JP2014508534A - タンパク質分泌およびリグノセルロース分解のための変異体細胞 - Google Patents
タンパク質分泌およびリグノセルロース分解のための変異体細胞 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2014508534A JP2014508534A JP2013558188A JP2013558188A JP2014508534A JP 2014508534 A JP2014508534 A JP 2014508534A JP 2013558188 A JP2013558188 A JP 2013558188A JP 2013558188 A JP2013558188 A JP 2013558188A JP 2014508534 A JP2014508534 A JP 2014508534A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cell
- cells
- gene
- protein
- recombinant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01021—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2445—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/02—Monosaccharides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/99—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with other acceptors (1.1.99)
- C12Y101/99018—Cellobiose oxidase (1.1.99.18)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Mycology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本発明は、タンパク質の分泌のため、およびリグノセルロース系バイオマスの分解のための細胞を提供する。これらの細胞を使用する方法もまた提供される。詳細には、真菌細胞および酵母細胞におけるタンパク質分泌のための、β−グルコシダーゼおよび異化分解産物レプレッサー遺伝子creA/cre−1の遺伝的欠失の組合せ利用が開示される。
Description
〔関連出願との相互関係〕
本願は、米国特許仮出願番号61/453,086(2011年3月15日出願)の利益を主張する。上記仮出願は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
本願は、米国特許仮出願番号61/453,086(2011年3月15日出願)の利益を主張する。上記仮出願は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
〔ASCIIテキストファイルに関する配列表の寄託〕
ASCIIテキストファイルに関する下記の寄託:配列表のコンピュータで読み込み可能な形式(CRF)(ファイル名:677792001640SEQLIST.txt、記録日:2012年3月14日、サイズ:22KB)の内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
ASCIIテキストファイルに関する下記の寄託:配列表のコンピュータで読み込み可能な形式(CRF)(ファイル名:677792001640SEQLIST.txt、記録日:2012年3月14日、サイズ:22KB)の内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
〔技術分野〕
本開示は、タンパク質(例えば、セルラーゼ)を増加させるため、およびリグノセルロース系バイオマスを分解するための変異体細胞に関する。本発明は特に、タンパク質(例えば、セルラーゼ)を増加させるための、変異体細胞および方法を提供する。
本開示は、タンパク質(例えば、セルラーゼ)を増加させるため、およびリグノセルロース系バイオマスを分解するための変異体細胞に関する。本発明は特に、タンパク質(例えば、セルラーゼ)を増加させるための、変異体細胞および方法を提供する。
〔背景技術〕
リグノセルロース系バイオマスは、バイオ燃料を製造するための、再生可能で豊富な原材料である。しかし、バイオ燃料の製造プロセスにおいて、不溶性のリグノセルロース系バイオマスから、細胞を透過でき、かつ急激に発酵できる糖類への初期変化率が、技術的な課題であり、大きな障害である。それゆえ、用途が多いエネルギー源としてリグノセルロース系バイオマスの可能性を十分に開くために、このような障害を克服するための改善された手段が必要とされている。
リグノセルロース系バイオマスは、バイオ燃料を製造するための、再生可能で豊富な原材料である。しかし、バイオ燃料の製造プロセスにおいて、不溶性のリグノセルロース系バイオマスから、細胞を透過でき、かつ急激に発酵できる糖類への初期変化率が、技術的な課題であり、大きな障害である。それゆえ、用途が多いエネルギー源としてリグノセルロース系バイオマスの可能性を十分に開くために、このような障害を克服するための改善された手段が必要とされている。
バイオマスの自然分解は、リグノセルロース分解酵素(lignocellolytic enzymes)の分泌を通して真菌の微生物によって行われる。例えば、糸状菌であり、研究用モデルの有機体であるNeurospora crassa(N. crassa)は、焼かれた後に近年成長している野生の植物中によく確認される。上記植物では、セルラーゼを分泌し、その結果、植物の細胞壁の分解を開始する。リグノセルロースの分解における自然の役割に基づき、糸状菌およびそのリグノセルロース分解酵素が、生物工学的な製造プロセスにおけるバイオマスの分解の触媒として大きな可能性を有する。
糸状菌におけるセルラーゼの分泌は、不溶性の植物の細胞壁の成分(例えば、セルロース、ヘミセルロースまたはキシラン)によって効果的に誘導されるが、水溶性の誘導因子では効果が小さい。例えば、セルラーゼの主な最終生成物である水溶性のセロビオースは、ハイポクレア・ジェコリナ(Hypocrea jecorina)(Trichoderma reesei;T. reesei)およびアスペルギルス(A. niger、A. nidulans、A. oryzae)を含んでいる糸状菌のいくつかの種類へセルラーゼを誘導するが、セルロース自体よりも非常に低いレベルである。しかし、不溶性の誘導因子が有する1つの問題は、セルラーゼが不溶性の誘導因子に付着し得、その結果、分泌される酵素の活性の効力が低減することである。
不溶性のバイオマス自体を処理することは、不均一なプロセスであり、バイオマス表面へ真菌細胞がアクセスすることが制限されている。それゆえ、真菌が豊富な培養液中では、大きな細胞の母集団が自由に動き、そして誘導している植物の表面との接触が不足するため、高いレベルにて活性のあるセルラーゼ酵素を分泌しない。細胞を懸濁させ、その結果バイオマスの分解を促進させる観点で、セルラーゼ酵素を含んでいるタンパク質の製造を最適化するために、水溶性の小分子(例えば、セロデキストリン)を用いて誘導した後に、高いレベルにて活性のあるタンパク質を分泌する細胞のシステムが必要とされている。
〔概要〕
本明細書中にて、タンパク質の分泌を増加させるため、およびリグノセルロース系バイオマスを分解するための変異体細胞を提供する。また、本明細書中にて、上記変異体細胞を用いる、タンパク質の分泌を増加させる方法およびリグノセルロース系バイオマスを分解する方法を提供する。さらに、本開示は、糸状菌(例えば、Neurospora crassa)中の変異しているβ−グルコシダーゼ遺伝子および異化分解産物レプレッサー遺伝子(cre−1)の少なくとも一方が、セルロース系バイオマス(例えば、セロビオース)によって誘導される場合、結果としてタンパク質の分泌が増加するという驚くべき発見の少なくとも一部に基づく。特定の理論に縛られることを望むものでないが、β−グルコシダーゼ遺伝子およびcre−1が、タンパク質の転写制御に関連していると考えられている(図1)。
本明細書中にて、タンパク質の分泌を増加させるため、およびリグノセルロース系バイオマスを分解するための変異体細胞を提供する。また、本明細書中にて、上記変異体細胞を用いる、タンパク質の分泌を増加させる方法およびリグノセルロース系バイオマスを分解する方法を提供する。さらに、本開示は、糸状菌(例えば、Neurospora crassa)中の変異しているβ−グルコシダーゼ遺伝子および異化分解産物レプレッサー遺伝子(cre−1)の少なくとも一方が、セルロース系バイオマス(例えば、セロビオース)によって誘導される場合、結果としてタンパク質の分泌が増加するという驚くべき発見の少なくとも一部に基づく。特定の理論に縛られることを望むものでないが、β−グルコシダーゼ遺伝子およびcre−1が、タンパク質の転写制御に関連していると考えられている(図1)。
従って、本開示の一局面は、細胞からのタンパク質の分泌を増加させる方法であって、(a)変異体細胞を提供する工程であって、該変異体細胞は、2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子にて不活性化変異を含んでいる、工程;および(b)上記変異体細胞をセルロース系バイオマスと接触させる工程であって、該セルロース系バイオマスは、上記タンパク質を分泌するように該変異体細胞を誘導する、工程による方法を提供する。ある実施形態において、上記変異体細胞は、該細胞中のcre−1遺伝子にて不活性化変異をさらに含む。本開示の別の局面は、細胞からのタンパク質の分泌を増加させる方法であって、(a)変異体細胞を提供する工程であって、該変異体細胞は、該細胞中のcre−1遺伝子にて不活性化変異を含んでいる、工程;および(b)上記変異体細胞をセルロース系バイオマスと接触させる工程であって、該セルロース系バイオマスは、上記タンパク質を分泌するように該変異体細胞を誘導する、工程による方法を提供する。ある実施形態において、上記変異体細胞は、2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子にて不活性化変異をさらに含む。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記セルロース系バイオマスは、1つ以上の多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースを含む。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記セルロース系バイオマスはセロビオースを含む。
従って、本開示の一局面は、細胞からのタンパク質の分泌を増加させる方法であって、(a)変異体細胞を提供する工程であって、該変異体細胞は、2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子にて不活性化変異を含んでいる、工程;および(b)上記変異体細胞を糖と接触させる工程であって、該糖は、上記タンパク質を分泌するように該変異体細胞を誘導する、工程による方法を提供する。ある実施形態において、上記変異体細胞は、該細胞中のcre−1遺伝子にて不活性化変異をさらに含む。本開示の別の局面は、細胞からのタンパク質の分泌を増加させる方法であって、(a)変異体細胞を提供する工程であって、該変異体細胞は、該細胞中のcre−1遺伝子にて不活性化変異を含んでいる、工程;および(b)上記変異体細胞を糖と接触させる工程であって、該糖は、上記タンパク質を分泌するように該変異体細胞を誘導する、工程による方法を提供する。ある実施形態において、上記変異体細胞は、2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子にて不活性化変異をさらに含む。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記糖は、多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースからなる群より選択される。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記糖はセロビオースである。
上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、セルロース誘導性タンパク質である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、セルラーゼ、GH61酵素、セロニオースデヒドロゲナーゼ、ラクトナーゼ、カルボヒドレートエステラーゼ、多糖リアーゼ、セルロース結合ドメイン含有タンパク質、およびこれらの組合せからなる群より選択される。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質はセルラーゼである。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764およびNCU05137からなる群より選択される遺伝子によってコードされる。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記変異体細胞は、少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子にて不活性化変異をさらに含む。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記変異体細胞は、少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子にて不活性化変異をさらに含む。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記不活性化変異は欠失である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、細胞はリコンビナント細胞である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は真菌細胞または酵母細胞である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は真菌細胞または酵母細胞である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は、Neurospora crassa(N. crassa)細胞、Aspergillus nidulans細胞、Trichoderma reesei細胞、Phanerochaete chrysosporium細胞、Sporotrichum thermophile(Myceliophthora thermophila)細胞、Gibberella zeae細胞、Sclerotinia sclerotiorum細胞、Botryotinia fuckeliana細胞、Aspergillus niger細胞、Penicillium chrysogenum細胞、Schizophyllum commune細胞、Postia placenta細胞、Aspergillus oryzae細胞、およびAcremonium cellulolyticus細胞から選択される。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、3つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、4つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、5つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、6つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、7つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記3つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、4つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、5つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、6つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、または7つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、NCU00130、NCU04952およびNCU08755を含む。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、少なくとも1つの上記β−グルコシダーゼ遺伝子は、細胞内β−グルコシダーゼをコードする。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、少なくとも1つの上記β−グルコシダーゼ遺伝子が、細胞外β−グルコシダーゼをコードする。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子はNCU00890である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子はNCU06650である。
本開示の別の局面は、細胞からのタンパク質の分泌を増加させる方法であって、(a)リコンビナント細胞を提供する工程であって、該リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現を示す、工程;および(b)上記リコンビナント細胞をセルロース系バイオマスと接触させる工程であって、該セルロース系バイオマスは、上記タンパク質を分泌するように該リコンビナント細胞を誘導する、工程による方法を提供する。ある実施形態において、上記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中のcre−1遺伝子の発現と比較して低減したcre−1遺伝子の発現をさらに示す。本開示の別の局面は、細胞からのタンパク質の分泌を増加させる方法であって、(a)リコンビナント細胞を提供する工程であって、該リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中のcre−1遺伝子の発現と比較して低減したcre−1遺伝子の発現を示す、工程;および(b)上記リコンビナント細胞をセルロース系バイオマスと接触させる工程であって、該セルロース系バイオマスは、上記タンパク質を分泌するように該リコンビナント細胞を誘導する、工程による方法を提供する。ある実施形態において、上記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現をさらに示す。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記セルロース系バイオマスは、1つ以上の多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースを含む。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記セルロース系バイオマスはセロビオースを含む。
本開示の別の局面は、細胞からのタンパク質の分泌を増加させる方法であって、(a)リコンビナント細胞を提供する工程であって、該リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現を示す、工程;および(b)上記リコンビナント細胞を糖と接触させる工程であって、該糖は、上記タンパク質を分泌するように該リコンビナント細胞を誘導する、工程による方法を提供する。ある実施形態において、上記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中のcre−1遺伝子の発現と比較して低減したcre−1遺伝子の発現をさらに示す。本開示の別の局面は、細胞からのタンパク質の分泌を増加させる方法であって、(a)リコンビナント細胞を提供する工程であって、該リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中のcre−1遺伝子の発現と比較して低減したcre−1遺伝子の発現を示す、工程;および(b)上記リコンビナント細胞を糖と接触させる工程であって、該糖は、上記タンパク質を分泌するように該リコンビナント細胞を誘導する、工程による方法を提供する。ある実施形態において、上記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現をさらに示す。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記糖は、多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースからなる群より選択される。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記糖はセロビオースである。
上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、セルロース誘導性タンパク質である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、セルラーゼ、GH61酵素、セロニオースデヒドロゲナーゼ、ラクトナーゼ、カルボヒドレートエステラーゼ、多糖リアーゼ、セルロース結合ドメイン含有タンパク質、およびこれらの組合せからなる群より選択される。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質はセルラーゼである。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764およびNCU05137から選択される遺伝子によってコードされる。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、creA/cre−1の機能は、ドミナントネガティブ変異体の過剰発現またはタンパク質インヒビターによって低減されている。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の発現をさらに示す。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の発現をさらに示す。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記遺伝子の発現は、siRNA、アンチセンスDNA、クエリングまたは減数分裂性サイレンシングによって低減されている。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、3つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、4つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、5つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、6つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、7つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記3つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、4つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、5つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、6つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、または7つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、NCU00130、NCU04952およびNCU08755を含む。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、少なくとも1つの上記β−グルコシダーゼ遺伝子は、細胞内β−グルコシダーゼをコードする。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、少なくとも1つの上記β−グルコシダーゼ遺伝子は、細胞外β−グルコシダーゼをコードする。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子はNCU00890である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子はNCU06650である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は、安定な細胞株または一過性にトランスフェクトされた細胞である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は真菌細胞または酵母細胞である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞が、子嚢菌種または担子菌種の糸状菌である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は、Neurospora crassa(N. crassa)細胞、Aspergillus nidulans細胞、Trichoderma reesei細胞、Phanerochaete chrysosporium細胞、Sporotrichum thermophile(Myceliophthora thermophila)細胞、Gibberella zeae細胞、Sclerotinia sclerotiorum細胞、Botryotinia fuckeliana細胞、Aspergillus niger細胞、Penicillium chrysogenum細胞、Schizophyllum commune細胞、Postia placenta細胞、Aspergillus oryzae細胞、およびAcremonium cellulolyticus細胞から選択される。
本開示の別の局面は、2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子にて不活性変異を含んでいる変異体細胞であって、セルロース系バイオマスが、上記変異体細胞に対応する、2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子にて不活性変異を欠いている細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記変異体細胞を誘導する、変異体細胞を提供する。ある実施形態において、上記変異体細胞は、該細胞中のcre−1遺伝子にて不活性化変異をさらに含んでおり、セルロース系バイオマスが、上記変異体細胞に対応する、cre−1遺伝子にて不活性変異を欠いている細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記変異体細胞を誘導する。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記変異体細胞は、少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子にて不活性化変異をさらに含んでおり、セルロース系バイオマスが、上記変異体細胞に対応する、少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子にて不活性変異を欠いている細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記変異体細胞を誘導する。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記変異体細胞は、少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子にて不活性化変異をさらに含んでおり、セルロース系バイオマスが、上記変異体細胞に対応する、少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子にて不活性変異を欠いている細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記変異体細胞を誘導する。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記セルロース系バイオマスは、1つ以上の多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースを含む。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記セルロース系バイオマスはセロビオースを含む。
本開示の別の局面は、2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子にて不活性変異を含んでいる変異体細胞であって、糖が、上記変異体細胞に対応する、2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子にて不活性変異を欠いている細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記変異体細胞を誘導する、変異体細胞を提供する。ある実施形態において、上記変異体細胞は、該細胞中のcre−1遺伝子にて不活性化変異をさらに含んでおり、糖が、上記変異体細胞に対応する、cre−1遺伝子にて不活性変異を欠いている細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記変異体細胞を誘導する。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記変異体細胞は、少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子にて不活性化変異をさらに含んでおり、糖が、上記変異体細胞に対応する、少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子にて不活性変異を欠いている細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記変異体細胞を誘導する。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記変異体細胞は、少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子にて不活性化変異をさらに含んでおり、糖が、上記変異体細胞に対応する、少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子にて不活性変異を欠いている細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記変異体細胞を誘導する。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記糖は、多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースから選択される。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記糖はセロビオースである。
上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、セルロース誘導性タンパク質である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、セルラーゼ、GH61酵素、セロニオースデヒドロゲナーゼ、ラクトナーゼ、カルボヒドレートエステラーゼ、多糖リアーゼ、セルロース結合ドメイン含有タンパク質、およびこれらの組合せから選択される。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質はセルラーゼである。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764およびNCU05137から選択される遺伝子によってコードされる。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記不活性化変異は欠失である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞はリコンビナント細胞である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は真菌細胞または酵母細胞である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は、子嚢菌種または担子菌種の糸状菌である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は、Neurospora crassa(N. crassa)細胞、Aspergillus nidulans細胞、Trichoderma reesei細胞、Phanerochaete chrysosporium細胞、Sporotrichum thermophile (Myceliophthora thermophila)細胞、Gibberella zeae細胞、Sclerotinia sclerotiorum細胞、Botryotinia fuckeliana細胞、Aspergillus niger細胞、Penicillium chrysogenum細胞、Schizophyllum commune細胞、Postia placenta細胞、Aspergillus oryzae細胞、およびAcremonium cellulolyticus細胞から選択される。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、3つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、4つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、5つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、6つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、7つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記3つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、4つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、5つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、6つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、または7つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、NCU00130、NCU04952およびNCU08755を含む。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、少なくとも1つの上記β−グルコシダーゼ遺伝子は、細胞内β−グルコシダーゼをコードする。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、少なくとも1つの上記β−グルコシダーゼ遺伝子は、細胞外β−グルコシダーゼをコードする。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子はNCU00890である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子はNCU06650である。
本開示の別の局面は、リコンビナント細胞であって、該リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現を示し、上記発現は、siRNA、アンチセンスDNA、クエリングまたは減数分裂性サイレンシングによって低減されており、セルロース系バイオマスが、上記対応する非リコンビナント細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記リコンビナント細胞を誘導し、上記対応する非リコンビナント細胞において、少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の上記発現は低減されていない、リコンビナント細胞を提供する。ある実施形態において、上記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中のcre−1遺伝子の発現と比較して低減したcre−1遺伝子の発現をさらに示し、上記発現は、siRNA、アンチセンスDNA、クエリングまたは減数分裂性サイレンシングによって低減されており、セルロース系バイオマスが、上記対応する非リコンビナント細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記リコンビナント細胞を誘導し、上記対応する非リコンビナント細胞において、cre−1遺伝子の上記発現は低減されていない。ある実施形態において、creA/cre−1の機能は、ドミナントネガティブ変異体の過剰発現またはタンパク質インヒビターによって低減されており、セルロース系バイオマスが、対応する細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記リコンビナント細胞を誘導し、上記対応する細胞において、上記ドミナントネガティブ変異体は過剰発現されていない。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の発現をさらに示し、上記発現は、siRNA、アンチセンスDNA、クエリングまたは減数分裂性サイレンシングによって低減されており、セルロース系バイオマスが、上記対応する非リコンビナント細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記リコンビナント細胞を誘導し、上記対応する非リコンビナント細胞において、少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の発現は低減されていない。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の発現をさらに示し、上記発現は、siRNA、アンチセンスDNA、クエリングまたは減数分裂性サイレンシングによって低減されており、セルロース系バイオマスが、上記非リコンビナント細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記リコンビナント細胞を誘導し、上記非リコンビナント細胞において、少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の発現は低減されていない。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記セルロース系バイオマスは、1つ以上の多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースを含む。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記セルロース系バイオマスはセロビオースを含む。
本開示の別の局面は、リコンビナント細胞であって、該リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現を示し、上記発現は、siRNA、アンチセンスDNA、クエリングまたは減数分裂性サイレンシングによって低減されており、糖が、上記対応する非リコンビナント細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記リコンビナント細胞を誘導し、上記対応する非リコンビナント細胞において、少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の上記発現は低減されていない、リコンビナント細胞を提供する。ある実施形態において、上記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中のcre−1遺伝子の発現と比較して低減したcre−1遺伝子の発現をさらに示し、上記発現は、siRNA、アンチセンスDNA、クエリングまたは減数分裂性サイレンシングによって低減されており、糖が、上記対応する非リコンビナント細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記リコンビナント細胞を誘導し、上記対応する非リコンビナント細胞において、cre−1遺伝子の上記発現は低減されていない。ある実施形態において、creA/cre−1の機能は、ドミナントネガティブ変異体の過剰発現またはタンパク質インヒビターによって低減されており、糖が、対応する細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記リコンビナント細胞を誘導し、上記対応する細胞において、上記ドミナントネガティブ変異体は過剰発現されていない。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の発現をさらに示し、上記発現は、siRNA、アンチセンスDNA、クエリングまたは減数分裂性サイレンシングによって低減されており、糖が、上記対応する非リコンビナント細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記リコンビナント細胞を誘導し、上記対応する非リコンビナント細胞において、少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の発現は低減されていない。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の発現をさらに示し、上記発現は、siRNA、アンチセンスDNA、クエリングまたは減数分裂性サイレンシングによって低減されており、糖が、上記非リコンビナント細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記リコンビナント細胞を誘導し、上記非リコンビナント細胞において、少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の発現は低減されていない。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記糖は、多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースから選択される。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記糖はセロビオースである。
