGSC2489)、cre-1基因缺失体(Δcre-1)(FGSC10372)，以及胞内β-葡萄糖苷酶NCU00130(FGSC11822和FGSC11823)和胞外β-葡萄糖苷酶：NCU08755(FGSC18387和FGSC18388)和NCU04952(FGSC13731和FGSC13732)的缺失菌株。
用FGSC(http://www.fgsc.net/neurosporaprotocols/How%20to%20make%20a%20cross-2.pdf)描述的方法进行序列杂交产生四重缺失体。用基因特异性引物和潮霉素(hph)盒的普通引物确定所有缺失菌株的基因型。用于hph的正向引物为：
hph Middle FWD：5’-CGA CAG ACG TCG CGG TGA GTT CAG-3’ [SEQ ID NO:4]
反向引物为：
NCU00130: 5’-TAG TGT ACA AAC CCC AAG C-3’ [SEQ ID NO:5]
NCU004953: 5’-AAC ACA CAC ACA CAC ACT GG-3’ [SEQ ID NO:6]
NCU08755: 5’-ACA GTG GAG GTG AGA AAG G-3’ [SEQ ID NO:7]
NCU08807: 5’-GTA CTT ACG CAG TAG CGT GG-3’ [SEQ ID NO:8]
转录生长研究
在含有50ml Vogel’s盐和2%(wt/vol)蔗糖的250ml爱伦美氏烧瓶中，当OD595等于0.05时接种菌株，并使菌株在持续光照，200rpm的情况下，生长16小时。接着，使生物质在4000rpm下旋转10分钟并用Vogel’s中洗涤两次以移除任何多余的蔗糖。然后，将该生物质加入含2%(wt/vol)蔗糖、纤维二糖(Sigma)，或
PH101
的50ml新培养物中。在持续光照，200rpm的情况下，诱导培养物4小时。接着通过Whatman玻璃微纤维过滤器(GF/F)过滤在布氏漏斗（Buchner funnel）上收集培养物生物质并用50mlVogel’s洗涤。生物质在液态氮中速冻并储存在-80℃。
RNA分离
根据生产商指示，用氧化锆/二氧化硅小珠(0.2g，直径0.5mm；Biospec)和Mini-Beadbeater-96(Biospec)以及1mL TRIzol试剂(Invitrogen)分离来自冷冻样品的总RNA。通过用不含DNA的TURBO(TURBODNA-free，Ambion)和RNeasy试剂盒(Qiagen)消化进一步纯化总RNA。通过Nanodrop和琼脂糖凝胶电泳检查RNA完整性。
实时定量RT-PCR
用EXPRESS One-Step SYBR GreenER试剂盒(Invitrogen)和StepOnePlus实时PCR系统(Applied Biosystems)进行定量RT-PCR。反应以10μl总反应体积，一式三份地进行，其中10μl总反应体积包括各300nM的正向引物和反向引物以及75ng模板RNA。通过StepOne软件(Applied Biosystems)用相对定量/比较CT(ΔΔCT)进行数据分析。按蔗糖上表达的内源性对照肌动蛋白（endogenous control actin）作为参考样品使数据标准化。误差条代表95%置信区间。使用Tian等人2009年描述的RT-PCR引物。
肌动蛋白: 5’-TGA TCT TAC CGA CTA CCT-3’ [SEQ ID NO:9]
5’-CAG AGC TTC TCC TTG ATG-3’ [SEQ ID NO:10]
CBHI(NCU07340) 5’-ATC TGG GAA GCG AAC AAA G-3’ [SEQ ID NO:11]
5’-TAG CGG TCG TCG GAA TAG-3’ [SEQ ID NO:12]
CBHII(NCU09680) 5’-CCC ATC ACC ACT ACT ACC-3’ [SEQ ID NO:13]
5’-CCA GCC CTG AAC ACC AAG-3’ [SEQ ID NO:14]
内切葡聚糖酶2 5’-GAG TTC ACA TTC CCT GAC A-3’ [SEQ ID NO:15]
(NCU00762) 5’-CGA AGC CAA CAC GGA AGA-3’ [SEQ ID NO:16]
GH61(NCU07898) 5’-TCA AGC CCG GTT ACT ATC-3’ [SEQ ID NO:17]
5’-AAC CTG TCA CCT GCA ACT-3’ [SEQ ID NO:18]
CRE-1 5’-CTACTGCCATGTCCTCTC-3’ [SEQ ID NO:19]
5’-TATCAGGACCACTTTGGCTTC-3’ [SEQ ID NO:20]
β-葡萄糖苷酶 5’-GTTCGGCGTTACCTATGT-3’ [SEQ ID NO:21]
(NCU00130) 5’-AGAGTCAAAGAGCGGCTTC-3’ [SEQ ID NO:22]
蛋白质分泌/酶活性研究
在含有100ml Vogel’s盐和1%(wt/vol)的250ml爱伦美氏烧瓶中，当OD595等于0.05时接种菌株，并使菌株在持续光照，200rpm的情况下，生长24小时。接着，用2%蔗糖、2%纤维二糖、1%蔗糖/1%纤维二糖，或1%蔗糖/1%
诱导培养物。培养物在持续光照，200rpm的情况下继续生长5天，并且在第1、2、3、4，和5天收集上清液。将收集的上清液用0.2μm PES过滤器过滤，以除去生物质，待收集完所有样品后，将其储存于-20℃。为了使分泌蛋白可见，在标准的10%Tris-HCL聚丙烯酰胺凝胶上跑15μl未浓缩上清液并用Thermo Scientific GelCode蓝色染色试剂染色。
根据生产商建议的方法，用Azo-CM-纤维素(Megazyme)测量内切-1,4-β-葡聚糖酶的活性。简单地说，100μlAzo-CM-纤维素底物溶液预加热至37℃，与96.5μl培养物上清液和3.5μl3M乙酸钠pH5.0在96深孔板中混合。混合之后，该板在37℃孵化10分钟。通过加入0.5ml沉淀剂溶液使反应停止，并且以1000g离心10分钟。将一式三份50μl样品转移至96孔平底试验板中，并且在Beckman Coulter Paradigm酶标仪中读取590nm光密度的吸光度。数据以在
上4天后的野生型活性的百分比表示。
用4-甲基伞形酮基-β-D-纤维二糖糖苷(MuLac)试验测量外切葡聚糖酶(纤维二糖水解酶I)的活性。该试验主要测量CBH-1的活性，并且活性表达为荧光随时间的变化，该变化作为酶活性指示导致最佳拟合线倾斜。在进行该试验之前，通过使上清液穿过5,000道尔顿浓缩器(sartorius stedim Vivaspin500)移除培养物上清液中任何多余的糖。将保留的蛋白用50mM乙酸钠pH5洗涤两次，并稀释至2μg/μl以确保试验保持在线性范围。该试验以100μl总体积进行，该100μl总体积含有10μg总蛋白并且MuLac的终浓度为1.0mM，乙酸钠pH5的终浓度为50mM。该试验按以下进行：将Beckman Coulter Paradigm酶标仪设置成40℃，激发/发射波长为360/465nm，并且10分钟内每30秒读取一次。最佳拟合线的斜率代表各种培养物上清液的MuLac活性。使MuLac活性标准化至获得2μg/μl的浓度所需的起始稀释度，以代表未稀释的活性。以重组纤维二糖水解酶-1的活性作为标准，并且数据以在上4天后的野生型活性的百分比表示。
根据Tian等人(Tian等人，2009)，测量来自WT、Δcre-1和其它缺失菌株的7天培养物上清液中的葡萄糖和纤维二糖浓度，确定微晶纤维素酶活性。简单地说，一体积来自WT和Δcre-1菌株的7天培养物上清液与一体积含有5mg/ml
和50mM NaAc缓冲液pH5.0的底物溶液在37℃混合。振荡5小时后，通过结合酶试验测量葡萄糖和纤维二糖浓度。
结果
在三个β-葡萄糖苷酶基因缺失体中纤维素酶转录的诱导
为了研究粗糙脉胞菌中早期时间点的纤维素酶诱导，首先将培养物在蔗糖上生长16小时以产生大量的生物质，并且随后转移至含有可选的碳源的新鲜培养物中。WT菌株的起始时间进程证实：4小时诱导期使纤维二糖水解酶I基因cbh-1和内切葡聚糖酶2基因gh5-1在蔗糖上的基因表达与在
上的基因表达相比有最大的不同（图2）。
WT粗糙脉胞菌在
或芒草上生长期间，三种β-葡萄糖苷酶(NCU08755、NCU04952，和NCU00130)在转录水平上展示了显著的提高(Tian等人，2009)。此外，质谱分析将NCU04952鉴定为分泌蛋白(Tian等人，2009)。为了确定这三种β-葡萄糖苷酶是否对在纤维二糖上的纤维素酶诱导发挥作用，通过qRT-PC对纤维二糖介导的纤维素酶诱导筛选缺失单个β-葡萄糖苷酶的三种菌株。但是，单个β-葡萄糖苷酶缺失突变没有展示显著的效果。为了克服β-葡萄糖苷酶活性过剩和极低的葡萄糖浓度下可能产生强烈的代谢物抑制的问题，构建三个β-葡萄糖苷酶缺失菌株。
在
上，对于检测的三种纤维素酶，三个β-葡萄糖苷酶缺失菌株展示了与WT菌株相似的的诱导表型（图3）。但是，在2%纤维二糖上，虽然WT菌株仅展示了对cbh-1的20倍诱导，并且相比在蔗糖上的相对表达，cbh-1或eg-2没有变化，但三个β-葡萄糖苷酶突变体展示了非常不同的图片：cbh-1的相对表达在蔗糖上的表达提高了6,500倍；cbh-2在相对表达上提高了2,100倍，而eg-2在相对表达上提高了2,200倍（图3）。
三个β-葡萄糖苷酶和cre-1基因缺失体中纤维素酶转录的诱导
通过使三个β-葡萄糖苷酶缺失体与Δcre-菌株杂交，产生突变体，该突变体对纤维二糖的转录应答的方式与WT菌株对
的应答方式相同。用纤维二糖或
诱导该突变体展示了cbh-1、cbh-2和eg-2的转录诱导与三个β-葡萄糖苷酶缺失体在纤维二糖或和WT菌株在
上的相似。这些结果证实cre-1充当普通的分解纤维素的调节子，并且cre-1缺失导致粗糙脉胞菌纤维素酶的永久性去抑制。
众所周知Cre-1缺失可适度增加纤维素酶在
上的转录和分泌。相似地，众所周知比起WT在蔗糖上的表达，Cre-1能使cbh-1和eg-2在蔗糖上的转录基础水平提高大约7倍（图4）。当用纤维二糖诱导时，比起在相同菌株中cbh-1和eg-2在蔗糖上的表达，Δcre-1展示了cbh-1的转录提高600倍，而eg-2的转录提高80倍（图3）。虽然相对于在蔗糖上的表达，该表达的提高是显著的，但与用
诱导Δcre-1时，cbh-1提高11,000倍并且eg-2提高8000倍相比，是相形见绌的（图3）。
为了展示对纤维二糖的转录应答是特异性的并且不是因为普遍的饥饿影响，进行无碳源对照实验。在蔗糖上起始16小时的预生长期过去之后，用基本培养基进行柔和的洗涤以移除任何残留的蔗糖，并且最后，将生物质转移到含有基本培养基并且没有添加任何碳源的培养物中。因为这些培养物以与添加蔗糖、纤维二糖，或
的培养物相同的方式加工，因此，经由RT-PCR获得的转录数据将展示饥饿在纤维素酶转录上的普遍效果。
图5展示了虽然由于饥饿，WT菌株、Δcre-1和β-葡萄糖苷酶缺失体展示了轻微的诱导（增加3至30倍），但在这些条件下，三个β-葡萄糖苷酶/cre-1缺失体在cbh-1和eg-2的转录上具有更大的增长量。相对于三个β-葡萄糖苷酶/cre-1缺失体在蔗糖上的生长，三个β-葡萄糖苷酶/cre-1缺失体对饥饿的应答分别是340和200倍的cbh-1和eg-2诱导。与在
或纤维二糖上观察到的10,000至20,000倍的cbh-1和eg-2诱导相比，这些影响是较小的。因此，这些结果证实这些粗糙脉胞菌纤维素酶在
和纤维二糖上的转录应答是特异性的并且不是对饥饿的普遍应答。
在自然界中，在纤维素水解期间，纤维二糖和葡萄糖不会累积至水平高到足以引起显著的葡萄糖阻遏作用。这种现象可以通过改变纤维二糖的实验浓度在体外再现。图6展示了虽然相对于缺失菌株，野生型菌株中纤维素酶的诱导显著降低，但WT纤维素酶的表达呈浓度依赖性，并且比起浓度较高的10mM浓度的纤维二糖，浓度较低的1mM浓度的纤维二糖可充当更好的诱导剂。通过去除主要的β-葡萄糖苷酶的活性，在任何纤维二糖浓度实现比野生型诱导提高25倍。此外，缺失代谢阻遏物CRE-1后，纤维二糖浓度增加不再限制酶的诱导（图6）。
当用纤维二糖诱导时，β-葡萄糖苷酶的缺失展示了纤维素分解酶的产量提高
当用蔗糖或
诱导时，三个β-葡萄糖苷酶缺失体展示了与野生型培养物相似的结果。在蔗糖上，两天后分泌蛋白非常少(180μg/ml)（图7），并且这些分泌蛋白对MuLac不具有活性（图8）。当用
诱导时，在第四天，我们可以在上清液中看见蛋白的明显汇聚（图7）。该培养物上清液的Azo-CM-纤维素和MuLac活性与在相同时间点的野生型培养物的Azo-CM-纤维素和MuLac活性相似（5.5μg CBHI当量）（图8和9）。虽然对于蔗糖和
培养物，该缺失体与野生型相似，但该缺失体对纤维二糖的应答非常不同。在纤维二糖上的第2天，我们可以看见MuLac活性相当于1.4μg重组CBHI，并且在第四天，该值明显增加至4.84μg重组CBHI当量（图8B），并且Azo-CM-纤维素活性类似于在
上生长时的野生型（图9）。该特异性酶活性表明当我们使碳代谢物阻遏的影响最小化时，除了诱导转录，纤维二糖可以直接刺激有活性的纤维素酶的分泌。
cre-1的缺失提高纤维素分解酶的产量
为了调查在粗糙脉胞菌在分解纤维素的培养基上生长中CRE-1的作用，在不同碳源上比较Δcre-1和野生型(WT)菌株的相对生长率。当以
培养基作为唯一碳源时，Δcre-1菌株消耗的
比WT更快（例如，3-4天对比5-6天），分泌的胞外蛋白多30%，并且展示了内切葡聚糖酶活性高50%（图10A和10B）。总微晶纤维素酶试验（测量组合的β-葡萄糖苷酶，内切纤维素酶和外切纤维素酶的活性）展示了与WT相比，Δcre-1菌株中葡萄糖浓度高出20%（图10B）。但是，检测到的纤维二糖更少，表明在Δcre-1菌株中β-葡萄糖苷酶（将纤维二糖转化为葡萄糖；图10B）的分泌增加。
与WT菌株相比，Δcre-1通常显得产生更多的分泌蛋白。这不仅在纤维二糖和诱导的培养物上得以证明，同样在蔗糖上48小时后（图7和11），分泌蛋白的浓度为WT所见的分泌蛋白浓度的大约2倍（481μg/ml对比270μg/ml）中得以证明。虽然Δcre-1在蔗糖上分泌更多的蛋白，但这些蛋白没有对MuLac显示任何活性（图8）。虽然最明显的带在70kDa，跑到相同分子量的是CBH-1/2，但活性的缺乏意味着该蛋白是灭活形式的CBH-1/2或不同的非分解纤维素的蛋白。与转录研究中所见的相似，在纤维二糖上，Δcre-1展示了纤维素酶分泌略微增加(653μg/ml)(图7)，这导致对MuLac的活性适度提高(0.8μg)(图8B)。此外，当用
诱导时，四天后MuLac活性比野生型的活性更小(2.8μg CBHI当量)(图8B)。但是，该效果可能是由于饥饿，因为在4天后的总的蛋白结合图谱通常比3天后的总蛋白结合图谱更亮（图12）。当用纤维二糖诱导时，β-葡萄糖苷酶基因和cre-1的缺失展示了纤维素分解酶的产量提高
三个β-葡萄糖苷酶基因和Δcre-1缺失菌株与cre-1缺失菌株在看来比野生型组成性地分泌更多的酶上时相似的，并且对于这两种菌株，在蔗糖和
诱导的情况下，蛋白凝胶上所见的图谱看起来非常相似（图11）。Δcre-1和三个β-葡萄糖苷酶基因/cre-1缺失菌株之间主要的区别是纤维二糖在分泌蛋白的活性上的影响（图8）。在纤维二糖上的第4天，该突变体能产生多于11μg的CBHI当量，这甚至比在相同时间点在
上产生的CBHI当量更多（图8B）。此外，Azo-CMC活性试验表明该菌株在
或纤维二糖诱导培养物中产生相似数量的内切-1,4-β-葡聚糖酶的活性（图9）。
实施例2
以下实施例涉及粗糙脉胞菌β-葡萄糖苷酶基因NCU00130、NCU04952，和NCU08755的直系同源物的鉴定。
材料和方法
将NCU00130、NCU04952，和NCU08755氨基酸序列作为查询序列，用国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)非冗余数据库进行BLASTp搜索。在MEGA5中用ClustalW2对BLASTp搜索的序列查询结果进行比对。
用邻接法（Saitou N.和Nei M.，1987）产生系统树。用泊松校正法（Poisson correction method）(ZuckerkandlE.和Pauling L.,1965)计算进化距离，并且该进化距离以每个位点中氨基酸替换数为单位。在MEGA5(Tamura K.,Dudley J.,Nei M.,和Kumar S.,2007)中进行进化分析。
结果
图13展示了在密切相关的真菌中，NCU00130、NCU04952，和NCU08755直系同源物的ClustalW氨基酸序列的比对结果。
图14描述了β-葡萄糖苷酶NCU00130的系统树。
图15描述了β-葡萄糖苷酶NCU04952的系统树。
图16描述了β-葡萄糖苷酶NCU08755的系统树。
实施例3
以下实施例涉及从三个β-葡萄糖苷酶基因缺失的粗糙脉胞菌菌株和三个β-葡萄糖苷酶和cre-1缺失的粗糙脉胞菌菌株中以更高水平分泌的蛋白的鉴定和特征。
材料和方法
菌株
从真菌遗传库存中心(Fungal Genetics Stock Center，FGSC)获得的菌株包括野生型(WT)(FGSC2489)、及胞内β-葡萄糖苷酶NCU00130(FGSC11822和FGSC11823)，和胞外β-葡萄糖苷酶：NCU08755(FGSC18387和FGSC18388)和NCU04952(FGSC13731和FGSC13732)的缺失菌株。在(44)中描述了同核体cre-1缺失菌株(NCU08807)。通过进行序列杂交制备多重缺失菌株。用基因特异性引物和潮霉素(hph)盒的普通引物确定每种多重缺失菌株的基因型。所用的hph正向引物为来自实施例1的SEQ ID NO:4。用于NCU00130、NCU004953、NCU08755，和NCU08807的反向引物与实施例1中所用的那些相同。具体地，用于NCU00130的反向引物为SEQ ID NO:5，用于NCU004953的反向引物为SEQ ID NO:6，用于NCU08755的反向引物为SEQ ID NO:7，而用于NCU08807的反向引物为SEQ ID NO:8。
转录研究
在含有50ml Vogel’s盐(45)和2%(wt/vol)蔗糖的250ml爱伦美氏烧瓶中，当OD595等于0.05时接种来自菌株的分生孢子，并使分生孢子在持续光照，200rpm的情况下，生长16小时。使生物质在4200rpm旋转10分钟并用Vogel’s盐中洗涤两次以移除任何多余的蔗糖。接着，将该生物质加到新烧瓶中，该新烧瓶含有添加了1%(wt/vol)蔗糖、0.2%w/v纤维二糖(Sigma)，或1%w/v
PH101(Sigma)的50ml Vogel’s盐。在持续光照，200rpm的情况下，诱导培养物4小时。接着通过Whatman玻璃微纤维过滤器(GF/F)过滤在布氏漏斗上收集培养物生物质并用50ml Vogel’s盐洗涤。生物质在液态氮中速冻并储存在-80℃。在每个时间点评估三个独立的生物复制品（烧瓶）。
RNA分离
根据生产商指示，用氧化锆/二氧化硅小珠(直径0.5mm；Biospec)和Mini-Beadbeater-96(Biospec)以及1mLTRIzol试剂(Invitrogen)分离来自冷冻样品的总RNA。用不含DNA的TURBO(TURBO DNA-free，Ambion)和RNeasy试剂盒(Qiagen)进一步纯化总RNA。通过Nanodrop和琼脂糖凝胶电泳检查RNA浓度和完整性。
RT-PCR
用EXPRESS One-Step SYBR GreenER试剂盒(Invitrogen)和StepOnePlus实时PCR系统(Applied Biosystems)进行定量RT-PCR。反应以10μl总反应体积，一式三份地进行，其中10μl总反应体积中包括各300nM的正向引物和反向引物以及75ng模板RNA。通过StepOne软件(Applied Biosystems)用相对定量/比较CT(ΔΔCT)设置进行数据分析。按蔗糖上表达的内源性对照肌动蛋白作为参考样品使数据标准化。
用于肌动蛋白(NCU4173)的RT-PCR引物为实施例1的SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；用于cbh-1(NCU07340)的RT-PCR引物为实施例1的SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12；用于gh6-2(NCU09680)的RT-PCR引物为实施例1的SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14；用于gh5-1(NCU00762)的RT-PCR引物为实施例1的SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16(46,47)。