上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、セルロース誘導性タンパク質である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、セルラーゼ、GH61酵素、セロニオースデヒドロゲナーゼ、ラクトナーゼ、カルボヒドレートエステラーゼ、多糖リアーゼ、セルロース結合ドメイン含有タンパク質、およびこれらの組合せから選択される。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質はセルラーゼである。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764およびNCU05137から選択される遺伝子によってコードされる。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、3つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、4つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、5つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、6つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、7つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記3つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、4つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、5つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、6つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、または7つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、NCU00130、NCU04952およびNCU08755を含む。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、少なくとも1つの上記β−グルコシダーゼ遺伝子は、細胞内β−グルコシダーゼをコードする。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、少なくとも1つの上記β−グルコシダーゼ遺伝子は、細胞外β−グルコシダーゼをコードする。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子はNCU00890である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子はNCU06650である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は、安定な細胞株または一過性にトランスフェクトされた細胞である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は、真菌細胞または酵母細胞である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は、子嚢菌種または担子菌種の糸状菌である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は、Neurospora crassa(N. crassa)細胞、Aspergillus nidulans細胞、Trichoderma reesei細胞、Phanerochaete chrysosporium細胞、Sporotrichum thermophile(Myceliophthora thermophila)細胞、Gibberella zeae細胞、Sclerotinia sclerotiorum細胞、Botryotinia fuckeliana細胞、Aspergillus niger細胞、Penicillium chrysogenum細胞、Schizophyllum commune細胞、Postia placenta細胞、Aspergillus oryzae細胞、およびAcremonium cellulolyticus細胞から選択される。
本開示の別の局面は、バイオマスを分解する方法であって、(a)リグノセルロース系バイオマスを提供する工程;(b)上述した実施形態のいずれかの細胞、あるいはcre−1遺伝子にて不活性化変異を含んでいる細胞を提供する工程;(c)上記細胞をセルロース系バイオマスと接触させることによってタンパク質を分泌するように上記細胞を誘導する工程;ならびに(d)誘導された上記細胞を上記リグノセルロース系バイオマスと接触させる工程であって、分泌された上記タンパク質が上記リグノセルロース系バイオマスを分解する、工程による方法に関する。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記セルロース系バイオマスは、1つ以上の多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースを含む。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記セルロース系バイオマスはセロビオースを含む。本発明の別の局面は、バイオマスを分解する方法であって、(a)リグノセルロース系バイオマスを提供する工程;(b)上述した実施形態のいずれかの細胞、あるいはcre−1遺伝子にて不活性化変異を含んでいる細胞を提供する工程;(c)上記細胞を糖と接触させることによってタンパク質を分泌するように上記細胞を誘導する工程;ならびに(d)誘導された上記細胞を上記リグノセルロース系バイオマスと接触させる工程であって、分泌された上記タンパク質が上記リグノセルロース系バイオマスを分解する、工程による方法に関する。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記糖は、多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースから選択される。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記糖はセロビオースである。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、セルロース誘導性タンパク質である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、セルラーゼ、GH61酵素、セロニオースデヒドロゲナーゼ、ラクトナーゼ、カルボヒドレートエステラーゼ、多糖リアーゼ、セルロース結合ドメイン含有タンパク質、およびこれらの組合せから選択される。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質はセルラーゼである。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764およびNCU05137から選択される遺伝子によってコードされる。
〔図面の簡単な説明〕
図1は、N.crassaのβ-グルコシダーゼ欠失株におけるセルラーゼの転写制御のためのモデルを示している。転写の抑制解除および特異的誘導の両方が、セルラーゼ遺伝子発現の最大転写活性を達成するために求められる。矢印は、セルロース代謝の経路を示している。青線はΔ3βGおよびΔ3βGΔcre欠失株において最小限と考えられる経路を示し、赤線は3βGおよびΔ3βGΔcre欠失株において最も活性化されると考えられる経路を示している。
図1は、N.crassaのβ-グルコシダーゼ欠失株におけるセルラーゼの転写制御のためのモデルを示している。転写の抑制解除および特異的誘導の両方が、セルラーゼ遺伝子発現の最大転写活性を達成するために求められる。矢印は、セルロース代謝の経路を示している。青線はΔ3βGおよびΔ3βGΔcre欠失株において最小限と考えられる経路を示し、赤線は3βGおよびΔ3βGΔcre欠失株において最も活性化されると考えられる経路を示している。
図2は、N.crassaにおけるセルラーゼ酵素に関する遺伝子発現の経時変化を示している。図2Aは、セロビオヒドロラ−ゼ1(cbh−1、NCU07340)の経時変化を示している。図2Bは、エンドグルカナーゼ2(gh5−1、NCU00762)の経時変化を示している。全ての遺伝子の発現レベルは、2%のスクロースを用いて誘導した場合を1に正規化している。株は、2%のスクロースを用いた最小培地において16時間成長させ、その後、2%のアビセル(登録商標)を用いた最小培地において4時間成長させた。全てのサンプルにおいて、アクチン(NCU04173)遺伝子発現レベルを内在性のコントロールとして用いた。各反応を3通り行い、エラーバーは95%の信頼区間を示している。
図3は、WT、Δ3βGおよびΔ3βGΔcreにおいて、0.2%のセロビオースまたは0.1%のアビセル(登録商標)を用いて4時間誘導した後、選択したセルラーゼの遺伝子発現を示している。cbh−1、gh6−2およびgh5−1の遺伝子発現レベルは、1%のスクロースを用いて誘導した場合を1に正規化している。全てのサンプルにおいて、アクチンを内在性のコントロールとして用いた。各株を3回成長させ、エラーバーは1の標準偏差を示している。
図4は、2%のスクロースを用いた最小培地に移して4時間経過したΔcre−1における、セルラーゼ セロビオヒドロラーゼ1(cbh−1、NCU07340)およびエンドグルカナーゼ2(gh5−1、NCU00762)の遺伝子発現レベルを示している。両方の遺伝子の発現レベルは、2%のスクロースを用いて誘導した野生型を1に正規化している。アクチン(NCU04173)の遺伝子発現レベルを内在性のコントロールとして用いた。各反応を3回行い、エラーバーは95%の信頼区間を示している。
図5は、野生型(WT)、Δcre−1、Δ4952Δ875Δ130、およびΔ4952Δ8755Δ130Δcre−1における、絶食状況下でのセルラーゼ セロビオヒドロラーゼ1(cbh−1、NCU07340)およびエンドグルカナーゼ2(gh5−1、NCU00762)の遺伝子発現レベルを示している。全ての遺伝子の発現レベルは、2%のスクロースを用いた場合を1に正規化している。株は、2%のスクロースを用いた最小培地において16時間成長させ、その後、炭素源が添加されていない最小培地において4時間成長させた。全てのサンプルにおいて、アクチン(NCU04173)遺伝子発現レベルを内在性のコントロールとして用いた。各反応を3回行い、エラーバーは95%の信頼区間を示している。
図6は、10mMまたは1mMのいずれかのセロビオースを用いて4時間誘導した後の、セルラーゼ セロビオヒドロラーゼ1(cbh−1、NCU07340)およびエンドグルカナーゼ2(gh5−1、NCU00762)の遺伝子発現レベルを示している。図6Aは、野生型に関する結果を示している。図6Bは、Δ4952Δ8755Δ130欠失変異体に関する結果を示している。図6Cは、Δ4952Δ8755Δ130Δcre−1欠失変異体に関する結果を示している。全ての遺伝子に関する発現レベルは、2%のスクロースを用いて誘導した場合を1に正規化している。株は、2%のスクロースを用いた最小培地において16時間成長させ、その後、1mMのセロビオース、10mMのセロビオース、または2%のスクロースを用いた最小培地において4時間成長させた。全てのサンプルにおいて、アクチン(NCU04173)遺伝子発現レベルを内在性のコントロールとして用いた。各反応を3回行い、エラーバーは95%の信頼区間を示している。
図7は、セロビオースおよびアビセル(登録商標)を用いて誘導した後の、WT、Δ3βG、およびΔ3βGΔcre株における、タンパク質生成および酵素活性の概要を示している。図7Aは、セロビオースを用いて誘導したΔ3βGを使用したバイオリアクターにおけるセルラーゼの生成を示している。図7Bは、セロビオースを用いて誘導したΔ3βGΔcreを使用したバイオリアクターにおけるセルラーゼの生成を示している。図7Cは、セロビオースを用いて誘導したWTを使用したバイオリアクターにおけるセルラーゼの生成を示している。図7Dは、アビセル(登録商標)で5日間成長させたWTを使用したバイオリアクターにおけるセルラーゼの生成を示している。セロビオース誘導株は、0.2%のセロビオースを用いた36時間の誘導の前に、1%のスクロースを用いた最小培地において24時間のプレ成長させている。スクロース、グルコース、フルクトースの濃度(グルコース等価物、三角形)、セロビオース(円形)、タンパク質生成物(正方形)、およびバイオマス蓄積(ダイヤモンド)を測定した。図7Eは、アビセル(登録商標)に関する、7A,7B、および7Dの24時間誘導の上清活性を示している。セロビオースを用いて24時間誘導したΔ3βG(正方形)およびΔ3βGΔcre(三角形)の培養上清のセルラーゼ活性を、アビセル(登録商標)で5日間成長させたWT(ダイヤモンド形)の培養上清と比較した。エラーバーは、1の標準偏差である。図7Fは、7Aおよび7Bにおける培養上清のバイオリアクターにおけるAzo-CMC(エンドグルカナーゼ)活性の経時変化を示している。Azo-CMC活性を、2%のアビセル(登録商標)で5日間成長させたWTの培養上清中の活性に対する割合として表している。
図8は、野生型(WT)、Δcre−1、Δ4952Δ8755Δ130、およびΔ4952Δ8755Δ130Δcre−1の培養濾過液における、MuLac活性(セロビオヒドロラ−ゼ1)の比較である。図8Aは、アビセル(登録商標)で4日間経過した後、アビセル(登録商標)での野生型活性の割合として表したMuLac活性を示している。図8Bは、精製したリコンビナントCbh−1等価物μgとして表したMuLac活性を示している。株は、2%のスクロースにおいて16時間成長させ、その後、2%のスクロース、2%のセロビオース、または2%のアビセル(登録商標)において4日間成長させており、2日および4日の両方の時点で採取した。培養上清中のエキソグルカナーゼ活性は、4-メチルウンベリフェリル-β-D-セロビオシド(MuLac)試験を用いて測定した。
図9は、野生型(WT)、Δcre−1、Δ4952Δ8755Δ130、およびΔ4952Δ8755Δ130Δcre―1の培養濾過液中のAzo−CM−セルロース活性の比較である。株は、2%のスクロースにおいて24時間成長させ、その後、2%のスクロース、1%のアビセル(登録商標)、または2%のセロビオースにおいて4日間成長させた。エンド−1,4−β−グルカナーゼ活性は、アビセル(登録商標)を用いた活性から4日後の野生型の活性に対する割合として示している。注釈:4つのどの株についてもAzo−CM−セルロース活性が検出されなかったため、スクロース培養のデータは示していない。
図10は、N.crassa野生型およびΔcre−1株の表現型の比較である。図10Aは、アビセル(登録商標)で7日間成長させたWTおよびΔcre−1株の培養濾過液中で分泌されたタンパク質のSDS−PAGE分析を示している。β−グルコシダーゼ(NCU04952)、セロビオヒドロラーゼ1(cbh―1、NCU07340)および2(cbh―2、NCU09680)、並びに、エンドグルカナーゼ2(gh5−1、NCU00762)を表すタンパク質のバンドに印を付けている。図10Bは、WTおよびcre―1株の7日間の培養上清のアビセラーゼ試験によって検出された、Azo−CMCでのエンドグルカナーゼ活性、タンパク質濃度、並びに、グルコースおよびセロビオース濃度の比較である。
図11は、野生型(WT)、Δcre−1、Δ4952Δ8755Δ130、およびΔ4952Δ8755Δ130Δcre−1欠失変異体の培養上清中に分泌されたタンパク質のSDS−PAGE分析を示している。株は、1%のスクロースにおいt24時間成長させ、その後、2%のスクロース、2%のセロビオース、1%のスクロースおよび1%のセロビオース、または1%のスクロースおよび1%のアビセル(登録商標)において4日間成長させており、24時間の時点でサインプルを採取した。15μlの濾過液の培養上清を、標準的な10%のTris−HCL ポリアクリルアミドゲルにて泳動させると共に、Thermo Scientific GelCode Blue Stain Reagentを用いて染色した。注釈:スクロースでのΔcre−1およびΔ4952Δ8755Δ130Δcre―1における72kDaで泳動したタンパク質を質量分析法によってNCU01517(グルコアミラーゼ1)として同定した。
図12は、野生型、N.crassaおよびΔ4952Δ8755Δ130(β−GtKO)の培養上清中に分泌されたタンパク質のSDS−PAGE分析を示している。株は、1%のスクロースにおいて24時間成長させ、その後、2%のスクロース、2%のセロビオース、または2%のアビセル(登録商標において5日間成長させた。セロビオヒドロラーゼ1(cbh―1、NCU07340)、セロビオヒドロラーゼ2(cbh―2、NCU09680)、およびエンドグルカナーゼ2(gh5−1、NCU00762)を表すタンパク質のバンドに印を付けている。さらに、野生型におけるβ−グルコシダーゼ(NCU04952)に目印を付け、三重欠失Δ4952Δ8755Δ130における欠如部分を縁取りしている。
図13は、近縁関係にある菌類における、オーソロガス遺伝子であるNCU00130(配列番号1)、NCU04952(配列番号2)およびNCU08755(配列番号3)に対する、ClustalWアラインメントを示している。全ての配列は、相違するアミノ酸のみを表すオーソロガス遺伝子を用いたN.crassa遺伝子を規定している。“.”は同一の残留物を示し、“−“は挿入または欠失を示している。
図14は、β−グルコシダーゼNCU00130オーソロガス遺伝子の進化の関係を示している。進化の歴史は近隣結合法(Saitou N. and Nei M., 1987)を用いて推測した。全体の枝長が1.56132503である最適な系図を示している。この系図は、同じユニットにおける枝長が系統樹を推測するために用いられる進化の距離となるような比率で描かれている。進化の距離は、ピアソン コレクション法(Zuckerkandl E. and Pauling L., 1965)を用いて算出し、また、サイト当たりのアミノ酸置換の数のユニットにある。この分析は、11のアミノ酸配列に関している。ギャップおよび欠けている(missing)データを含む全ての位置は削除されている。最終的なデータセットにおいて、全体で447の位置が存在する。進化に関する解析は、MEGA5にて行った(Tamura K., Dudley J., Nei M., and Kumar S., 2007)。
図15は、β−グルコシダーゼNCU04952オーソロガス遺伝子の進化の関係を示している。全体の枝長が2.84018960である最適な系図を示している。この分析は、11のアミノ酸配列に関している。最終的なデータセットにおいて全体で690の位置が存在する。
図16は、β−グルコシダーゼNCU08755オーソロガス遺伝子の進化の関係を示している。全体の枝長が2.37353896である最適な系図を示している。この分析は、11のアミノ酸配列に関している。最終的なデータセットにおいて全体で709の位置が存在する。
図17は、セロデキストリンを用いて誘導した後の、WTおよびΔ3βGにおけるセルラーゼ誘導を示している。図17Aは、アビセル(登録商標)、セロビオース、セロトリオース、またはセロテトラオースを用いて4時間誘導した後のWTにおけるcbh―1、gh5−1、およびgh6−2の発現を示している。図17Bは、アビセル(登録商標)、セロビオース、セロトリオース、またはセロテトラオースを用いて4時間誘導した後のΔ3βGにおけるcbh―1、gh5−1、およびgh6−2の発現を示している。cbh―1、gh5−1、およびgh6−2の遺伝子発現レベルは、1%のスクロースを用いて誘導した場合を1に正規化している。全てのサンプルにおいて、アクチン(NCU04173)遺伝子発現レベルを内在性のコントロールとして用いた。エラーバーは1の標準偏差を示している。
図18は、セロビオースまたはアビセル(登録商標)を用いた誘導後のWTおよびβグルコシダーゼ欠失株におけるセルラーゼの発現レベルを示している。図18Aは、WT、Δ3βG、およびΔ3βGcre−1株の培養上清中で分泌されたタンパク質のSDS−PAGE分析を示している。3重ノックアウト(triple knockout)における、CBH―1、GH6−2およびGH5−1を表すタンパク質のバンドに印を付けている。グルコアミラーゼI(NCU01517)の存在は、cre−1遺伝子の欠失と関連している。培養物は、2%のスクロースにおいて24時間成長させ、その後、2%のスクロースまたは0.2%のセロビオースを添加した。24時間(WT、Δ3βGおよびΔ3βGΔcre)または72時間(Δ3βG)後に、上清を回収した。WTアビセル(登録商標)の培養物は2%のアビセル(登録商標)において5日間成長させた。Δ3βGは1%のスクロースにおいて24時間成長させた後、1%のアビセル(登録商標)において48時間成長させた。Δ3βGΔcreは1%のスクロースにおいて24時間成長させた後、1%のアビセル(登録商標)において24時間成長させた。図18Bは、アビセル(登録商標)に関する、18Aの上清の活性を示している。グルコース(濃いグレー)およびセロビオース(淡いグレー)を、1%のアビセル(登録商標)を用いて24時間、50℃で培養した後に測定した。エラーバーは1の標準偏差を示している。
図19は、ソホロース、ラクトースまたはD(+)−ガラクトースを用いて誘導した後の、TWおよびΔ3βGにおけるセルラーゼ誘導を示している。図19Aは、1mMのソホロース、1mMのラクトースまたは1mMのD(+)−ガラクトースを用いて4時間誘導した後の、WTおよびΔ3βGにおけるchb−1の発現を示している。図19Bは、1mMのソホロース、1mMのラクトースまたは1mMのD(+)−ガラクトースを用いて4時間誘導した後の、WTおよびΔ3βGにおけるgh6−2の発現を示している。chb−1およびgh6−2の遺伝子発現レベルは、1%のスクロースを用いて誘導した場合を1に正規化している。全てのサンプルにおいて、アクチン(NCU04173)遺伝子発現レベルを内在性のコントロールとして用いた。エラーバーは1の標準偏差を示している。
図20は、WTおよびΔ3βGのmRNAの配列決定を示している。図20Aは、WTN.crassaにおいて異なる誘導を受けた318の遺伝子の階層的クラスタ分析を示し、セアビセル(登録商標)による誘導をセロビオースによる誘導と比較している。淡い色は相対的な発現が高いことを示し、また、濃い色は相対的な発現が低いことを示している。図20Bは、セロビオースまたはアビセル(登録商標)を用いて誘導したWTを、セロビオースを用いて誘導したΔ3βGと比較したFPKMs(fragments per kilobase of exon per million fragments mapped)におけるセルラーゼ発現を示している。全ての株は、2%のスクロースで16時間成長させ、その後、炭素源のない培地(Vogels食塩水のみ)、0.2%のセロビオースまたは1%のアビセル(登録商標)に4時間移した。
図21は、セロビオースまたはアビセル(登録商標)を用いて誘導した後の、WT、Δ3βG、およびΔ3βGΔcre株における酵素活性を示している。図21Aは、アビセル(登録商標)に関する、24時間の誘導上清活性を示している。セロビースを用いて24時間誘導したときのΔ3βG(正方形)およびΔ3βGΔcre(ダイヤモンド)株の培養上清のセルラーゼの活性を、アビセル(登録商標)で5日間成長させたWTの培養上清の活性と比較している。図21Bは、36時間経過した後のアビセル(登録商標)加水分解試験(Aに基づく)において生成された、セロビオース(淡いグレー)およびグルコース(濃いグレー)の内訳を示している。エラーバーは1の標準偏差を示している。
図22は、野生型(アビセル(登録商標))、Δ3βG(セロビオース)、およびΔ3βGΔcre(セロビオース)Neurospora crassa株において、質量分析によって同定されたタンパク質の概要を示している。
図23は、Neurospora crassa株Δ3βG、Δ3βGΔcre、Δ3βGΔ890、Δ3βGΔ6650、Δ3βGΔ6650Δ890、Δ3βGΔcreΔ6650、Δ3βGΔcreΔ890、およびΔ3βGΔcreΔ6650Δ89の培養濾過液中のMuLac活性(セルラーゼ活性)を示している。Δ890を用いた株は、β−マンノシターゼ遺伝子NCU00890において欠失があった。Δ6650を用いた株は、ホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子NCU06650において欠失があった。株は、2%のスクロースで36時間成長させ、その後、0.2%のセロビオースで24時間成長させた。培養上清中のエキソグルカナーゼ活性は、4−メチルウンベリフェリル−β−D−セロビオシド(MuLac)試験を用いて測定した。結果は、各株における相対的な蛍光発光として示されている。
〔詳細な説明〕
[概要]
本開示は、セルロース系バイオマスによる誘導に応答したセルラーゼ等のタンパク質分泌の増加を示す変異体細胞及びリコンビナント細胞、及びこのような細胞を、タンパク質分泌の増加に利用する方法に関する。分泌されるタンパク質は、リグノセルロース系バイオマスの分解において、使い道を見出してもよい。ここに開示されているように、本開示の変異体細胞は、β−グルコシダーゼ遺伝子、cre−1遺伝子、β−マンノシダーゼ遺伝子、または、ホスホリパーゼ若しくはホスホリパーゼ様遺伝子等の、少なくとも1つの遺伝子において、不活性化変異を含んでいる。ここに開示されているように、本開示のリコンビナント細胞は、β−グルコシダーゼ遺伝子、cre−1遺伝子、β−マンノシダーゼ遺伝子、または、ホスホリパーゼ若しくはホスホリパーゼ様遺伝子等の、少なくとも1つの遺伝子について、対応する非リコンビナント細胞における上記少なくとも1つの遺伝子の発現と比較して低減した発現を示す。
[概要]
本開示は、セルロース系バイオマスによる誘導に応答したセルラーゼ等のタンパク質分泌の増加を示す変異体細胞及びリコンビナント細胞、及びこのような細胞を、タンパク質分泌の増加に利用する方法に関する。分泌されるタンパク質は、リグノセルロース系バイオマスの分解において、使い道を見出してもよい。ここに開示されているように、本開示の変異体細胞は、β−グルコシダーゼ遺伝子、cre−1遺伝子、β−マンノシダーゼ遺伝子、または、ホスホリパーゼ若しくはホスホリパーゼ様遺伝子等の、少なくとも1つの遺伝子において、不活性化変異を含んでいる。ここに開示されているように、本開示のリコンビナント細胞は、β−グルコシダーゼ遺伝子、cre−1遺伝子、β−マンノシダーゼ遺伝子、または、ホスホリパーゼ若しくはホスホリパーゼ様遺伝子等の、少なくとも1つの遺伝子について、対応する非リコンビナント細胞における上記少なくとも1つの遺伝子の発現と比較して低減した発現を示す。
[タンパク質分泌の誘導]
セルロース系バイオマスは、植物、藻類、真菌類、バクテリア等の生命体、並びに、多糖及び多糖構成要素を含む細菌性バイオフィルムから得られるマスである。セルロースは、セルロース系バイオマスにおける支配的な多糖である。セルロースは、アンヒドロセロビオース(線状β−(1,4)−D−グルカン)のホモポリマーであり、β−1,4グルコシド結合にて結合したグルコース単位を含む。多形全般であるが、セルロースは、まず、並列したグルカン鎖からなる不溶性結晶マトリックスとして、植物組織に見られる。セルロース系バイオマスは、生のバイオマス、未処理のバイオマス、または加工されたバイオマスであってもよい。セルロース系バイオマスは、1つ以上の多糖を含んでいてもよい。
セルロース系バイオマスは、植物、藻類、真菌類、バクテリア等の生命体、並びに、多糖及び多糖構成要素を含む細菌性バイオフィルムから得られるマスである。セルロースは、セルロース系バイオマスにおける支配的な多糖である。セルロースは、アンヒドロセロビオース(線状β−(1,4)−D−グルカン)のホモポリマーであり、β−1,4グルコシド結合にて結合したグルコース単位を含む。多形全般であるが、セルロースは、まず、並列したグルカン鎖からなる不溶性結晶マトリックスとして、植物組織に見られる。セルロース系バイオマスは、生のバイオマス、未処理のバイオマス、または加工されたバイオマスであってもよい。セルロース系バイオマスは、1つ以上の多糖を含んでいてもよい。
本開示に適したセルロース系バイオマスは、限定されないが、糖、多糖、オリゴ糖、精製したセルロース、及びセルロース誘導体を含んでいてもよい。精製したセルロースは、Solka Flok等のホロセルロース、並びに、Avicel(登録商標)及び Sigmacell(登録商標)等の微結晶性セルロースを含む。セルロース誘導体は、限定されないが、セロデキストリン、β−メチルウンベリフェリル−オリゴ糖、p−ニトロフェノール−オリゴ糖、長鎖セルロース誘導体、カルボキシメチルセルロース(CMC)、及びヒドロキシメチルセルロース(HEC)を含む。
本明細書に使用されるとき、「セロデキストリン」は、様々な長さのβ(1→4)グルコースポリマーを指し、限定されないが、セロビオース(2グルコースモノマー)、セロトリオース(3グルコースモノマー)、セロテトロース(4グルコースモノマー)、セロペントース(5グルコースモノマー)、及びセロヘキソース(6グルコースモノマー)を包含する。有利には、セロビオース等の短鎖のセロデキストリンが適している。また、本開示における分泌されるタンパク質は、セロビオース等の短鎖のセロデキストリンに付着しない。
ある局面において、本開示におけるセルロース系バイオマスは、本開示の細胞によって分解される、生のバイオマス原料であってもよい。分解されたバイオマスは、限定されないが、セルロース及び微結晶性セルロース等の多糖、またはセロデキストリン及びセロビオース等のオリゴ糖を含む。他の局面において、本開示におけるセルロース系バイオマスは、セルロース及び微結晶性セルロース等の精製された多糖、またはセロデキストリン及びセロビオース等のオリゴ糖を含んでいてもよい。さらに他の局面において、本開示のバイオマスは、セルロース及び微結晶性セルロース等の多糖と、セロデキストリン及びセロビオース等のオリゴ糖との混合物を含んでいてもよい。
ある局面において、本開示のセルロース系バイオマスは、タンパク質分泌を誘導するために、本開示の変異体細胞またはリコンビナント細胞へ直接添加されてもよい。
他の局面において、タンパク質の分泌は、セルロース系バイオマスの分解を介して上記細胞によりインサイチュで生じた、セロデキストリンまたはセロビオース等の1つ以上のセルロース誘導体によって、本開示の変異体細胞またはリコンビナント細胞から誘導されてもよい。ある局面において、セルロース系バイオマスは、細胞から分泌を誘導するが、細胞から分泌された1つ以上のタイプのタンパク質に付着しない、あるいは該タンパク質を隔離するセルロース誘導体を生成するのに十分な量である。
さらに、糖は、本開示の変異体細胞またはリコンビナント細胞からタンパク質分泌を誘導するのに用いられてもよい。適切な糖は、限定されないが、多糖、オリゴ糖、ソホロース、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースを含む。
[分泌されるタンパク質]
ある局面において、本開示の変異体細胞またはリコンビナント細胞は、セルロース系バイオマスまたは糖による誘導に応答して、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、またはそれ以上のタイプのタンパク質の分泌を増加させる。
ある局面において、本開示の変異体細胞またはリコンビナント細胞は、セルロース系バイオマスまたは糖による誘導に応答して、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、またはそれ以上のタイプのタンパク質の分泌を増加させる。
本明細書に使用されるとき、増加した分泌は、本開示のタンパク質の分泌の増加したレベルを指す。分泌は、細胞内から細胞外へのタンパク質の移動を包含している。分泌の増加したレベルは、所望のタンパク質の発現または生成を増加する結果であってもよい。または、分泌の増加したレベルは、所望のタンパク質の細胞からの輸送を増加した結果であってもよい。本開示の方法は、タンパク質の生成及び分泌に関わる経路を改変し結果としてタンパク質の分泌レベル全体を増加させることによって、タンパク質の分泌レベルを増加させてもよい。
分泌され得る本開示のタンパク質のタイプは、限定されないが、内因性タンパク質及び異種タンパク質を包含する。本開示の内因性タンパク質は、本開示の細胞に内在するタンパク質である、あるいは、本開示の細胞によって自然に生成される。本開示の異種タンパク質は、本開示の細胞内で自然に発現されないタンパク質である。異種タンパク質は、当該技術において公知な任意の方法によって、組換えによって細胞内で発現されてもよい。一般的に、異種タンパク質をコードするリコンビナント核酸は、操作できるように、プロモーター等の調節配列に連結されている。当該技術において公知な、適切な調節配列が用いられてもよい。適切なプロモーターは、限定されないが、恒常的プロモーター及び誘導性プロモーターを包含する。さらに、異種タンパク質は、細胞から自身の分泌を導く分泌ペプチドを含んでもよい。本開示の方法における使用に適した、当該技術において公知な任意の分泌ペプチドが使用されてもよい。
ある局面において、分泌されたタンパク質は、セルロース誘導性タンパク質である。本明細書に使用されるとき、「セルロース誘導性タンパク質」は、野生型細胞(例えば非変異体細胞または非リコンビナント細胞)における発現及び分泌がセルロースによって誘導されるタンパク質を指す。例えば、セルロース誘導性タンパク質は、C.M. Phillips et al., 2011 (Phillips, CM et al., Proteome Res. 2011 Sep 2;10(9):4177-85. Epub 2011 Aug 1) に記載されている。
本開示における、分泌されたセルロース誘導性タンパク質は、限定されないが、セルラーゼ、GH61酵素、セロビオースデヒドロゲナーゼ、ラクトナーゼ、カルボヒドレートエステラーゼ、多糖リアーゼ、及びセルロース結合ドメイン含有タンパク質を含む。
本明細書に使用されるとき、「セルラーゼ」または「セルラーゼペプチド」は、セルロース、リケニン、及び穀物β−D−グルカンの加水分解を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを指す。例えば、セルラーゼは、セルロースにおける1,4−β−D−グルコシド結合を加水分解してもよい。本開示のセルラーゼは、限定されないが、エンドセルラーゼ、エンドグルカナーゼ、エンド−1,4−β−グルカナーゼ、エンド−1,4−β−D−グルカナーゼ、カルボキシメチルセルラーゼ(CMCases)、β−1,4−グルカナーゼ、β−1,4−エンドグルカンヒドロラーゼ、及びセルデキストリナーゼ、エキソグルカナーゼ等のエキソセルラーゼ、セロビナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セロビオースデヒドロゲナーゼ等の酸化セルラーゼ、並びにセルロースホスホリラーゼを包含する。
本明細書に使用されるとき、「GH61酵素」は、グルコシドヒドロラーゼファミリー61酵素を指す。本開示のGH61酵素は、セルラーゼ活性を促進することができる。GH61酵素の例は、限定されないが、多糖モノオキシゲナーゼを包含する。ある局面において、本開示のGH61ヒドロラーゼは、GH61−1遺伝子、GH61−2遺伝子、GH61−5遺伝子、NCU07898遺伝子、NCU08760遺伝子、これらのホモログ、及びこれらの相同分子種によってコードされる。
セロビオースデヒドロゲナーゼは、酸化還元酵素活性を有する酵素であり、EC 1.1.99.18活性を有する酵素を包含する。ある局面において、セロビオースデヒドロゲナーゼは、NCU00206、cdh−1遺伝子、これらのホモログ、及びこれらの相同分子種によってコードされる。
ラクトナーゼは、アシル化ホモセリンラクトンにおけるホモセリンラクトン環のエステル結合を加水分解し得る酵素である。ある局面において、本開示のラクトナーゼは、NCU07143、lac−2遺伝子、これらのホモログ、及びこれらの相同分子種によってコードされる。
カルボヒドレートエステラーゼは、EC 3.1.1.−活性及びEC 3.1.2−活性を有する酵素である。カルボヒドレートエステラーゼの例は、限定されないが、アセチルキシランエステラーゼ、シンナモイルエステラーゼ、フェルロイルエステラーゼ、カルボキシルエステラーゼ、及びS−フォルミルグルタチオンヒドロラーゼを包含する。ある局面において、本開示のカルボヒドレートエステラーゼは、NCU09491、NCU09664、これらのホモログ、及びこれらの相同分子種によってコードされる。
多糖リアーゼは、EC 4.2.2−活性を有する酵素である。ある局面において、本開示の多糖リアーゼは、NCU05598、このホモログ、及びこの相同分子種によってコードされる。
本明細書に使用されるとき、「セルロース結合ドメイン含有タンパク質」は、セルロース結合ドメインを含むタンパク質を指す。セルロース結合ドメインは、グルコシドヒドロラーゼ等のセルロース−活性酵素に見られるタンパク質ドメインである。一般的に、セルロース結合ドメインは、カルボヒドレート結合活性を有する。ある局面において、本開示のセルロース結合ドメイン含有タンパク質は、NCU09764、このホモログ、及びこの相同分子種によってコードされる。
ある局面において、本開示における分泌されたセルロース誘導性タンパク質は、NCU05137、このホモログ、及びこの相同分子種によってコードされるタンパク質である。
[変異体細胞]
本開示の一局面は、セルロース系バイオマスまたは糖に応答したタンパク質の分泌増加を示す変異体細胞及びリコンビナント細胞、並びに、このような細胞を、タンパク質の細胞からの分泌を増加させるため、及びリグノセルロース系バイオマスを分解するために、利用する方法に関する。ここに開示されているように、本開示の変異体細胞は、少なくとも1つの遺伝子にて不活性変異を含む。適切な不活性変異の例は、限定されないが、欠失、点変異、機能欠損変異、切断、重複、転位、及び/または反転を包含し、結果として遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を阻害する。所望の遺伝子にて1つ以上の不活性変異を生成する方法は、当該技術において公知であり、特に限定されないが、PCR変異誘発、挿入変異誘発、化学変異誘発、及び照射を包含する。
本開示の一局面は、セルロース系バイオマスまたは糖に応答したタンパク質の分泌増加を示す変異体細胞及びリコンビナント細胞、並びに、このような細胞を、タンパク質の細胞からの分泌を増加させるため、及びリグノセルロース系バイオマスを分解するために、利用する方法に関する。ここに開示されているように、本開示の変異体細胞は、少なくとも1つの遺伝子にて不活性変異を含む。適切な不活性変異の例は、限定されないが、欠失、点変異、機能欠損変異、切断、重複、転位、及び/または反転を包含し、結果として遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を阻害する。所望の遺伝子にて1つ以上の不活性変異を生成する方法は、当該技術において公知であり、特に限定されないが、PCR変異誘発、挿入変異誘発、化学変異誘発、及び照射を包含する。
本開示の一局面において、上記変異体細胞は、真菌細胞または酵母細胞である。本開示のもう1つの局面において、上記変異体細胞は、子嚢菌種担子菌種の真菌細胞、Neurospora crassa (N. crassa)細胞、Aspergillus nidulans細胞、Trichoderma reesei細胞、Phanerochaete chrysosporium細胞、Sporotrichum thermophile (Myceliophthora thermophila)細胞、Gibberella zeae細胞、Sclerotinia sclerotiorum細胞、Botryotinia fuckeliana細胞、Aspergillus niger細胞、Penicillium chrysogenum 細胞、 Schizophyllum commune細胞、Postia placenta細胞、Aspergillus oryzae細胞、またはAcremonium cellulolyticus細胞であってもよい。好ましくは、上記変異体細胞は、N. crassa変異体細胞である。本開示のもう1つの局面において、上記変異体細胞は、リコンビナント細胞である。好ましくは、上記変異体、リコンビナント細胞は、N. crassa変異体、リコンビナント細胞である。
[β−グルコシダーゼ変異体細胞]
β−グルコシダーゼ遺伝子は、β−グルコシダーゼ酵素をコードする。本明細書に使用されるとき、「β−グルコシダーゼ」は、グルコースの遊離とともに末端非還元のβ−D−グルコース残基の加水分解を触媒するβ−グルコシドグルコヒドロラーゼを指す。β−グルコシダーゼは、高度に保存された酵素である。
β−グルコシダーゼ遺伝子は、β−グルコシダーゼ酵素をコードする。本明細書に使用されるとき、「β−グルコシダーゼ」は、グルコースの遊離とともに末端非還元のβ−D−グルコース残基の加水分解を触媒するβ−グルコシドグルコヒドロラーゼを指す。β−グルコシダーゼは、高度に保存された酵素である。
一局面において、本開示の変異体細胞は、少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子にて不活性化変異を含む。この変異は、上記少なくとも2つの遺伝子によってコードされるβ−グルコシダーゼの機能欠陥を引き起こす。少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の不活性化変異は、特に限定されないが、欠失、点変異、ナンセンス変異、切断、及び挿入を包含する。不活性化変異は、β−グルコシダーゼ活性を完全になくす、あるいは、β−グルコシダーゼ活性を、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、またはそれ以上、阻害してもよい。不活性化変異は、変異遺伝子の発現レベルに影響を与える、あるいは、変異遺伝子によりコードされたタンパク質若しくはRNAの機能活性に影響を与えてもよい。また、不活性化変異は、シス作用性またはトランス作用性であってもよい。不活性化変異は、照射若しくは変異原化学物質への暴露を包含する、ランダム変異誘発によって誘導されてもよいし、あるいは、相同組み換え、及び不活性化変異を有する菌株の交配を包含する、標的方式にて誘導されてもよい。