mRNA测序
用Illumina试剂盒(RS-100-0801)对分离的RNA进行mRNA测序。通过Agilent生物分析仪2000（Agilentbioanalyzer2000）定量最终的cDNA文库并且利用Illumina基因分析仪II（Illumina Genome Analyzer-II）以标准的Illumina操作步骤测序。
系统进化分析
在系统进化分析中所用的B-G的GenBank登记号(PID)、联合基因组研究所蛋白质ID(Joint Genome Instituteprotein ID，JGI)，或博德研究所镰刀菌基因比较数据库(Broad Institute Fusarium Comparative DatabaseGenes，FGSG)号如下：NCU08755：嗜热毁丝霉，JGI80304；黑曲霉，PID254674400；黄孢原毛平革菌，PID19352194；里氏木霉，JGI121735；禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum），FGSG_06605；核盘菌，PID156051478；灰葡萄孢霉，PID154301968；产黄青霉，PID255942539；裂褶菌，JGI256304；褐腐菌，JGI107557。NCU00130：嗜热毁丝霉，JGI115968；黑曲霉，PID213437；黄孢原毛平革菌，PID127920；里氏木霉，JGI120749；禾谷镰刀菌，FGSG_07274；核盘菌，PID156037816；灰葡萄孢霉，PID156037816；产黄青霉，PID255941826；裂褶菌，JGI57050；褐腐菌，JGI45922。NCU04952:嗜热毁丝霉，JGI66804；土曲霉（Aspergillus terreus），PID115401928；黄孢原毛平革菌，PID3320413；里氏木霉，JGI76672；核盘菌，PID156050519；灰葡萄孢霉，PID154293970；产黄青霉，PID255945487；裂褶菌，PID302694815.用鉴定BLASTp比对中所用的所有蛋白。在MEGA5中用ClustalW比对同源蛋白。用泊松模型（Poissonmodel）确定最大似然系统发育（Maximum Likelihood phylogeny）从而用500次自引重复（bootstrapreplication）评估距离和最近邻居互换(Nearest-Neighborhood-Interchange，NNI)树搜索策略(48,49)。
差异表达分析
为了建立生物多样性，在移除培养基后，对一式三份培养物进行采样并分析在纤维素和蔗糖上4小时的WT菌株。对于所有其它菌株和条件，分析单个RNAseq文库。
将测序文库映射粗糙脉胞菌OR74A基因组（第10版）和Tophat(第1.1.4版)的预期转录(50)。通过Cufflinks(第0.9.2版)以FPKM（每百万片段映射的每千个碱基的外显子片段）(51)用上四分位数标准化法（upperquartile normalization）并映射来自博德研究所(Broad Institute)的参考异构体评估转录丰度。
分层聚类分析
通过Cuffdiff，用上四分位数标准化法和每个位点映射的最小读取数目，鉴定显示了在菌株或生长条件之间表达在统计上明显变化的基因。接着过滤这些基因并仅选择在测试的每种菌株/条件的所有生物重复样之间评估的丰度显示了2倍变化的那些基因和仅选择在至少一种菌株/条件中FPKM一直高于10的那些基因。用Cluster3.0(52)根据WT菌株在纤维素上、WT在纤维二糖上、突变菌株在纤维二糖和突变菌株在纤维素上的FPKM进行分层聚类分析。在聚类之前，将FPKM进行对数转换，在每个基因的基础上使交联的菌株/条件标准化，并使交联的菌株/条件集中在平均值。将皮尔森相关系数（未集中的）作为相似性度量并且将平均连锁法作为聚类方法。
摇瓶研究
培养物在1%蔗糖中生长24小时，接着添加2%蔗糖或0.2%纤维二糖。24小时(WT、Δ3βG，和Δ3βGΔcre)或72小时(Δ3βG)后，收集上清液。WT
培养物在2%
中生长5天，Δ3βG在1%蔗糖中生长24小时，接着在中生长48小时，而Δ3βGΔcre在1%蔗糖中生长24小时，接着在中生长24小时。
生物反应器研究
在3.7L生物反应器(BioEngineering AG)中以1L操作体积进行纤维素酶生产。该生物反应器配备48mmRushton叶轮和4个等距挡板，以进行适当的混合。叶轮速度控制为200rpm持续8小时，从而使孢子萌发，接着，在剩余的实验中，叶轮速度控制在500rpm。温度维持在25℃，用40%磷酸和1:5稀释的氢氧化铵将培养基的PH控制在5.5。通过使通气速率在0.5和3VVM之间变动，使溶解氧的水平保持比培养基的20%饱和值更大，以响应溶解氧张力。以1%w/v蔗糖作为唯一碳源（除非另有说明）的基本生长培养基接种109分生孢子。在24小时的初期生长后，用添加至终浓度为0.2%w/v的纤维二糖或
诱导纤维素酶生产。在以下时间点收集上清液样品：诱导前0、12小时，诱导时，以及诱导后4、8、12、24和36小时。使样品在4000rpm旋转5分钟以使生物质成团块，并在储存于-20℃之前经由.2μm PES过滤器过滤上清液直到收集完所有样品为止。
酶活性试验
用Bio-Rad蛋白试剂盒(Bio-Rad)测量总分泌蛋白，在标准的4-14%Tris-HCL聚丙烯酰胺凝胶上跑15μl非浓缩上清液并用Thermo Scientific GelCode蓝色染色试剂染色，使分泌蛋白可视化。
将在50℃孵化的250mL培养基瓶在200rpm定轨摇床上进行纤维素酶活性试验。每个瓶子含有1%纤维素
和50mM(pH5.0)乙酸钠，工作体积为50ml。加入四环素(10μg/mL)以防止微生物污染。生物反应器培养物肉汤样品用10kDa MWCO离心过滤器进行缓冲液交换，从而在开始水解实验前移除任何可溶性糖。将水解混合物预孵化至50℃后，加入酶(1mL过滤的培养物肉汤)。在前12小时中，每4小时取一次样品，接着此后每12小时一次，直到总计48小时。水解实验以一式三份进行。
糖分析
在DIONEX ICS-3000HPLC(加利福尼亚州森尼韦尔的Dionex Corp.)上用CarboPac PA20分析柱(3x150mm)和CarboPac PA20保护柱(3x30mm)在30℃测量蔗糖、果糖、葡萄糖和纤维二糖。在注入25μl稀释样品之后，用100mM KOH(等度)以.4ml/min进行洗脱。用PAD检测糖，并且用Chromeleon软件包分析4种潜在的碳水化合物波形和峰。
质谱分析
利用从Fisher Scientific（宾夕法尼亚州匹兹堡）购买的乙腈（Fisher最优级，99.9%）和甲酸（Pierce，1mL安瓿，99+%）和用Milli-Q梯度超纯水净化系统（Millipore，马萨诸塞州，比尔里卡）纯化成电阻率为18.2MΩ·cm（在25℃时）的水制备用于液相色谱-质谱法的流动相溶剂。
用与超高效液相色谱仪(UPLC)串联的正交加速型四极杆飞行时间(Q-tof)质谱仪分析胰蛋白酶消化的蛋白质。用配备C18捕获柱（180μm×20mm）和分析柱（100μm×100mm）和10μL样品环的nanoAcquity UPLC（Waters，马萨诸塞州，米尔福德市）分离肽。溶剂A为99.9%水/0.1%甲酸，而溶剂B是99.9%乙腈/0.1%甲酸（V／V）。在分析前，将包含在用隔膜盖子（septa cap）(Wheaton Science,新泽西州，米尔维尔)密封的0.3mL聚丙烯扣帽瓶中的样品溶液加载到nanoAcquity自动进样器室。注射样品(10μL)之后，用100%A以15μL/min流速进行3分钟捕获。在注射后，用各500μL的溶剂A和溶剂B洗涤注射针以避免样品间的交叉污染。洗脱程序由下列组成：线性梯度在30分钟从8%变至35%B，线性梯度在0.33分钟变至95%B，等度条件95%B持续3.67分钟，线性梯度在0.33分钟变至1%B，和等度条件1%B持续11.67分钟，流速为500nL/min。分析柱和样品室分别维持在35℃和8℃。
UPLC的柱出口连接到通用纳流喷雾器纳升级电喷雾电离（Universal NanoFlow Sprayer nanoelectrosprayionization，nanoESI）发射器，该发生器安装在质谱仪（Q-tof Premier，Waters，马萨诸塞州，米尔福德）的纳流离子源中。该nanoESI发射器尖端定位在离采样锥孔大约3mm处。该nanoESI源参数如下：nanoESI电压2.4kV，雾化气体（氮气）压力0.15毫巴（mbar），样品锥孔电压35V，萃取锥孔和离子导电压4V，和源温度（source block temperature）80℃。不使用锥孔气。碰撞室含有压力为8×10-3毫巴的氩气。Tof分析仪在“V”模式下操作。在这些条件下，通常能实现1.0×104（在m/z=771测得）的质量分辨率（53），这足以解决本研究中测量的单电荷和多电荷的前体和碎片离子的同位素分布。因此，独立确定离子质量和电荷，即，从m/z谱中相邻的同位素峰之间的间距的倒数确定离子电荷。分析之前立即用甲酸钠溶液进行外部质量校准。在正离子模式下，在m/z=400-1500范围，用0.45s扫描周期（scan integration）和0.05s内扫描延迟获取测定扫描（Survey scan）。在数据依赖模式，从每个测定扫描中选择强度阈值超过20计数/秒（CPS）的多达5种前体离子用于串联质谱（MS/MS）分析。在MS/MS，利用实时去同位素和电荷状态识别选择2+，3+，和4+电荷状态的前体离子。基于给定的前体离子的质量和电荷状态自动选择碰撞活化解离（CAD）的碰撞能量。在m/z=100-2000的范围，用0.20s扫描周期（scan integration）和0.05s内扫描延迟获取MS/MS谱。使离子成碎片，从而在累积到最长为2秒的MS/MS谱中实现30,000cps最小总离子流（TIC）。为了避免产生冗余MS/MS测量值，利用实时动态排除以杜绝在300s的周期内重新选择在排除宽度±0.2m/z单位内的之前分析过的前体离子。