本開示の不活性変異を含むβ−グルコシダーゼは、細胞内のβ−グルコシダーゼまたは細胞外の(すなわち分泌された)β−グルコシダーゼであってもよい。不活性変異を含む、適したβ−グルコシダーゼの例は、限定されないが、N. crassa遺伝子NCU00130、NCU04952、NCU08755、これらのホモログ、及びこれらの相同分子種によってコードされるものを包含する。NCU00130の相同分子種、NCU04952の相同分子種、及びNCU08755の相同分子種の例は、限定されないが、図13〜16にリスト化されたものを包含する。
本開示における特有の一局面において、セルロース系バイオマスまたは糖は、少なくとも1つのタイプのタンパク質を、不活性化β−グルコシダーゼ変異を欠く細胞のレベルと比較して、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍、10,000倍、50,000倍または100,000倍高いレベルで転写するように上記変異体細胞を誘導してもよい。
本開示における特有の一局面において、セルロース系バイオマスまたは糖は、誘導2日後の少なくとも1つのタイプのタンパク質を、不活性化β−グルコシダーゼ変異を欠く細胞のレベルと比較して、1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍、2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍、または10,000倍高いレベルで分泌するように上記変異体細胞を誘導してもよい。
本開示におけるもう1つの特有の局面において、セルロース系バイオマスまたは糖は、誘導2日後の全タンパク質を、不活性化β−グルコシダーゼ変異を欠く細胞のレベルと比較して、1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、または10倍高いレベルで分泌するように上記変異体細胞を誘導してもよい。
本開示におけるもう1つの特有の局面において、少なくとも1nM、少なくとも5nM、少なくとも10nM、15nM、少なくとも20nM、少なくとも25nM、30nM、少なくとも35nM、少なくとも40nM、45nM、少なくとも50nM、少なくとも55nM、60nM、少なくとも65nM、少なくとも70nM、少なくとも75nM、80nM、少なくとも85nM、90nM、少なくとも95nM、少なくとも100nM、少なくとも125nM、150nM、少なくとも175nM、200nM、少なくとも225nM、少なくとも250nM、少なくとも275nM、300nM、少なくとも325nM、350nM、少なくとも375nM、少なくとも400nM、少なくとも425nM、少なくとも450nM、少なくとも475nM、500nM、少なくとも525nM、少なくとも550nM、少なくとも575nM、600nM、少なくとも625nM、650nM、少なくとも675nM、少なくとも700nM、少なくとも725nM、少なくとも750nM、少なくとも775nM、800nM、少なくとも825nM、少なくとも850nM、少なくとも875nM、900nM、少なくとも925nM、950nM、少なくとも975nM、少なくとも1μM、少なくとも2μM、少なくとも3μM、少なくとも4μM、少なくとも5μM、少なくとも6μM、少なくとも7μM、少なくとも8μM、少なくとも9μM、少なくとも10μM、少なくとも15μM、少なくとも20μM、少なくとも25μM、少なくとも30μM、少なくとも35μM、少なくとも40μM、少なくとも45μM、少なくとも50μM、少なくとも55μM、少なくとも60μM、少なくとも65μM、少なくとも70μM、少なくとも75μM、少なくとも80μM、少なくとも85μM、少なくとも90μM、少なくとも95μM、少なくとも100μM、少なくとも125μM、少なくとも150μM、少なくとも175μM、少なくとも200μM、少なくとも225μM、少なくとも250μM、少なくとも275μM、少なくとも300μM、少なくとも325μM、少なくとも350μM、少なくとも375μM、少なくとも400μM、少なくとも425μM、少なくとも450μM、少なくとも475μM、少なくとも500μM、少なくとも525μM、少なくとも550μM、少なくとも575μM、少なくとも600μM、少なくとも625μM、少なくとも650μM、少なくとも675μM、少なくとも700μM、少なくとも725μM、少なくとも750μM、少なくとも775μM、少なくとも800μM、少なくとも825μM、少なくとも850μM、少なくとも875μM、少なくとも900μM、少なくとも925μM、少なくとも950μM、少なくとも975μM、少なくとも1mM、少なくとも2mM、少なくとも3mM、少なくとも4mM、少なくとも5mM、少なくとも6mM、少なくとも7mM、少なくとも8mM、少なくとも9mM、少なくとも10mM、少なくとも11mM、少なくとも12mM、少なくとも13 mM、少なくとも14mM、少なくとも15mM、少なくとも16mM、少なくとも17mM、少なくとも18mM、少なくとも19mM、少なくとも20mM、またはそれ以上のセルロース系バイオマスまたは糖の誘導後、上記変異体細胞は、少なくとも1つのタイプのタンパク質を、不活性化β−グルコシダーゼ変異を欠く細胞のレベルと比較して、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍、10,000倍、50,000倍または100,000倍高いレベルで転写してもよい。
本開示におけるもう1つの特有の局面において、少なくとも1nM、少なくとも5nM、少なくとも10nM、15nM、少なくとも20nM、少なくとも25nM、30nM、少なくとも35nM、少なくとも40nM、45nM、少なくとも50nM、少なくとも55nM、60nM、少なくとも65nM、少なくとも70nM、少なくとも75nM、80nM、少なくとも85nM、90nM、少なくとも95nM、少なくとも100nM、少なくとも125nM、150nM、少なくとも175nM、200nM、少なくとも225nM、少なくとも250nM、少なくとも275nM、300nM、少なくとも325nM、350nM、少なくとも375nM、少なくとも400nM、少なくとも425nM、少なくとも450nM、少なくとも475nM、500nM、少なくとも525nM、少なくとも550nM、少なくとも575nM、600nM、少なくとも625nM、650nM、少なくとも675nM、少なくとも700nM、少なくとも725nM、少なくとも750nM、少なくとも775nM、800nM、少なくとも825nM、少なくとも850nM、少なくとも875nM、900nM、少なくとも925nM、950nM、少なくとも975nM、少なくとも1μM、少なくとも2μM、少なくとも3μM、少なくとも4μM、少なくとも5μM、少なくとも6μM、少なくとも7μM、少なくとも8μM、少なくとも9μM、少なくとも10μM、少なくとも15μM、少なくとも20μM、少なくとも25μM、少なくとも30μM、少なくとも35μM、少なくとも40μM、少なくとも45μM、少なくとも50μM、少なくとも55μM、少なくとも60μM、少なくとも65μM、少なくとも70μM、少なくとも75μM、少なくとも80μM、少なくとも85μM、少なくとも90μM、少なくとも95μM、少なくとも100μM、少なくとも125μM、少なくとも150μM、少なくとも175μM、少なくとも200μM、少なくとも225μM、少なくとも250μM、少なくとも275μM、少なくとも300μM、少なくとも325μM、少なくとも350μM、少なくとも375μM、少なくとも400μM、少なくとも425μM、少なくとも450μM、少なくとも475μM、少なくとも500μM、少なくとも525μM、少なくとも550μM、少なくとも575μM、少なくとも600μM、少なくとも625μM、少なくとも650μM、少なくとも675μM、少なくとも700μM、少なくとも725μM、少なくとも750μM、少なくとも775μM、少なくとも800μM、少なくとも825μM、少なくとも850μM、少なくとも875μM、少なくとも900μM、少なくとも925μM、少なくとも950μM、少なくとも975μM、少なくとも1mM、少なくとも2mM、少なくとも3mM、少なくとも4mM、少なくとも5mM、少なくとも6mM、少なくとも7mM、少なくとも8mM、少なくとも9mM、少なくとも10mM、少なくとも11mM、少なくとも12mM、少なくとも13mM、少なくとも14mM、少なくとも15mM、少なくとも16mM、少なくとも17mM、少なくとも18mM、少なくとも19mM、少なくとも20mM、またはそれ以上のセルロース系バイオマスまたは糖の誘導後、上記変異体細胞は、少なくとも1つのタイプのタンパク質を、不活性化β−グルコシダーゼ変異を欠く細胞のレベルと比較して、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍、または256倍高いレベルで分泌してもよい。
本開示におけるもう1つの特有の局面において、上記少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子は、少なくとも3つのβ−グルコシダーゼ遺伝子、少なくとも4つのβ−グルコシダーゼ遺伝子、少なくとも5つのβ−グルコシダーゼ遺伝子、少なくとも6つのβ−グルコシダーゼ遺伝子、少なくとも7つのβ−グルコシダーゼ遺伝子またはそれ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。
本開示における1つの好ましい実施形態では、N. crassa細胞において、上記β−グルコシダーゼ遺伝子NCU00130、NCU04952、及びNCU08755は、欠失されている。
本開示におけるもう1つの局面において、少なくとも2つのβ−グルコシダーゼの活性を低減する不活性化変異を含む上記変異体細胞は、さらに、cre−1遺伝子にて不活性化変異を含み、セルロース系バイオマスまたは糖の誘導によって、cre−1遺伝子において変異を欠く細胞のレベルよりも高いレベルで少なくとも1つのタイプのタンパク質を分泌する。不活性化変異は、変異遺伝子の発現レベルに影響を与える、あるいは、変異遺伝子によりコードされるタンパク質若しくはRNAの機能活性に影響を与えてもよい。また、不活性化変異は、シス作用性またはトランス作用性であってもよい。不活性化変異は、照射若しくは変異原化学物質への暴露を包含する、ランダム変異誘発によって誘導されてもよいし、あるいは、相同組み換え、及び単一または多重の不活性化変異を有する菌株の交配を包含する、標的方式にて誘導されてもよい。
本開示の特有の一局面において、セルロース系バイオマスまたは糖は、少なくとも1つのタイプのタンパク質を、不活性化creA/cre−1変異を欠く細胞のレベルと比較して、2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍、10,000倍、50,000倍、または100,000倍高いレベルで転写するように上記変異体細胞を誘導してもよい。
本開示の特有の一局面において、セルロース系バイオマスまたは糖は、少なくとも1つのタイプのタンパク質を、β−グルコシダーゼ変異またはcre−1変異を欠く細胞のレベルと比較して、1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍、2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000、または10,000倍高いレベルで分泌するように上記変異体細胞を誘導してもよい。
本開示におけるもう1つの特有の局面において、セルロース系バイオマスまたは糖は、誘導2日後の全タンパク質を、β−グルコシダーゼ変異またはcre−1変異を欠く細胞のレベルと比較して、1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、または10倍高いレベルで分泌するように上記変異体細胞を誘導してもよい。
本開示におけるもう1つの特有の局面において、1nM、少なくとも5nM、少なくとも10nM、15nM、少なくとも20nM、少なくとも25nM、30nM、少なくとも35nM、少なくとも40nM、45nM、少なくとも50nM、少なくとも55nM、60nM、少なくとも65nM、少なくとも70nM、少なくとも75nM、80nM、少なくとも85nM、90nM、少なくとも95nM、少なくとも100nM、少なくとも125nM、150nM、少なくとも175nM、200nM、少なくとも225nM、少なくとも250nM、少なくとも275nM、300nM、少なくとも325nM、350nM、少なくとも375nM、少なくとも400nM、少なくとも425nM、少なくとも450nM、少なくとも475nM、500nM、少なくとも525nM、少なくとも550nM、少なくとも575nM、600nM、少なくとも625nM、650nM、少なくとも675nM、少なくとも700nM、少なくとも725nM、少なくとも750nM、少なくとも775nM、800nM、少なくとも825nM、少なくとも850nM、少なくとも875nM、900nM、少なくとも925nM、950nM、少なくとも975nM、少なくとも1μM、少なくとも2μM、少なくとも3μM、少なくとも4μM、少なくとも5μM、少なくとも6μM、少なくとも7μM、少なくとも8μM、少なくとも9μM、少なくとも10μM、少なくとも15μM、少なくとも20μM、少なくとも25μM、少なくとも30μM、少なくとも35μM、少なくとも40μM、少なくとも45μM、少なくとも50μM、少なくとも55μM、少なくとも60μM、少なくとも65μM、少なくとも70μM、少なくとも75μM、少なくとも80μM、少なくとも85μM、少なくとも90μM、少なくとも95μM、少なくとも100μM、少なくとも125μM、少なくとも150μM、少なくとも175μM、少なくとも200μM、少なくとも225μM、少なくとも250μM、少なくとも275μM、少なくとも300μM、少なくとも325μM、少なくとも350μM、少なくとも375μM、少なくとも400μM、少なくとも425μM、少なくとも450μM、少なくとも475μM、少なくとも500μM、少なくとも525μM、少なくとも550μM、少なくとも575μM、少なくとも600μM、少なくとも625μM、少なくとも650μM、少なくとも675μM、少なくとも700μM、少なくとも725μM、少なくとも750μM、少なくとも775μM、少なくとも800μM、少なくとも825μM、少なくとも850μM、少なくとも875μM、少なくとも900μM、少なくとも925μM、少なくとも950μM、少なくとも975μM、少なくとも1mM、少なくとも2mM、少なくとも3mM、少なくとも4mM、少なくとも5mM、少なくとも6mM、少なくとも7mM、少なくとも8mM、少なくとも9mM、少なくとも10mM、少なくとも11mM、少なくとも12mM、少なくとも13mM、少なくとも14mM、少なくとも15mM、少なくとも16mM、少なくとも17mM、少なくとも18mM、少なくとも19mM、少なくとも20mM、またはそれ以上のセルロース系バイオマスまたは糖の誘導後、上記変異体細胞は、少なくとも1つのタイプのタンパク質を、β−グルコシダーゼ変異またはcre−1変異を欠く細胞のレベルと比較して、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍、10,000倍、50,000倍または100,000倍高いレベルで転写してもよい。
本開示におけるもう1つの特有の局面において、1nM、少なくとも5nM、少なくとも10nM、15nM、少なくとも20nM、少なくとも25nM、30nM、少なくとも35nM、少なくとも40nM、45nM、少なくとも50nM、少なくとも55nM、60nM、少なくとも65nM、少なくとも70nM、少なくとも75nM、80nM、少なくとも85nM、90nM、少なくとも95nM、少なくとも100nM、少なくとも125nM、150nM、少なくとも175nM、200nM、少なくとも225nM、少なくとも250nM、少なくとも275nM、300nM、少なくとも325nM、350nM、少なくとも375nM、少なくとも400nM、少なくとも425nM、少なくとも450nM、少なくとも475nM、500nM、少なくとも525nM、少なくとも550nM、少なくとも575nM、600nM、少なくとも625nM、650nM、少なくとも675nM、少なくとも700nM、少なくとも725nM、少なくとも750nM、少なくとも775nM、800nM、少なくとも825nM、少なくとも850nM、少なくとも875nM、900nM、少なくとも925nM、950nM、少なくとも975nM、少なくとも1μM、少なくとも2μM、少なくとも3μM、少なくとも4μM、少なくとも5μM、少なくとも6μM、少なくとも7μM、少なくとも8μM、少なくとも9μM、少なくとも10μM、少なくとも15μM、少なくとも20μM、少なくとも25μM、少なくとも30μM、少なくとも35μM、少なくとも40μM、少なくとも45μM、少なくとも50μM、少なくとも55μM、少なくとも60μM、少なくとも65μM、少なくとも70μM、少なくとも75μM、少なくとも80μM、少なくとも85μM、少なくとも90μM、少なくとも95μM、少なくとも100μM、少なくとも125μM、少なくとも150μM、少なくとも175μM、少なくとも200μM、少なくとも225μM、少なくとも250μM、少なくとも275μM、少なくとも300μM、少なくとも325μM、少なくとも350μM、少なくとも375μM、少なくとも400μM、少なくとも425μM、少なくとも450μM、少なくとも475μM、少なくとも500μM、少なくとも525μM、少なくとも550μM、少なくとも575μM、少なくとも600μM、少なくとも625μM、少なくとも650μM、少なくとも675μM、少なくとも700μM、少なくとも725μM、少なくとも750μM、少なくとも775μM、少なくとも800μM、少なくとも825μM、少なくとも850μM、少なくとも875μM、少なくとも900μM、少なくとも925μM、少なくとも950μM、少なくとも975μM、少なくとも1mM、少なくとも2mM、少なくとも3mM、少なくとも4mM、少なくとも5mM、少なくとも6mM、少なくとも7mM、少なくとも8mM、少なくとも9mM、少なくとも10mM、少なくとも11mM、少なくとも12mM、少なくとも13mM、少なくとも14mM、少なくとも15mM、少なくとも16mM、少なくとも17mM、少なくとも18mM、少なくとも19mM、少なくとも20mM、またはそれ以上のセルロース系バイオマスまたは糖の誘導後、上記変異体細胞は、少なくとも1つのタイプのタンパク質を、β−グルコシダーゼ変異またはcre−1変異を欠く細胞のレベルと比較して、1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍、または256倍高いレベルで分泌してもよい。
本開示におけるもう1つの特有の局面において、上記少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子は、少なくとも3つのβ−グルコシダーゼ遺伝子である。
本開示におけるもう1つの好ましい実施形態では、N. crassa細胞において、上記β−グルコシダーゼ遺伝子NCU00130、NCU04952、NCU08755、及び上記cre−1遺伝子は、欠失されている。
[CreA/cre−1変異体細胞]
一局面において、本開示の変異体細胞は、creA/cre−1遺伝子にて不活性化変異を含む。この変異は、上記遺伝子によってコードされるCreA/CRE−1の機能欠陥を引き起こす。creA/cre−1遺伝子の不活性化変異は、特に限定されないが、欠失変異、点変異、ナンセンス変異、切断、及び挿入を包含する。不活性化変異は、CreA/CRE−1活性を、完全になくす、あるいは、CreA/CRE−1活性を、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、またはそれ以上、阻害してもよい。不活性化変異は、変異遺伝子の発現レベルに影響を与える、あるいは、変異遺伝子によりコードされたタンパク質若しくはRNAの機能活性に影響を与えてもよい。また、不活性化変異は、シス作用性またはトランス作用性であってもよい。不活性化変異は、照射若しくは変異原化学物質への暴露を包含する、ランダム変異誘発によって誘導されてもよいし、あるいは、相同組み換え、及び不活性化変異を有する菌株の交配を包含する、標的方式にて誘導されてもよい。本明細書に使用されるとき、「cre−1遺伝子」及び「creA/cre−1遺伝子」は、置換可能に使用される。
一局面において、本開示の変異体細胞は、creA/cre−1遺伝子にて不活性化変異を含む。この変異は、上記遺伝子によってコードされるCreA/CRE−1の機能欠陥を引き起こす。creA/cre−1遺伝子の不活性化変異は、特に限定されないが、欠失変異、点変異、ナンセンス変異、切断、及び挿入を包含する。不活性化変異は、CreA/CRE−1活性を、完全になくす、あるいは、CreA/CRE−1活性を、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、またはそれ以上、阻害してもよい。不活性化変異は、変異遺伝子の発現レベルに影響を与える、あるいは、変異遺伝子によりコードされたタンパク質若しくはRNAの機能活性に影響を与えてもよい。また、不活性化変異は、シス作用性またはトランス作用性であってもよい。不活性化変異は、照射若しくは変異原化学物質への暴露を包含する、ランダム変異誘発によって誘導されてもよいし、あるいは、相同組み換え、及び不活性化変異を有する菌株の交配を包含する、標的方式にて誘導されてもよい。本明細書に使用されるとき、「cre−1遺伝子」及び「creA/cre−1遺伝子」は、置換可能に使用される。
本開示の特有の一局面において、セルロース系バイオマスまたは糖は、少なくとも1つのタイプのタンパク質を、不活性化cre−1変異を欠く細胞のレベルと比較して、2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍、10,000倍、50,000倍、または100,000倍高いレベルで転写するように上記変異体細胞を誘導してもよい。
本開示の特有の一局面において、セルロース系バイオマスまたは糖は、少なくとも1つのタイプのタンパク質を、不活性化cre−1変異を欠く細胞のレベルと比較して、1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍、2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍、または10,000倍高いレベルで分泌するように、不活性化cre−1変異を含む上記変異体細胞を誘導してもよい。
本開示におけるもう1つの特有の局面において、上記変異体細胞は、cre−1変異を欠く細胞に対して、C−化合物/糖代謝、細胞外代謝、結合機能または補因子要求性を有するタンパク質、C−化合物/糖の輸送、輸送機構、及びタンパク質合成に関わる遺伝子の発現の基底レベルを向上させる。
本開示の好ましい一例では、N. crassa細胞において、上記cre−1遺伝子は、欠失されている。
本開示のもう1つの局面において、cre−1遺伝子にて不活性化変異を含む上記変異体細胞は、さらに、少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子によってコードされる、β−グルコシダーゼ活性をなくす不活性変異を含む。少なくとも2つのβ−グルコシダーゼにおける不活性変異は、欠失、点変異、ナンセンス変異、切断、及び挿入を包含する。不活性化変異は、β−グルコシダーゼ活性を完全になくす、あるいは、上記活性を、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、またはそれ以上、阻害してもよい。不活性化変異は、変異遺伝子の発現レベルに影響を与える、あるいは、変異遺伝子によりコードされたタンパク質若しくはRNAの機能活性に影響を与えてもよい。また、不活性化変異は、シス作用性またはトランス作用性であってもよい。不活性化変異は、照射若しくは変異原化学物質への暴露を包含する、ランダム変異誘発によって誘導されてもよいし、あるいは、相同組み換え、及び不活性化変異を有する菌株の交配を包含する、標的方式にて誘導されてもよい。上記β−グルコシダーゼは、細胞内のβ−グルコシダーゼ、または細胞外の(すなわち、分泌された)β−グルコシダーゼであってもよい。
本開示の特有の一局面において、セルロース系バイオマスまたは糖は、少なくとも1つのタイプのタンパク質を、不活性化β−グルコシダーゼ変異を欠く細胞のレベルと比較して、2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍、10,000倍、50,000倍、または100,000倍高いレベルで転写するように上記変異体細胞を誘導してもよい。
本開示の特有の一局面において、本開示の特有の一局面において、セルロース系バイオマスまたは糖は、少なくとも1つのタイプのタンパク質を、少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子にて不活性化変異を欠く細胞のレベルと比較して、1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍、2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍、または10,000倍高いレベルで分泌するように上記変異体細胞を誘導してもよい。
本開示におけるもう1つの特有の局面において、上記少なくとも2つのβ−グルコシダーゼは、3つのβ−グルコシダーゼである。
本開示の好ましい一実施形態では、上記変異体細胞は、β−グルコシダーゼ遺伝子NCU00130、NCU04952、及びNCU08755の欠失、並びにcre−1の欠失を含む、N. crassa細胞である。
[β−マンノシダーゼ変異体細胞]
本開示におけるもう1つの局面において、少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の活性を低減させる不活性化変異を含む本開示の変異体細胞、cre−1遺伝子にて不活性化変異を含む本開示の変異体細胞、並びに/または、少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の活性を低減させる不活性化変異及びcre−1遺伝子での不活性化変異を含む変異体細胞は、さらに、少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の活性を低減させる変異を含む。
本開示におけるもう1つの局面において、少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の活性を低減させる不活性化変異を含む本開示の変異体細胞、cre−1遺伝子にて不活性化変異を含む本開示の変異体細胞、並びに/または、少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の活性を低減させる不活性化変異及びcre−1遺伝子での不活性化変異を含む変異体細胞は、さらに、少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の活性を低減させる変異を含む。
本開示におけるβ−マンノシダーゼ遺伝子は、β−マンノシダーゼ酵素をコードする。本明細書に使用されるとき、「β−マンノシダーゼ」、「マンナンエンド−1,4−β−マンノシダーゼ」、「エンド−1,4−β−マンノシダーゼ」、「エンド−β−1,4−マンナナーゼ」、「β-マンナナーゼB」、「β−1,4−マンナン4−マンナノヒドロラーゼ」、「エンド−β−マンナナーゼ」、「β−D−マンナナーゼ」、及び「1,4−β−D−マンナンマンナノヒドロラーゼ」は、置換可能に使用され、マンナン、ガラクトマンナン、及びグルコマンナンにおける1,4−β−D−マンノシド結合をランダムに加水分解できる酵素を指す(EC3.2.1.78)。ある局面において、上記少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子は、NCU00890、T. reeseiタンパク質ID62166、T. reeseiンパク質ID57857、これらのホモログ、及びこれらの相同分子種である。
一局面において、本開示の変異体細胞は、少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子にて不活性化変異を含む。この変異は、上記遺伝子によってコードされるβ−マンノシダーゼの機能欠陥を引き起こす。上記少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の不活性化変異は、限定されないが、欠失変異、点変異、ナンセンス変異、切断、及び挿入を包含する。不活性化変異は、β−マンノシダーゼ活性を完全になくす、あるいは、β−マンノシダーゼ活性を、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、またはそれ以上、阻害してもよい。不活性化変異は、変異遺伝子の発現レベルに影響を与える、あるいは、変異遺伝子によりコードされたタンパク質若しくはRNAの機能活性に影響を与えてもよい。また、不活性化変異は、シス作用性またはトランス作用性であってもよい。不活性化変異は、照射若しくは変異原化学物質への暴露を包含する、ランダム変異誘発によって誘導されてもよいし、あるいは、相同組み換え、及び不活性化変異を有する菌株の交配を包含する、標的方式にて誘導されてもよい。
本開示の特有の一局面において、セルロース系バイオマスまたは糖は、少なくとも1つのタイプのタンパク質を、少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の不活性化変異を欠く細胞のレベルと比較して、2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍、10,000倍、50,000倍、または100,000倍高いレベルで転写するように、少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の不活性化変異をさらに含む変異体細胞を誘導してもよい。
本開示の特有の一局面において、セルロース系バイオマスまたは糖は、少なくとも1つのタイプのタンパク質を、少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の不活性化変異を欠く細胞のレベルと比較して、1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍、2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍、または10,000倍高いレベルで分泌するように、少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の不活性化変異をさらに含む変異体細胞を誘導してもよい。
本開示の好ましい一例では、N. crassa細胞において、上記少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子は、欠失されている。
[ホスホリパーゼ変異体細胞]
本開示におけるもう1つの局面において、少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の活性を低減させる不活性化変異を含む本開示の変異体細胞、creA/cre−1遺伝子にて不活性化変異を含む本開示の変異体細胞、少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の活性を低減させる不活性化変異及びcreA/cre−1遺伝子での不活性化変異を含む変異体細胞、並びに/または、少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の活性を低減させる不活性化変異、creA/cre−1遺伝子での不活性化変異、及び少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の活性を低減させる不活性化変異を含む本開示の変異体細胞は、さらに、少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の活性を低減させる不活性化変異を含む。
本開示におけるもう1つの局面において、少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の活性を低減させる不活性化変異を含む本開示の変異体細胞、creA/cre−1遺伝子にて不活性化変異を含む本開示の変異体細胞、少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の活性を低減させる不活性化変異及びcreA/cre−1遺伝子での不活性化変異を含む変異体細胞、並びに/または、少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の活性を低減させる不活性化変異、creA/cre−1遺伝子での不活性化変異、及び少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の活性を低減させる不活性化変異を含む本開示の変異体細胞は、さらに、少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の活性を低減させる不活性化変異を含む。
本明細書に使用されるとき、「ホスホリパーゼ様遺伝子」は、ホスホリパーゼ遺伝子と相同性がある配列を有する遺伝子、またはホスホリパーゼと相同性があるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子である。例えば、本開示のホスホリパーゼ様遺伝子は、NCU06650であってもよい。NCU06650は、ホスホリパーゼ活性を示すタンパク質をコードすることが示されていない一方、そのコードされるアミノ酸配列と最も近い関連ホモログは、ホスホリパーゼである。
本開示のホスホリパーゼ遺伝子は、ホスホリパーゼ酵素をコードする。本明細書に使用されるホスホリパーゼ酵素は、限定されないが、リン脂質を、例えば脂肪酸及び他の脂肪親和性に分子加水分解する任意の酵素を包含する。ホスホリパーゼをコードする遺伝子は、限定されないが、ホスホリパーゼA1、ホスホリパーゼA2、ホスホリパーゼB、ホスホリパーゼC、ホスホリパーゼD、またはホスホジエステラーゼをコードする遺伝子を包含する。
従って、ある局面において、上記少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子は、NCU06650、T. reeseiタンパク質ID67579、これらのホモログ、及びこれらの相同分子種である。
一局面において、本開示の変異体細胞は、少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子にて不活性化変異を含む。この変異は、上記遺伝子によってコードされるタンパク質の機能欠陥を引き起こす。上記少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の不活性化変異は、限定されないが、欠失変異、点変異、ナンセンス変異、切断、及び挿入を包含する。不活性化変異は、ホスホリパーゼ活性を完全になくす、あるいは、ホスホリパーゼ活性を、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、またはそれ以上、阻害してもよい。不活性化変異は、変異遺伝子の発現レベルに影響を与える、あるいは、変異遺伝子によりコードされたタンパク質若しくはRNAの機能活性に影響を与えてもよい。また、不活性化変異は、シス作用性またはトランス作用性であってもよい。不活性化変異は、照射若しくは変異原化学物質への暴露を包含する、ランダム変異誘発によって誘導されてもよいし、あるいは、相同組み換え、及び不活性化変異を有する菌株の交配を包含する、標的方式にて誘導されてもよい。
本開示の特有の一局面において、セルロース系バイオマスまたは糖は、少なくとも1つのタイプのタンパク質を、少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の不活性化変異を欠く細胞のレベルと比較して、2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍、10,000倍、50,000倍、または100,000倍高いレベルで転写するように、少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の不活性化変異をさらに含む変異体細胞を誘導してもよい。
本開示の特有の一局面において、セルロース系バイオマスまたは糖は、少なくとも1つのタイプのタンパク質を、少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の不活性化変異を欠く細胞のレベルと比較して、1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍、2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍、または10,000倍高いレベルで分泌するように、少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の不活性化変異をさらに含む変異体細胞を誘導してもよい。
本開示の好ましい一例では、N. crassa細胞において、上記少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子は、欠失されている。
[リコンビナント細胞]
本開示のもう1つの局面は、細胞において、低減した、少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子またはcre−1遺伝子の発現を示し、セルロース系バイオマス若しくは糖に応答して、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、またはそれ以上のタンパク質の分泌の増加を示すコンビナント細胞、並びに、細胞からのタンパク質の分泌を増加させるため、及びグノセルロース系バイオマスを分解するために、このような細胞を利用する方法に関する。本開示のリコンビナント細胞は、安定な細胞株または一過性にトランスフェクトされた細胞であってもよい。
本開示のもう1つの局面は、細胞において、低減した、少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子またはcre−1遺伝子の発現を示し、セルロース系バイオマス若しくは糖に応答して、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、またはそれ以上のタンパク質の分泌の増加を示すコンビナント細胞、並びに、細胞からのタンパク質の分泌を増加させるため、及びグノセルロース系バイオマスを分解するために、このような細胞を利用する方法に関する。本開示のリコンビナント細胞は、安定な細胞株または一過性にトランスフェクトされた細胞であってもよい。
本開示における、低減した、所望の遺伝子(例えば、β−グルコシダーゼ遺伝子、cre−1遺伝子、β−マンノシダーゼ遺伝子、または、ホスホリパーゼ遺伝子若しくはホスホリパーゼ様遺伝子)の発現を示すリコンビナント細胞は、上記所望の遺伝子の発現を低減させる変異を含んでいてもよい。変異を生じさせ特徴付ける方法は、当該技術において公知であり、変異スクリーニング等である。また、本開示のリコンビナント細胞は、上記所望の遺伝子を標的としその発現を低減させる阻害性オリゴヌクレオチド等の、組換えコンストラクトを含むトランスジェニック細胞であってもよい。上記阻害性オリゴヌクレオチド限定されない例は、siRNA、miRNA、アンチセンスDNAを包含する。さらに、所望の遺伝子の発現は、クエリング及び減数分裂性サイレンシング等の、遺伝子サイレンシング技術によって低減されてもよい。遺伝子サイレンシング技術は、所望の遺伝子、所望のRNA、所望の遺伝子の調節タンパク質を標的とすることができる。
本開示のリコンビナント細胞によって分泌され得るタンパク質のタイプは、限定されないが、セルロース誘導性タンパク質を包含する。セルロース誘導性タンパク質の限定されない例は、限定されないが、セルラーゼ、GH61酵素、セロビオースデヒドロゲナーゼ、ラクトナーゼ、カルボヒドレートエステラーゼ、多糖リアーゼ、及びセルロース結合ドメイン含有タンパク質を包含する。ある局面において、本開示における分泌されるタンパク質は、NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764、またはNCU05137によってコードされる。ある局面において、本開示のリコンビナント細胞は、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、またはそれ以上のタンパク質の分泌を増加させている。
ある局面において、本開示のリコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現を示す。他の実施形態において、本開示のリコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中のcre−1遺伝子の発現と比較して低減したcre−1遺伝子の発現を示す。
ここで用いられている「対応する非リコンビナント細胞」は、上記リコンビナント細胞において遺伝子発現が低減した結果となる上記リコンビナント細胞の改変の欠損を除き、上記リコンビナント細胞と同じ種であり、上記リコンビナント細胞と同じ条件下にて培養された細胞をいう。本開示における遺伝子の「低減した発現」は、対応する改変していない細胞中の遺伝子発現レベルと比較して減少した、改変した細胞中の遺伝子発現レベルをいう。
ある局面において、上記少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現は、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%低減されていてもよい。他の局面において、上記cre−1遺伝子の発現は、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%低減されていてもよい。
本開示の特有の局面において、低減した少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現を示す上記リコンビナント細胞は、さらに、低減した、遺伝子creA/cre−1の発現を示す。creA/cre−1の発現を低減するための手段は、siRNA、miRNA、アンチセンスDNA、クエリング、または減数分裂性サイレンシングを包含する、遺伝子サイレンシング技術であってもよい。遺伝子サイレンシング技術は、creA/cre−1、またはcreA/cre−1の調節タンパク質若しくはRNAを標的としてもよい。creA/cre−1の発現は、少なくとも10%0、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%低減されていてもよい。
本開示におけるもう1つの特有の局面において、低減した少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現を示す上記リコンビナント細胞は、上記CreA/CRE−1転写因子の機能活性が、ドミナントネガティブ変異体の過剰発現またはタンパク質インヒビターによって低減された細胞であってもよい。上記CreA/CRE−1の機能は、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%低減されていてもよい。
本開示におけるもう1つの特有の局面において、低減した少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現を示す上記リコンビナント細胞、並びに/または低減した少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現レベル及び低減した遺伝子creA/cre−1の発現レベルを示す上記リコンビナント細胞は、さらに、低減した、本開示の少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の発現を示してもよい。上記β−マンノシダーゼ遺伝子の発現を低減するための手段は、限定されないが、siRNA、miRNA、アンチセンスDNA、クエリング、または減数分裂性サイレンシングを包含する、遺伝子サイレンシング技術を包含する。遺伝子サイレンシング技術は、上記少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子、またはβ−マンノシダーゼ遺伝子の調節タンパク質若しくはRNAを標的としてもよい。β−マンノシダーゼ遺伝子の発現は、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%低減されていてもよい。ある局面において、β−マンノシダーゼ遺伝子NCU00890の発現は、リコンビナントN. crassa細胞において、低減されている。
本開示におけるもう1つの特有の局面において、低減した少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現を示す上記リコンビナント細胞、低減した少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現及び低減した遺伝子creA/cre−1の発現を示す上記リコンビナント細胞、並びに/または低減した少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現、低減した遺伝子creA/cre−1の発現、及び低減した少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の発現を示す上記リコンビナント細胞は、さらに、低減した、本開示の少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子若しくはホスホリパーゼ様遺伝子の発現を示してもよい。上記ホスホリパーゼの発現を低減するための手段は、限定されないが、siRNA、miRNA、アンチセンスDNA、クエリング、または減数分裂性サイレンシングを包含する、遺伝子サイレンシング技術を包含する。遺伝子サイレンシング技術は、上記少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子若しくはホスホリパーゼ様遺伝子、または遺伝子の調節タンパク質若しくはRNAを標的としてもよい。ホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の発現は、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%低減されていてもよい。ある局面において、遺伝子NCU06650の発現は、リコンビナントN. crassa細胞において、低減されている。
本開示の好ましい実施形態において、β−グルコシダーゼ遺伝子NCU00130、NCU04952、及びNCU08755の発現は、リコンビナントN. crassa細胞において、低減されている。本開示のもう1つの好ましい実施形態において、β−グルコシダーゼ遺伝子NCU00130、NCU04952、及びNCU08755の発現、並びにcre−1遺伝子の発現は、リコンビナントN. crassa細胞において、低減されている。本開示のさらにもう1つの好ましい実施形態において、β−グルコシダーゼ遺伝子NCU00130、NCU04952、及びNCU08755の発現、cre−1遺伝子の発現、並びにβ−マンノシダーゼ遺伝子NCU00890の発現は、リコンビナントN. crassa細胞において、低減されている。本開示のさらに好ましい実施形態において、β−グルコシダーゼ遺伝子NCU00130、NCU04952、及びNCU08755の発現、cre−1遺伝子の発現、β−マンノシダーゼ遺伝子NCU00890の発現、並びに遺伝子NCU06650の発現は、リコンビナントN. crassa細胞において、低減されている。
本開示の一局面において、上記リコンビナント細胞は、低減したcre−1遺伝子の発現を示す。cre−1の発現を低減するための手段は、限定されないが、siRNA、miRNA、アンチセンスDNA、クエリング、または減数分裂性サイレンシングを包含する、遺伝子サイレンシング技術を包含する。遺伝子サイレンシング技術は、cre−1、またはcre−1の調節タンパク質若しくはRNAを標的としてもよい。cre−1の発現は、リコンビナント細胞において、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%低減されていてもよい。
本開示のもう1つの局面において、CreA/CRE−1転写因子の機能活性は、リコンビナント細胞において、ドミナントネガティブ変異体の過剰発現またはタンパク質インヒビターによって低減されている。CreA/cre−1の機能は、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%低減されていてもよい。
[バリアント、配列同一性、及び配列類似性]
比較のための配列のアライメント方法は、当該技術において、公知である。例えば、2つの配列間の配列同一性のパーセンテージの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成され得る。このような数学的アルゴリズムの限定されない例は、Myers 及び Miller (1988) CABIOS 4:11 17のアルゴリズム、Smith et al (1981) Adv. Appl. Math. 2:482の局所ホモロジーアルゴリズム、Needleman及びWunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443 453のホモロジーアライメントアルゴリズム、Pearson及びLipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444 2448の類似性を検索する方法、Karlin 及びAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873 5877において見られるような、改良された、Karlin及びAltschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264のアルゴリズムである。
比較のための配列のアライメント方法は、当該技術において、公知である。例えば、2つの配列間の配列同一性のパーセンテージの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成され得る。このような数学的アルゴリズムの限定されない例は、Myers 及び Miller (1988) CABIOS 4:11 17のアルゴリズム、Smith et al (1981) Adv. Appl. Math. 2:482の局所ホモロジーアルゴリズム、Needleman及びWunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443 453のホモロジーアライメントアルゴリズム、Pearson及びLipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444 2448の類似性を検索する方法、Karlin 及びAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873 5877において見られるような、改良された、Karlin及びAltschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264のアルゴリズムである。
これらの数学的アルゴリズムのコンピュータによる実行は、配列同一性を決定するための配列比較に利用される。このような実行は、限定されないが、PC/GeneプログラムのCLUSTAL(Intelligenetics, Mountain View, Calif.から入手可能)、ALIGNプログラム(Version 2.0)、並びにWisconsin Genetics Software Package, Version 8(Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wis., USAから入手可能)のGAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、及びTFASTAを包含する。これらのプログラムを用いたアライメントは、初期パラメーターを用いて行うことができる。CLUSTALプログラムは、Higgins et al. (1988) Gene 73:237 244 (1988)、Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151 153、Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881 90、Huang et al. (1992) CABIOS 8:155 65、及びPearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307 331によく記載されている。ALIGNプログラムは、上記のMyers及びMiller (1988) のアルゴリズムに基づいている。アミノ酸配列を比較する場合、PAM120重量残基テーブル(weight residue table)、12のギャップ長ペナルティ、及び4のギャップペナルティがALIGNプログラムに用いられ得る。Altschulr et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403のBLASTプログラムは、上記のKarlin 及びAltschul (1990) のアルゴリズムに基づいている。本開示のタンパク質をコードするヌクレオチド配列と相同性があるヌクレオチド配列を得るために、BLASTヌクレオチド検索は、BLASTNプログラム、スコア=100、ワード長=12にて行うことができる。本開示のタンパク質またはポリペプチドと相同性があるアミノ酸配列を得るために、BLASTタンパク質検索は、BLASTXプログラム、スコア=50、ワード長=3にて行うことができる。比較を目的としてギャップを加えたアライメントを得るために、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 に記載されているように、Gapped BLAST(BLAST 2.0)が利用される。あるいは、PSI−BLAST (BLAST 2.0)が、分子間の離間した関係を検出する反復検索を行うのに用いられ得る。上記のAltschul et al. (1997)を参照されたい。BLAST、Gapped BLAST、またはPSI−BLASTを利用する場合、各プログラム(例えば、ヌクレオチド配列に対してBLASTN、タンパク質に対してBLASTX)の初期パラメーターが用いられ得る。http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。アライメントは、検査によって手動にて行われてもよい。
本明細書に使用されるとき、配列同一性、すなわち2つの核酸またはポリペプチドの配列に照らした同一性は、2つの配列において、特有の比較ウィンドウにて最大一致となるように整列したときに同じとなる残基を参照する。配列同一性のパーセンテージがタンパク質への参照に用いられる場合、同一でなくかつアミノ酸の同類置換によりしばしば異なる残基位置は、アミノ酸残基が類似した化学特性(例えば電荷または疎水性)を有する他のアミノ酸に置換されている場合、分子の機能特性が変化していないと認識される。配列が同類置換によって異なる場合、配列同一性のパーセンテージは、上記置換の同類の性質を補正するために、上方に調整されてもよい。このような同類置換によって異なる配列は、配列類似性すなわち類似性を有するといわれている。この調整をする手段は、当業者にとって公知である。通常、これは、完全ミスマッチというよりむしろ部分ミスマッチとして同類置換をスコアリングし、これによって配列同一性のパーセンテージを増加させることを包含する。従って、例えば、同一アミノ酸についてスコア1が付与され、非同類置換についてスコアゼロが付与された場合、同類置換については、ゼロと1との間のスコアが付与される。同類置換のスコアリングは、例えば、プログラムPC/GENE(Intelligenetics, Mountain View, Calif.)において実行されるように、計算される。
核酸は、Sambrook, J. et al. 2000. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition)に記載された技術等の標準的な分子生物学的技術を用いて、合成される、単離される、あるいは、操作されてもよい。技術は、クローニング、cDNAライブラリーの発現、及びmRNA若しくはゲノムDNAの増幅を包含する。
本開示の核酸、またはそのサブ配列は、発現カセットまたはベクターを含むクローニング媒介物に挿入されてもよい。上記クローニング媒介物は、ウイルスベクター、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、フォスミド、バクテリオファージ、または人工染色体であり得る。上記ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはアデノ関連ウイルスベクターを包含し得る。上記クローニング媒介物は、バクテリア人工染色体(BAC)、プラスミド、バクテリオファージP1由来ベクター(PAC)、酵母人工染色体(YAC)、または哺乳類人工染色体(MAC)を包含し得る。
上記核酸は、操作できるように、プロモーターに連結されてもよい。上記プロモーターは、ウイルス、バクテリア、哺乳類、または植物のプロモーターであり得る。上記プロモーターは、恒常的なプロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、または、環境的に調節された、あるいは発生的に調節されたプロモーターであり得る。
[タンパク質の分泌を増加させる方法]
本開示の他の局面は、セルロース系バイオマスまたは糖に応答して、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、またはそれ以上のタイプのタンパク質を分泌することができる本開示の任意の細胞を提供する工程、及び、上記細胞をセルロース系バイオマスまたは糖と接触させることにより、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、またはそれ以上のタイプのタンパク質を分泌するように上記細胞を誘導する工程によって、細胞からのタンパク質の分泌を増加させる方法に関する。
本開示の他の局面は、セルロース系バイオマスまたは糖に応答して、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、またはそれ以上のタイプのタンパク質を分泌することができる本開示の任意の細胞を提供する工程、及び、上記細胞をセルロース系バイオマスまたは糖と接触させることにより、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、またはそれ以上のタイプのタンパク質を分泌するように上記細胞を誘導する工程によって、細胞からのタンパク質の分泌を増加させる方法に関する。
本開示の方法にて用いられてもよいセルロース系バイオマスは、限定されないが、1つ以上の多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースを含む。ある好ましい実施形態において、セルロース系バイオマスは、セロビオースを含む。
本開示の方法にて用いられてもよい糖は、限定されないが、多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントース、セロヘキソース、及びソホロースを含む。ある好ましい実施形態において、上記糖は、セロビオースを含む。
本開示のリコンビナント細胞によって分泌されてもよいタンパク質のタイプは、限定されないが、セルロース誘導性タンパク質を包含する。セルロース誘導性タンパク質の限定されない例は、限定されないが、セルラーゼ、GH61酵素、セロビオースデヒドロゲナーゼ、ラクトナーゼ、カルボヒドレートエステラーゼ、多糖リアーゼ、及び セルロース結合ドメイン含有タンパク質を包含する。ある局面において、本開示における分泌されるタンパク質は、NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764、またはNCU05137によってコードされる。
従って、本開示のある局面は、変異体細胞を提供する工程であって、該変異体細胞は、2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子にて不活性化変異を含んでいる、あるいは上記細胞中のcre−1遺伝子にて不活性化変異を含んでいる工程、及び上記変異体細胞をセルロース系バイオマスまたは糖と接触させる工程であって、該セルロース系バイオマスまたは糖は、タンパク質を分泌するように該変異体細胞を誘導する、工程によって、細胞からのタンパク質の分泌を増加させる方法を提供する。ある局面において、上記セルロース系バイオマスまたは糖は、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、またはそれ以上のタイプのタンパク質を分泌するように上記細胞を誘導する。
いくつかの局面において、細胞からのタンパク質の分泌を増加させる上記方法は、β−グルコシダーゼインヒビター存在下にてタンパク質の分泌を誘導するステップを含む。好ましくは、上記β−グルコシダーゼインヒビターは、ノジリマイシンである。
本開示の他の局面は、リコンビナント細胞を提供する工程であって、該リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現と比較して低減した2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現を示す、あるいは、対応する非リコンビナント細胞中のcre−1遺伝子の発現と比較して低減したcre−1遺伝子の発現を示す、工程、及び上記リコンビナント細胞をセルロース系バイオマスまたは糖と接触させる工程であって、該セルロース系バイオマスまたは糖は、タンパク質を分泌するように該リコンビナント細胞を誘導する、工程によって、細胞からのタンパク質の分泌を増加させる方法を提供する。ある局面において、上記セルロース系バイオマスまたは糖は、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、またはそれ以上のタイプのタンパク質を分泌するように上記細胞を誘導する。
[リグノセルロース系バイオマスの分解のための方法]
本開示のさらなる局面は、リグノセルロース系バイオマスを提供する工程、本開示の任意の変異体細胞またはリコンビナント細胞を提供する工程、上記細胞をセルロース系バイオマスまたは糖と接触させることにより、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、またはそれ以上のタイプのタンパク質を分泌するように上記細胞を誘導する工程、及び、上記誘導された細胞をリグノセルロース系バイオマスと接触させる工程であって、上記分泌された、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、またはそれ以上のタイプのタンパク質は、リグノセルロース系バイオマスを分解する、工程による、バイオマスの分解のための方法に関する。
本開示のさらなる局面は、リグノセルロース系バイオマスを提供する工程、本開示の任意の変異体細胞またはリコンビナント細胞を提供する工程、上記細胞をセルロース系バイオマスまたは糖と接触させることにより、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、またはそれ以上のタイプのタンパク質を分泌するように上記細胞を誘導する工程、及び、上記誘導された細胞をリグノセルロース系バイオマスと接触させる工程であって、上記分泌された、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、またはそれ以上のタイプのタンパク質は、リグノセルロース系バイオマスを分解する、工程による、バイオマスの分解のための方法に関する。
一般的に、リグノセルロース系バイオマスは、セルロース、及びリグニンと強く結合した他のカルボヒドレートポリマーを含む植物バイオマスを指す。適切なリグノセルロース系バイオマスの例は、限定されないが、植物材料、都市ごみ、都市の紙ごみ、木材残渣、製材工場及び製紙工場の廃棄物、並びに農業残渣を包含する。適切な植物材料の例は、限定されないが、ススキ(Miscanthus)、エネルギーグラス、エレファントグラス、スイッチグラス、索草、ライグラス、リードカナリーグラス、葦、麦藁、大麦藁、カノラ藁、オート麦藁、トウモロコシ滓、大豆滓、オート外皮, スペルト麦、モロコシ、もみ殻、サトウキビの搾り殻、トウモロコシ繊維、大麦、麦、アマ、小麦、アマニ、柑橘類の果肉、綿実、ラッカセイ、アブラナ、ヒマワリ、えんどう豆、ルピナス、パーム殻粒、ココナッツ、コンニャク、ローカストビーンガム、グアルガム、大豆、可溶性物質添加乾燥蒸留穀物残渣(DDGS)、青い茎、トウモロコシの穂軸、松、針葉樹軟材、ユーカリ、樺木、柳、ヤマナラシ、ポプラ木、雑種ポプラ、エネルギーカン、短いローテーションの木質農作物、作物残渣、庭ごみ、及びこれらの組合せを包含する。
本開示の方法にて用いられてもよいセルロース系バイオマスは、限定されないが、1つ以上の多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースを含む。ある好ましい実施形態において、セルロース系バイオマスは、セロビオースを含む。
本開示の方法にて用いられてもよい糖は、限定されないが、多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントース、セロヘキソース、及びソホロースを含む。ある好ましい実施形態において、上記糖は、セロビオースを含む。
本開示のリコンビナント細胞によって分泌されてもよいタンパク質のタイプは、限定されないが、セルロース誘導性タンパク質を包含する。セルロース誘導性タンパク質の限定されない例は、限定されないが、セルラーゼ、GH61酵素、セロビオースデヒドロゲナーゼ、ラクトナーゼ、カルボヒドレートエステラーゼ、多糖リアーゼ、及び セルロース結合ドメイン含有タンパク質を包含する。ある局面において、本開示における分泌されるタンパク質は、NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764、またはNCU05137によってコードされる。
本開示の一局面において、リグノセルロース系バイオマスの分解のための上記方法は、β−グルコシダーゼインヒビター存在下にてリグノセルロース系バイオマスを上述した本開示の変異体細胞と接触させるステップを含む。好ましくは、上記β−グルコシダーゼインヒビターは、ノジリマイシンである。
[用途]
本明細書に記載された方法は、リグノセルロース系バイオマスを分解するのに有用な他の方法と組み合わせて実施され得る。
本明細書に記載された方法は、リグノセルロース系バイオマスを分解するのに有用な他の方法と組み合わせて実施され得る。
例えば、リグノセルロース系バイオマスは、アンモニア繊維拡散(AFEX)、蒸気爆発、アルカリ水溶液、酸性溶液、有機溶媒、イオン液体(IL)、電解水、リン酸、及びこれらの組合せによる処理を含む前処理がされていてもよい。植物材料からリグニンを除去する前処理では、ヘミセルロースから遊離した糖質の全体的な量を増やしてもよい。
〔実施例〕
後述する実施例は、単なる例であって、本開示の局面を何ら限定するものではない。
後述する実施例は、単なる例であって、本開示の局面を何ら限定するものではない。
〔実施例1〕
以下の実施例は、3つのβ−グルコシダーゼ遺伝子を欠失しているN. crassa株内、および、3つのβ−グルコシダーゼ遺伝子とcre−1遺伝子とを欠失しているN. crassa株内で誘導される、セルラーゼの転写およびセルロース分解酵素の生産における特徴に関するものである。
以下の実施例は、3つのβ−グルコシダーゼ遺伝子を欠失しているN. crassa株内、および、3つのβ−グルコシダーゼ遺伝子とcre−1遺伝子とを欠失しているN. crassa株内で誘導される、セルラーゼの転写およびセルロース分解酵素の生産における特徴に関するものである。
[材料および方法]
(株)
株は、Fungal Genetics Stock Center(FGSC)から入手した。当該株には、Neurospora crassaの、野生型(wild-type:WT)(FGSC 2489)、cre−1遺伝子の欠失株(Δcre−1)(FGSC 10372)、細胞内(intracellular)のβ−グルコシダーゼ NCU00130の欠失株(FGSC 11822およびFGSC 11823)、細胞外(extracellular)のβ−グルコシダーゼ NCU08755の欠失株(FGSC 18387およびFGSC 18388)、および、細胞外のβ−グルコシダーゼ NCU04952の欠失株(FGSC 13731およびFGSC 13732)が含まれる。
(株)
株は、Fungal Genetics Stock Center(FGSC)から入手した。当該株には、Neurospora crassaの、野生型(wild-type:WT)(FGSC 2489)、cre−1遺伝子の欠失株(Δcre−1)(FGSC 10372)、細胞内(intracellular)のβ−グルコシダーゼ NCU00130の欠失株(FGSC 11822およびFGSC 11823)、細胞外(extracellular)のβ−グルコシダーゼ NCU08755の欠失株(FGSC 18387およびFGSC 18388)、および、細胞外のβ−グルコシダーゼ NCU04952の欠失株(FGSC 13731およびFGSC 13732)が含まれる。
4つの遺伝子の欠失株は、FGSCに記載されている方法(http://www.fgsc.net/neurosporaprotocols/How%20to%20make%20a%20cross-2.pdf)にしたがって、1つの遺伝子を欠失している株を順次掛け合せることによって作製した。全ての欠失株の遺伝子型は、遺伝子に特異的なプライマーと、ハイグロマイシン(hygromycin:hph)カセットに対する共通のプライマーと、を用いて確認した。hphに対するフォワードプライマーは、以下のとおりである。つまり、
hph Middle FWD: 5’−CGACAGACGTCGCGGTGAGTTCAG−3’ (配列番号4)
リバースプライマーは、以下のとおりである。つまり。
hph Middle FWD: 5’−CGACAGACGTCGCGGTGAGTTCAG−3’ (配列番号4)
リバースプライマーは、以下のとおりである。つまり。
NCU00130: 5’−TAGTGTACAAACCCCAAGC−3’ (配列番号5)
NCU004953: 5’−AACACACACACACACACTGG−3’ (配列番号6)
NCU08755: 5’−ACAGTGGAGGTGAGAAAGG−3’ (配列番号7)
NCU08807: 5’−GTACTTACGCAGTAGCGTGG−3’ (配列番号8)
(生育と転写研究(Transcriptional Studies Growth))
菌株を、250mLの三角フラスコ内に入った、2%(wt/vol)のスクロースを含む50mLのフォーゲルの塩(Vogel’s salts)へ、OD595が0.05になるように植菌した。そして、当該菌株を、照明が点いた状態で、200rpmにて16時間生育させた。次いで、バイオマスに対して4000rpmにて10分間の遠心分離を行うとともに、バイオマスをフォーゲルの塩にて2回洗浄することによって、余分なスクロースを除去した。次いで、当該バイオマスを、新鮮な50mLの培地へ加えた。なお、当該培地は、2%(wt/vol)のスクロースと、セロビオース(Sigma)またはアビセル(Avicel)(登録商標) PH101(アビセル(Avicel)(登録商標))と、を含んだものであった。照明が点いた状態にて、培養物に対して、200rpmにて4時間の誘導をかけた。次いで、ブフナー漏斗上のワットマン ガラス マイクロファイバー フィルター(GF/F)にて濾過するとともに、50mLのフォーゲルの塩を用いて洗浄することによって、培養したバイオマスを集めた。バイオマスを、液体窒素中で瞬時に冷凍させ、当該バイオマスを、−80℃にて保存した。
NCU004953: 5’−AACACACACACACACACTGG−3’ (配列番号6)
NCU08755: 5’−ACAGTGGAGGTGAGAAAGG−3’ (配列番号7)
NCU08807: 5’−GTACTTACGCAGTAGCGTGG−3’ (配列番号8)
(生育と転写研究(Transcriptional Studies Growth))
菌株を、250mLの三角フラスコ内に入った、2%(wt/vol)のスクロースを含む50mLのフォーゲルの塩(Vogel’s salts)へ、OD595が0.05になるように植菌した。そして、当該菌株を、照明が点いた状態で、200rpmにて16時間生育させた。次いで、バイオマスに対して4000rpmにて10分間の遠心分離を行うとともに、バイオマスをフォーゲルの塩にて2回洗浄することによって、余分なスクロースを除去した。次いで、当該バイオマスを、新鮮な50mLの培地へ加えた。なお、当該培地は、2%(wt/vol)のスクロースと、セロビオース(Sigma)またはアビセル(Avicel)(登録商標) PH101(アビセル(Avicel)(登録商標))と、を含んだものであった。照明が点いた状態にて、培養物に対して、200rpmにて4時間の誘導をかけた。次いで、ブフナー漏斗上のワットマン ガラス マイクロファイバー フィルター(GF/F)にて濾過するとともに、50mLのフォーゲルの塩を用いて洗浄することによって、培養したバイオマスを集めた。バイオマスを、液体窒素中で瞬時に冷凍させ、当該バイオマスを、−80℃にて保存した。
(RNAの分離)
ジルコニア/シリカ ビーズ(0.2g、直径0.5mm;Biospec)、Mini-Beadbeater-96(Biospec)、および、1mLのTRIzol試薬(Invitrogen)を用い、これらの使用説明書にしたがって、凍結サンプルから全RNAを精製した。TURBO DNA-free(Ambion)およびRNeasy kit(Qiagen)を用いて消化することによって、全RNAを更に精製した。ナノドロップ、および、アガロースゲル電気泳動によって、RNAの品質を確認した。
ジルコニア/シリカ ビーズ(0.2g、直径0.5mm;Biospec)、Mini-Beadbeater-96(Biospec)、および、1mLのTRIzol試薬(Invitrogen)を用い、これらの使用説明書にしたがって、凍結サンプルから全RNAを精製した。TURBO DNA-free(Ambion)およびRNeasy kit(Qiagen)を用いて消化することによって、全RNAを更に精製した。ナノドロップ、および、アガロースゲル電気泳動によって、RNAの品質を確認した。
(定量的なリアル−タイム RT−PCR)
EXPRESS One-Step SYBR GreenER Kit(Invitrogen)、および、StepOnePlus Real-Time PCR System(Applied Biosystems)を用いて、定量的なRT−PCRを行った。全反応容量を10μLとし、当該全反応容量中に300nMのフォワードプライマー、300nMのリバースプライマー、および、75ngの鋳型RNAが含まれている状態にて、3回の反応を行った。データの解析は、Relative Quantitation/Comparative CT(ΔΔCT)を利用したStepOne Software(Applied Biosystems)を用いて行った。データを、対照サンプルとしての、スクロースによって発現した内在性のコントロールであるアクチン、に対して標準化した。エラーバーは、95%の信頼区間(confidence interval)を示している。RT−PCRのプライマーは、「Tian et al., 2009」内に記載されているように用いた。
EXPRESS One-Step SYBR GreenER Kit(Invitrogen)、および、StepOnePlus Real-Time PCR System(Applied Biosystems)を用いて、定量的なRT−PCRを行った。全反応容量を10μLとし、当該全反応容量中に300nMのフォワードプライマー、300nMのリバースプライマー、および、75ngの鋳型RNAが含まれている状態にて、3回の反応を行った。データの解析は、Relative Quantitation/Comparative CT(ΔΔCT)を利用したStepOne Software(Applied Biosystems)を用いて行った。データを、対照サンプルとしての、スクロースによって発現した内在性のコントロールであるアクチン、に対して標準化した。エラーバーは、95%の信頼区間(confidence interval)を示している。RT−PCRのプライマーは、「Tian et al., 2009」内に記載されているように用いた。
アクチン
5’−TGATCTTACCGACTACCT−3’ (配列番号9)
5’−CAGAGCTTCTCCTTGATG−3’ (配列番号10)
CBHI(NCU07340)
5’−ATCTGGGAAGCGAACAAAG−3’ (配列番号11)
5’−TAGCGGTCGTCGGAATAG−3’ (配列番号12)
CBHII(NCU09680)
5’−CCCATCACCACTACTACC−3’ (配列番号13)
5’−CCAGCCCTGAACACCAAG−3’ (配列番号14)
エンドグルカナーゼ 2(NCU00762)
5’−GAGTTCACATTCCCTGACA−3’ (配列番号15)
5’−CGAAGCCAACACGGAAGA−3’ (配列番号16)
GH61(NCU07898)
5’−TCAAGCCCGGTTACTATC−3’ (配列番号17)
5’−AACCTGTCACCTGCAACT−3’ (配列番号18)
CRE−1
5’−CTACTGCCATGTCCTCTC−3’ (配列番号19)
5’−TATCAGGACCACTTTGGCTTC-3’ (配列番号20)
β−グルコシダーゼ(NCU00130)
5’−GTTCGGCGTTACCTATGT−3’ (配列番号21)
5’−AGAGTCAAAGAGCGGCTTC−3’ (配列番号22)
(タンパク質の分泌/酵素活性に関する試験)
菌株を、250mLの三角フラスコ内に入った、1%(wt/vol)のスクロースを含む100mLのフォーゲルの塩へ、OD595が0.05になるように植菌した。そして、当該菌株を、照明が点いた状態で、200rpmにて24時間生育させた。次いで、2%スクロース、2%セロビオース、1%スクロース/1%セロビオース、または、1%スクロース/1%アビセル(登録商標)を用いて、培養物に対して誘導をかけた。照明が点いた状態で200rpmにて5日間の培養を続けながら、1日目、2日目、3日目、4日目および5日目に上清を回収した。全てのサンプルを回収するまで、回収した上清を2μmのPESフィルターにて濾過してバイオマスを回収し、当該バイオマスを−20℃にて保存した。分泌されたタンパク質を可視化するために、濃縮されていない15μLの上清を、標準的な10%のTris−HCL ポリアクリルアミドゲルにて泳動させるとともに、Thermo Scientific GelCode Blue Stain Reagentを用いて染色した。
5’−TGATCTTACCGACTACCT−3’ (配列番号9)
5’−CAGAGCTTCTCCTTGATG−3’ (配列番号10)
CBHI(NCU07340)
5’−ATCTGGGAAGCGAACAAAG−3’ (配列番号11)
5’−TAGCGGTCGTCGGAATAG−3’ (配列番号12)
CBHII(NCU09680)
5’−CCCATCACCACTACTACC−3’ (配列番号13)
5’−CCAGCCCTGAACACCAAG−3’ (配列番号14)
エンドグルカナーゼ 2(NCU00762)
5’−GAGTTCACATTCCCTGACA−3’ (配列番号15)
5’−CGAAGCCAACACGGAAGA−3’ (配列番号16)
GH61(NCU07898)
5’−TCAAGCCCGGTTACTATC−3’ (配列番号17)
5’−AACCTGTCACCTGCAACT−3’ (配列番号18)
CRE−1
5’−CTACTGCCATGTCCTCTC−3’ (配列番号19)
5’−TATCAGGACCACTTTGGCTTC-3’ (配列番号20)
β−グルコシダーゼ(NCU00130)
5’−GTTCGGCGTTACCTATGT−3’ (配列番号21)
5’−AGAGTCAAAGAGCGGCTTC−3’ (配列番号22)
(タンパク質の分泌/酵素活性に関する試験)
菌株を、250mLの三角フラスコ内に入った、1%(wt/vol)のスクロースを含む100mLのフォーゲルの塩へ、OD595が0.05になるように植菌した。そして、当該菌株を、照明が点いた状態で、200rpmにて24時間生育させた。次いで、2%スクロース、2%セロビオース、1%スクロース/1%セロビオース、または、1%スクロース/1%アビセル(登録商標)を用いて、培養物に対して誘導をかけた。照明が点いた状態で200rpmにて5日間の培養を続けながら、1日目、2日目、3日目、4日目および5日目に上清を回収した。全てのサンプルを回収するまで、回収した上清を2μmのPESフィルターにて濾過してバイオマスを回収し、当該バイオマスを−20℃にて保存した。分泌されたタンパク質を可視化するために、濃縮されていない15μLの上清を、標準的な10%のTris−HCL ポリアクリルアミドゲルにて泳動させるとともに、Thermo Scientific GelCode Blue Stain Reagentを用いて染色した。
Endo−1,4−β−グルカナーゼの活性は、Azo−CM−Cellulose(Megazyme)を用いて、使用説明書にしたがって測定した。簡潔に言えば、前もって37℃に加熱しておいた100μLのAzo−CM−Cellulose基質溶液と、96.5μLの培養上清と、3.5μLの3M 酢酸ナトリウム(pH5.0)とを、深い96ウエルプレート内にて混合した。混合した後で、上記プレートを、37℃にて10分間インキュベートした。0.5mLの沈殿剤溶液を加えることによって反応を停止させ、1000gにて10分間の遠心分離を行った。50μLのサンプルを平底の96ウエルアッセイ用プレートへ移し、Beckman Coulter Paradigm plate readerを用いて、590nmの光学濃度にて吸光度を3回測定した。データを、アビセル(登録商標)を用いた時の4日後の野生型の活性に対する割合として示す。
エキソグルカナーゼ(セロビオハイドロラーゼ−1)の活性は、4−Methylumbelliferyl β−D−cellobioside(MuLac)アッセイを用いて測定した。当該アッセイは、主としてCBH−1の活性を測定するものである。活性は、経時的な蛍光の変化として示され、当該変化は、酵素活性を示すものとして最適な線のスロープ(slope of a best-fit line)になる。当該アッセイを行う前に、培養上清を5000ダルトンより上の濃縮装置(sartorius stedim Vivaspin 500)にかけることによって、培養上清中の余分な糖を取り除いた。保持されたタンパク質を50mMの酢酸ナトリウム(pH5)を用いて2回洗浄し、直線の範囲内にてアッセイが行われるように、上記タンパク質を2μg/μLに希釈した。アッセイは、10μgの全タンパク質を含む100μLの全容量にて行われ、アッセイでは、MuLacの最終濃度が1.0mMであり、酢酸ナトリウム(pH5)の最終濃度が50mMであった。40℃に設定されたBeckman Coulter Paradigm plate reader内にてアッセイを行った。なお、当該アッセイでは、励起/発光波長として360/465nmを採用し、10分間にわたって30秒毎に測定を行った。最適な線のスロープは、個々の培養上清のMuLacの活性を示している。希釈されていない活性を示すために、MuLacの活性を、2μg/mLの希釈物を得るために必要な最初の希釈物に対して標準化した。セロビオハイドロラーゼ−1の組み換え体の活性をスタンダードとして用い、データを、アビセル(登録商標)を用いた時の4日後の野生型の活性に対する割合として示す。
アビラーゼ(Avicelase)の活性は、WT、Δcre−1、および、他の欠失株の7日目の培養上清中のグルコースおよびセロビオースの濃度を指標として、Tian等(Tian et al, 2009)にしたがって決定した。簡潔に言えば、WTおよびΔcre−1の7日目の培養上清の1ボリュームと、5mg/mLのアビセル(登録商標)および50mMのNaAcバッファー(pH5.0)を含む基質溶液の1ボリュームとを、37℃にて混合した。撹拌して5時間の後、共役酵素反応によって、グルコースの濃度とセロビオースの濃度とを測定した。