用ProteinLynx Global Server软件（第2.3版，Waters）处理从胰蛋白酶消化蛋白质的LC-MS/MS分析得到的数据，进行背景消除（阈值35%和第五阶多项式），理顺（Savitzky-Golay，10倍，在三个通道上），和计算质谱和MS/MS谱的形心（每个峰的上80%和在四条通道中半峰高处最小峰宽）。在粗糙脉胞菌蛋白数据库(Broad Institute,马萨诸塞州，坎布里奇)中搜索处理的数据。在数据库搜索中使用以下标准：前体离子质量公差100ppm，碎片离子质量公差0.15Da，消化试剂胰蛋白酶，允许多达三个未酶切位点（missedcleavage），并且以蛋氨酸氧化作为可变的修饰。需要从相同系列，即，b或y类碎片离子中鉴定至少3种连续的碎片离子(54)用于肽在MS/MS谱中的分配。检查MS/MS谱以核实鉴定该肽的碎片离子的存在。如果在3个生物重复样（全上清液，PASC绑定或PASC未绑定）的2个中检测至少1条肽存在，则确定存在该蛋白。
结果
在缺失三个β-葡萄糖苷酶基因的粗糙脉胞菌的纤维糊精诱导的培养物中纤维素酶转录的诱导
当野生型粗糙脉胞菌（WT）在作为唯一碳源的蔗糖、纤维二糖、纤维三糖、或纤维四糖上生长时，分解木质纤维素的基因没有受到诱导，也没检测到纤维素分解酶的活性（图17A）。应该相信，当粗糙脉胞菌在纤维糊精上生长时，由β-葡萄糖苷酶的作用产生的葡萄糖可以掩盖其诱导能力（图1）。虽然粗糙脉胞菌的基因组具有至少7种编码预测的β-葡萄糖苷酶的基因，但在
或芒草上生长期间，仅有3种（NCU00130、NCU04952和NCU08755）展示了转录明显增加(20)。所有这3种β-葡萄糖苷酶展示了与在其它丝状真菌中预测的和经试验验证的β-葡萄糖苷酶明显同源。基于表达数据，我们相信GH1-1(NCU00130)、GH3-3(NCU08755)，和GH3-4(NCU04952)会是粗糙脉胞菌在作为唯一碳源的
或纤维糊精上生长时将纤维二糖转化成葡萄糖的最相关的酶。
为了确定纤维二糖是否诱导粗糙脉胞菌中纤维素酶基因的表达。我们测试通过转化实验携带β-葡萄糖苷酶基因gh1-1、gh3-3或gh3-4缺失体的菌株是否诱导三种主要的纤维素酶基因(cbh-1，NCU07340；gh6-2，NCU09680和gh5-1，NCU00762)表达。为了消除β-葡萄糖苷酶之间可能的冗余，还构建并测试了携带不同组合的β-葡萄糖苷酶基因缺失体组的双重和三重突变株。在用0.2%纤维二糖诱导4小时后，单个β-葡萄糖苷酶缺失株(Δgh1-1、Δgh3-3或Δgh3-4)没有展示出明显诱导cbh-1、gh6-2或gh5-1表达，而Δgh1-1Δgh3-3双重缺失突变体展示了一些纤维素酶基因诱导。但是，当如WT培养物转移到
一样转移到0.2%纤维二糖中时，携带所有3种β葡萄糖苷酶基因(Δgh1-1、Δgh3-3和Δgh3-4;Δ3βG)缺失体的菌株展示了cbh-1、gh5-1和gh6-2的相关表达水平相似（图18A）。此外，当转移至纤维二糖、纤维三糖，或纤维四糖时，Δ3βG菌株展示了cbh-1、gh5-1和gh6-2的相关表达水平相似（图17B）。对于纤维二糖，Δ3βG突变体中的转录应答是特异性的并且不是由于饥饿，因为，当转移至缺乏任何碳源的培养基时，WT和Δ3βG菌株中cbh-1和gh5-1的表达仅展示了略微提高的转录水平（低于50倍诱导）。与在上的WT粗糙脉胞菌和转移至纤维二糖的Δ3βG菌株中cbh-1和gh5-1的～20,000倍（最低）的诱导相比，这些值可以忽略。
在工业物种里氏木霉中，最广泛使用的纤维素酶可溶性诱导剂是槐糖和乳糖(25)。因此，我们用WT和Δ3βG缺失菌株检测了暴露于槐糖或乳糖是否在粗糙脉孢菌中诱导纤维素酶基因的表达。观察其它丝状真菌物种（15），将WT或Δ3βG突变体转移至含有槐糖，乳糖或D-(+)-半乳糖（乳糖的降解产物）的培养基中没有明显诱导纤维素酶基因表达（图19）。
碳分解代谢物阻遏（CCR）作用于丝状真菌中，从而在存在优选碳源如葡萄糖或蔗糖，的情况下，即便存在木质纤维素，同样抑制纤维素酶和半纤维素酶基因的表达(4)。，C2H2锌指转录因子CreA/CRE1/CRE-1(26)在缺乏CreA/CRE1/CRE-1的曲霉属、里氏木霉和粗糙脉孢菌菌株的CCR中分别起着关键作用，当在纤维素或半纤维素上生长时，引起纤维素酶和半纤维素酶的量增加(21,27,28)。从粗糙脉孢菌cre-1缺失菌株(ΔNCU08807)分离的RNA的定量RT-PCR分析表明，相对于WT菌株，cbh-1和gh5-1的基础表达提高约10倍。当从蔗糖转移到0.2%纤维二糖4小时后，Δcre-1菌株展示了cbh-1、gh5-1和gh6-2的诱导增加(分别为3,000、500，和85倍)。但是在Δcre-1突变体中诱导水平明显低于暴露于
的WT或暴露于纤维二糖的Δ3βG突变体获得的诱导水平。注意，还携带Δcre-1缺失体的Δ3βG菌株(Δ3βGΔcre)显示了比转移至
的WT或转移至纤维二糖的Δ3βG菌株更强的cbh-1、gh5-1和gh6-2诱导（图18A）。这些数据表明当暴露于纤维二糖时，Δ3βG突变体诱导的纤维素酶基因的表达与纤维素诱导的是相当的，并且不是CCR减轻的结果。
三个β-葡萄糖苷酶突变体在纤维二糖上的野生型粗糙脉孢菌分解纤维素应答的扼要回顾。
用高通量测序（RNA-Seq）评估Δ3βG菌株对纤维二糖的全基因组应答是否与暴露于
的WT菌株相似或不同。基因表达的全基因组图谱的变化表明，Δ3βG突变体对纤维二糖的应答与
诱导的WT的应答密切匹配，但与WT对纤维二糖的应答或当遭受饥饿时明显不同。为了鉴定在WT粗糙脉孢菌响应
中哪些基因明显并特异性地受到诱导，在转移至
的WT的表达谱对比转移至没添加碳源的培养基的WT的表达谱之间进行成对分析。这些分析鉴定在WT培养物对
应答中明显并特异性地诱导的321种基因（包括三种缺失的β-葡萄糖苷酶基因）（纤维素调节子）。该基因组包括16种预测的纤维素酶和12种预测的半纤维素酶基因。在纤维素调节子中，另外的基因包括编码预测在碳水化合物上通过CAZy激活的蛋白的41种基因(29)和编码分泌蛋白(signalP)的111种基因(30)。在纤维素调节子的321种基因中，156种编码具有未分类蛋白(MIPS FunCat数据库)(31)的特征的蛋白。在特别感兴趣的蛋白中，在曲霉(32)和里氏木霉(33)的纤维素酶的调节中发挥重要作用的xlnR/xyr1(NCU06971)的直系同源物属于纤维素调节子。但是，虽然NCU06971在之前鉴定为粗糙脉孢菌的xlnR/xyr1同源物(34)，但其在植物细胞壁降解中的作用是未知的。
根据WT转移至不含碳源，含纤维二糖或
的培养基和Δ3βG菌株转移至含有纤维二糖或的培养基的表达数据将纤维素调节子内的基因分层聚类鉴定为四种不同的表达簇（图20A）。最大的簇（簇2）含有210种基因，WT菌株在
上，以及Δ3βG菌株在纤维二糖或在
诱导的条件下，该210种基因展示了高表达。该210种基因含有所有16种预测的纤维素酶（(NCU00762，gh5-1；NCU00836，gh61-7；NCU01050，gh61-4；NCU02240，gh61-1；NCU02344，gh61-12；NCU02916，gh61-3；NCU03328，gh61-6；NCU04854，gh7-2；NCU05057，gh7-1；NCU05121，gh45-1；NCU07190，gh6-3；NCU07340，cbh-1；NCU07760，gh61-2；NCU07898，gh61-13；NCU08760，gh61-5；NCU09680，gh6-2）以及3种鉴定为纤维素降解辅助蛋白的基因(NCU00206，cdh-1；NCU07143，lac-2；NCU09764，含有CBM1的蛋白)(20,35)。该簇也含有9种半纤维素酶基因（NCU02343，gh51-1；NCU02855，gh11-1；NCU04997，gh10-3；NCU05924，gh10-1；NCU05955，gh74-1；NCU07225，gh11-2；NCU07326，gh43-6；NCU08189，gh10-2；NCU09775，gh54-1）。在该簇剩下的182种蛋白中，预测29种通过CAZy(29)在碳水化合物上激活，并且预测76种通过signalP分泌，并且有25种基因同时属于这两类。剩下的102种基因根据其预测的功能归类(31)，结果10种基因预期参与C化合物和碳水化合物代谢，8种基因参与蛋白折叠、修饰，或转运；并且62种基因编码未分类的蛋白。
当暴露于
时WT或Δ3βG缺失菌株中的一小群36种基因（簇1）展示了高表达水平（图20A），但在纤维二糖上的Δ3βG缺失菌株中具有较低的表达水平。这组基因包含预测的β-木糖苷酶基因(NCU09652,gh43-5)和若干种编码在半纤维素上激活的蛋白(NCU00710，乙酰木聚糖酶；NCU01900，木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶；NCU00891，木糖醇脱氢酶；和NCU08384，木糖还原酶)的其它基因。这些结果表明，这些基因通过
中发现的0.5-1.0%半纤维素诱导(20)并且不是纤维二糖诱导的调节子的一部分。
在比较Δ3βG菌株在纤维二糖上对比WT在
上的诱导时，出现惊人的图谱（图20B）。
在WT中诱导的基因非常接近Δ3βG突变体中所见的值。例如，在上WT的cbh-1的FPKM为126,816±53,016，而在纤维二糖上Δ3βG的FPKM为130,865。该图谱甚至扩展到较少诱导的纤维素酶，比如NCU07760(gh61-2)，在
上WT的NCU07760(gh61-2)的FPKM为239±62，而在纤维二糖上Δ3βG突变体的NCU07760(gh61-2)的FPKM为538。相反，Δ3βG突变体在对纤维二糖应答中诱导一些半纤维素基因，但表达水平低于
诱导的WT或Δ3βG培养物中的水平。例如，虽然在用诱导的WT中，NCU05924(内切木聚糖酶,gh10-1)的FPKM为20,023±9,888，但在用纤维二糖诱导的Δ3βG突变体中观察到10,000FPKM的表达水平。这些结果表明虽然所有的纤维素酶基因在相同的调节子中，而但半纤维素酶基因划分为与纤维素酶协同调节的调节子中和完全诱导需要另外的信号的调节子。
Δ3βG突变体中植物细胞壁降解酶的转录与纤维素酶分泌和活性的关联
为了确定对纤维二糖的应答中Δ3βG和Δ3βGΔcre菌株的转录应答是否与功能蛋白的增加相符，我们评估与WT培养物相比，在应答纤维二糖或
(SI材料和方法)的诱导中Δ3βG和Δ3βGΔcre菌株的分泌蛋白和纤维素酶活性。正如所料，在
水解试验(材料和方法)中，来自在蔗糖上生长的所有培养物(Δ3βG、Δ3βGΔcre和WT)的上清液不能从微晶纤维素中产生葡萄糖或纤维二糖，而来自
诱导的所有的3种培养物(Δ3βG、Δ3βGΔcre和WT)的上清液能将微晶纤维素降解为纤维二糖和葡萄糖（图18C）。当在纤维二糖上生长时，Δ3βG和Δ3βGΔcre菌株展示了与在
上生长的WT培养物相似的分泌蛋白图谱（图18B）(20)。重要的是，来自纤维二糖诱导的Δ3βG和Δ3βGΔcre缺失菌株的上清液水解微晶纤维素，而来自在纤维二糖上生长的WT培养物的上清液不能水解微晶纤维素。缺少3个β-葡萄糖苷酶的Δ3βG和Δ3βGΔcre菌株主要产生纤维二糖。这些数据与该3个β-葡萄糖苷酶在WT培养物中提供大部分的葡萄糖生成活性的作用一致。
使工业丝状真菌在用于各种产物的高水平生产的深层培养物中生长（38）。我们检查了在受控的生物反应器进程中Δ3βG和Δ3βGΔcre缺失菌株的纤维素酶的诱导（图7A-D）。在蔗糖上生长24小时后，WT、Δ3βG和Δ3βGΔcre产生的生物质的量相似（～3.5g/L）（图7A-C）。用0.2%纤维二糖诱导后，WT分泌的蛋白的量不明显（0.05mg/mL；图7C）。相比之下，Δ3βG和Δ3βGΔcre培养物在上清液中分别产生0.12mg/mL和0.24mg/mL的蛋白质（图7A和7B）。此外，纤维二糖诱导的Δ3βG和Δ3βGΔcre培养物展示了在相同的诱导时期，内切葡聚糖酶活性的明显增加（图7F）。从24小时时间点检测的总的微晶纤维素酶活性表明，与Δ3βG菌株(0.296mg/mL)相比，Δ3βGΔcre菌株产生的葡萄糖当量多60%（0.424mg/mL）（图7E）。但是，当使蛋白的总浓度标准化时，Δ3βGΔcre菌株的比活性比WT或Δ3βG培养物上清液的更小（图21）。
分泌蛋白的蛋白质组学分析
为了比较在
上生长的WT粗糙脉孢菌对比用纤维二糖诱导的Δ3βG菌株分泌的蛋白的一致性，我们用鸟枪法蛋白质组学分析分泌蛋白质组（secretome）（表1）。在
上生长的WT培养物上清液中鉴定39种蛋白质。在纤维二糖上生长的培养物中，在Δ3βG肉汤中鉴定38种蛋白质并且在Δ3βGΔcre肉汤中鉴定24种蛋白质（图22）。使用定量质谱分析法得出：在
上的WT粗糙脉孢菌分泌蛋白质组中的76%由6种单独的蛋白质组成(35)。在WT、Δ3βG，和Δ3βGΔcre培养物肉汤中鉴定所有这些蛋白（除了缺失的β-葡萄糖苷酶，gh3-4）（表1）。除了纤维素酶，我们鉴定了若干较低丰度的辅助蛋白，该辅助蛋白组成总计6.5%的分泌蛋白质组(35)：纤维二糖脱氢酶(CDH-1)、2型内酯酶(LAC-2)，和两种假定蛋白：NCU09764—具有未知功能的含CBM1的蛋白质，和NCU05137—缺失会导致纤维素酶活性增加的基因(20)。这些数据表明，与Δ3βG突变体对纤维二糖的转录应答相似，在纤维二糖上Δ3βG菌株分泌的蛋白的一致性和分泌的蛋白的量模仿WT粗糙脉孢菌对
的应答。
表1
在表1中，GH指的是糖苷水解酶，而N/A指的是基因敲除。对于分泌蛋白质组百分比，通过AQUA质谱分析法鉴定
诱导的分泌蛋白质组(35)。该13种蛋白代表91%的总分泌蛋白质组并且所有其它蛋白质代表低于1%的分泌蛋白质组。
实施例4
以下实施例涉及含有粗糙脉胞菌基因NCU00890和粗糙脉胞菌基因NCU06650的缺失体的粗糙脉胞菌菌株中纤维素酶的活性的特征。
材料和方法
根据实施例1中所述的方法产生粗糙脉胞菌的三个β-葡萄糖苷酶基因缺失菌株以及粗糙脉胞菌的三个β-葡萄糖苷酶基因缺失和cre-1基因缺失菌株。
从真菌遗传库存中心(Fungal Genetics Stock Center，FGSC)获得NCU06650(FGSC11246和11247)和NCU00890(FGSC16749)缺失菌株。通过进行序列杂交产生多重缺失菌株。用基因特异性引物和潮霉素(hph)盒普通引物确定每种多重缺失菌株的基因型。用于hph的正向引物为：
hph Middle FWD:5’-CGA CAG ACG TCG CGG TGA GTT CAG-3’ [SEQ ID NO:4]
反向引物为：
NCU06650: 5’-CAT CTC ATA CTC CCT CAT CC-3’ [SEQ ID NO:23]
NCU00890: 5’-GGT TGT CTC GGT CGA CAT TG-3’ [SEQ ID NO:24]
用4-甲基伞形酮基-β-D-纤维二糖糖苷(MuLac)试验测量外切葡聚糖酶(纤维二糖水解酶I)的活性。该试验主要测量CBH-1的活性，并且活性表达为荧光随时间的变化，该变化作为酶活性指示导致最佳拟合线倾斜。该试验以100μl总体积进行，该100μl总体积含有20μg总培养物上清液并且MuLac的终浓度为1.0mM，
乙酸钠pH5的终浓度为50mM。该试验根据以下进行：将Beckman Coulter Paradigm酶标仪设置成40℃，激发/发射波长为360/465nm，并且10分钟内每30秒读取一次。最佳拟合线的斜率代表各种培养物上清液的MuLac活性。
结果
鉴于NCU00890和NCU06650缺失体都被描述为高分泌者（hypersecretor），我们想调查使这些缺失体与三个β-葡萄糖苷酶和cre-1缺失菌株结合是否会提高纤维素酶的分泌。NCU00890基因编码β-甘露糖苷酶。NCU06650基因编码具有与磷脂酶最密切同源的特征的多肽。
如图23所示，当NCU00890或NCU06650缺失体与三个β-葡萄糖苷酶缺失菌株结合时，我们看到在用纤维二糖诱导24小时后，纤维二糖水解酶I的活性适度增加。此外，通过另外包括cre-1缺失体，六重突变体（含有三个β-葡萄糖苷酶缺失体及NCU00890和NCU06650缺失体）在用纤维二糖诱导24小时后，具有更高的纤维二糖水解酶I的活性。
在里氏木霉中鉴定β-甘露糖苷酶基因NCU00890的同源物。该里氏木霉同源物在支架（Scaffold）10,258215-260779，蛋白质ID62166并在支架4,877954-880802，蛋白质ID57857上发现。
此外，在里氏木霉中鉴定基因NCU06650的同源物。该同源物在支架22，490155-490769，蛋白质ID67579上发现。
利用能源部联合基因组研究所(DOE Joint Genome Institute)里氏木霉数据库对NCU00890或NCU06650进行BLASTp搜索鉴定里氏木霉同源物。
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Claims (140)
1.一种增加来自细胞的蛋白质的分泌的方法，所述方法包括：
（a）提供突变细胞，其中所述突变细胞包括两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因中的失活性突变；以及
（b）将所述突变细胞与纤维素类生物质接触，其中所述纤维素类生物质诱导所述突变细胞分泌所述蛋白质。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述突变细胞进一步包括位于该细胞的cre-1基因中的失活性突变。
3.一种增加来自细胞的蛋白质的分泌的方法，所述方法包括：
（a）提供突变细胞，其中所述突变细胞包括位于该细胞的cre-1基因中的失活性突变；以及
（b）将所述突变细胞与纤维素类生物质接触，其中所述纤维素类生物质诱导所述突变细胞分泌所述蛋白质。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述突变细胞进一步包括位于两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因中的失活性突变。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其特征在于，所述纤维素类生物质包括多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖，和纤维六糖中的一种或多种。
6.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其特征在于，所述纤维素类生物质包括纤维二糖。
7.一种增加来自细胞的蛋白质的分泌的方法，所述方法包括：
（a）提供突变细胞，其中所述突变细胞包括两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因中的失活性突变；以及
（b）将所述突变细胞与糖类接触，其中所述糖类诱导所述突变细胞分泌所述蛋白质。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述突变细胞进一步包括位于所述细胞的cre-1基因中的失活性突变。
9.一种增加来自细胞的蛋白质的分泌的方法，所述方法包括：
（a）提供突变细胞，其中所述突变细胞包括位于该细胞的cre-1基因中的失活性突变；以及（b）将所述突变细胞与糖类接触，其中所述糖类诱导所述突变细胞分泌所述蛋白质。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述突变细胞进一步包括位于两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因中的失活性突变。
11.根据权利要求7-10中任意一项所述的方法，其特征在于，所述糖类选自多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖，和纤维六糖。
12.根据权利要求7-10中任意一项所述的方法，其特征在于，所述糖类为纤维二糖。
13.根据权利要求1-12中任意一项所述的方法，其特征在于，所述分泌蛋白为纤维素诱导蛋白。
14.根据权利要求1-13中任意一项所述的方法，其特征在于，所述分泌蛋白选自：纤维素酶、GH61酶、纤维二糖脱氢酶、内酯酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶，含有纤维素结合结构域的蛋白质，及其组合。
15.根据权利要求1-13中任意一项所述的方法，其特征在于，所述分泌蛋白为纤维素酶。
16.根据权利要求1-13中任意一项所述的方法，其特征在于，所述分泌蛋白由选自以下的基因编码：NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764，和NCU05137。