[結果]
(3つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の欠失株における、セルラーゼの転写の誘導)
N. crassa内にてセルラーゼが誘導される初期の時点を調べるために、まず、培養物をスクロースの存在下にて16時間培養し、大量のバイオマスを作製した。その後、培養物を、別の炭素源を含む新鮮な培地へ移した。野生株における初期の経時変化では、セロビオハイドロラーゼ I遺伝子 cbh−1およびエンドグルカナーゼ 2遺伝子 gh5−1に関して、4時間の誘導時間において、スクロースにおける遺伝子発現とアビセル(登録商標)における遺伝子発現との差が最も大きかった(図2)。
(3つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の欠失株における、セルラーゼの転写の誘導)
N. crassa内にてセルラーゼが誘導される初期の時点を調べるために、まず、培養物をスクロースの存在下にて16時間培養し、大量のバイオマスを作製した。その後、培養物を、別の炭素源を含む新鮮な培地へ移した。野生株における初期の経時変化では、セロビオハイドロラーゼ I遺伝子 cbh−1およびエンドグルカナーゼ 2遺伝子 gh5−1に関して、4時間の誘導時間において、スクロースにおける遺伝子発現とアビセル(登録商標)における遺伝子発現との差が最も大きかった(図2)。
3つのβ−グルコシダーゼ(NCU08755、NCU04952、および、NCU00130)は、アビセル(登録商標)またはススキ(Miscanthus)を用いて野生型のN. crassaが生育している間に、転写レベルが著しく増加することが知られている(Tian et al, 2009)。加えて、質量分析法によって、NCU04952が分泌タンパク質として同定された(Tian et al, 2009)。これら3つのβ−グルコシダーゼが、セロビオースを利用したセルラーゼの誘導において役割を果たしているか否かを決定するために、単一のβ−グルコシダーゼを欠失している3種類の菌株を、セロビオースが媒介するセルラーゼの誘導のためのqRT−PCTによってスクリーニングした。しかしながら、単一のβ−グルコシダーゼの欠失変異体には、著しい効果を示すものは無かった。余計なβ−グルコシダーゼの活性の問題、および、最小限のグルコース濃度における強力なカタボライト リプレッションの可能性、を克服するために、3つのβ−グルコシダーゼを欠失した株を作製した。
アビセル(登録商標)を用いた場合、3つのβ−グルコシダーゼの欠失株は、試験した3種類のセルラーゼの誘導について、野生株と似た表現型を示した(図3)。しかしながら、2%のセロビオースを用いた場合、野生型の株では、cbh−1についてはスクロースを用いたときの20倍誘導されるのみであり、cbh−2またはeg−2についてはスクロースを用いたときと誘導に違いが無かった。一方、2%のセロビオースを用いた場合、3つのβ−グルコシダーゼの変異株では、非常に異なった様相を示し、cbh−1についてはスクロースを用いたときの6,500倍誘導され、cbh−2についてはスクロースを用いたときの2,100倍誘導され、eg−2についてはスクロースを用いたときの2,200倍誘導された(図3)。
(3つのβ−グルコシダーゼ遺伝子およびcre−1遺伝子の欠失株における、セルラーゼの転写の誘導)
3つのβ−グルコシダーゼの欠失株とΔcre−1株とを掛け合わせることによって、野生株がアビセル(登録商標)へ応答するのと同様に、セロビオースに対して転写レベルで応答する変異体を作製した。セロビオースまたはアビセル(登録商標)の何れかを用いて当該変異体に誘導をかけると、セロビオースまたはアビセル(登録商標)を用いたときの3つのβ−グルコシダーゼの欠失株、および、アビセル(登録商標)を用いたときの野生株のように、cbh−1、cbh−2およびeg−2について同様に転写が誘導された(図3)。これらの結果は、cre−1が一般的なセルロース分解レギュロンとして機能していること、および、cre−1の欠失がN. crassaのセルラーゼの永久的な機能低下(depression)を引き起こすこと、を示している。
3つのβ−グルコシダーゼの欠失株とΔcre−1株とを掛け合わせることによって、野生株がアビセル(登録商標)へ応答するのと同様に、セロビオースに対して転写レベルで応答する変異体を作製した。セロビオースまたはアビセル(登録商標)の何れかを用いて当該変異体に誘導をかけると、セロビオースまたはアビセル(登録商標)を用いたときの3つのβ−グルコシダーゼの欠失株、および、アビセル(登録商標)を用いたときの野生株のように、cbh−1、cbh−2およびeg−2について同様に転写が誘導された(図3)。これらの結果は、cre−1が一般的なセルロース分解レギュロンとして機能していること、および、cre−1の欠失がN. crassaのセルラーゼの永久的な機能低下(depression)を引き起こすこと、を示している。
cre−1の欠失株では、アビセル(登録商標)を用いた場合に、セルラーゼの転写および分泌が穏やかに増加することが知られている。同様に、Cre−1では、スクロースを用いたときのcbh−1およびeg−2の転写のベースレベルが、スクロースを用いたときの野生型の略7倍に増加することが知られている(図4)。セロビオースを用いて誘導した場合に、Δcre−1は、スクロースを用いて誘導した場合よりも、cbh−1の転写が600倍に増加し、eg−2の転写が80倍に増加する(図3)。発現における当該増加は、スクロースを用いたときの発現と比較して顕著ではあるが、アビセル(登録商標)を用いてΔcre−1を誘導したときに観察される、cbh−1における11,000倍の増加、eg−2におけ8000倍の増加からすれば、僅かでしかない(図3)。
セロビオースに対する転写応答が特異的な応答であって、一般的な飢餓による効果ではないことを示すために、炭素源を用いない対照実験を行った。スクロースを用いた最初の16時間のプレ増殖期(pre-growth phase)の後で、最小培地を用いて穏やかな洗浄を行い、残留するスクロースを残さず除去した。そして、最後に、バイオマスを、炭素源が全く添加されていない最小培地を含む培地へ移した。スクロース、セロビオースまたはアビセル(登録商標)が加えられたときの培養と同じ方法にてこれらの培養を行ったので、RT−PCRを介して得られた転写データは、飢餓がセルラーゼの転写に及ぼす一般的な影響を示している。
図5は、野生株、Δcre−1、および、3つのβ−グルコシダーゼの欠失株は、飢餓によって僅かな誘導(3〜30倍の増加)を示すのに対し、3つのβ−グルコシダーゼ遺伝子とcre−1遺伝子とを欠失した株は、これらの条件下において、cbh−1およびeg−2の転写がより大きく増加することを示している。3つのβ−グルコシダーゼ遺伝子とcre−1遺伝子とを欠失した株をスクロースにて生育させたときと比較して、当該株の飢餓に対する応答は、cbh−1およびeg−2の誘導が、各々340倍および200倍である。これらの影響は、アビセル(登録商標)またはセロビオースを用いたときに観察される10,000倍〜20,000倍に達するcbh−1およびeg−2の誘導と比較すれば、僅かでしかない。それ故に、これらの結果は、アビセル(登録商標)およびセロビオースに対するこれらN. crassaのセルラーゼの転写応答は、特異的なものであって、飢餓に対する一般的な応答ではない、ことを示している。
自然にセルロースが加水分解される場合、著しいグルコース レプレッションが引き起こされる程に高い濃度のセロビオースおよびグルコースが蓄積されることはない。実験におけるセロビオースの濃度を変化させることによって、in vitroにおいて上記現象を再現することができる。図6は、欠失株と比較して、野生型の株ではセルラーゼの誘導が著しく減少している一方で、野生型のセルラーゼの発現は濃度依存性であって、より高い10mMというセロビオースの濃度よりも、より低い1mMというセロビオースの濃度の方がより良い誘導物質として機能することを示している。主要なβ−グルコシダーゼの活性を取り除くことにより、両方のセロビオース濃度において、野生型の誘導の25倍の誘導が達成される。更に、カタボライト リプレッサーであるCRE−1を欠失させると、セロビオースの濃度を増加させても、もはや酵素の誘導を制限しない(図6)。
(β−グルコシダーゼ遺伝子の欠損が示す、セロビオースによって誘導される、セルロース分解酵素の生産の増加)
スクロースまたはアビセル(登録商標)を用いて誘導した場合、3つのβ−グルコシダーゼの欠失株は、野生型と非常に似た結果を示す。スクロースを用いた場合、2日後に、非常に少量の分泌されたタンパク質(180μg/mL)が観察される(図7)。そして、当該分泌されたタンパク質は、MuLacに対して全く活性を有していない(図8)。アビセル(登録商標)を用いて誘導した場合、4日目までに、上清中に有意な濃度のタンパク質が観察される(図7)。この培養上清は、同じ時点において、野生型の培養物と同様に、Azo−CM−Cellulose活性およびMuLac活性を有している(5.5μg CBHI等価物)(図8および9)。スクロースおよびアビセル(登録商標)を用いた培養では、この欠失株は、野生型と似ている。一方、この欠失株は、セロビオースに対して全く異なる応答をする。セロビオースを用いた場合の2日目において、1.4μgの組み換えCBHIに等価なMuLac活性が観察され、4日目までに、当該値は、4.84μgの組み換えCBHI等価物の値にまで有意に増加する(図8B)。そして、Azo−CM−Cellulose活性は、アビセル(登録商標)を用いたときの野生型に似ている(図9)。この特異的な酵素活性は、炭素のカタボライト リプレッションの影響を最小限にしたときに、セロビオースが、転写の誘導に加えて、活性のあるセルラーゼの分泌を直接的に刺激し得ることを示している。
スクロースまたはアビセル(登録商標)を用いて誘導した場合、3つのβ−グルコシダーゼの欠失株は、野生型と非常に似た結果を示す。スクロースを用いた場合、2日後に、非常に少量の分泌されたタンパク質(180μg/mL)が観察される(図7)。そして、当該分泌されたタンパク質は、MuLacに対して全く活性を有していない(図8)。アビセル(登録商標)を用いて誘導した場合、4日目までに、上清中に有意な濃度のタンパク質が観察される(図7)。この培養上清は、同じ時点において、野生型の培養物と同様に、Azo−CM−Cellulose活性およびMuLac活性を有している(5.5μg CBHI等価物)(図8および9)。スクロースおよびアビセル(登録商標)を用いた培養では、この欠失株は、野生型と似ている。一方、この欠失株は、セロビオースに対して全く異なる応答をする。セロビオースを用いた場合の2日目において、1.4μgの組み換えCBHIに等価なMuLac活性が観察され、4日目までに、当該値は、4.84μgの組み換えCBHI等価物の値にまで有意に増加する(図8B)。そして、Azo−CM−Cellulose活性は、アビセル(登録商標)を用いたときの野生型に似ている(図9)。この特異的な酵素活性は、炭素のカタボライト リプレッションの影響を最小限にしたときに、セロビオースが、転写の誘導に加えて、活性のあるセルラーゼの分泌を直接的に刺激し得ることを示している。
(cre−1の欠失によって増大するセルロース分解酵素の生産)
セルロース分解性の培地(cellulolytic media)におけるN. crassaの生育に対するCRE−1の機能を調べるために、異なる炭素源において、Δcre−1株と野生株との相対的な増殖速度を比較した。唯一の炭素源として2%のアビセル(登録商標)を含む培地を用いて生育させた場合、Δcre−1株は、野生株よりも早くアビセル(登録商標)を消費し(例えば、3−4日、対、5−6日)、Δcre−1株は、30%多い細胞外タンパク質を分泌し、Δcre−1株は、50%高いエンドグルカナーゼ活性を示した(図10Aおよび図10B)。アグリゲート アビセル アッセイ(aggregate Avicelase assay)(当該アッセイは、併合されたβ−グルコシダーゼ活性、エンドセルラーゼ活性およびエキソセルラーゼ活性を意図している)は、野生株と比較して、Δcre−1株におけるグルコース濃度が20%高いことを示している(図10B)。しかしながら、セロビオースの検出量が少ないことは、Δcre−1株においてβ−グルコシダーゼ(β−グルコシダーゼは、セロビオースをグルコースへ変換する;図10B)の分泌が増加していることを示唆している。
セルロース分解性の培地(cellulolytic media)におけるN. crassaの生育に対するCRE−1の機能を調べるために、異なる炭素源において、Δcre−1株と野生株との相対的な増殖速度を比較した。唯一の炭素源として2%のアビセル(登録商標)を含む培地を用いて生育させた場合、Δcre−1株は、野生株よりも早くアビセル(登録商標)を消費し(例えば、3−4日、対、5−6日)、Δcre−1株は、30%多い細胞外タンパク質を分泌し、Δcre−1株は、50%高いエンドグルカナーゼ活性を示した(図10Aおよび図10B)。アグリゲート アビセル アッセイ(aggregate Avicelase assay)(当該アッセイは、併合されたβ−グルコシダーゼ活性、エンドセルラーゼ活性およびエキソセルラーゼ活性を意図している)は、野生株と比較して、Δcre−1株におけるグルコース濃度が20%高いことを示している(図10B)。しかしながら、セロビオースの検出量が少ないことは、Δcre−1株においてβ−グルコシダーゼ(β−グルコシダーゼは、セロビオースをグルコースへ変換する;図10B)の分泌が増加していることを示唆している。
野生株と比較して、Δcre−1株は、一般的により多くの分泌タンパク質を生産していると考えられる。このことは、セロビオースおよびアビセル(登録商標)によって誘導された培養物においてのみならず、スクロースを用いた48時間目(図7および11)においても明らかである。なお、当該スクロースを用いた48時間目では、分泌タンパク質の濃度は、野生型における分泌タンパク質の濃度の略2倍である(481μg/mL、対、270μg/mL)。Δcre−1は、スクロースを用いたときにより多くのタンパク質を分泌する一方で、これらのタンパク質は、MuLacに対して何ら活性を示さない(図8)。70kDaの最も明確なバンドは、CBH−1/2と同じ分子量に対応する。活性が無いことは、BNH−1/2の不活性型であるか、あるいは、別の非セルロース分解性タンパク質であることを示唆している。転写に関する試験にて観察された事項と同様に、Δcre−1株は、セロビオースを用いたときに(653μg/mL)、セルラーゼの分泌が少し増加する(図7)。そして、当該増加は、MuLacに対する活性(.8ug)の穏やかな増加を引き起こす(図8B)。加えて、アビセル(登録商標)を用いて誘導した場合、4日目のMuLac活性は、野生型の活性よりも低い(2.8ug CBHI等価物)(図8B)。しかしながら、3日目と比較して、4日目における全体的なタンパク質のバンドパターンが概してより薄いことから、この効果は、飢餓に起因する可能性がある(図12)。
(β−グルコシダーゼ遺伝子とcre−1遺伝子との欠失によって引き起こされる、セロビオースを用いた誘導時のセルロース分解酵素の生産の増加)
野生型よりも多くのタンパク質を恒常的に分泌している点において、3つのβ−グルコシダーゼ遺伝子とcre−1遺伝子とを欠失した株は、cre−1を欠失した株と似ている。また、スクロースまたはアビセル(登録商標)にて誘導したときの、タンパク質ゲル(protein gel)にて可視化されたパターンが、これらの2つの株において非常に似ている(図11)。Δcre−1株と、3つのβ−グルコシダーゼおよびcre−1を欠失した株と、の間の主要な相違点は、分泌されたタンパク質の活性におけるセロビオースの影響である(図8)。セロビオースを用いたときには4日目までに、当該変異株は、11μgのCBHI等価物よりも多い量を生産することができる。当該量は、アビセル(登録商標)を用いたときに同じ時点で生産される量よりも多い(図8B)。加えて、Azo−CMC活性アッセイは、アビセル(登録商標)またはセロビオースを用いた誘導培養の両方において、この株が、似た量のEndo−1,4−β−グルカナーゼ活性を生産することを示している(図9)。
野生型よりも多くのタンパク質を恒常的に分泌している点において、3つのβ−グルコシダーゼ遺伝子とcre−1遺伝子とを欠失した株は、cre−1を欠失した株と似ている。また、スクロースまたはアビセル(登録商標)にて誘導したときの、タンパク質ゲル(protein gel)にて可視化されたパターンが、これらの2つの株において非常に似ている(図11)。Δcre−1株と、3つのβ−グルコシダーゼおよびcre−1を欠失した株と、の間の主要な相違点は、分泌されたタンパク質の活性におけるセロビオースの影響である(図8)。セロビオースを用いたときには4日目までに、当該変異株は、11μgのCBHI等価物よりも多い量を生産することができる。当該量は、アビセル(登録商標)を用いたときに同じ時点で生産される量よりも多い(図8B)。加えて、Azo−CMC活性アッセイは、アビセル(登録商標)またはセロビオースを用いた誘導培養の両方において、この株が、似た量のEndo−1,4−β−グルカナーゼ活性を生産することを示している(図9)。
〔実施例2〕
後述する実施例は、N. crassaのβ−グルコシダーゼのオーソロガス遺伝子であるNCU00130、NCU04952およびNCU08755の同定に関する。
後述する実施例は、N. crassaのβ−グルコシダーゼのオーソロガス遺伝子であるNCU00130、NCU04952およびNCU08755の同定に関する。
[材料および方法]
National Center for Biotechnology Information(NCBI)non-redundant amino acid databaseと、検索要求(queries)としてのNCU00130、NCU04952およびNCU08755のアミノ酸配列と、を用いて、BLASTpサーチを行った。BLASTpサーチにてヒットした配列を、ClustalW2を用いてMEGA5にて整列させた。
National Center for Biotechnology Information(NCBI)non-redundant amino acid databaseと、検索要求(queries)としてのNCU00130、NCU04952およびNCU08755のアミノ酸配列と、を用いて、BLASTpサーチを行った。BLASTpサーチにてヒットした配列を、ClustalW2を用いてMEGA5にて整列させた。
近隣結合法(Saitou N. and Nei M., 1987)を用いて、系統樹を作製した。ピアソン コレクション法(Zuckerkandl E. and Pauling L., 1965)を用いて進化距離を算出した。なお、当該進化距離は、サイトあたりのアミノ酸置換の数のユニットにある。進化に関する解析は、MEGA5にて行った(Tamura K., Dudley J., Nei M., and Kumar S., 2007)。
[結果]
図13に、近縁関係にある菌類における、オーソロガス遺伝子であるNCU00130、NCU04952およびNCU08755に対する、ClustalWアミノ酸配列アラインメントの結果を示す。
図13に、近縁関係にある菌類における、オーソロガス遺伝子であるNCU00130、NCU04952およびNCU08755に対する、ClustalWアミノ酸配列アラインメントの結果を示す。
図14に、β−グルコシダーゼ NCU00130の系統樹を示す。
図15に、β−グルコシダーゼ NCU04952の系統樹を示す。
図16に、β−グルコシダーゼ NCU08755の系統樹を示す。
〔実施例3〕
後述する実施例は、3つのβ−グルコシダーゼ遺伝子を欠失しているN. crassa株、および、3つのβ−グルコシダーゼ遺伝子とcre−1遺伝子とを欠失しているN. crassa株から高レベルにて分泌されるタンパク質の、同定および特性検討に関する。
後述する実施例は、3つのβ−グルコシダーゼ遺伝子を欠失しているN. crassa株、および、3つのβ−グルコシダーゼ遺伝子とcre−1遺伝子とを欠失しているN. crassa株から高レベルにて分泌されるタンパク質の、同定および特性検討に関する。
[材料および方法]
(株)
Fungal Genetics Stock Center(FGSC)から入手した株には、野生型(FGSC 2489)、細胞内のβ−グルコシダーゼ NCU00130の欠失株(FGSC 11822およびFGSC 11823)、細胞外のβ−グルコシダーゼ NCU08755の欠失株(FGSC 18387およびFGSC 18388)、および、NCU04952の欠失株(FGSC 13731およびFGSC 13732)が含まれる。ホモカリオンであるcre−1を欠失している株(NCU08807)は、(44)内に記載されている。複数の欠失を有する株は、順次掛け合せることによって作製した。複数の欠失を有する各株の遺伝子型は、遺伝子に特異的なプライマーと、ハイグロマイシン(hph)カセット対する共通のプライマーと、を用いて確認した。hphに対するフォワードプライマーとして、実施例1の配列番号4に示すものを用いた。NCU00130、NCU004953、NCU08755およびNCU08807のために用いたリバースプライマーは、実施例1にて用いたものと同じであった。具体的に、NCU00130のためのリバースプライマーは配列番号5であり、NCU004953のためのリバースプライマーは配列番号6であり、NCU08755のためのリバースプライマーは配列番号7であり、NCU08807のためのリバースプライマーは配列番号8であった。
(株)
Fungal Genetics Stock Center(FGSC)から入手した株には、野生型(FGSC 2489)、細胞内のβ−グルコシダーゼ NCU00130の欠失株(FGSC 11822およびFGSC 11823)、細胞外のβ−グルコシダーゼ NCU08755の欠失株(FGSC 18387およびFGSC 18388)、および、NCU04952の欠失株(FGSC 13731およびFGSC 13732)が含まれる。ホモカリオンであるcre−1を欠失している株(NCU08807)は、(44)内に記載されている。複数の欠失を有する株は、順次掛け合せることによって作製した。複数の欠失を有する各株の遺伝子型は、遺伝子に特異的なプライマーと、ハイグロマイシン(hph)カセット対する共通のプライマーと、を用いて確認した。hphに対するフォワードプライマーとして、実施例1の配列番号4に示すものを用いた。NCU00130、NCU004953、NCU08755およびNCU08807のために用いたリバースプライマーは、実施例1にて用いたものと同じであった。具体的に、NCU00130のためのリバースプライマーは配列番号5であり、NCU004953のためのリバースプライマーは配列番号6であり、NCU08755のためのリバースプライマーは配列番号7であり、NCU08807のためのリバースプライマーは配列番号8であった。
(転写に関する試験)
菌株の分生子を、250mLの三角フラスコ内に入った、2% w/vのスクロースを含む50mLのフォーゲルの塩(45)へ、OD595が.05になるように植菌した。そして、当該分生子を、照明が点いた状態で、200rpmにて16時間生育させた。次いで、バイオマスに対して4200rpmにて10分間の遠心分離を行うとともに、バイオマスをフォーゲルの塩にて2回洗浄することによって、過剰なスクロースを除去した。次いで、当該バイオマスを、50mLのフォーゲルの塩が入った新しいフラスコへ加えた。なお、当該フォーゲルの塩には、1% w/vのスクロース、0.2% w/vのセロビオース(Sigma)、または、1% w/vのアビセル(登録商標)PH101(Sigma)が追加されていた。照明が点いた状態にて、培養物に対して、200rpmにて4時間の誘導をかけた。次いで、ブフナー漏斗上のワットマン ガラス マイクロファイバー フィルター(GF/F)にて濾過するとともに、50mLのフォーゲルの塩を用いて洗浄することによって、培養したバイオマスを集めた。バイオマスを、液体窒素中で瞬時に冷凍させ、そして、当該バイオマスを、−80℃にて保存した。各時点において、3つの独立した生物学的な複製物(フラスコ)について、試験を行った。
菌株の分生子を、250mLの三角フラスコ内に入った、2% w/vのスクロースを含む50mLのフォーゲルの塩(45)へ、OD595が.05になるように植菌した。そして、当該分生子を、照明が点いた状態で、200rpmにて16時間生育させた。次いで、バイオマスに対して4200rpmにて10分間の遠心分離を行うとともに、バイオマスをフォーゲルの塩にて2回洗浄することによって、過剰なスクロースを除去した。次いで、当該バイオマスを、50mLのフォーゲルの塩が入った新しいフラスコへ加えた。なお、当該フォーゲルの塩には、1% w/vのスクロース、0.2% w/vのセロビオース(Sigma)、または、1% w/vのアビセル(登録商標)PH101(Sigma)が追加されていた。照明が点いた状態にて、培養物に対して、200rpmにて4時間の誘導をかけた。次いで、ブフナー漏斗上のワットマン ガラス マイクロファイバー フィルター(GF/F)にて濾過するとともに、50mLのフォーゲルの塩を用いて洗浄することによって、培養したバイオマスを集めた。バイオマスを、液体窒素中で瞬時に冷凍させ、そして、当該バイオマスを、−80℃にて保存した。各時点において、3つの独立した生物学的な複製物(フラスコ)について、試験を行った。
(RNAの分離)
ジルコニア/シリカ ビーズ(直径0.5mm;Biospec)、Mini-Beadbeater-96(Biospec)、および、1mLのTRIzol試薬(Invitrogen)を用い、これらの使用説明書にしたがって、凍結サンプルから全RNAを精製した。TURBO DNA-free(Ambion)およびRNeasy kit(Qiagen)を用いて消化することによって全RNAを更に精製した。ナノドロップ、および、アガロースゲル電気泳動によって、RNAの濃度および品質を確認した。
ジルコニア/シリカ ビーズ(直径0.5mm;Biospec)、Mini-Beadbeater-96(Biospec)、および、1mLのTRIzol試薬(Invitrogen)を用い、これらの使用説明書にしたがって、凍結サンプルから全RNAを精製した。TURBO DNA-free(Ambion)およびRNeasy kit(Qiagen)を用いて消化することによって全RNAを更に精製した。ナノドロップ、および、アガロースゲル電気泳動によって、RNAの濃度および品質を確認した。
(RT−PCR)
EXPRESS One-Step SYBR GreenER Kit(Invitrogen)、および、StepOnePlus Real-Time PCR System(Applied Biosystems)を用いて、定量的なRT−PCRを行った。全反応容量を10μLとし、当該全反応容量中に300nMのフォワードプライマー、300nMのリバースプライマー、および、75ngの鋳型RNAが含まれている状態にて、3回の反応を行った。データの解析は、Relative Quantitation/Comparative CT(ΔΔCT) settingを利用したStepOne Software(Applied Biosystems)を用いて行った。データを、対照サンプルとしての、スクロースによって発現した内在性のコントロールであるアクチン、に対して標準化した。
EXPRESS One-Step SYBR GreenER Kit(Invitrogen)、および、StepOnePlus Real-Time PCR System(Applied Biosystems)を用いて、定量的なRT−PCRを行った。全反応容量を10μLとし、当該全反応容量中に300nMのフォワードプライマー、300nMのリバースプライマー、および、75ngの鋳型RNAが含まれている状態にて、3回の反応を行った。データの解析は、Relative Quantitation/Comparative CT(ΔΔCT) settingを利用したStepOne Software(Applied Biosystems)を用いて行った。データを、対照サンプルとしての、スクロースによって発現した内在性のコントロールであるアクチン、に対して標準化した。
アクチン(NCU4173)のRT−PCRに用いたプライマーは、実施例1の配列番号9および配列番号10であり、cbh−1(NCU07340)のRT−PCTに用いたプライマーは、実施例1の配列番号11および配列番号12であり、gh6−2(NCU09680)のRT−PCRに用いたプライマーは、実施例1の配列番号13および配列番号14であり、gh5−1(NCU00762)のRT−PCRに用いたプライマーは、実施例1の配列番号15および配列番号16であった(46,47)。
(mRNAの配列決定)
mRNAの配列決定は、Illumina kit(RS-100-0801)と、精製したRNAと、を用いて行った。最終的なcDNAライブラリーを、Agilent bioanalyzer 2000によって定量化するとともに、標準的なIlluminaの操作手順にしたがってIllumina Genome Analyzer-IIを用いて配列を決定した。
mRNAの配列決定は、Illumina kit(RS-100-0801)と、精製したRNAと、を用いて行った。最終的なcDNAライブラリーを、Agilent bioanalyzer 2000によって定量化するとともに、標準的なIlluminaの操作手順にしたがってIllumina Genome Analyzer-IIを用いて配列を決定した。
(系統発生学的な解析)
系統発生学的な解析に用いたB−G’sのための、GenBank accession numbers(PID)、 Joint Genome Institute protein ID(JGI)、または、Broad Institute Fusarium Comparative Database Genes(FGSG)numberは、以下のとおりである。つまり、NCU08755:Myceliophthora thermophila、JGI 80304:Aspergillus niger、PID 254674400;Phanerochaete chrysosporium、PID 19352194;Trichoderma reesei、JGI 121735;Fusarium graminearum、FGSG_06605;Sclerotinia sclerotiorum、PID 156051478;Botryotinia fuckeliana、PID 154301968;Penicillium chrysogenum、PID 255942539;Schizophyllum commune、JGI 256304;Postia placenta、JGI 107557. NCU00130:Myceliophthora thermophila、JGI 115968;Aspergillus niger、PID 213437;Phanerochaete chrysosporium、PID 127920;Trichoderma reesei、JGI 120749;Fusarium graminearum、FGSG_07274;Sclerotinia sclerotiorum、PID 156037816;Botryotinia fuckeliana、PID 156037816;Penicillium chrysogenum、PID 255941826;Schizophyllum commune、JGI 57050;Postia placenta、JGI 45922. NCU04952:Myceliophthora thermophila、JGI 66804;Aspergillus terreus、PID 115401928;Phanerochaete chrysosporium、PID 3320413;Trichoderma reesei、JGI 76672;Sclerotinia sclerotiorum、PID 156050519;Botryotinia fuckeliana、PID 154293970;Penicillium chrysogenum、PID 255945487;Schizophyllum commune、PID 302694815。
系統発生学的な解析に用いたB−G’sのための、GenBank accession numbers(PID)、 Joint Genome Institute protein ID(JGI)、または、Broad Institute Fusarium Comparative Database Genes(FGSG)numberは、以下のとおりである。つまり、NCU08755:Myceliophthora thermophila、JGI 80304:Aspergillus niger、PID 254674400;Phanerochaete chrysosporium、PID 19352194;Trichoderma reesei、JGI 121735;Fusarium graminearum、FGSG_06605;Sclerotinia sclerotiorum、PID 156051478;Botryotinia fuckeliana、PID 154301968;Penicillium chrysogenum、PID 255942539;Schizophyllum commune、JGI 256304;Postia placenta、JGI 107557. NCU00130:Myceliophthora thermophila、JGI 115968;Aspergillus niger、PID 213437;Phanerochaete chrysosporium、PID 127920;Trichoderma reesei、JGI 120749;Fusarium graminearum、FGSG_07274;Sclerotinia sclerotiorum、PID 156037816;Botryotinia fuckeliana、PID 156037816;Penicillium chrysogenum、PID 255941826;Schizophyllum commune、JGI 57050;Postia placenta、JGI 45922. NCU04952:Myceliophthora thermophila、JGI 66804;Aspergillus terreus、PID 115401928;Phanerochaete chrysosporium、PID 3320413;Trichoderma reesei、JGI 76672;Sclerotinia sclerotiorum、PID 156050519;Botryotinia fuckeliana、PID 154293970;Penicillium chrysogenum、PID 255945487;Schizophyllum commune、PID 302694815。
アラインメントに用いた全てのタンパク質は、BLASTpを用いて同定した。相同タンパク質の配列は、ClustalWを用いてMEGA5にて整列させた。距離を見積もるためのポアソンモデルと、500回のブートストラップ反復(bootstrap replications)を用いた最近隣枝交換(NNI)ツリー検索ストラテジー(Nearest-Neighborhood-Interchange(NNI) tree searching strategy)と、を用いて、最大尤度系統(Maximum Likelihood phylogeny)を決定した(48,49)。
(発現差分(Differential Expression)の解析)
生物学的な差異を明確にするために、培地を替えてから4時間目において、セルロースおよびスクロースを用いた野生株に関して、3つの培養物をサンプリングするとともに解析した。全ての別の菌株およびコンディションについては、単一のRNAseqライブラリーを解析した。
生物学的な差異を明確にするために、培地を替えてから4時間目において、セルロースおよびスクロースを用いた野生株に関して、3つの培養物をサンプリングするとともに解析した。全ての別の菌株およびコンディションについては、単一のRNAseqライブラリーを解析した。
Tophat(version 1.1.4)(50)を用いて、N. crassa OR74Aのゲノム(version 10)における推測される転写物に対して、配列を決定したライブラリーをマッピングした。FPKMs(fragments per kilobase of exon per million fragments mapped)のCufflinks(version 0.9.2)(51)を用いて、転写物の量を見積もった。なお、このとき、上から4分の1の順位における正規化(upper quartile normalization)を用い、Broad Instituteに由来するリファレンスのアイソフォームに対してマッピングした。
(階層的クラスタ分析)
複数の菌株の間において、または、複数の生育条件の間において統計学的に顕著な発現の変化を示す遺伝子を、Cuffdiffを用いて同定した。このとき、上から4分の1の順位における正規化、および、遺伝子座毎にマップされた読み取りの最小値(minimum of mapped reads per locus)を用いた。次いで、これらの遺伝子を選別にかけて、i)菌株/コンディション試験の各々において、全ての生物学的な複製物の間で、見積もられた量が2倍の変化を示す遺伝子、および、ii)少なくとも1つの菌株/コンディション試験において、常に10より大きなFPKMを有する遺伝子、のみを選択した。
複数の菌株の間において、または、複数の生育条件の間において統計学的に顕著な発現の変化を示す遺伝子を、Cuffdiffを用いて同定した。このとき、上から4分の1の順位における正規化、および、遺伝子座毎にマップされた読み取りの最小値(minimum of mapped reads per locus)を用いた。次いで、これらの遺伝子を選別にかけて、i)菌株/コンディション試験の各々において、全ての生物学的な複製物の間で、見積もられた量が2倍の変化を示す遺伝子、および、ii)少なくとも1つの菌株/コンディション試験において、常に10より大きなFPKMを有する遺伝子、のみを選択した。
セルロースを用いた野生株、セロビオースを用いた野生株、セロビオースを用いた変異株、および、セルロースを用いた変異株に関して、FPKMにしたがったCluster 3.0 (52)を用いて、階層的クラスタ分析を行った。クラスタリングに先立って、FPKMをlogへ変換し、遺伝子ごとの基準(per-gene basis)に基づいて菌株/生育条件にわたって標準化し、菌株/生育条件にわたる平均値に基づいて中央を決めた。クラスタリング法における、類似関数および平均連鎖(similarity metric and average linkage)として、ピアソンの相関係数(中央が決められていない(uncentered))を用いた。
(フラスコの振とう試験)
培養物は、1%のスクロース中で24時間成長させ、その後、2%のスクロースまたは0.2%のセロビオースを加えた。24時間後(WT、Δ3βG、および、Δ3βGΔcre)または72時間後(Δ3βG)に、上清を回収した。アビセル(登録商標)を用いたWTの培養物は、2%のアビセル(登録商標)の存在下で5日間生育させ、Δ3βGは、1%のスクロースの存在下で24時間生育させた後で1%のアビセル(登録商標)の存在下で48時間生育させ、Δ3βGΔcreは、1%のスクロースの存在下で24時間生育させた後で1%のアビセル(登録商標)の存在下で24時間生育させた。
培養物は、1%のスクロース中で24時間成長させ、その後、2%のスクロースまたは0.2%のセロビオースを加えた。24時間後(WT、Δ3βG、および、Δ3βGΔcre)または72時間後(Δ3βG)に、上清を回収した。アビセル(登録商標)を用いたWTの培養物は、2%のアビセル(登録商標)の存在下で5日間生育させ、Δ3βGは、1%のスクロースの存在下で24時間生育させた後で1%のアビセル(登録商標)の存在下で48時間生育させ、Δ3βGΔcreは、1%のスクロースの存在下で24時間生育させた後で1%のアビセル(登録商標)の存在下で24時間生育させた。
(バイオリアクターの試験)
セルラーゼの生産は、1Lの操作容積にて、3.7Lのバイオリアクター(BioEngineering AG)内で行った。適切に撹拌を行うために、バイオリアクターには、1個の48mmのRushton型のインペラと、等しく間隔をあけた4個のバッフルと、が備えられていた。インペラのスピードを、8時間の間は、胞子を発芽させるために200rpmに制御し、その後の残りの試験では、500rpmまでに制御した。温度は25℃に維持され、培地のpHは5.5に制御された。なお、培地のpHの制御には、40%のリン酸、および、1:5に希釈された水酸化アンモニウムを用いた。溶存酸素を、培地の飽和濃度の20%よりも高い濃度に維持した。当該維持は、溶存酸素圧(dissolved oxygen tension)に基づいて、通気速度を0.5〜3VVMに変化させることによって行った。唯一の炭素源として1% w/vのスクロースを含む最少培地(他の物でない限り、記載)に、109の分生子を植菌した。生育を開始してから24時間後に、最終濃度が0.2% w/vとなるようにセロビオースまたはアビセル(登録商標)を加えることによって、セルラーゼの生産を誘導した。誘導の0時間または12時間前、誘導時、誘導してから4、8、12、24および36時間後に、上清のサンプルを回収した。サンプルに対して4000rpmにて5分間の遠心分離を行うことによって、バイオマスを沈殿させた。そして、全てのサンプルを回収するまで、上清を2μmのPESフィルターにて濾過して−20℃にて保存した。
セルラーゼの生産は、1Lの操作容積にて、3.7Lのバイオリアクター(BioEngineering AG)内で行った。適切に撹拌を行うために、バイオリアクターには、1個の48mmのRushton型のインペラと、等しく間隔をあけた4個のバッフルと、が備えられていた。インペラのスピードを、8時間の間は、胞子を発芽させるために200rpmに制御し、その後の残りの試験では、500rpmまでに制御した。温度は25℃に維持され、培地のpHは5.5に制御された。なお、培地のpHの制御には、40%のリン酸、および、1:5に希釈された水酸化アンモニウムを用いた。溶存酸素を、培地の飽和濃度の20%よりも高い濃度に維持した。当該維持は、溶存酸素圧(dissolved oxygen tension)に基づいて、通気速度を0.5〜3VVMに変化させることによって行った。唯一の炭素源として1% w/vのスクロースを含む最少培地(他の物でない限り、記載)に、109の分生子を植菌した。生育を開始してから24時間後に、最終濃度が0.2% w/vとなるようにセロビオースまたはアビセル(登録商標)を加えることによって、セルラーゼの生産を誘導した。誘導の0時間または12時間前、誘導時、誘導してから4、8、12、24および36時間後に、上清のサンプルを回収した。サンプルに対して4000rpmにて5分間の遠心分離を行うことによって、バイオマスを沈殿させた。そして、全てのサンプルを回収するまで、上清を2μmのPESフィルターにて濾過して−20℃にて保存した。