17.根据权利要求1-16中任意一项所述的方法，其特征在于，所述突变细胞进一步包括位于该细胞的至少一种β-甘露糖苷酶基因中的失活性突变。
18.根据权利要求1-17中任意一项所述的方法，其特征在于，所述突变细胞进一步包括位于该细胞的至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因中的失活性突变。
19.根据权利要求1-18中任意一项所述的方法，其特征在于，所述失活性突变为缺失。
20.根据权利要求1-19中任意一项所述的方法，其特征在于，所述细胞为重组细胞。
21.根据权利要求1-20中任意一项所述的方法，其特征在于，所述细胞为真菌或酵母细胞。
22.根据权利要求1-21中任意一项所述的方法，其特征在于，所述细胞为子囊菌和担子菌物种的丝状真菌。
23.根据权利要求1-22中任意一项所述的方法，其特征在于，所述细胞选自粗糙脉孢菌（N.crassa）细胞、构巢曲霉细胞、里氏木霉细胞、黄孢原毛平革菌细胞、嗜热侧孢霉（嗜热毁丝霉）细胞、玉米赤霉细胞、核盘菌细胞、灰葡萄孢霉细胞、黑曲霉细胞、产黄青霉细胞、裂褶菌细胞、褐腐菌细胞、米曲霉细胞和解纤维顶孢霉细胞。
24.根据权利要求1-23中任意一项所述的方法，其特征在于，所述两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为三种或更多种β-葡萄糖苷酶基因。
25.根据权利要求1-23中任意一项所述的方法，其特征在于，所述两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为四种或更多种β-葡萄糖苷酶基因。
26.根据权利要求1-23中任意一项所述的方法，其特征在于，所述两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为五种或更多种β-葡萄糖苷酶基因。
27.根据权利要求1-23中任意一项所述的方法，其特征在于，所述两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为六种或更多种β-葡萄糖苷酶基因。
28.根据权利要求1-23中任意一项所述的方法，其特征在于，所述两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为七种或更多种β-葡萄糖苷酶基因。
29.根据权利要求24-28中任意一项所述的方法，其特征在于，所述三种或更多种β-葡萄糖苷酶基因、四种或更多种β-葡萄糖苷酶基因、五种或更多种β-葡萄糖苷酶基因、六种或更多种β-葡萄糖苷酶基因，或七种或更多种β-葡萄糖苷酶基因包括NCU00130、NCU04952，和NCU08755。
30.根据权利要求1-29中任意一项所述的方法，其特征在于，至少一种β-葡萄糖苷酶基因编码胞内β-葡萄糖苷酶。
31.根据权利要求1-29中任意一项所述的方法，其特征在于，至少一种β-葡萄糖苷酶基因编码胞外β-葡萄糖苷酶。
32.根据权利要求1-31中任意一项所述的方法，其特征在于，所述至少一种β-甘露糖苷酶基因为NCU00890。
33.根据权利要求1-32中任意一项所述的方法，其特征在于，所述至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因为NCU06650。
34.一种增加来自细胞的蛋白质的分泌的方法，所述方法包括：
（a）提供重组细胞，其中与相应非重组细胞中至少两种β-葡萄糖苷酶基因的表达相比，所述重组细胞中所述至少两种β-葡萄糖苷酶基因的表达显示出下降；以及
（b）将所述重组细胞与纤维素类生物质接触，所述纤维素类生物质诱导所述重组细胞分泌所述蛋白质。
35.根据权利要求34所述的方法，其特征在于，与相应非重组细胞中的cre-1基因的表达相比，所述重组细胞进一步显示出cre-1基因的表达下降。
36.一种增加来自细胞的蛋白质的分泌的方法，所述方法包括：
（a）提供重组细胞，其中与相应非重组细胞中cre-1基因的表达相比，所述重组细胞显示出cre-1基因的表达下降；以及
（b）将所述重组细胞与纤维素类生物质接触，其中所述纤维素类生物质诱导所述重组细胞分泌所述蛋白质。
37.根据权利要求36所述的方法，其特征在于，与相应非重组细胞中至少两种β-葡萄糖苷酶基因的表达相比，所述重组细胞进一步显示出所述至少两种β-葡萄糖苷酶基因的表达下降。
38.根据权利要求34-371中任意一项所述的方法，其特征在于，所述纤维素类生物质包括多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖，和纤维六糖中的一种或更多种。
39.根据权利要求34-37中任意一项所述的方法，其特征在于，所述纤维素类生物质包括纤维二糖。
40.一种增加来自细胞的蛋白质的分泌的方法，所述方法包括：
（a）提供重组细胞，其中与相应非重组细胞中的至少两种β-葡萄糖苷酶基因的表达相比，所述重组细胞显示出所述至少两种β-葡萄糖苷酶基因的表达下降；以及
（b）将所述重组细胞与糖类接触，其中所述糖类诱导所述重组细胞分泌所述蛋白质。
41.根据权利要求40所述的方法，其特征在于，与相应非重组细胞中的cre-1基因的表达相比，所述重组细胞进一步显示出cre-1基因的表达下降。
42.一种增加来自细胞的蛋白质的分泌的方法，所述方法包括：
（a）提供重组细胞，其中与相应非重组细胞中cre-1基因的表达相比，所述重组细胞显示出cre-1基因的表达下降；以及
（b）将所述重组细胞与糖类接触，其中所述糖类诱导突变细胞分泌所述蛋白质。
43.根据权利要求42所述的方法，其特征在于，与相应非重组细胞中至少两种β-葡萄糖苷酶基因的表达相比，所述重组细胞进一步显示出所述至少两种β-葡萄糖苷酶基因的表达下降。
44.根据权利要求40-43中任意一项所述的方法，其特征在于，所述糖类选自多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖，和纤维六糖。
45.根据权利要求40-43中任意一项所述的方法，其特征在于，所述糖类为纤维二糖。
46.根据权利要求34-45中任意一项所述的方法，其特征在于，分泌的蛋白质为纤维素诱导蛋白。
47.根据权利要求34-46中任意一项所述的方法，其特征在于，所述分泌蛋白选自：纤维素酶、GH61酶、纤维二糖脱氢酶、内酯酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶，含有纤维素结合结构域的蛋白质，及其组合。
48.根据权利要求34-46中任意一项所述的方法，其特征在于，分泌的蛋白质为纤维素酶。
49.根据权利要求34-46中任意一项所述的方法，其特征在于，分泌的蛋白质由选自以下的基因编码：NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764，和NCU05137。
50.根据权利要求34-49中任意一项所述的方法，其特征在于，creA/cre-1的功能通过使显性失活突变或蛋白抑制剂过表达而降低。
51.根据权利要求34-50中任意一项所述的方法，其特征在于，与相应非重组细胞中至少一种β-甘露糖苷酶基因的表达相比，所述重组细胞进一步显示出所述至少一种β-甘露糖苷酶基因的表达下降。
52.根据权利要求34-51中任意一项所述的方法，其特征在于，与相应非重组细胞中磷脂酶基因或磷脂酶类基因的表达相比，所述重组细胞进一步显示出所述磷脂酶基因或磷脂酶类基因的表达下降。
53.根据权利要求34-52中任意一项所述的方法，其特征在于，通过siRNA、反义DNA、抑制，或减数分裂沉默降低基因表达。
54.根据权利要求34-53中任意一项所述的方法，其特征在于，所述两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为三种或更多种β-葡萄糖苷酶基因。
55.根据权利要求34-53中任意一项所述的方法，其特征在于，所述两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为四种或更多种β-葡萄糖苷酶基因。
56.根据权利要求34-53中任意一项所述的方法，其特征在于，所述两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为五种或更多种β-葡萄糖苷酶基因。
57.根据权利要求34-53中任意一项所述的方法，其特征在于，所述两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为六种或更多种β-葡萄糖苷酶基因。
58.根据权利要求34-53中任意一项所述的方法，其特征在于，所述两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为七种或更多种β-葡萄糖苷酶基因。
59.根据权利要求54-58中任意一项所述的方法，其特征在于，所述三种或更多种β-葡萄糖苷酶基因、四种或更多种β-葡萄糖苷酶基因、五种或更多种β-葡萄糖苷酶基因、六种或更多种β-葡萄糖苷酶基因，或七种或更多种β-葡萄糖苷酶基因包括NCU00130、NCU04952，和NCU08755。
60.根据权利要求34-59中任意一项所述的方法，其特征在于，至少一种β-葡萄糖苷酶基因编码胞内β-葡萄糖苷酶。
61.根据权利要求34-59中任意一项所述的方法，其特征在于，至少一种β-葡萄糖苷酶基因编码胞外β-葡萄糖苷酶。
62.根据权利要求34-61中任意一项所述的方法，其特征在于，所述至少一种β-甘露糖苷酶基因为NCU00890。
63.根据权利要求34-62中任意一项所述的方法，其特征在于，所述至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因为NCU06650。
64.根据权利要求34-63中任意一项所述的方法，其特征在于，所述细胞为稳定细胞系或瞬时转染的细胞。
65.根据权利要求34-64中任意一项所述的方法，其特征在于，所述细胞为真菌或酵母细胞。
66.根据权利要求34-65中任意一项所述的方法，其特征在于，所述细胞为子囊菌和担子菌物种的丝状真菌。
67.根据权利要求34-66中任意一项所述的方法，其特征在于，所述细胞选自粗糙脉孢菌（N.crassa）细胞、构巢曲霉细胞、里氏木霉细胞、黄孢原毛平革菌细胞、嗜热侧孢霉（嗜热毁丝霉）细胞、玉米赤霉细胞、核盘菌细胞、灰葡萄孢霉细胞、黑曲霉细胞、产黄青霉细胞、裂褶菌细胞、褐腐菌细胞、米曲霉细胞和解纤维顶孢霉细胞。
68.一种突变细胞，所述突变细胞包括位于两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因中的失活性突变，其中，与在所述两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因中缺乏所述突变的相应细胞相比，纤维素类生物质能够诱导所述突变细胞分泌更高水平的蛋白质。
69.根据权利要求68所述的突变细胞，其特征在于，在所述突变细胞的cre-1基因中进一步包括失活性突变，其中与在cre-1基因中缺乏所述突变的相应细胞相比，纤维素类生物质能够诱导所述突变细胞分泌更高水平的蛋白质。
70.根据权利要求68或权利要求69所述的突变细胞，其特征在于，在所述突变细胞的至少一种β-甘露糖苷酶基因中进一步包括失活性突变，其中与在至少一种β-甘露糖苷酶基因中缺乏所述突变的相应细胞相比，纤维素类生物质能够诱导所述突变细胞分泌更高水平的蛋白质。
71.根据权利要求68-70中任意一项所述的突变细胞，其特征在于，在所述突变细胞的至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因中进一步包括失活性突变，其中与在所述至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因中缺乏所述突变的相应细胞相比，纤维素类生物质能够诱导所述细胞分泌更高水平的蛋白质。
72.根据权利要求68-71中任意一项所述的突变细胞，其特征在于，所述纤维素类生物质包括多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖，和纤维六糖中的一种或更多种。
73.根据权利要求68-71中任意一项所述的突变细胞，其特征在于，所述纤维素类生物质包括纤维二糖。
74.一种突变细胞，在该突变细胞的两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因中包括失活性突变，其中与在所述两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因中缺乏所述突变的相应细胞相比，糖类能够诱导所述突变细胞分泌更高水平的蛋白质。
75.根据权利要求74所述的突变细胞，其特征在于，在所述突变细胞的cre-1基因中进一步含有失活性突变，其中与在所述cre-1基因中缺乏所述突变的相应细胞相比，糖类能够诱导所述突变细胞分泌更高水平的蛋白质。
76.根据权利要求74或权利要求75所述的突变细胞，其特征在于，在所述突变细胞的至少一种β-甘露糖苷酶基因中进一步包括失活性突变，其中与在所述至少一种β-甘露糖苷酶基因中缺乏所述突变的相应细胞相比，糖类能够诱导所述突变细胞分泌更高水平的蛋白质。
77.根据权利要求74-76中任何一项所述的突变细胞，其特征在于，在所述突变细胞的至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因中进一步包括失活性突变，其中与在所述至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因中缺乏所述突变的相应细胞相比，糖类能够诱导所述突变细胞分泌更高水平的蛋白质。
78.根据权利要求74-77中任何一项所述的突变细胞，其特征在于，所述糖类选自多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖，和纤维六糖。
79.根据权利要求74-77中任何一项所述的突变细胞，其特征在于，所述糖类为纤维二糖。
80.根据权利要求68-79中任何一项所述的突变细胞，其特征在于，分泌的蛋白质为纤维素诱导蛋白。
81.根据权利要求68-80中任何一项所述的突变细胞，其特征在于，分泌的蛋白质选自：纤维素酶、GH61酶、纤维二糖脱氢酶、内酯酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶，含有纤维素结合结构域的蛋白质，及其组合。
82.根据权利要求68-80中任何一项所述的突变细胞，其特征在于，分泌的蛋白质为纤维素酶。
83.根据权利要求68-80中任何一项所述的突变细胞，其特征在于，分泌的蛋白质由选自以下的基因编码：NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764，和NCU05137。
84.根据权利要求68-83中任何一项所述的突变细胞，其特征在于，所述失活性突变为缺失。
85.根据权利要求68-84中任何一项所述的突变细胞，其特征在于，所述细胞为重组细胞。
86.根据权利要求68-85中任何一项所述的突变细胞，其特征在于，所述细胞为真菌或酵母细胞。
87.根据权利要求68-86中任何一项所述的突变细胞，其特征在于，所述细胞为子囊菌和担子菌物种的丝状真菌。
88.根据权利要求68-87中任何一项所述的突变细胞，其特征在于，所述细胞选自粗糙脉孢菌（N.crassa）细胞、构巢曲霉细胞、里氏木霉细胞、黄孢原毛平革菌细胞、嗜热侧孢霉（嗜热毁丝霉）细胞、玉米赤霉细胞、核盘菌细胞、灰葡萄孢霉细胞、黑曲霉细胞、产黄青霉细胞、裂褶菌细胞、褐腐菌细胞、米曲霉细胞和解纤维顶孢霉细胞。
89.根据权利要求68-88中任何一项所述的突变细胞，其特征在于，所述两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为三种或更多种β-葡萄糖苷酶基因。
90.根据权利要求68-88中任何一项所述的突变细胞，其特征在于，所述两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为四种或更多种β-葡萄糖苷酶基因。
91.根据权利要求68-88中任何一项所述的突变细胞，其特征在于，所述两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为五种或更多种β-葡萄糖苷酶基因。
92.根据权利要求68-88中任何一项所述的突变细胞，其特征在于，所述两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为六种或更多种β-葡萄糖苷酶基因。
93.根据权利要求68-88中任何一项所述的突变细胞，其特征在于，所述两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为七种或更多种β-葡萄糖苷酶基因。
94.根据权利要求89-93中任何一项所述的突变细胞，其特征在于，所述三种或更多种β-葡萄糖苷酶基因、四种或更多种β-葡萄糖苷酶基因、五种或更多种β-葡萄糖苷酶基因、六种或更多种β-葡萄糖苷酶基因，或七种或更多种β-葡萄糖苷酶基因包括NCU00130、NCU04952，和NCU08755。
95.根据权利要求68-94中任何一项所述的突变细胞，其特征在于，至少一种β-葡萄糖苷酶基因编码胞内β-葡萄糖苷酶。
96.根据权利要求68-94中任何一项所述的突变细胞，其特征在于，至少一种β-葡萄糖苷酶基因编码胞外β-葡萄糖苷酶。
97.根据权利要求68-96中任何一项所述的突变细胞，其特征在于，所述至少一种β-甘露糖苷酶基因为NCU00890。
98.根据权利要求68-97中任何一项所述的突变细胞，其特征在于，所述至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因为NCU06650。
99.一种重组细胞，与相应非重组细胞中至少两种β-葡萄糖苷酶基因的表达相比，所述重组细胞显示出所述至少两种β-葡萄糖苷酶基因的表达下降，其中通过siRNA、反义DNA、抑制或减数分裂沉默来降低所述表达，并且与所述至少两种β-葡萄糖苷酶基因表达不下降的相应非重组细胞相比，纤维素类生物质能够诱导所述重组细胞分泌更高水平的蛋白质。
100.根据权利要求99中所述的重组细胞，其特征在于，与相应非重组细胞中cre-1基因的表达相比，所述重组细胞进一步显示出cre-1基因的表达下降，其中通过siRNA、反义DNA、抑制或减数分裂沉默来降低所述表达，并且与所述cre-1基因表达不下降的相应非重组细胞相比，纤维素类生物质能够诱导所述重组细胞分泌更高水平的蛋白质。
101.根据权利要求100中所述的重组细胞，其特征在于，creA/cre-1的功能通过显性失活突变或蛋白抑制剂的过表达而降低，其中与显性失活突变没有过表达的相应细胞相比，纤维素类生物质能够诱导所述重组细胞分泌更高水平的蛋白质。
102.根据权利要求99-101中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，与相应非重组细胞中至少一种β-甘露糖苷酶基因的表达相比，所述重组细胞显示出所述至少一种β-甘露糖苷酶基因的表达下降，其中通过siRNA、反义DNA、抑制或减数分裂沉默来降低所述表达，并且与所述至少一种β-甘露糖苷酶基因表达不下降的相应非重组细胞相比，纤维素类生物质能够诱导所述重组细胞分泌更高水平的蛋白质。
103.根据权利要求99-102中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，与相应非重组细胞中至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因的表达相比，所述重组细胞进一步显示出所述至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因的表达下降，其中通过siRNA、反义DNA、抑制或减数分裂沉默来降低所述表达，并且与所述至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因表达不下降的非重组细胞相比，纤维素类生物质能够诱导所述重组细胞分泌更高水平的蛋白质。
104.根据权利要求99-103中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，所述纤维素类生物质包括多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖，和纤维六糖中的一种或更多种。