(酵素活性のアッセイ)
分泌された全タンパク質は、Bio-Rad Protein Assay kit(Bio-Rad)を用いて測定され、15μLの濃縮されていない上清を4−14%のTris−HCL ポリアクリルアミドゲルにて泳動することによって可視化され、かつ、Thermo Scientific GelCode Blue Stain Reagentを用いて染色された。
分泌された全タンパク質は、Bio-Rad Protein Assay kit(Bio-Rad)を用いて測定され、15μLの濃縮されていない上清を4−14%のTris−HCL ポリアクリルアミドゲルにて泳動することによって可視化され、かつ、Thermo Scientific GelCode Blue Stain Reagentを用いて染色された。
全アビセラーゼの活性は、200rpmにてオービタルシェーカーにて撹拌しながら、50℃にて、250mLの培養ボトル内にて処理された。各ボトルには、50mLの操作容積にて、1%のセルロース(アビセル(登録商標))および50mM(pH5.0)の酢酸ナトリウムが入っていた。微生物の混入を防ぐために、テトラサイクリン(10μg/mL)が加えられた。加水分解試験を開始するに先立って、あらゆる溶解した糖を除去するために、10kDaのMWCO遠心濾過機を用いて、バイオリアクターの培養液サンプルのバッファー交換を行った。加水分解する混合物を予め50℃に加熱した後、酵素を加えた(1mLの濾過された培養液)。はじめの12時間の間は4時間毎にサンプルを採取し、その後の合計48時間の間は12時間毎にサンプルを採取した。加水分解試験は、3回行った。
(糖の解析)
30℃の条件下にて、CarboPac PA20 Analytical Column(3×150mm)およびCarboPac PA20 guard column(3×30mm)を用いて、DIONEX ICS-3000 HPLC(Dionex Corp., Sunnyvale, CA)によって、スクロース、フルクトース、グルコースおよびセロビオースを測定した。25μLの希釈されたサンプルを注入し、4mL/minの条件下にて、100mMのKOH(isocratic)を用いて溶出を行った。PADを用いて糖を検出し、Chromeleon software packageを用いて、4つの潜在的な糖質の波形(Four-Potential Carbohydrate Waveform)およびピークを解析した。
30℃の条件下にて、CarboPac PA20 Analytical Column(3×150mm)およびCarboPac PA20 guard column(3×30mm)を用いて、DIONEX ICS-3000 HPLC(Dionex Corp., Sunnyvale, CA)によって、スクロース、フルクトース、グルコースおよびセロビオースを測定した。25μLの希釈されたサンプルを注入し、4mL/minの条件下にて、100mMのKOH(isocratic)を用いて溶出を行った。PADを用いて糖を検出し、Chromeleon software packageを用いて、4つの潜在的な糖質の波形(Four-Potential Carbohydrate Waveform)およびピークを解析した。
(質量分析)
液体クロマトグラフィー−質量分析(liquid chromatography−mass spectrometry)に用いる移動相の溶媒を準備するために、Fisher Scientific(Pittsburgh, PA)から購入したアセトニトリル(Fisher Optima grade, 99.9%)およびギ酸(Pierce, 1 mL ampules, 99+%)、並びに、Milli−Q Gradient ultrapure water purification system(Millipore, Billerica, MA)を用いて18.2 MΩ・cm(25℃)の抵抗率に精製した水、を用いた。
液体クロマトグラフィー−質量分析(liquid chromatography−mass spectrometry)に用いる移動相の溶媒を準備するために、Fisher Scientific(Pittsburgh, PA)から購入したアセトニトリル(Fisher Optima grade, 99.9%)およびギ酸(Pierce, 1 mL ampules, 99+%)、並びに、Milli−Q Gradient ultrapure water purification system(Millipore, Billerica, MA)を用いて18.2 MΩ・cm(25℃)の抵抗率に精製した水、を用いた。
四重極直交加速飛行時間型(Q−tof)質量分析計(orthogonal acceleration quadrupole time-of-flight (Q−tof) mass spectrometer)を用いて、トリプシンにて消化されたタンパク質を解析した。なお、当該四重極直交加速飛行時間型(Q−tof)質量分析計は、直列にて、ウルトラパフォーマンス液体クロマトグラフィー(ultraperformance liquid chromatograph:UPLC)へ連結されていた。C18トラップ用カラム(180μm×20mm)、分析用カラム(100μm×100mm)、および、10μLのサンプルループを備えたnanoAcquity UPLC(Waters, Milford, MA)を用いて、ペプチドを分離した。Solvent Aは、水が99.9%でありギ酸が0.1%のものであり、Solvent Bは、アセトニトリルが99.9%でありギ酸が0.1%のものであった(v/v)。分析の前に、隔壁キャップにてシールされたポリプロピレン製の0.3mLのスナップ−トップ バイアル(Wheaton Science, Millville, NJ)に入ったサンプル溶液を、nanoAcquity autosampler compartment内へ装填した。サンプル(10μL)を注入した後、流速が15μL/minの条件下にて、100%のSolvent Aを用いて3分間のトラッピングを行った。サンプル間の二次汚染を防止するために、注入後に、500μLのSolvent AおよびSolvent Bの各々を用いて、注入用の注射針を洗浄した。溶出プログラムは、30分間にて8%のSolvent Bから35%のSolvent Bへ変化するリニア・グラディエント(linear gradient)、0.33分間にて95%のSolvent Bへ変化するリニア・グラディエント、3.67分間にわたる95%のSolvent Bによる一定状態、0.33分間にて1%のSolvent Bへ変化するリニア・グラディエント、および、11.67分間にわたる1%のSolvent Bによる一定状態、からなるものであった。なお、当該溶出プログラムでは、流速は、500nL/minであった。分析用カラムおよびサンプルコンパートメントは、各々、35℃および8℃に維持された。
UPLCカラムの出口は、Universal NanoFlow Sprayer nanoelectrospray ionization(nanoESI)エミッターへ連結された。なお、当該エミッターは、質量分析計(Q-tof Premier, Waters, Milford, MA)のナノフローイオン源内に備え付けられたものであった。nanoESIエミッターチップは、サンプリングコーン開口(sampling cone aperture)から略3mmの位置に配置された。nanoESIソースパラメーターは、以下のとおりであった。つまり、nanoESI電圧が2.4kVであり、噴霧ガス(窒素)の圧力が0.15ミリバール(mbar)であり、サンプルコーン電圧が35Vであり、エクストラクションコーンおよびイオンガイド電圧が4Vであり、ソースブロック温度が80℃であった。コーンガスは、用いなかった。コリジョンセルには、8×10−3mbarの圧力のアルゴンガスが含まれていた。Tof分析器を‘V’モードにて操作した。これらの条件下では、通常、1.0×104(m/z=771にて測定)の質量分解能(53)が実現された。当該質量分解能は、本試験において測定される、一価にまたは多価に帯電したプレカーサーイオンおよび断片イオンの同位体の分布(isotopic distributions)を解明するのに十分なものであった。それ故に、独立して、イオンの質量および電荷を決定した。つまり、m/zスペクトル内で隣接する同位体ピークの間の間隔の逆数から、イオンの電荷を決定した。解析を行う直前に、ギ酸ナトリウムの水溶液を用いて、エクスターナルな質量のキャリブレーションを行った。0.45sのスキャンインテグレーションと0.05sのインタースキャンディレイとを用いた、m/z=400−1500のポジティブイオンモードにて、計測スキャンを行った。データ依存モードでは、タンデム質量分析(MS/MS)解析のための各計測スキャンから、20カウント/秒(cpm)の強度閾値よりも大きい最大5つのプレカーサーイオンを選択した。MS/MSにおいて、2+、3+、および、4+の電荷状態のプレカーサーイオンを選択するために、リアルタイムの脱同位体および電荷状態の識別(Real-time deisotoping and charge state recognition)を行った。任意のプレカーサーイオンの質量および電荷状態に基づいて、自動的に衝突活性化解離の衝突エネルギー(CAD)(Collision energies for collisionally activated dissociation(CAD))を選択した。0.20sのスキャンインテグレーションと0.05sのインタースキャンディレイとを用いて、m/z=100−2000の範囲にて、MS/MSスペクトルを測定した。最大2Sの累積MS/MSスペクトルにおいて30,000cpmの最小全イオン電流(TIC)(minimum total ion current(TIC))を達成するために、イオンをフラグメント化させた。不必要なMS/MS測定が発生することを避けるために、リアルタイムの動的排除(real−time dynamic exclusion)を用いて、300Sの期間にわたって±0.2m/zユニットの排除幅にて、既に解析されたプレカーサーイオンが再び選択されることを防いだ。
トリプシンによって消化されたタンパク質のLC−MS/MS解析にて得られたデータを、ProteinLynx Global Server software(version 2.3, Waters)を用いて処理した。当該ProteinLynx Global Server software(version 2.3, Waters)によって、バックグラウンド除去(35%の閾値および5次の多項式(fifth order polynomial))、スムージング(Savitzky-Golay、10回、3チャンネルよりも大)、質量スペクトルおよびMS/MSスペクトルの重心化(centroiding)(4つのチャンネルの半分の高さにおける、上位80%の各ピークおよび最少ピークの幅)を行った。処理されたデータを、Neurospora crassaのタンパク質のデータベース(Broad Institute, Cambridge, MA)に対して検索した。データベースの検索には、以下の基準を用いた。つまり、プレカーサーイオン質量トレランスが100ppm、フラグメントイオン質量トレランスが0.15Da、消化試薬がトリプシン、間違った分解を最大3つまで許容、メチオニンの酸化は変化可能な修飾である。ペプチドをMS/MSスペクトルへ対応付けるために、同じシリーズから少なくとも3つの連続したフラグメントイオン(換言すれば、bタイプのフラグメントイオン、または、yタイプのフラグメントイオン)を同定する必要があった。ペプチドを同定するフラグメントイオンの存在を確かめるために、MS/MSスペクトルを検査した。3つの生物学的な複製物(全上清、結合PASC、非結合PASC)中の2つにおいて、少なくともペプチドが検出された場合、タンパク質が存在すると決定した。
[結果]
(3つのβ−グルコシダーゼ遺伝子を欠失しているN. crassaの、セロデキストリンを用いた誘導培養におけるセルラーゼの転写の誘導)
野生型のN. crassa(WT)を、スクロース、セロビオース、セロトリオース、またはセロテトラオースを単一の炭素源として用いて成長させた場合には、リグノセルロース分解酵素遺伝子は誘導されず、セルロース分解酵素活性も検出されなかった(図17A)。これは、N. crassaがセロデキストリンによって成長するときに、β−グルコシダーゼ酵素の活性によって産生されたグルコースが、セロデキストリンの誘導能を隠す可能性があると考えられた(図1)。N. crassaのゲノムは、推定β−グルコシダーゼ酵素をコードしている少なくとも7つの遺伝子を有しているが、3つのみ(NCU00130、NCU04952およびNCU08755)が、アビセル(登録商標)またはMiscanthus(20)による成長の間に、転写が有意に増加する。これらのβ−グルコシダーゼの3つ全てが、他の糸状菌において推定され且つ実験的に証明されたβ−グルコシダーゼ酵素に対して高い相同性を示した。発現データに基づいて、GH1−1(NCU00130)、GH3−3(NCU08755)およびGH3−4(NCU04952)は、N. crassaが単一の炭素源としてアビセル(登録商標)またはセロデキストリンによって成長するときにセロビオースをグルコースへ変換することにおいて、最も関連がある酵素であると考えた。
(3つのβ−グルコシダーゼ遺伝子を欠失しているN. crassaの、セロデキストリンを用いた誘導培養におけるセルラーゼの転写の誘導)
野生型のN. crassa(WT)を、スクロース、セロビオース、セロトリオース、またはセロテトラオースを単一の炭素源として用いて成長させた場合には、リグノセルロース分解酵素遺伝子は誘導されず、セルロース分解酵素活性も検出されなかった(図17A)。これは、N. crassaがセロデキストリンによって成長するときに、β−グルコシダーゼ酵素の活性によって産生されたグルコースが、セロデキストリンの誘導能を隠す可能性があると考えられた(図1)。N. crassaのゲノムは、推定β−グルコシダーゼ酵素をコードしている少なくとも7つの遺伝子を有しているが、3つのみ(NCU00130、NCU04952およびNCU08755)が、アビセル(登録商標)またはMiscanthus(20)による成長の間に、転写が有意に増加する。これらのβ−グルコシダーゼの3つ全てが、他の糸状菌において推定され且つ実験的に証明されたβ−グルコシダーゼ酵素に対して高い相同性を示した。発現データに基づいて、GH1−1(NCU00130)、GH3−3(NCU08755)およびGH3−4(NCU04952)は、N. crassaが単一の炭素源としてアビセル(登録商標)またはセロデキストリンによって成長するときにセロビオースをグルコースへ変換することにおいて、最も関連がある酵素であると考えた。
セロビオースがN. crassaにおけるセルラーゼ遺伝子の発現を誘導するかどうかを検証するために、β−グルコシダーゼ遺伝子であるgh1−1、gh3−3またはgh3−4を欠失している株において、3つの主要なセルラーゼ遺伝子(cbh−1、NCU07340;gh6−2、NCU09680およびgh5−1、NCU00762)の発現が誘導されたかどうかを、移行実験によって試験した。β−グルコシダーゼ酵素間の重複の可能性を排除するために、β−グルコシダーゼ遺伝子を異なる組合せで欠失している二重変異体株および三重変異体株も構築し、試験を行った。0.2%セロビオースを用いて4時間に亘って誘導した後に、それぞれのβ−グルコシダーゼ欠失株(Δgh1−1、Δgh3−3またはΔgh3−4)は、cbh−1、gh6−2またはgh5−1の発現の誘導を示さなかった。これに対して、Δgh1−1Δgh3−3二重変異体は、いくつかのセルラーゼ遺伝子の誘導を示した。しかし、WTの培養をアビセル(登録商標)に移したときのように、全ての3つのβ−グルコシダーゼ遺伝子(Δgh1−1、Δgh3−3およびΔgh3−4)を欠失している株(Δ3βG)は、0.2%セロビオースに移したときのcbh−1、gh5−1およびgh6−2の相対的な発現レベルが類似していた(図18A)。さらに、Δ3βG株は、セロビオース、セロトリオースまたはセロテトラオースに移したときのcbh−1、gh5−1およびgh6−2の相対的な発現レベルが類似していた(図17B)。Δ3βG変異体における転写応答は、セロビオースに特異的であった。そして、あらゆる炭素源を欠失している培地に移したときのWT株およびΔ3βG株におけるcbh−1およびgh5−1の発現は、転写レベルでのわずかな増加のみを示したので(50倍未満の誘導)、Δ3βG変異体における転写応答は、飢餓が原因ではなかった。WTのN. crassaにおけるアビセル(登録商標)によるcbh−1およびgh5−1の誘導およびセロビオースに移したΔ3βG株におけるアビセル(登録商標)によるcbh−1およびgh5−1の誘導が、〜20,000倍(最小値)であることと比較すると、これらの値は無視してもよい。
工業用の種であるT. reeseiにおいて、もっとも広く使用されている可溶性のセルラーゼ誘導剤は、ソホロースおよび乳糖である(25)。それゆえ、WTおよびΔ3βG欠失株を用いて、ソホロースまたは乳糖への接触によってN. crassaにおけるセルラーゼ遺伝子の発現が誘導されるかどうかを調べた。他の糸状菌種にみられるように(15)、WTまたはΔ3βG変異体を、ソホロース、乳糖またはD−(+)−ガラクトース(乳糖の分解産物)を含有している培地に移すと、セルラーゼ遺伝子の発現は有意に誘導されなかった(図19)。
たとえリグノセルロースが存在していたとしても、炭素異化代謝産物抑制(CCR)は、糸状菌において、グルコースまたはスクロース等の好ましい炭素源の存在下におけるセルラーゼ遺伝子およびヘミセルラーゼ遺伝子の発現を抑制するために機能する(4)。Aspergillus sp.、T. reeseiおよびN. crassaにおいてCreA/CRE1/CRE−1を欠失している株は、それぞれ、セルロースまたはヘミセルロースによって成長するときにセルラーゼおよびヘミセルラーゼの量を増加させる。このため、C2H2ジンクフィンガー転写因子であるCreA/CRE1/CRE−1(26)は、CCRにおいて主要な役割を担っている(21、27、28)。N. crassaのcre−1欠失株(ΔNCU08807)から単離されたRNAの定量的なRT−PCR解析は、cbh−1およびgh5−1の基礎的な発現が、WT株に対しておよそ10倍増加したことを示した。スクロースから0.2%セロビオースに4時間に亘って移したときに、Δcre−1株は、cbh−1、gh5−1およびgh6−2の誘導の増加を示した(それぞれ、3,000倍、500倍および85倍)。しかし、Δcre−1変異体における誘導のレベルは、アビセル(登録商標)に接触したWTまたはセロビオースに接触したΔ3βG変異体において得られた誘導レベルよりも有意に低かった。特に、cre−1も欠失しているΔ3βG株(Δ3βGΔcre)は、アビセル(登録商標)に移したWTまたはセロビオースに移したΔ3βG変異体よりも、cbh−1、gh5−1およびgh6−2をより強く誘導した(図18A)。これらのデータは、セロビオースに接触したときのΔ3βG変異体におけるセルラーゼ遺伝子の発現の誘導が、セルロースによる誘導と遜色ないこと、およびCCRが解除された結果ではないことを示している。
(セロビオースに接触した三重β−グルコシダーゼ変異体における野生型のN. crassaのセルロース分解反応の再現)
Δ3βG株におけるセロビオースに対する全ゲノム応答が、アビセル(登録商標)に接触したWT株と類似しているかまたは異なっているかを評価するために、ハイスループットシークエンシング(RNA−Seq)を用いた。遺伝子発現の変化の全ゲノムパターンは、セロビオースに対するΔ3βG変異体の応答が、アビセル(登録商標)によって誘導されたWTの応答と密接に一致することを示した。そして、セロビオースに対するΔ3βG変異体の応答が、セロビオースに対するWTの応答または飢餓状態におけるWTの応答とは有意に異なっていることを示した。アビセル(登録商標)に対する応答において、WTのN. crassaにおいてどの遺伝子が有意且つ特異的に誘導されたのかを特定するために、アビセル(登録商標)に移したWTの発現プロファイルと炭素源を追加していない培地に移したWTの発現プロファイルとの間でペアワイズ解析を実施した。これらの解析によって、321個の遺伝子(3つの欠失したβ−グルコシダーゼ遺伝子を含む)を同定した。これらの遺伝子は、アビセル(登録商標)に対する応答において、WT培養において有意且つ特異的に誘導された(セルロースレギュロン)。この遺伝子セットは、16個の推定セルラーゼ遺伝子と、12個の推定ヘミセルラーゼ遺伝子とを含んでいた。セルロースレギュロンにおける追加遺伝子は、CAZy(29)によって炭水化物において活性があると予測されたタンパク質をコードしている41個の遺伝子と、分泌タンパク質(signalP)(30)をコードしている111個の遺伝子とを含んでいた。セルロースレギュロンにおける321個の遺伝子の内、156個は未分類のタンパク質として特徴づけられるタンパク質をコードしている(MIPS FunCat database)(31)。特に興味深いことに、xlnR/xyr1の相同体(NCU06971)は、Aspergilli(32)およびT. reesei(33)におけるセルラーゼの制御において主要な役割を担っており、セルロースレギュロンに分類される。しかし、NCU06971は、N. crassa(34)において、xlnR/xyr1相同体として既に同定されたが、植物細胞壁の分解におけるその役割は未知である。
Δ3βG株におけるセロビオースに対する全ゲノム応答が、アビセル(登録商標)に接触したWT株と類似しているかまたは異なっているかを評価するために、ハイスループットシークエンシング(RNA−Seq)を用いた。遺伝子発現の変化の全ゲノムパターンは、セロビオースに対するΔ3βG変異体の応答が、アビセル(登録商標)によって誘導されたWTの応答と密接に一致することを示した。そして、セロビオースに対するΔ3βG変異体の応答が、セロビオースに対するWTの応答または飢餓状態におけるWTの応答とは有意に異なっていることを示した。アビセル(登録商標)に対する応答において、WTのN. crassaにおいてどの遺伝子が有意且つ特異的に誘導されたのかを特定するために、アビセル(登録商標)に移したWTの発現プロファイルと炭素源を追加していない培地に移したWTの発現プロファイルとの間でペアワイズ解析を実施した。これらの解析によって、321個の遺伝子(3つの欠失したβ−グルコシダーゼ遺伝子を含む)を同定した。これらの遺伝子は、アビセル(登録商標)に対する応答において、WT培養において有意且つ特異的に誘導された(セルロースレギュロン)。この遺伝子セットは、16個の推定セルラーゼ遺伝子と、12個の推定ヘミセルラーゼ遺伝子とを含んでいた。セルロースレギュロンにおける追加遺伝子は、CAZy(29)によって炭水化物において活性があると予測されたタンパク質をコードしている41個の遺伝子と、分泌タンパク質(signalP)(30)をコードしている111個の遺伝子とを含んでいた。セルロースレギュロンにおける321個の遺伝子の内、156個は未分類のタンパク質として特徴づけられるタンパク質をコードしている(MIPS FunCat database)(31)。特に興味深いことに、xlnR/xyr1の相同体(NCU06971)は、Aspergilli(32)およびT. reesei(33)におけるセルラーゼの制御において主要な役割を担っており、セルロースレギュロンに分類される。しかし、NCU06971は、N. crassa(34)において、xlnR/xyr1相同体として既に同定されたが、植物細胞壁の分解におけるその役割は未知である。
セロビオースまたはアビセル(登録商標)の炭素源を含有していない培地に移したWTの発現データと、セロビオースまたはアビセル(登録商標)を含有している培地に移したΔ3βG株の発現データとから、セルロースレギュロンの範囲内において遺伝子の階層的クラスタ分析を行った結果、4つの異なる発現クラスタを同定した(図20A)。最も大きいクラスタ(クラスタ2)は、210個の遺伝子を含み、セロビオースにおけるΔ3βG株またはアビセル(登録商標)誘導条件下のΔ3βG株と同様に、アビセル(登録商標)におけるWT株において高い発現を示した。210個の遺伝子のこのグループは、セルロース分解のためのアクセサリータンパク質であると特定された3つの遺伝子(NCU00206、cdh−1;NCU07143、lac−2;NCU09764、CBM1含有タンパク質)と同様に、全ての16個の推定セルラーゼ遺伝子(NCU00762、gh5−1;NCU00836、gh61−7;NCU01050、gh61−4;NCU02240、gh61−1;NCU02344、gh61−12;NCU02916、gh61−3;NCU03328、gh61−6;NCU04854、gh7−2;NCU05057、gh7−1;NCU05121、gh45−1;NCU07190、gh6−3;NCU07340、cbh−1;NCU07760、gh61−2;NCU07898、gh61−13;NCU08760、gh61−5;NCU09680、gh6−2)を含んでいた(20,35)。このクラスタは、9個のヘミセルラーゼ遺伝子(NCU02343、gh51−1;NCU02855、gh11−1;NCU04997、gh10−3;NCU05924、gh10−1;NCU05955、gh74−1;NCU07225、gh11−2;NCU07326、gh43−6;NCU08189、gh10−2;NCU09775、gh54−1)も含んでいた。このクラスタにおける残りの182個のタンパク質の内、29個はCAZy(29)によって炭水化物において活性があると予測され、76個はsignalPによって分泌されると予測されると共に、25個の遺伝子は両方のカテゴリーに分類される。残る102個の遺伝子は、推定された機能的カテゴリー(31)、すなわち、C−化合物および炭水化物の代謝に関与すると推定された10個の遺伝子;タンパク質の折畳み、修飾または輸送に関与する8個の遺伝子;および未分類のタンパク質をコードする62個の遺伝子に分類された。
36個の遺伝子の小さなクラスタ(クラスタ1)は、WT株またはΔ3βG欠失株がアビセル(登録商標)に接触したときに、高い発現レベルを示した(図20A)。しかし、セロビオースに接触したΔ3βG欠失株においては、より低い発現レベルを示した。このグループは、推定β−キシロシダーゼ遺伝子(NCU09652、gh43−5)およびヘミセルロースにおいて活性があるタンパク質をコードしているいくつかの他の遺伝子(NCU00710、アセチルキシランエステラーゼ;NCU01900、キシロシダーゼ/アラビノシダーゼ;NCU00891、キシリトールデヒドロゲナーゼ;およびNCU08384、キシロース還元酵素)を含んでいた。これらの結果は、これらの遺伝子は、アビセル(登録商標)において見出されたように、0.5〜1.0%ヘミセルロースによって誘導されたこと(20)、およびセロビオースによって誘導されたレギュロンの一部ではないことを示している。
セロビオースにおけるΔ3βG株の誘導と、アビセル(登録商標)におけるWTの誘導とを比較すると、顕著なパターンが現れる(図20B)。アビセル(登録商標)によってWTにおいて誘導された遺伝子は、Δ3βG変異体において認められた値と非常に近い。例えば、アビセル(登録商標)におけるWTにおいて、cbh−1のためのFPKMは126,816±53,016である。一方、セロビオースにおけるΔ3βGにおいて、FPKMは130,865である。このパターンは、NCU07760(gh61−2)のような、わずかに誘導されたセルラーゼにまで及ぶ。アビセル(登録商標)におけるWTにおいて、NCU07760(gh61−2)のためのFPKMは239±62であり、セロビオースにおけるΔ3βG変異体において、FPKMは538であった。一方で、Δ3βG変異体におけるいくつかのヘミセルラーゼ遺伝子が、セロビオースに対する応答において誘導された。しかし、アビセル(登録商標)によって誘導したWT培養またはΔ3βG培養における発現レベルよりも低かった。例えば、アビセル(登録商標)を用いて誘導したWTにおいて、NCU05924(エンドキシラーゼ、gh10−1)は、20,023±9,888FPKMであった。これに対して、セロビオースによって誘導したΔ3βG変異体においては、10,000FPKMの発現レベルが観察された。これらの結果は、全てのセルラーゼ遺伝子が同じレギュロン内にあること、およびヘミセルラーゼ遺伝子は、セルラーゼによって協調的に制御されるものと、完全誘導のためにさらなるシグナルが必要なものとに分類されることを示している。
(Δ3βG変異体における植物細胞壁分解酵素の転写は、セルラーゼ分泌およびセルラーゼ活性と関連している)
セロビオースに対する応答において、Δ3βG株およびΔ3βGΔcre株の転写応答が機能的なタンパク質の増加と関連するかどうかを検証するために、セロビオースまたはアビセル(登録商標)による誘導に対する応答において、Δ3βG株およびΔ3βGΔcre株の分泌タンパク質およびセルラーゼ活性をWT培養と比較することによって評価した(SI材料および方法)。予測されたとおり、全てのスクロース成長培養からの上清(Δ3βG、Δ3βGΔcreおよびWT)は、アビセル(登録商標)加水分解試験において、結晶質セルロースからグルコースまたはセロビオースを産生することができなかった(材料および方法)。一方、アビセル(登録商標)によって誘導した培養からの全ての3つの上清(Δ3βG、Δ3βGΔcreおよびWT)は、結晶性セルロースをセロビオースおよびグルコースに分解することができた(図18C)。セロビオースを用いて成長させたときに、Δ3βG株およびΔ3βGΔcre株は、WTのアビセル(登録商標)成長培養と同様の分泌タンパク質のパターンを示した(図18B)(20)。重要なことに、セロビオースによって誘導した、Δ3βG欠失株およびΔ3βGΔcre欠失株からの上清は、結晶性セルロースを加水分解した。一方で、WTのセロビオース成長培養からの上清は、結晶性セルロースを加水分解しなかった。Δ3βG株およびΔ3βGΔcre株は、3つのβ−グルコシダーゼを欠失しており、大部分はセロビオースを産生した。これらのデータは、WTの培養においてグルコース産生活性の大部分をもたらす点で、3つのβ-グルコシダーゼ酵素の役割と一致している(37)。
セロビオースに対する応答において、Δ3βG株およびΔ3βGΔcre株の転写応答が機能的なタンパク質の増加と関連するかどうかを検証するために、セロビオースまたはアビセル(登録商標)による誘導に対する応答において、Δ3βG株およびΔ3βGΔcre株の分泌タンパク質およびセルラーゼ活性をWT培養と比較することによって評価した(SI材料および方法)。予測されたとおり、全てのスクロース成長培養からの上清(Δ3βG、Δ3βGΔcreおよびWT)は、アビセル(登録商標)加水分解試験において、結晶質セルロースからグルコースまたはセロビオースを産生することができなかった(材料および方法)。一方、アビセル(登録商標)によって誘導した培養からの全ての3つの上清(Δ3βG、Δ3βGΔcreおよびWT)は、結晶性セルロースをセロビオースおよびグルコースに分解することができた(図18C)。セロビオースを用いて成長させたときに、Δ3βG株およびΔ3βGΔcre株は、WTのアビセル(登録商標)成長培養と同様の分泌タンパク質のパターンを示した(図18B)(20)。重要なことに、セロビオースによって誘導した、Δ3βG欠失株およびΔ3βGΔcre欠失株からの上清は、結晶性セルロースを加水分解した。一方で、WTのセロビオース成長培養からの上清は、結晶性セルロースを加水分解しなかった。Δ3βG株およびΔ3βGΔcre株は、3つのβ−グルコシダーゼを欠失しており、大部分はセロビオースを産生した。これらのデータは、WTの培養においてグルコース産生活性の大部分をもたらす点で、3つのβ-グルコシダーゼ酵素の役割と一致している(37)。
工業用の糸状菌は、種々の産物を高レベルに産生するために、液内培養において成長させられる(38)。それゆえ、制御されたバイオリアクター工程において、Δ3βG欠失株およびΔ3βGΔcre欠失株におけるセルラーゼの誘導を調べた(図7A〜D)。スクロースを用いた成長の24時間後に、WT、Δ3βGおよびΔ3βGΔcreは、同量のバイオマス(〜3.5g/L)を産生した(図7A〜C)。0.2%セロビオースを用いた誘導後に、WTは、大量のタンパク質を分泌しなかった(.05mg/mL;図7C)。一方、Δ3βG培養およびΔ3βGΔcre培養は、上清において、それぞれ、0.12mg/mLのタンパク質および0.24mg/mLのタンパク質を産生した(図7Aおよび7B)。さらに、セロビオースによって誘導した、Δ3βG培養およびΔ3βGΔcre培養は、この誘導の同じ期間に亘って、エンドグルカナーゼ活性が有意に増加した(図7F)。24時間の時点の合計のアビセラーゼ活性を調べると、Δ3βGΔcre株は、Δ3βG株(0.296mg/mL)と比較して、さらに60%のグルコース等価物(0.424mg/mL)を産生したことがわかった(図7E)。しかし、タンパク質の全濃度を規準化すると、Δ3βGΔcre株は、WTまたはΔ3βGの培養上清よりも比活性が低かった(図21)。
(分泌タンパク質のプロテオーム解析)
アビセル(登録商標)において成長するWTのN. crassaによって分泌されるタンパク質に対する、セロビオースによって誘導したΔ3βG株によって分泌されるタンパク質の独自性を比較するために、ショットガンプロテオミクスアプローチを用いてセクレトームを解析した(表1)。WTのアビセル(登録商標)成長培養上清において、39個のタンパク質が同定された。セロビオース成長培養において、Δ3βG培養液において38個のタンパク質が同定され、Δ3βGΔcre培養液において24個のタンパク質が同定された(図22)。定量的な質量分析法によって、アビセル(登録商標)におけるWTのN. crassaのセクレトームの76%は、6個の個別のタンパク質からなると結論付けられた(35)。これらのタンパク質の全てが、WT培養液、Δ3βG培養液、およびΔ3βGΔcre培養液において同定された(欠失したβ−グルコシダーゼ、gh3−4を除く)(表1)。セルラーゼに加えて、少量のアクセサリータンパク質を同定した。これらのアクセサリータンパク質は、セクレトームの計6.5%を構成する(35)。同定したアクセサリータンパク質は、セロビオースデヒドロゲナーゼ(CDH−1)、2型ラクトナーゼ(LAC−2)、および2つの仮想タンパク質(すなわち、NCU09764、機能未知のCBM1−含有タンパク質、およびNCU05137、欠失するとセルラーゼ活性の増加をもたらす遺伝子)であった(20)。これらのデータは、セロビオースに対するΔ3βG変異体の転写応答と同様に、セロビオースにおけるΔ3βG株において分泌されたタンパク質の独自性と、分泌されたタンパク質の量とが、アビセル(登録商標)に対するWTのN. crassaの応答とよく似ていることを示している。
アビセル(登録商標)において成長するWTのN. crassaによって分泌されるタンパク質に対する、セロビオースによって誘導したΔ3βG株によって分泌されるタンパク質の独自性を比較するために、ショットガンプロテオミクスアプローチを用いてセクレトームを解析した(表1)。WTのアビセル(登録商標)成長培養上清において、39個のタンパク質が同定された。セロビオース成長培養において、Δ3βG培養液において38個のタンパク質が同定され、Δ3βGΔcre培養液において24個のタンパク質が同定された(図22)。定量的な質量分析法によって、アビセル(登録商標)におけるWTのN. crassaのセクレトームの76%は、6個の個別のタンパク質からなると結論付けられた(35)。これらのタンパク質の全てが、WT培養液、Δ3βG培養液、およびΔ3βGΔcre培養液において同定された(欠失したβ−グルコシダーゼ、gh3−4を除く)(表1)。セルラーゼに加えて、少量のアクセサリータンパク質を同定した。これらのアクセサリータンパク質は、セクレトームの計6.5%を構成する(35)。同定したアクセサリータンパク質は、セロビオースデヒドロゲナーゼ(CDH−1)、2型ラクトナーゼ(LAC−2)、および2つの仮想タンパク質(すなわち、NCU09764、機能未知のCBM1−含有タンパク質、およびNCU05137、欠失するとセルラーゼ活性の増加をもたらす遺伝子)であった(20)。これらのデータは、セロビオースに対するΔ3βG変異体の転写応答と同様に、セロビオースにおけるΔ3βG株において分泌されたタンパク質の独自性と、分泌されたタンパク質の量とが、アビセル(登録商標)に対するWTのN. crassaの応答とよく似ていることを示している。
表1において、GHは、グリコシド加水分解酵素を表し、N/Aは遺伝子ノックアウトを示す。セクレトームの割合は、アビセル(登録商標)によって誘導されたセクレトームを、AQUA質量分析法(35)によって同定した。13個のタンパク質が、全セクレトームの91%に相当し、全ての他のタンパク質がセクレトームの1%未満に相当した。
〔実施例4〕
以下の実施例は、N. crassaの遺伝子であるNCU00890およびN. crassaの遺伝子であるNCU06650の欠失を含むN. crassa株におけるセルラーゼ活性の特定に関する。
以下の実施例は、N. crassaの遺伝子であるNCU00890およびN. crassaの遺伝子であるNCU06650の欠失を含むN. crassa株におけるセルラーゼ活性の特定に関する。
[材料および方法]
N. crassaの三重β−グルコシダーゼ遺伝子欠失株と、N. crassaの三重β−グルコシダーゼ遺伝子およびcre−1遺伝子欠失株とを、実施例1において記載したとおり作製した。
N. crassaの三重β−グルコシダーゼ遺伝子欠失株と、N. crassaの三重β−グルコシダーゼ遺伝子およびcre−1遺伝子欠失株とを、実施例1において記載したとおり作製した。
NCU06650(FGSC 11246および11247)の欠失株およびNCU00890(FGSC 16749)の欠失株は、真菌遺伝子ストックセンター(Fungal Genetics Stock Center)(FGSC)から取得した。多重欠失株は、連続交雑を行うことによって産生した。それぞれの多重欠失株の遺伝子型は、遺伝子特異的プライマーおよびハイグロマイシン(hph)カセットに対する共通プライマーを用いて確認した。フォワードプライマーは以下であった:
hph Middle FWD: 5’-CGA CAG ACG TCG CGG TGA GTT CAG-3’ [配列番号4]
リバースプライマーは以下であった:
NCU06650: 5’- CAT CTC ATA CTC CCT CAT CC-3’ [配列番号23]
NCU00890: 5’- GGT TGT CTC GGT CGA CAT TG -3’ [配列番号24]。
hph Middle FWD: 5’-CGA CAG ACG TCG CGG TGA GTT CAG-3’ [配列番号4]
リバースプライマーは以下であった:
NCU06650: 5’- CAT CTC ATA CTC CCT CAT CC-3’ [配列番号23]
NCU00890: 5’- GGT TGT CTC GGT CGA CAT TG -3’ [配列番号24]。
エキソグルカナーゼ(セロビオヒドラーゼI)活性は、4−メチルウンベリフェリルβ−D−セロビオシド(MuLac)試験を用いて測定した。この試験は、主に、CBH−1の活性を測定するものである。そして、活性は、蛍光における変化として表され、蛍光における変化は、酵素活性の指標としてのベストフィットラインの傾きを時間とともにもたらす。この試験は、20μlの全培養上清と、最終濃度が1.0mMのMuLacおよび50mMの酢酸ナトリウムpH5とを含む、全量100μlにおいて実施される。この試験は、40℃に設定されたベックマンコールターパラダイムプレートリーダー(Beckman Coulter Paradigm plate reader)において、360/465nmの励起波長/発光波長を用いて、10分間にわたって30秒ごとに測定することによって実施した。ベストフィットラインの傾きは、それぞれの培養上清のMuLac活性を表している。
[結果]
NCU00890欠失およびNCU06650欠失の両方が分泌過剰として特徴づけられることを考えると、これらの欠失を、三重β−グルコシダーゼおよびcre−1欠失株と組み合わせることによって、セルラーゼ分泌が増加することを確認する必要があった。NCU00890遺伝子は、β−マンノシダーゼをコードしている。NCU06650遺伝子は、ホスホリパーゼに最も近い相同性を有していると特徴付けられたポリペプチドをコードしている。
NCU00890欠失およびNCU06650欠失の両方が分泌過剰として特徴づけられることを考えると、これらの欠失を、三重β−グルコシダーゼおよびcre−1欠失株と組み合わせることによって、セルラーゼ分泌が増加することを確認する必要があった。NCU00890遺伝子は、β−マンノシダーゼをコードしている。NCU06650遺伝子は、ホスホリパーゼに最も近い相同性を有していると特徴付けられたポリペプチドをコードしている。
図23において示したように、NCU00890欠失またはNCU06650欠失を三重β−グルコシダーゼ欠失株と組み合わせると、セロビオースによる誘導の24時間後に、セロビオヒドラーゼI活性における少量の増加が認められた。さらに、cre−1欠失も含むことによって、六重変異体(三重β−グルコシダーゼ欠失と、NCU00890欠失およびNCU06650欠失の両方とを含む)は、セロビオースによる誘導の24時間後に、さらに高いセロビオヒドラーゼI活性を有していた。
β−マンノシダーゼ遺伝子NCU00890の相同体は、Trichoderma reeseiにおいて同定された。T. reesei相同体は、スキャフォールド10(Scaffold 10)、258215-260779、protein ID 62166;およびスキャフォールド4(Scaffold 4)、877954-880802、protein ID 57857において見出される。
さらに、遺伝子NCU06650の相同体は、T. reeseiにおいて同定された。この相同体は、スキャフォールド22(Scaffold 22)、490155-490769、protein ID 67579において見出された。
T. reesei相同体は、DOE Joint Genome Institute T. reesei databaseを用いて、NCU00890またはNCU06650のBLASTpサーチを行うことによって同定された。
[文献]
1. Rubin EM (2008) Genomics of cellulosic biofuels. Nature 454:841-845.
2. Himmel ME, et al. (2007) Biomass recalcitrance: engineering plants and enzymes for biofuels production. Science 315:804-807.