105.根据权利要求99-103中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，所述纤维素类生物质包括纤维二糖。
106.一种重组细胞，与相应非重组细胞中至少两种β-葡萄糖苷酶基因的表达相比，所述重组细胞显示出所述至少两种β-葡萄糖苷酶基因的表达下降，其中通过siRNA、反义DNA、抑制或减数分裂沉默来降低所述表达，并且与所述至少两种β-葡萄糖苷酶基因表达不下降的相应非重组细胞相比，糖类能够诱导所述重组细胞分泌更高水平的蛋白质。
107.根据权利要求106所述的重组细胞，其特征在于，与相应非重组细胞中cre-1基因的表达相比，所述重组细胞显示出cre-1基因的表达下降，其中通过siRNA、反义DNA、抑制或减数分裂沉默来降低所述表达，并且与所述cre-1基因表达不下降的相应非重组细胞相比，糖类能够诱导所述重组细胞分泌更高水平的蛋白质。
108.根据权利要求107所述的重组细胞，其特征在于，creA/cre-1的功能通过显性失活突变或蛋白抑制剂的过表达而降低，其中与显性失活突变没有过表达的相应细胞相比，糖类能够诱导所述重组细胞分泌更高水平的蛋白质。
109.根据权利要求106-108中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，与相应非重组细胞中至少一种β-甘露糖苷酶基因的表达相比，所述重组细胞显示出所述至少一种β-甘露糖苷酶基因的表达下降，其中通过siRNA、反义DNA、抑制或减数分裂沉默来降低所述表达，并且与所述至少一种β-甘露糖苷酶基因表达不下降的相应非重组细胞相比，糖类能够诱导所述重组细胞分泌更高水平的蛋白质。
110.根据权利要求106-109中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，与相应非重组细胞中至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因的表达相比，所述重组细胞进一步显示出所述至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因的表达下降，其中通过siRNA、反义DNA、抑制或减数分裂沉默来降低所述表达，并且与所述至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因表达不下降的非重组细胞相比，糖类能够诱导所述重组细胞分泌更高水平的蛋白质。
111.根据权利要求106-110中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，所述糖类选自多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖，和纤维六糖。
112.根据权利要求106-110中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，所述糖类为纤维二糖。
113.根据权利要求99-112中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，分泌的蛋白质为纤维素诱导蛋白。
114.根据权利要求99-113中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，分泌的蛋白质选自：纤维素酶、GH61酶、纤维二糖脱氢酶、内酯酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶，含有纤维素结合结构域的蛋白质，及其组合。
115.根据权利要求99-113中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，分泌的蛋白质为纤维素酶。
116.根据权利要求99-113中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，分泌的蛋白质由选自以下的基因编码：NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764，和NCU05137。
117.根据权利要求99-116中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，所述两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为三种或更多种β-葡萄糖苷酶基因。
118.根据权利要求99-116中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，所述两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为四种或更多种β-葡萄糖苷酶基因。
119.根据权利要求99-116中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，所述两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为五种或更多种β-葡萄糖苷酶基因。
120.根据权利要求99-116中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，所述两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为六种或更多种β-葡萄糖苷酶基因。
121.根据权利要求99-116中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，所述两种或更多种β-葡萄糖苷酶基因为七种或更多种β-葡萄糖苷酶基因。
122.根据权利要求117-121中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，所述三种或更多种β-葡萄糖苷酶基因、四种或更多种β-葡萄糖苷酶基因、五种或更多种β-葡萄糖苷酶基因、六种或更多种β-葡萄糖苷酶基因，或七种或更多种β-葡萄糖苷酶基因包括NCU00130、NCU04952，和NCU08755。
123.根据权利要求99-122中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，至少一种β-葡萄糖苷酶基因编码胞内β-葡萄糖苷酶。
124.根据权利要求99-122中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，至少一种β-葡萄糖苷酶基因编码胞外β-葡萄糖苷酶。
125.根据权利要求99-124中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，所述至少一种β-甘露糖苷酶基因为NCU00890。
126.根据权利要求99-125中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，所述至少一种磷脂酶基因或磷脂酶类基因为NCU06650。
127.根据权利要求99-126中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，所述细胞为稳定细胞系或瞬时转染的细胞。
128.根据权利要求99-127中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，所述细胞为真菌或酵母细胞。
129.根据权利要求99-128中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，所述细胞为子囊菌和担子菌物种的丝状真菌。
130.根据权利要求99-129中任何一项所述的重组细胞，其特征在于，所述细胞选自粗糙脉孢菌（N.crassa）细胞、构巢曲霉细胞、里氏木霉细胞、黄孢原毛平革菌细胞、嗜热侧孢霉（嗜热毁丝霉）细胞、玉米赤霉细胞、核盘菌细胞、灰葡萄孢霉细胞、黑曲霉细胞、产黄青霉细胞、裂褶菌细胞、褐腐菌细胞、米曲霉细胞和解纤维顶孢霉细胞。
131.一种降解生物质的方法，所述方法包括：
(a)提供木质纤维素类生物质；
(b)提供权利要求68-130中任何一项所述的细胞，或提供在cre-1基因中含有失活性突变的细胞；
(c)通过用纤维素类生物质接触所述细胞，诱导所述细胞分泌蛋白质；以及
(d)用木质纤维素类生物质接触经过诱导的细胞，其中，分泌的蛋白质降解所述木质纤维素类生物质。
132.根据权利要求131所述的方法，其特征在于，所述纤维素类生物质包括多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖，和纤维六糖中的一种或更多种。
133.根据权利要求131所述的方法，其特征在于，所述纤维素类生物质包括纤维二糖。
134.一种降解生物质的方法，所述方法包括：
(a)提供木质纤维素类生物质；
(b)提供权利要求68-130中任何一项所述的细胞，或提供在cre-1基因中含有失活性突变的细胞；
(c)用糖类接触所述细胞诱导所述细胞分泌蛋白质；以及
(d)用木质纤维素类生物质接触经过诱导的细胞，其中，分泌的蛋白质降解所述木质纤维素类生物质。
135.根据权利要求134所述的方法，其特征在于，所述糖类选自多糖，低聚糖，纤维素，微晶纤维素，纤维糊精，纤维二糖，纤维三糖，纤维四糖，纤维五糖，和纤维六糖。
136.根据权利要求134所述的方法，其特征在于，所述糖类为纤维二糖。
137.根据权利要求131-136中任何一项所述的方法，其特征在于，分泌的蛋白质为纤维素诱导蛋白。
138.根据权利要求131-137中任何一项所述的方法，其特征在于，分泌的蛋白质选自：纤维素酶、GH61酶、纤维二糖脱氢酶、内酯酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶，含有纤维素结合结构域的蛋白质，及其组合。
139.根据权利要求131-137中任何一项所述的方法，其特征在于，分泌的蛋白质为纤维素酶。
140.根据权利要求131-137中任何一项所述的方法，其特征在于，分泌的蛋白质由选自以下的基因编码：NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764，和NCU05137。
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