3. Cherry JR & Fidantsef AL (2003) Directed evolution of industrial enzymes: an update. Curr Opin Biotechnol 14:438-443.
4. Kubicek CP, Messner R, Gruber F, Mach RL, & Kubicek-Pranz EM (1993) The Trichoderma cellulase regulatory puzzle: from the interior life of a secretory fungus. Enzyme Microb Technol 15:90-99.
5. Vaheri MP, Vaheri MEO, & Kauppinen VS (1979) Formation and release of cellulolytic enzymes during growth of Trichoderma reesei on cellobiose and glycerol. Appl Microbiol Biotechnol 8:73-80.
6. Mandels M & Reese ET (1960) Induction of cellulase in fungi by cellobiose. J Bacteriol 79:816-826.
7. Vaheri MP, Vaheri MEO, & Kauppinen VS (1979) Formation and release of cellulolytic enzymes during growth of Trichoderma reesei on cellobiose and glycerol. Appl Microbiol Biotechnol 8:73-80.
8. Chikamatsu G, Shirai K, Kato M, Kobayashi T, & Tsukagoshi N (1999) Structure and expression properties of the endo-beta-1,4-glucanase A gene from the filamentous fungus Aspergillus nidulans. FEMS Microbiol Lett 175:239-245.
9. Nevalainen KM, Te'o VS, & Bergquist PL (2005) Heterologous protein expression in filamentous fungi. Trends Biotechnol 23:468-474.
10. Suzuki H, Igarashi K, & Samejima M (2010) Cellotriose and cellotetraose as inducers of the genes encoding cellobiohydrolases in the basidiomycete Phanerochaete chrysosporium. Appl Environ Microbiol 76:6164-6170.
11. Vaheri M, Leisola M, & Kauppinen V (1979) Transglycosylation products of cellulase system of Trichoderma reesei. Biotechnol Lett 1:41-46.
12. Mandels M, Parrish FW, & Reese ET (1962) Sophorose as an inducer of cellulase in Trichoderma viride. J Bacteriol 83:400-408.
13. Sternberg D & Mandels GR (1979) Induction of cellulolytic enzymes in Trichoderma reesei by sophorose. J Bacteriol 139:761-769.
14. Sternberg D & Mandels GR (1980) Regulation of the cellulolytic system in Trichoderma reesei by sophorose: induction of cellulase and repression of beta-glucosidase. J Bacteriol 144:1197-1199.
15. Gielkens MM, Dekkers E, Visser J, & de Graaff LH (1999) Two cellobiohydrolase-encoding genes from Aspergillus niger require D-xylose and the xylanolytic transcriptional activator XlnR for their expression. Appl Environ Microbiol 65:4340-4345.
16. Ulmer DC, Leisola MSA, & Fiechter A (1984) Possible induction of the ligninolytic system of Phanerochaete chrysosporium. J Biotechnol 1:13-24.
17. Fritscher CC (1990) Cellobiose metabolism and cellobiohydrolase I biosynthesis by Trichoderma reesei. Exp Mycol 14:405-415.
18. Reese ET, Parrish FW, & Ettlinger M (1971) Nojirimycin and d-glucono-1,5-lactone as inhibitors of carbohydrases Carbohydrate Res 18:381-388.
19. Woodward J & Arnold SL (1981) The inhibition of β-glucosidase activity in Trichoderma reesei C30 cellulase by derivatives and isomers of glucose. Biotechnol Bioeng 23:1553-1562.
20. Tian C, et al. (2009) Systems analysis of plant cell wall degradation by the model filamentous fungus Neurospora crassa. Proc Natl Acad Sci U S A 106:22157-22162.
21. Sun J & Glass NL (2011) Identification of the CRE-1 cellulolytic regulon in Neurospora crassa. PLoS One 6:e25654.
22. Galazka JM, et al. (2010) Cellodextrin transport in yeast for improved biofuel production. Science 330:84-86.
23. Maddi A, Bowman SM, & Free SJ (2009) Trifluoromethanesulfonic acid-based proteomic analysis of cell wall and secreted proteins of the ascomycetous fungi Neurospora crassa and Candida albicans. Fungal Genet Biol 46:768-781.
24. Bohlin C, et al. (2010) A comparative study of activity and apparent inhibition of fungal beta-glucosidases. Biotechnol Bioeng 107:943-952.
25. Seiboth B, Hofmann G, & Kubicek CP (2002) Lactose metabolism and cellulase production in Hypocrea jecorina: the gal7 gene, encoding galactose-1-phosphate uridylyltransferase, is essential for growth on galactose but not for cellulase induction. Mol Genet Genomics 267:124-132.
26. Portnoy T, et al. (2011) The CRE1 carbon catabolite repressor of the fungus
Trichoderma reesei: a master regulator of carbon assimilation. BMC Genomics
12:269.
27. Tamayo EN, et al. (2008) CreA mediates repression of the regulatory gene xlnR which controls the production of xylanolytic enzymes in Aspergillus nidulans. Fungal Genet Biol 45:984-993.
28. Nakari-Setala T, et al. (2009) Genetic modification of carbon catabolite repression in Trichoderma reesei for improved protein production. Appl Environ Microbiol 75:4853-4860.
29. Cantarel BL, et al. (2009) The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): an expert resource for glycogenomics. Nucleic Acids Res 37:D233-238.
30. Nielsen H, Emanuelsson O, Brunak S, & von Heijne G (2007) Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools. Nat Protoc 2:953-971.
31. Ruepp A, et al. (2004) The FunCat, a functional annotation scheme for systematic classification of proteins from whole genomes. Nucleic Acids Res 32:5539-5545.
32. Noguchi Y, et al. (2009) Genes regulated by AoXlnR, the xylanolytic and cellulolytic transcriptional regulator, in Aspergillus oryzae. Appl Microbiol Biotechnol 85:141-154.
33. Portnoy T, et al. (2011) Differential regulation of the cellulase transcription factors XYR1, ACE2, and ACE1 in Trichoderma reesei strains producing high and low levels of cellulase. Eukaryot Cell 10:262-271.
34. Goncalves RD, Cupertino FB, Freitas FZ, Luchessi AD, & Bertolini MC (2011) A genome-wide screen for Neurospora crassa transcription factors regulating glycogen metabolism. Mol Cell Proteomics 10:M111 007963.
35. Phillips CM, Iavarone AT, & Marletta MA (2011) A quantitative proteomic approach for cellulose degradation by Neurospora crassa. J Proteome Res 10:4177-4185.
36. Ilmen M, Saloheimo A, Onnela ML, & Penttila ME (1997) Regulation of cellulase gene expression in the filamentous fungus Trichoderma reesei. Appl Environ Microbiol 63:1298-1306.
37. Levine SE, Fox JM, Clark DS, & Blanch HW (2011) A mechanistic model for rational design of optimal cellulase mixtures. Biotechnol Bioeng 108:2561-2570.
38. Gibbs PA, Seviour RJ, & Schmid F (2000) Growth of filamentous fungi in submerged culture: problems and possible solutions. Crit Rev Biotechnol 20:17-48.
39. Messner R, Gruber F, & Kubicek CP (1988) Differential regulation of synthesis of multiple forms of specific endoglucanases by Trichoderma reesei QM9414. J Bacteriol 170:3689-3693.
40. Kubicek CP, Messner R, Gruber F, Mandels M, & Kubicek-Pranz EM (1993) Triggering of cellulase biosynthesis by cellulose in Trichoderma reesei. Involvement of a constitutive, sophorose-inducible, glucose-inhibited betadiglucoside permease. J Biol Chem 268:19364-19368.
41. Ha SJ, et al. (2011) Engineered Saccharomyces cerevisiae capable of simultaneous cellobiose and xylose fermentation. Proc Natl Acad Sci U S A 108:504-509.
42. Langmead B, Trapnell C, Pop M, & Salzberg SL (2009) Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol 10:R25.
43. Roberts A, Trapnell C, Donaghey J, Rinn JL, & Pachter L (2011) Improving RNA-Seq expression estimates by correcting for fragment bias. Genome Biol 12:R22.
44. Sun J & Glass NL (2011) Identification of the CRE-1 Cellulolytic Regulon in Neurospora crassa. PLoS One 6:e25654.
45. Vogel H (1956) A convenient growth medium for Neurospora. Microbial Genetics Bulletin 13:42-46.
46. Tian C, et al. (2009) Systems analysis of plant cell wall degradation by the model filamentous fungus Neurospora crassa. Proc Natl Acad Sci U S A 106:22157-22162.
47. Dementhon K, Iyer G, & Glass NL (2006) VIB-1 is required for expression of genes necessary for programmed cell death in Neurospora crassa. Eukaryot Cell 5:2161-2173.
48. Hall BG (2008) Phylogenetic trees made easy : a how-to manual (Sinauer Associates, Sunderland, Mass.) 3rd Ed pp xiv, 233 p.
49. Tamura K, et al. (2011) MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Mol Biol Evol 28:2731-2739.
50. Langmead B, Trapnell C, Pop M, & Salzberg SL (2009) Ultrafast and memory efficient-alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol 10:R25.
51. Roberts A, Trapnell C, Donaghey J, Rinn JL, & Pachter L (2011) Improving RNA-Seq expression estimates by correcting for fragment bias. Genome Biol 12:R22.
52. de Hoon MJL, Imoto S, Nolan J, & Miyano S (2004) Open source clustering software. Bioinformatics 20:1453-1454.
53. Marshall AG & Hendrickson CL (2008) High-resolution mass spectrometers. Annu Rev Anal Chem (Palo Alto Calif) 1:579-599.
54. Roepstorff P & Fohlman J (1984) Proposal for a common nomenclature for sequence ions in mass spectra of peptides. Biomed Mass Spectrom 11:601.
1. Rubin EM (2008) Genomics of cellulosic biofuels. Nature 454:841-845.
2. Himmel ME, et al. (2007) Biomass recalcitrance: engineering plants and enzymes for biofuels production. Science 315:804-807.
3. Cherry JR & Fidantsef AL (2003) Directed evolution of industrial enzymes: an update. Curr Opin Biotechnol 14:438-443.
4. Kubicek CP, Messner R, Gruber F, Mach RL, & Kubicek-Pranz EM (1993) The Trichoderma cellulase regulatory puzzle: from the interior life of a secretory fungus. Enzyme Microb Technol 15:90-99.
5. Vaheri MP, Vaheri MEO, & Kauppinen VS (1979) Formation and release of cellulolytic enzymes during growth of Trichoderma reesei on cellobiose and glycerol. Appl Microbiol Biotechnol 8:73-80.
6. Mandels M & Reese ET (1960) Induction of cellulase in fungi by cellobiose. J Bacteriol 79:816-826.
7. Vaheri MP, Vaheri MEO, & Kauppinen VS (1979) Formation and release of cellulolytic enzymes during growth of Trichoderma reesei on cellobiose and glycerol. Appl Microbiol Biotechnol 8:73-80.
8. Chikamatsu G, Shirai K, Kato M, Kobayashi T, & Tsukagoshi N (1999) Structure and expression properties of the endo-beta-1,4-glucanase A gene from the filamentous fungus Aspergillus nidulans. FEMS Microbiol Lett 175:239-245.
9. Nevalainen KM, Te'o VS, & Bergquist PL (2005) Heterologous protein expression in filamentous fungi. Trends Biotechnol 23:468-474.
10. Suzuki H, Igarashi K, & Samejima M (2010) Cellotriose and cellotetraose as inducers of the genes encoding cellobiohydrolases in the basidiomycete Phanerochaete chrysosporium. Appl Environ Microbiol 76:6164-6170.
11. Vaheri M, Leisola M, & Kauppinen V (1979) Transglycosylation products of cellulase system of Trichoderma reesei. Biotechnol Lett 1:41-46.
12. Mandels M, Parrish FW, & Reese ET (1962) Sophorose as an inducer of cellulase in Trichoderma viride. J Bacteriol 83:400-408.
13. Sternberg D & Mandels GR (1979) Induction of cellulolytic enzymes in Trichoderma reesei by sophorose. J Bacteriol 139:761-769.
14. Sternberg D & Mandels GR (1980) Regulation of the cellulolytic system in Trichoderma reesei by sophorose: induction of cellulase and repression of beta-glucosidase. J Bacteriol 144:1197-1199.
15. Gielkens MM, Dekkers E, Visser J, & de Graaff LH (1999) Two cellobiohydrolase-encoding genes from Aspergillus niger require D-xylose and the xylanolytic transcriptional activator XlnR for their expression. Appl Environ Microbiol 65:4340-4345.
16. Ulmer DC, Leisola MSA, & Fiechter A (1984) Possible induction of the ligninolytic system of Phanerochaete chrysosporium. J Biotechnol 1:13-24.
17. Fritscher CC (1990) Cellobiose metabolism and cellobiohydrolase I biosynthesis by Trichoderma reesei. Exp Mycol 14:405-415.
18. Reese ET, Parrish FW, & Ettlinger M (1971) Nojirimycin and d-glucono-1,5-lactone as inhibitors of carbohydrases Carbohydrate Res 18:381-388.
19. Woodward J & Arnold SL (1981) The inhibition of β-glucosidase activity in Trichoderma reesei C30 cellulase by derivatives and isomers of glucose. Biotechnol Bioeng 23:1553-1562.
20. Tian C, et al. (2009) Systems analysis of plant cell wall degradation by the model filamentous fungus Neurospora crassa. Proc Natl Acad Sci U S A 106:22157-22162.
21. Sun J & Glass NL (2011) Identification of the CRE-1 cellulolytic regulon in Neurospora crassa. PLoS One 6:e25654.
22. Galazka JM, et al. (2010) Cellodextrin transport in yeast for improved biofuel production. Science 330:84-86.
23. Maddi A, Bowman SM, & Free SJ (2009) Trifluoromethanesulfonic acid-based proteomic analysis of cell wall and secreted proteins of the ascomycetous fungi Neurospora crassa and Candida albicans. Fungal Genet Biol 46:768-781.
24. Bohlin C, et al. (2010) A comparative study of activity and apparent inhibition of fungal beta-glucosidases. Biotechnol Bioeng 107:943-952.
25. Seiboth B, Hofmann G, & Kubicek CP (2002) Lactose metabolism and cellulase production in Hypocrea jecorina: the gal7 gene, encoding galactose-1-phosphate uridylyltransferase, is essential for growth on galactose but not for cellulase induction. Mol Genet Genomics 267:124-132.
26. Portnoy T, et al. (2011) The CRE1 carbon catabolite repressor of the fungus
Trichoderma reesei: a master regulator of carbon assimilation. BMC Genomics
12:269.
27. Tamayo EN, et al. (2008) CreA mediates repression of the regulatory gene xlnR which controls the production of xylanolytic enzymes in Aspergillus nidulans. Fungal Genet Biol 45:984-993.
28. Nakari-Setala T, et al. (2009) Genetic modification of carbon catabolite repression in Trichoderma reesei for improved protein production. Appl Environ Microbiol 75:4853-4860.
29. Cantarel BL, et al. (2009) The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): an expert resource for glycogenomics. Nucleic Acids Res 37:D233-238.
30. Nielsen H, Emanuelsson O, Brunak S, & von Heijne G (2007) Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools. Nat Protoc 2:953-971.
31. Ruepp A, et al. (2004) The FunCat, a functional annotation scheme for systematic classification of proteins from whole genomes. Nucleic Acids Res 32:5539-5545.
32. Noguchi Y, et al. (2009) Genes regulated by AoXlnR, the xylanolytic and cellulolytic transcriptional regulator, in Aspergillus oryzae. Appl Microbiol Biotechnol 85:141-154.
33. Portnoy T, et al. (2011) Differential regulation of the cellulase transcription factors XYR1, ACE2, and ACE1 in Trichoderma reesei strains producing high and low levels of cellulase. Eukaryot Cell 10:262-271.
34. Goncalves RD, Cupertino FB, Freitas FZ, Luchessi AD, & Bertolini MC (2011) A genome-wide screen for Neurospora crassa transcription factors regulating glycogen metabolism. Mol Cell Proteomics 10:M111 007963.
35. Phillips CM, Iavarone AT, & Marletta MA (2011) A quantitative proteomic approach for cellulose degradation by Neurospora crassa. J Proteome Res 10:4177-4185.
36. Ilmen M, Saloheimo A, Onnela ML, & Penttila ME (1997) Regulation of cellulase gene expression in the filamentous fungus Trichoderma reesei. Appl Environ Microbiol 63:1298-1306.
37. Levine SE, Fox JM, Clark DS, & Blanch HW (2011) A mechanistic model for rational design of optimal cellulase mixtures. Biotechnol Bioeng 108:2561-2570.
38. Gibbs PA, Seviour RJ, & Schmid F (2000) Growth of filamentous fungi in submerged culture: problems and possible solutions. Crit Rev Biotechnol 20:17-48.
39. Messner R, Gruber F, & Kubicek CP (1988) Differential regulation of synthesis of multiple forms of specific endoglucanases by Trichoderma reesei QM9414. J Bacteriol 170:3689-3693.
40. Kubicek CP, Messner R, Gruber F, Mandels M, & Kubicek-Pranz EM (1993) Triggering of cellulase biosynthesis by cellulose in Trichoderma reesei. Involvement of a constitutive, sophorose-inducible, glucose-inhibited betadiglucoside permease. J Biol Chem 268:19364-19368.
41. Ha SJ, et al. (2011) Engineered Saccharomyces cerevisiae capable of simultaneous cellobiose and xylose fermentation. Proc Natl Acad Sci U S A 108:504-509.
42. Langmead B, Trapnell C, Pop M, & Salzberg SL (2009) Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol 10:R25.
43. Roberts A, Trapnell C, Donaghey J, Rinn JL, & Pachter L (2011) Improving RNA-Seq expression estimates by correcting for fragment bias. Genome Biol 12:R22.
44. Sun J & Glass NL (2011) Identification of the CRE-1 Cellulolytic Regulon in Neurospora crassa. PLoS One 6:e25654.
45. Vogel H (1956) A convenient growth medium for Neurospora. Microbial Genetics Bulletin 13:42-46.
46. Tian C, et al. (2009) Systems analysis of plant cell wall degradation by the model filamentous fungus Neurospora crassa. Proc Natl Acad Sci U S A 106:22157-22162.
47. Dementhon K, Iyer G, & Glass NL (2006) VIB-1 is required for expression of genes necessary for programmed cell death in Neurospora crassa. Eukaryot Cell 5:2161-2173.
48. Hall BG (2008) Phylogenetic trees made easy : a how-to manual (Sinauer Associates, Sunderland, Mass.) 3rd Ed pp xiv, 233 p.
49. Tamura K, et al. (2011) MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Mol Biol Evol 28:2731-2739.
50. Langmead B, Trapnell C, Pop M, & Salzberg SL (2009) Ultrafast and memory efficient-alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol 10:R25.
51. Roberts A, Trapnell C, Donaghey J, Rinn JL, & Pachter L (2011) Improving RNA-Seq expression estimates by correcting for fragment bias. Genome Biol 12:R22.
52. de Hoon MJL, Imoto S, Nolan J, & Miyano S (2004) Open source clustering software. Bioinformatics 20:1453-1454.
53. Marshall AG & Hendrickson CL (2008) High-resolution mass spectrometers. Annu Rev Anal Chem (Palo Alto Calif) 1:579-599.
54. Roepstorff P & Fohlman J (1984) Proposal for a common nomenclature for sequence ions in mass spectra of peptides. Biomed Mass Spectrom 11:601.
上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、セルロース誘導性タンパク質である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、セルラーゼ、GH61酵素、セロビオースデヒドロゲナーゼ、ラクトナーゼ、カルボヒドレートエステラーゼ、多糖リアーゼ、セルロース結合ドメイン含有タンパク質、およびこれらの組合せからなる群より選択される。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質はセルラーゼである。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764およびNCU05137からなる群より選択される遺伝子によってコードされる。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記変異体細胞は、少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子にて不活性化変異をさらに含む。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記変異体細胞は、少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子にて不活性化変異をさらに含む。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記不活性化変異は欠失である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、細胞はリコンビナント細胞である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は真菌細胞または酵母細胞である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は真菌細胞または酵母細胞である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は、Neurospora crassa(N. crassa)細胞、Aspergillus nidulans細胞、Trichoderma reesei細胞、Phanerochaete chrysosporium細胞、Sporotrichum thermophile(Myceliophthora thermophila)細胞、Gibberella zeae細胞、Sclerotinia sclerotiorum細胞、Botryotinia fuckeliana細胞、Aspergillus niger細胞、Penicillium chrysogenum細胞、Schizophyllum commune細胞、Postia placenta細胞、Aspergillus oryzae細胞、およびAcremonium cellulolyticus細胞から選択される。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、3つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、4つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、5つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、6つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、7つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記3つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、4つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、5つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、6つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、または7つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、NCU00130、NCU04952およびNCU08755を含む。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、少なくとも1つの上記β−グルコシダーゼ遺伝子は、細胞内β−グルコシダーゼをコードする。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、少なくとも1つの上記β−グルコシダーゼ遺伝子が、細胞外β−グルコシダーゼをコードする。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子はNCU00890である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子はNCU06650である。
上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、セルロース誘導性タンパク質である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、セルラーゼ、GH61酵素、セロビオースデヒドロゲナーゼ、ラクトナーゼ、カルボヒドレートエステラーゼ、多糖リアーゼ、セルロース結合ドメイン含有タンパク質、およびこれらの組合せからなる群より選択される。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質はセルラーゼである。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764およびNCU05137から選択される遺伝子によってコードされる。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、creA/cre−1の機能は、ドミナントネガティブ変異体の過剰発現またはタンパク質インヒビターによって低減されている。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の発現をさらに示す。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の発現をさらに示す。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記遺伝子の発現は、siRNA、アンチセンスDNA、クエリングまたは減数分裂性サイレンシングによって低減されている。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、3つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、4つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、5つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、6つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、7つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記3つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、4つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、5つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、6つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、または7つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、NCU00130、NCU04952およびNCU08755を含む。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、少なくとも1つの上記β−グルコシダーゼ遺伝子は、細胞内β−グルコシダーゼをコードする。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、少なくとも1つの上記β−グルコシダーゼ遺伝子は、細胞外β−グルコシダーゼをコードする。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子はNCU00890である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子はNCU06650である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は、安定な細胞株または一過性にトランスフェクトされた細胞である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は真菌細胞または酵母細胞である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞が、子嚢菌種または担子菌種の糸状菌である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は、Neurospora crassa(N. crassa)細胞、Aspergillus nidulans細胞、Trichoderma reesei細胞、Phanerochaete chrysosporium細胞、Sporotrichum thermophile(Myceliophthora thermophila)細胞、Gibberella zeae細胞、Sclerotinia sclerotiorum細胞、Botryotinia fuckeliana細胞、Aspergillus niger細胞、Penicillium chrysogenum細胞、Schizophyllum commune細胞、Postia placenta細胞、Aspergillus oryzae細胞、およびAcremonium cellulolyticus細胞から選択される。
上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、セルロース誘導性タンパク質である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、セルラーゼ、GH61酵素、セロビオースデヒドロゲナーゼ、ラクトナーゼ、カルボヒドレートエステラーゼ、多糖リアーゼ、セルロース結合ドメイン含有タンパク質、およびこれらの組合せから選択される。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質はセルラーゼである。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764およびNCU05137から選択される遺伝子によってコードされる。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記不活性化変異は欠失である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞はリコンビナント細胞である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は真菌細胞または酵母細胞である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は、子嚢菌種または担子菌種の糸状菌である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は、Neurospora crassa(N. crassa)細胞、Aspergillus nidulans細胞、Trichoderma reesei細胞、Phanerochaete chrysosporium細胞、Sporotrichum thermophile (Myceliophthora thermophila)細胞、Gibberella zeae細胞、Sclerotinia sclerotiorum細胞、Botryotinia fuckeliana細胞、Aspergillus niger細胞、Penicillium chrysogenum細胞、Schizophyllum commune細胞、Postia placenta細胞、Aspergillus oryzae細胞、およびAcremonium cellulolyticus細胞から選択される。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、3つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、4つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、5つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、6つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、7つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記3つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、4つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、5つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、6つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、または7つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、NCU00130、NCU04952およびNCU08755を含む。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、少なくとも1つの上記β−グルコシダーゼ遺伝子は、細胞内β−グルコシダーゼをコードする。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、少なくとも1つの上記β−グルコシダーゼ遺伝子は、細胞外β−グルコシダーゼをコードする。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子はNCU00890である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子はNCU06650である。
上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、セルロース誘導性タンパク質である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、セルラーゼ、GH61酵素、セロビオースデヒドロゲナーゼ、ラクトナーゼ、カルボヒドレートエステラーゼ、多糖リアーゼ、セルロース結合ドメイン含有タンパク質、およびこれらの組合せから選択される。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質はセルラーゼである。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764およびNCU05137から選択される遺伝子によってコードされる。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、3つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、4つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、5つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、6つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、7つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記3つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、4つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、5つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、6つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、または7つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子は、NCU00130、NCU04952およびNCU08755を含む。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、少なくとも1つの上記β−グルコシダーゼ遺伝子は、細胞内β−グルコシダーゼをコードする。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、少なくとも1つの上記β−グルコシダーゼ遺伝子は、細胞外β−グルコシダーゼをコードする。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子はNCU00890である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子はNCU06650である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は、安定な細胞株または一過性にトランスフェクトされた細胞である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は、真菌細胞または酵母細胞である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は、子嚢菌種または担子菌種の糸状菌である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記細胞は、Neurospora crassa(N. crassa)細胞、Aspergillus nidulans細胞、Trichoderma reesei細胞、Phanerochaete chrysosporium細胞、Sporotrichum thermophile(Myceliophthora thermophila)細胞、Gibberella zeae細胞、Sclerotinia sclerotiorum細胞、Botryotinia fuckeliana細胞、Aspergillus niger細胞、Penicillium chrysogenum細胞、Schizophyllum commune細胞、Postia placenta細胞、Aspergillus oryzae細胞、およびAcremonium cellulolyticus細胞から選択される。
本開示の別の局面は、バイオマスを分解する方法であって、(a)リグノセルロース系バイオマスを提供する工程;(b)上述した実施形態のいずれかの細胞、あるいはcre−1遺伝子にて不活性化変異を含んでいる細胞を提供する工程;(c)上記細胞をセルロース系バイオマスと接触させることによってタンパク質を分泌するように上記細胞を誘導する工程;ならびに(d)誘導された上記細胞を上記リグノセルロース系バイオマスと接触させる工程であって、分泌された上記タンパク質が上記リグノセルロース系バイオマスを分解する、工程による方法に関する。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記セルロース系バイオマスは、1つ以上の多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースを含む。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記セルロース系バイオマスはセロビオースを含む。本発明の別の局面は、バイオマスを分解する方法であって、(a)リグノセルロース系バイオマスを提供する工程;(b)上述した実施形態のいずれかの細胞、あるいはcre−1遺伝子にて不活性化変異を含んでいる細胞を提供する工程;(c)上記細胞を糖と接触させることによってタンパク質を分泌するように上記細胞を誘導する工程;ならびに(d)誘導された上記細胞を上記リグノセルロース系バイオマスと接触させる工程であって、分泌された上記タンパク質が上記リグノセルロース系バイオマスを分解する、工程による方法に関する。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記糖は、多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースから選択される。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、上記糖はセロビオースである。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、セルロース誘導性タンパク質である。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、セルラーゼ、GH61酵素、セロビオースデヒドロゲナーゼ、ラクトナーゼ、カルボヒドレートエステラーゼ、多糖リアーゼ、セルロース結合ドメイン含有タンパク質、およびこれらの組合せから選択される。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質はセルラーゼである。上述した任意の実施形態と組み合わせ得る実施形態において、分泌される上記タンパク質は、NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764およびNCU05137から選択される遺伝子によってコードされる。
Claims (140)
- 細胞からのタンパク質の分泌を増加させる方法であって、
(a)変異体細胞を提供する工程であって、該変異体細胞は、2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子にて不活性化変異を含んでいる、工程;および
(b)上記変異体細胞をセルロース系バイオマスと接触させる工程であって、該セルロース系バイオマスは、上記タンパク質を分泌するように該変異体細胞を誘導する、工程
を包含する、方法。 - 前記変異体細胞は、該細胞中のcre−1遺伝子にて不活性化変異をさらに含んでいる、請求項1に記載の方法。
- 細胞からのタンパク質の分泌を増加させる方法であって、
(a)変異体細胞を提供する工程であって、該変異体細胞は、該細胞中のcre−1遺伝子にて不活性化変異を含んでいる、工程;および
(b)上記変異体細胞をセルロース系バイオマスと接触させる工程であって、該セルロース系バイオマスは、上記タンパク質を分泌するように該変異体細胞を誘導する、工程
を包含する、方法。 - 前記変異体細胞は、2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子にて不活性化変異をさらに含んでいる、請求項3に記載の方法。
- 前記セルロース系バイオマスは、1つ以上の多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースを含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記セルロース系バイオマスはセロビオースを含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 細胞からのタンパク質の分泌を増加させる方法であって、
(a)変異体細胞を提供する工程であって、該変異体細胞は、2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子にて不活性化変異を含んでいる、工程;および
(b)上記変異体細胞を糖と接触させる工程であって、該糖は、上記タンパク質を分泌するように該変異体細胞を誘導する、工程
を包含する、方法。 - 前記変異体細胞は、該細胞中のcre−1遺伝子にて不活性化変異をさらに含んでいる、請求項7に記載の方法。
- 細胞からのタンパク質の分泌を増加させる方法であって、
(a)変異体細胞を提供する工程であって、該変異体細胞は、該細胞中のcre−1遺伝子にて不活性化変異を含んでいる、工程;および
(b)上記変異体細胞を糖と接触させる工程であって、該糖は、上記タンパク質を分泌するように該変異体細胞を誘導する、工程
を包含する、方法。 - 前記変異体細胞は、2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子にて不活性化変異をさらに含んでいる、請求項9に記載の方法。
- 前記糖は、多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースからなる群より選択される、請求項7〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記糖はセロビオースである、請求項7〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 分泌される前記タンパク質は、セルロース誘導性タンパク質である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 分泌される前記タンパク質は、セルラーゼ、GH61酵素、セロニオースデヒドロゲナーゼ、ラクトナーゼ、カルボヒドレートエステラーゼ、多糖リアーゼ、セルロース結合ドメイン含有タンパク質、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 分泌される前記タンパク質はセルラーゼである、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 分泌される前記タンパク質は、NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764およびNCU05137からなる群より選択される遺伝子によってコードされる、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記変異体細胞は、該細胞中の少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子にて不活性化変異をさらに含んでいる、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記変異体細胞は、該細胞中の少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子にて不活性化変異をさらに含んでいる、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記不活性化変異が欠失である、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞がリコンビナント細胞である、請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が真菌細胞または酵母細胞である、請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が、子嚢菌種または担子菌種の糸状菌である、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が、Neurospora crassa(N. crassa)細胞、Aspergillus nidulans細胞、Trichoderma reesei細胞、Phanerochaete chrysosporium細胞、Sporotrichum thermophile(Myceliophthora thermophila)細胞、Gibberella zeae細胞、Sclerotinia sclerotiorum細胞、Botryotinia fuckeliana細胞、Aspergillus niger細胞、Penicillium chrysogenum細胞、Schizophyllum commune細胞、Postia placenta細胞、Aspergillus oryzae細胞、およびAcremonium cellulolyticus細胞からなる群より選択される、請求項1〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、3つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である、請求項1〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、4つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である、請求項1〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、5つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である、請求項1〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、6つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である、請求項1〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、7つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である、請求項1〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記3つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、4つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、5つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、6つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、または7つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、NCU00130、NCU04952およびNCU08755を含む、請求項24〜28のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも1つの前記β−グルコシダーゼ遺伝子が、細胞内β−グルコシダーゼをコードする、請求項1〜29のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも1つの前記β−グルコシダーゼ遺伝子が、細胞外β−グルコシダーゼをコードする、請求項1〜29のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子がNCU00890である、請求項1〜31のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子がNCU06650である、請求項1〜32のいずれか1項に記載の方法。
- 細胞からのタンパク質の分泌を増加させる方法であって、
(a)リコンビナント細胞を提供する工程であって、該リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現を示す、工程;および
(b)上記リコンビナント細胞をセルロース系バイオマスと接触させる工程であって、該セルロース系バイオマスは、上記タンパク質を分泌するように該リコンビナント細胞を誘導する、工程
を包含する、方法。 - 前記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中のcre−1遺伝子の発現と比較して低減したcre−1遺伝子の発現をさらに示す、請求項34に記載の方法。
- 細胞からのタンパク質の分泌を増加させる方法であって、
(a)リコンビナント細胞を提供する工程であって、該リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中のcre−1遺伝子の発現と比較して低減したcre−1遺伝子の発現を示す、工程;および
(b)上記リコンビナント細胞をセルロース系バイオマスと接触させる工程であって、該セルロース系バイオマスは、上記タンパク質を分泌するように該リコンビナント細胞を誘導する、工程
を包含する、方法。 - 前記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現をさらに示す、請求項36に記載の方法。
- 前記セルロース系バイオマスは、1つ以上の多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースを含む、請求項34〜37のいずれか1項に記載の方法。
- 前記セルロース系バイオマスはセロビオースを含む、請求項34〜37のいずれか1項に記載の方法。
- 細胞からのタンパク質の分泌を増加させる方法であって、
(a)リコンビナント細胞を提供する工程であって、該リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現を示す、工程;および
(b)上記変異体細胞を糖と接触させる工程であって、該糖は、上記タンパク質を分泌するように該変異体細胞を誘導する、工程
を包含する、方法。 - 前記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中のcre−1遺伝子の発現と比較して低減したcre−1遺伝子の発現をさらに示す、請求項40に記載の方法。
- 細胞からのタンパク質の分泌を増加させる方法であって、
(a)リコンビナント細胞を提供する工程であって、該リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中のcre−1遺伝子の発現と比較して低減したcre−1遺伝子の発現を示す、工程;および
(b)上記変異体細胞を糖と接触させる工程であって、該糖は、上記タンパク質を分泌するように該変異体細胞を誘導する、工程
を包含する、方法。 - 前記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現をさらに示す、請求項42に記載の方法。
- 前記糖は、多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースからなる群より選択される、請求項40〜43のいずれか1項に記載の方法。
- 前記糖はセロビオースである、請求項40〜43のいずれか1項に記載の方法。
- 分泌される前記タンパク質は、セルロース誘導性タンパク質である、請求項34〜45のいずれか1項に記載の方法。
- 分泌される前記タンパク質は、セルラーゼ、GH61酵素、セロニオースデヒドロゲナーゼ、ラクトナーゼ、カルボヒドレートエステラーゼ、多糖リアーゼ、セルロース結合ドメイン含有タンパク質、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項34〜46のいずれか1項に記載の方法。
- 分泌される前記タンパク質はセルラーゼである、請求項34〜46のいずれか1項に記載の方法。
- 分泌される前記タンパク質は、NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764およびNCU05137からなる群より選択される遺伝子によってコードされる、請求項34〜46のいずれか1項に記載の方法。
- creA/cre−1の機能が、ドミナントネガティブ変異体の過剰発現またはタンパク質インヒビターによって低減されている、請求項34〜49のいずれか1項に記載の方法。
- 前記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の発現をさらに示す、請求項34〜50のいずれか1項に記載の方法。
- 前記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の発現をさらに示す、請求項34〜51のいずれか1項に記載の方法。
- 前記遺伝子の発現が、siRNA、アンチセンスDNA、クエリングまたは減数分裂性サイレンシングによって低減されている、請求項34〜52のいずれか1項に記載の方法。
- 前記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、3つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である、請求項34〜53のいずれか1項に記載の方法。
- 前記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、4つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である、請求項34〜53のいずれか1項に記載の方法。
- 前記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、5つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である、請求項34〜53のいずれか1項に記載の方法。
- 前記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、6つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である、請求項34〜53のいずれか1項に記載の方法。
- 前記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、7つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である、請求項34〜53のいずれか1項に記載の方法。
- 前記3つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、4つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、5つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、6つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、または7つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、NCU00130、NCU04952およびNCU08755を含む、請求項54〜58のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも1つの前記β−グルコシダーゼ遺伝子が、細胞内β−グルコシダーゼをコードする、請求項34〜59のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも1つの前記β−グルコシダーゼ遺伝子が、細胞外β−グルコシダーゼをコードする、請求項34〜59のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子がNCU00890である、請求項34〜61のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子がNCU06650である、請求項34〜62のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が、安定な細胞株または一過性にトランスフェクトされた細胞である、請求項34〜63のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が真菌細胞または酵母細胞である、請求項34〜64のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が、子嚢菌種または担子菌種の糸状菌である、請求項34〜65のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が、Neurospora crassa(N. crassa)細胞、Aspergillus nidulans細胞、Trichoderma reesei細胞、Phanerochaete chrysosporium細胞、Sporotrichum thermophile(Myceliophthora thermophila)細胞、Gibberella zeae細胞、Sclerotinia sclerotiorum細胞、Botryotinia fuckeliana細胞、Aspergillus niger細胞、Penicillium chrysogenum細胞、Schizophyllum commune細胞、Postia placenta細胞、Aspergillus oryzae細胞、およびAcremonium cellulolyticus細胞からなる群より選択される、請求項34〜66のいずれか1項に記載の方法。
- 2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子にて不活性変異を含んでいる変異体細胞であって、セルロース系バイオマスが、上記変異体細胞に対応する、2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子にて不活性変異を欠いている細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記変異体細胞を誘導する、変異体細胞。
- 請求項68に記載の変異体細胞であって、該変異体細胞は、該細胞中のcre−1遺伝子にて不活性化変異をさらに含んでおり、セルロース系バイオマスが、上記変異体細胞に対応する、cre−1遺伝子にて不活性変異を欠いている細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記変異体細胞を誘導する、変異体細胞。
- 請求項68または69に記載の変異体細胞であって、該変異体細胞は、少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子にて不活性化変異をさらに含んでおり、セルロース系バイオマスが、上記変異体細胞に対応する、少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子にて不活性変異を欠いている細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記変異体細胞を誘導する、変異体細胞。
- 請求項68〜70のいずれか1項に記載の変異体細胞であって、該変異体細胞は、少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子にて不活性化変異をさらに含んでおり、セルロース系バイオマスが、上記変異体細胞に対応する、少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子にて不活性変異を欠いている細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記変異体細胞を誘導する、変異体細胞。
- 前記セルロース系バイオマスは、1つ以上の多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースを含む、請求項68〜71のいずれか1項に記載の変異体細胞。
- 前記セルロース系バイオマスはセロビオースを含む、請求項68〜71のいずれか1項に記載の変異体細胞。
- 2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子にて不活性変異を含んでいる変異体細胞であって、糖が、上記変異体細胞に対応する、2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子にて不活性変異を欠いている細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記変異体細胞を誘導する、変異体細胞。
- 請求項74に記載の変異体細胞であって、該変異体細胞は、該細胞中のcre−1遺伝子にて不活性化変異をさらに含んでおり、糖が、上記変異体細胞に対応する、cre−1遺伝子にて不活性変異を欠いている細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記変異体細胞を誘導する、変異体細胞。
- 請求項74または75に記載の変異体細胞であって、該変異体細胞は、少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子にて不活性化変異をさらに含んでおり、糖が、上記変異体細胞に対応する、少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子にて不活性変異を欠いている細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記変異体細胞を誘導する、変異体細胞。
- 請求項74〜76のいずれか1項に記載の変異体細胞であって、該変異体細胞は、少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子にて不活性化変異をさらに含んでおり、糖が、上記変異体細胞に対応する、少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子にて不活性変異を欠いている細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記変異体細胞を誘導する、変異体細胞。
- 前記糖は、1つ以上の多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースからなる群より選択される、請求項74〜77のいずれか1項に記載の変異体細胞。
- 前記糖はセロビオースである、請求項74〜77のいずれか1項に記載の変異体細胞。
- 分泌される前記タンパク質は、セルロース誘導性タンパク質である、請求項68〜79のいずれか1項に記載の変異体細胞。
- 分泌される前記タンパク質は、セルラーゼ、GH61酵素、セロニオースデヒドロゲナーゼ、ラクトナーゼ、カルボヒドレートエステラーゼ、多糖リアーゼ、セルロース結合ドメイン含有タンパク質、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項68〜80のいずれか1項に記載の変異体細胞。
- 分泌される前記タンパク質はセルラーゼである、請求項68〜80のいずれか1項に記載の変異体細胞。
- 分泌される前記タンパク質は、NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764およびNCU05137からなる群より選択される遺伝子によってコードされる、請求項68〜80のいずれか1項に記載の変異体細胞。
- 前記不活性化変異が欠失である、請求項68〜83のいずれか1項に記載の変異体細胞。
- 前記細胞がリコンビナント細胞である、請求項68〜84のいずれか1項に記載の変異体細胞。
- 前記細胞が真菌細胞または酵母細胞である、請求項68〜85のいずれか1項に記載の変異体細胞。
- 前記細胞が、子嚢菌種または担子菌種の糸状菌である、請求項68〜86のいずれか1項に記載の変異体細胞。
- 前記細胞が、Neurospora crassa(N. crassa)細胞、Aspergillus nidulans細胞、Trichoderma reesei細胞、Phanerochaete chrysosporium細胞、Sporotrichum thermophile(Myceliophthora thermophila)細胞、Gibberella zeae細胞、Sclerotinia sclerotiorum細胞、Botryotinia fuckeliana細胞、Aspergillus niger細胞、Penicillium chrysogenum細胞、Schizophyllum commune細胞、Postia placenta細胞、Aspergillus oryzae細胞、およびAcremonium cellulolyticus細胞からなる群より選択される、請求項68〜87のいずれか1項に記載の変異体細胞。
- 前記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、3つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である、請求項68〜88のいずれか1項に記載の変異体細胞。
- 前記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、4つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である、請求項68〜88のいずれか1項に記載の変異体細胞。
- 前記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、5つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である、請求項68〜88のいずれか1項に記載の変異体細胞。
- 前記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、6つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である、請求項68〜88のいずれか1項に記載の変異体細胞。
- 前記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、7つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である、請求項68〜88のいずれか1項に記載の変異体細胞。
- 前記3つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、4つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、5つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、6つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、または7つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、NCU00130、NCU04952およびNCU08755を含む、請求項89〜93のいずれか1項に記載の変異体細胞。
- 少なくとも1つの前記β−グルコシダーゼ遺伝子が、細胞内β−グルコシダーゼをコードする、請求項68〜94のいずれか1項に記載の変異体細胞。
- 少なくとも1つの前記β−グルコシダーゼ遺伝子が、細胞外β−グルコシダーゼをコードする、請求項68〜94のいずれか1項に記載の変異体細胞。
- 前記少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子がNCU00890である、請求項68〜96のいずれか1項に記載の変異体細胞。
- 前記少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子がNCU06650である、請求項68〜97のいずれか1項に記載の変異体細胞。
- リコンビナント細胞であって、該リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現を示し、
上記発現は、siRNA、アンチセンスDNA、クエリングまたは減数分裂性サイレンシングによって低減されており、
セルロース系バイオマスが、上記対応する非リコンビナント細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記リコンビナント細胞を誘導し、
上記対応する非リコンビナント細胞において、少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の上記発現は低減されていない、リコンビナント細胞。 - 請求項99に記載のリコンビナント細胞であって、
上記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中のcre−1遺伝子の発現と比較して低減したcre−1遺伝子の発現をさらに示し、
上記発現は、siRNA、アンチセンスDNA、クエリングまたは減数分裂性サイレンシングによって低減されており、
セルロース系バイオマスが、上記対応する非リコンビナント細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記リコンビナント細胞を誘導し、
上記対応する非リコンビナント細胞において、cre−1遺伝子の上記発現は低減されていない、リコンビナント細胞。 - 請求項100に記載のリコンビナント細胞であって、
creA/cre−1の機能が、ドミナントネガティブ変異体の過剰発現またはタンパク質インヒビターによって低減されており、
セルロース系バイオマスが、対応する細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記リコンビナント細胞を誘導し、
上記対応する細胞において、上記ドミナントネガティブ変異体は過剰発現されていない、リコンビナント細胞。 - 請求項99〜101のいずれか1項に記載のリコンビナント細胞であって、
上記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の発現をさらに示し、
上記発現は、siRNA、アンチセンスDNA、クエリングまたは減数分裂性サイレンシングによって低減されており、
セルロース系バイオマスが、上記対応する非リコンビナント細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記リコンビナント細胞を誘導し、
上記対応する非リコンビナント細胞において、少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の発現は低減されていない、リコンビナント細胞。 - 請求項99〜102のいずれか1項に記載のリコンビナント細胞であって、
上記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の発現をさらに示し、
上記発現は、siRNA、アンチセンスDNA、クエリングまたは減数分裂性サイレンシングによって低減されており、
セルロース系バイオマスが、上記対応する非リコンビナント細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記リコンビナント細胞を誘導し、
上記対応する非リコンビナント細胞において、少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の発現は低減されていない、リコンビナント細胞。 - 前記セルロース系バイオマスは、1つ以上の多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースを含む、請求項99〜103のいずれか1項に記載のリコンビナント細胞。
- 前記セルロース系バイオマスはセロビオースを含む、請求項99〜103のいずれか1項に記載のリコンビナント細胞。
- リコンビナント細胞であって、該リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の発現を示し、
上記発現は、siRNA、アンチセンスDNA、クエリングまたは減数分裂性サイレンシングによって低減されており、
糖が、上記対応する非リコンビナント細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記リコンビナント細胞を誘導し、
上記対応する非リコンビナント細胞において、少なくとも2つのβ−グルコシダーゼ遺伝子の上記発現は低減されていない、リコンビナント細胞。 - 請求項106に記載のリコンビナント細胞であって、
上記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中のcre−1遺伝子の発現と比較して低減したcre−1遺伝子の発現をさらに示し、
上記発現は、siRNA、アンチセンスDNA、クエリングまたは減数分裂性サイレンシングによって低減されており、
糖が、上記対応する非リコンビナント細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記リコンビナント細胞を誘導し、
上記対応する非リコンビナント細胞において、cre−1遺伝子の上記発現は低減されていない、リコンビナント細胞。 - 請求項107に記載のリコンビナント細胞であって、
creA/cre−1の機能が、ドミナントネガティブ変異体の過剰発現またはタンパク質インヒビターによって低減されており、
糖が、対応する細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記リコンビナント細胞を誘導し、
上記対応する細胞において、上記ドミナントネガティブ変異体は過剰発現されていない、リコンビナント細胞。 - 請求項106〜108のいずれか1項に記載のリコンビナント細胞であって、
上記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の発現をさらに示し、
上記発現は、siRNA、アンチセンスDNA、クエリングまたは減数分裂性サイレンシングによって低減されており、
糖が、上記対応する非リコンビナント細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記リコンビナント細胞を誘導し、
上記対応する非リコンビナント細胞において、少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子の発現は低減されていない、リコンビナント細胞。 - 請求項106〜109のいずれか1項に記載のリコンビナント細胞であって、
上記リコンビナント細胞は、対応する非リコンビナント細胞中の少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の発現と比較して低減した少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の発現をさらに示し、
上記発現は、siRNA、アンチセンスDNA、クエリングまたは減数分裂性サイレンシングによって低減されており、
糖が、上記対応する非リコンビナント細胞よりも高いレベルにてタンパク質を分泌するように上記リコンビナント細胞を誘導し、
上記対応する非リコンビナント細胞において、少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子の発現は低減されていない、リコンビナント細胞。 - 前記糖は、多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースからなる群より選択される、請求項106〜110のいずれか1項に記載のリコンビナント細胞。
- 前記糖はセロビオースである、請求項106〜110のいずれか1項に記載のリコンビナント細胞。
- 分泌される前記タンパク質は、セルロース誘導性タンパク質である、請求項99〜112のいずれか1項に記載のリコンビナント細胞。
- 分泌される前記タンパク質は、セルラーゼ、GH61酵素、セロニオースデヒドロゲナーゼ、ラクトナーゼ、カルボヒドレートエステラーゼ、多糖リアーゼ、セルロース結合ドメイン含有タンパク質、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項99〜113のいずれか1項に記載のリコンビナント細胞。
- 分泌される前記タンパク質はセルラーゼである、請求項99〜113のいずれか1項に記載のリコンビナント細胞。
- 分泌される前記タンパク質は、NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764およびNCU05137からなる群より選択される遺伝子によってコードされる、請求項99〜113のいずれか1項に記載のリコンビナント細胞。
- 前記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、3つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である、請求項99〜116のいずれか1項に記載のリコンビナント細胞。
- 前記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、4つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である、請求項99〜116のいずれか1項に記載のリコンビナント細胞。
- 前記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、5つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である、請求項99〜116のいずれか1項に記載のリコンビナント細胞。
- 前記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、6つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である、請求項99〜116のいずれか1項に記載のリコンビナント細胞。
- 前記2つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、7つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子である、請求項99〜116のいずれか1項に記載のリコンビナント細胞。
- 前記3つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、4つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、5つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、6つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子、または7つ以上のβ−グルコシダーゼ遺伝子が、NCU00130、NCU04952およびNCU08755を含む、請求項117〜121のいずれか1項に記載のリコンビナント細胞。
- 少なくとも1つの前記β−グルコシダーゼ遺伝子が、細胞内β−グルコシダーゼをコードする、請求項99〜122のいずれか1項に記載のリコンビナント細胞。
- 少なくとも1つの前記β−グルコシダーゼ遺伝子が、細胞外β−グルコシダーゼをコードする、請求項99〜122のいずれか1項に記載のリコンビナント細胞。
- 前記少なくとも1つのβ−マンノシダーゼ遺伝子がNCU00890である、請求項99〜124のいずれか1項に記載のリコンビナント細胞。
- 前記少なくとも1つのホスホリパーゼ遺伝子またはホスホリパーゼ様遺伝子がNCU06650である、請求項99〜125のいずれか1項に記載のリコンビナント細胞。
- 前記細胞が、安定な細胞株または一過性にトランスフェクトされた細胞である、請求項99〜126のいずれか1項に記載のリコンビナント細胞。
- 前記細胞が、真菌細胞または酵母細胞である、請求項99〜127のいずれか1項に記載のリコンビナント細胞。
- 前記細胞が、子嚢菌種または担子菌種の糸状菌である、請求項99〜128のいずれか1項に記載のリコンビナント細胞。
- 前記細胞が、Neurospora crassa(N. crassa)細胞、Aspergillus nidulans細胞、Trichoderma reesei細胞、Phanerochaete chrysosporium細胞、Sporotrichum thermophile(Myceliophthora thermophila)細胞、Gibberella zeae細胞、Sclerotinia sclerotiorum細胞、Botryotinia fuckeliana細胞、Aspergillus niger細胞、Penicillium chrysogenum細胞、Schizophyllum commune細胞、Postia placenta細胞、Aspergillus oryzae細胞、およびAcremonium cellulolyticus細胞からなる群より選択される、請求項99〜129のいずれか1項に記載のリコンビナント細胞。
- バイオマスを分解する方法であって、
(a)リグノセルロース系バイオマスを提供する工程;
(b)請求項68〜130のいずれか1項に記載の細胞、あるいはcre−1遺伝子にて不活性化変異を含んでいる細胞を提供する工程;
(c)上記細胞をセルロース系バイオマスと接触させることによってタンパク質を分泌するように上記細胞を誘導する工程;ならびに
(d)誘導された上記細胞を上記リグノセルロース系バイオマスと接触させる工程であって、分泌された上記タンパク質が上記リグノセルロース系バイオマスを分解する、工程
を包含する、方法。 - 前記セルロース系バイオマスは、1つ以上の多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースを含む、請求項131に記載の方法。
- 前記セルロース系バイオマスはセロビオースを含む、請求項131に記載の方法。
- バイオマスを分解する方法であって、
(a)リグノセルロース系バイオマスを提供する工程;
(b)請求項68〜130のいずれか1項に記載の細胞、あるいはcre−1遺伝子にて不活性化変異を含んでいる細胞を提供する工程;
(c)上記細胞を糖と接触させることによってタンパク質を分泌するように上記細胞を誘導する工程;ならびに
(d)誘導された上記細胞を上記リグノセルロース系バイオマスと接触させる工程であって、分泌された上記タンパク質が上記リグノセルロース系バイオマスを分解する、工程
を包含する、方法。 - 前記糖は、多糖、オリゴ糖、セルロース、微結晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペントースおよびセロヘキソースからなる群より選択される、請求項134に記載の方法。
- 前記糖はセロビオースである、請求項134に記載の方法。
- 分泌される前記タンパク質は、セルロース誘導性タンパク質である、請求項131〜136のいずれか1項に記載の方法。
- 分泌される前記タンパク質は、セルラーゼ、GH61酵素、セロニオースデヒドロゲナーゼ、ラクトナーゼ、カルボヒドレートエステラーゼ、多糖リアーゼ、セルロース結合ドメイン含有タンパク質、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項131〜137のいずれか1項に記載の方法。
- 分泌される前記タンパク質はセルラーゼである、請求項131〜137のいずれか1項に記載の方法。
- 分泌される前記タンパク質は、NCU07340、NCU09680、NCU07898、NCU00762、NCU08760、NCU05057、NCU02240、NCU07190、NCU07898、NCU08760、NCU00206、NCU07143、NCU09491、NCU09664、NCU05598、NCU09764およびNCU05137からなる群より選択される遺伝子によってコードされる、請求項131〜137のいずれか1項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201161453086P | 2011-03-15 | 2011-03-15 | |
US61/453,086 | 2011-03-15 | ||
PCT/US2012/029293 WO2012125865A1 (en) | 2011-03-15 | 2012-03-15 | Mutant cells for protein secretion and lignocellulose degradation |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2014508534A true JP2014508534A (ja) | 2014-04-10 |
Family
ID=45894690
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013558188A Pending JP2014508534A (ja) | 2011-03-15 | 2012-03-15 | タンパク質分泌およびリグノセルロース分解のための変異体細胞 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20140045243A1 (ja) |
EP (1) | EP2686426A1 (ja) |
JP (1) | JP2014508534A (ja) |
CN (1) | CN103890168A (ja) |
AR (1) | AR085912A1 (ja) |
AU (1) | AU2012229063A1 (ja) |
BR (1) | BR112013023756A2 (ja) |
CA (1) | CA2829842A1 (ja) |
WO (1) | WO2012125865A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPWO2019188980A1 (ja) * | 2018-03-26 | 2021-02-12 | 東レ株式会社 | トリコデルマ・リーセイ変異株およびタンパク質の製造方法 |
Families Citing this family (23)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103305426B (zh) * | 2012-03-16 | 2015-12-02 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 产纤维素酶的突变菌株、高效表达目的蛋白的突变菌株及其构建方法与应用 |
JP2015512653A (ja) * | 2012-04-09 | 2015-04-30 | ビーピー・バイオフューエルズ・ユーケイ・リミテッド | バイオ燃料及び他の再生可能な材料の産生のための低多糖微生物 |
JP2014150745A (ja) * | 2013-02-06 | 2014-08-25 | Nagaoka Univ Of Technology | トリコデルマ属に属する微生物の変異株および該変異株の使用 |
JP6103584B2 (ja) * | 2013-03-04 | 2017-03-29 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | cre1遺伝子が機能しない糸状菌変異株 |
WO2015093467A1 (ja) * | 2013-12-16 | 2015-06-25 | 味の素株式会社 | セルラーゼ生産微生物 |
CN103911296B (zh) * | 2014-04-21 | 2016-02-24 | 山东大学 | 一种提高纤维素酶和半纤维素酶酶活性的草酸青霉菌株 |
EP3242952A4 (en) * | 2015-01-09 | 2018-12-05 | University of Cincinnati | Neurospora crassa strains with amplified expression of cellulases and production of biofuel therefrom |
CN106119137B (zh) * | 2015-05-06 | 2020-06-26 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种改善丝状真菌蛋白分泌能力的方法 |
CN105671021B (zh) * | 2016-03-01 | 2019-06-28 | 山东大学 | 甘露糖苷酶i的表达基因的应用 |
US20190256884A1 (en) * | 2016-07-07 | 2019-08-22 | Novozymes A/S | Methods of producing a fermentation product in trichoderma |
CN106520726B (zh) * | 2016-11-25 | 2017-09-19 | 山东大学 | 一种胞外醛糖酸内酯酶PoALAC及其应用 |
CN106520822B (zh) * | 2016-12-15 | 2019-10-11 | 湖北工业大学 | 一种磷酸盐诱导启动子降低黑曲霉β-葡萄糖苷酶表达酶活的方法 |
CN106755052B (zh) * | 2016-12-15 | 2021-03-16 | 湖北工业大学 | 一种光调控启动子降低黑曲霉β-葡萄糖苷酶表达酶活的方法 |
CN108795988B (zh) * | 2017-05-04 | 2022-07-29 | 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 | 木聚糖酶专性转录抑制因子及其在里氏木霉改造中的应用 |
CN107227261A (zh) * | 2017-05-24 | 2017-10-03 | 陕西省微生物研究所 | 一种食用菌菌渣促腐复合菌剂及其制备方法 |
EP3690040A4 (en) * | 2017-09-25 | 2021-09-29 | Ajinomoto Co., Inc. | PROCESS FOR THE PRODUCTION OF PROTEIN AND PROCESS FOR THE PRODUCTION OF DISACCHARIDES |
CN109694861B (zh) * | 2017-10-24 | 2021-04-16 | 朱一民 | 人工纤维小体、利用其分解纤维素及生产酒精的方法 |
CN109837232A (zh) * | 2019-03-27 | 2019-06-04 | 黑龙江大学 | 一种粗糙脉胞菌外切葡聚糖酶突变菌株的构建方法和应用 |
US20230240305A1 (en) * | 2019-06-17 | 2023-08-03 | Migal Galilee Research Institute Ltd. | Stabilized mutants of quorum quenching lactonase and use thereof in treatment of pathogens |
CN113106114B (zh) * | 2020-01-13 | 2024-04-12 | 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 | 调控里氏木霉蛋白表达效率的因子、调控方法及应用 |
CN114409062A (zh) * | 2021-12-31 | 2022-04-29 | 浙江巨能环境工程有限公司 | 一种用于强化废水处理生物膜的药剂与方法 |
WO2023225459A2 (en) | 2022-05-14 | 2023-11-23 | Novozymes A/S | Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections |
CN115896049B (zh) * | 2022-11-28 | 2024-02-02 | 中南林业科技大学 | 纤维二糖脱氢酶基因、载体、重组菌及它们的应用 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2097180C (en) * | 1990-12-10 | 2007-08-14 | Timothy Fowler | Saccharification of cellulose by cloning and amplification of the .beta.-glucosidase gene of trichoderma reesei |
US6982159B2 (en) * | 2001-09-21 | 2006-01-03 | Genencor International, Inc. | Trichoderma β-glucosidase |
JP4744879B2 (ja) * | 2002-11-07 | 2011-08-10 | ジェネンコー・インターナショナル・インク | BGL6β−グルコシダーゼ及びそれをエンコードする核酸 |
CA2518580A1 (en) * | 2003-03-12 | 2004-09-23 | Vib Vzw | Improved protein secretion in eukaryotic cells |
US20110262983A1 (en) | 2010-03-31 | 2011-10-27 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Metabolically engineered yeasts for the production of ethanol and other products from xylose and cellobiose |
-
2012
- 2012-03-15 AU AU2012229063A patent/AU2012229063A1/en not_active Abandoned
- 2012-03-15 WO PCT/US2012/029293 patent/WO2012125865A1/en active Application Filing
- 2012-03-15 BR BR112013023756A patent/BR112013023756A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2012-03-15 US US14/005,245 patent/US20140045243A1/en not_active Abandoned
- 2012-03-15 AR ARP120100853A patent/AR085912A1/es unknown
- 2012-03-15 JP JP2013558188A patent/JP2014508534A/ja active Pending
- 2012-03-15 CA CA2829842A patent/CA2829842A1/en not_active Abandoned
- 2012-03-15 CN CN201280023229.6A patent/CN103890168A/zh active Pending
- 2012-03-15 EP EP12711091.4A patent/EP2686426A1/en not_active Withdrawn
-
2015
- 2015-05-15 US US14/714,165 patent/US9822373B2/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPWO2019188980A1 (ja) * | 2018-03-26 | 2021-02-12 | 東レ株式会社 | トリコデルマ・リーセイ変異株およびタンパク質の製造方法 |
JP7334620B2 (ja) | 2018-03-26 | 2023-08-29 | 東レ株式会社 | トリコデルマ・リーセイ変異株およびタンパク質の製造方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN103890168A (zh) | 2014-06-25 |
US9822373B2 (en) | 2017-11-21 |
EP2686426A1 (en) | 2014-01-22 |
AU2012229063A2 (en) | 2014-01-09 |
AU2012229063A1 (en) | 2013-09-19 |
AR085912A1 (es) | 2013-11-06 |
US20140045243A1 (en) | 2014-02-13 |
CA2829842A1 (en) | 2012-09-20 |
US20150247152A1 (en) | 2015-09-03 |
BR112013023756A2 (pt) | 2016-09-20 |
WO2012125865A1 (en) | 2012-09-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US9822373B2 (en) | Mutant cells for protein secretion and lignocellulose degradation | |
US11091785B2 (en) | Compositions for saccharification of cellulosic material | |
DK2606131T3 (en) | Use of proteins from glycoside hydrolase 61 family for cellulose processing | |
ES2582320T3 (es) | Tratamiento de material celulósico y enzimas útiles en el mismo | |
US10407705B2 (en) | Fungal cells and fermentation processes | |
Chen et al. | Isolation and characterization of a β-glucosidase from Penicillium decumbens and improving hydrolysis of corncob residue by using it as cellulase supplementation | |
CN108823184B (zh) | 具有木聚糖酶活性的多肽及其编码多核苷酸 | |
US8323931B2 (en) | Hosts and fermentation processes for cellulase production | |
Poidevin et al. | Comparative analyses of Podospora anserina secretomes reveal a large array of lignocellulose-active enzymes | |
CN110628803A (zh) | 具有纤维二糖水解酶活性的多肽及编码该多肽的多核苷酸 | |
EP2760997A1 (en) | Fungal proteases | |
Adav et al. | Label free quantitative proteomic analysis of secretome by Thermobifida fusca on different lignocellulosic biomass | |
Meng et al. | The functioning of a novel protein, Swollenin, in promoting the lignocellulose degradation capacity of Trichoderma guizhouense NJAU4742 from a proteomic perspective | |
Sharma Ghimire et al. | Insight into enzymatic degradation of corn, wheat, and soybean cell wall cellulose using quantitative secretome analysis of Aspergillus fumigatus | |
EP2794871A1 (en) | Endoglucanase 1b (eg1b) variants | |
JP2024500118A (ja) | トウモロコシ湿潤製粉における改善された繊維洗浄 | |
BR112020003088A2 (pt) | polipeptídeo, polinucleotídeos, vetor de expressão, transformante, fungo filamentoso transformado, métodos para produzir uma composição enzimática e para produzir uma solução de açúcar, ß-glucosidase e composição enzimática | |
BR112016028559B1 (pt) | Composição de enzimas, célula hospedeira fúngica recombinante, e, processos para produção de uma composição de enzimas e de um produto de fermentação, para degradação de um material celulósico ou hemicelulósico e para fermentação de um material celulósico ou hemicelulósico. | |
FR3019558A1 (fr) | Preparation multi-enzymatique contenant le secretome d'une souche de laetisaria arvalis |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20131031 |