CN115896049B

CN115896049B - 纤维二糖脱氢酶基因、载体、重组菌及它们的应用

Info

Publication number: CN115896049B
Application number: CN202211502251.0A
Authority: CN
Inventors: 曾柏全; 钟雅楠; 郭泽潘; 闫文徳; 李美群; 张轩; 贾晓江
Original assignee: Central South University of Forestry and Technology
Current assignee: Central South University of Forestry and Technology
Priority date: 2022-11-28
Filing date: 2022-11-28
Publication date: 2024-02-02
Anticipated expiration: 2042-11-28
Also published as: CN115896049A

Abstract

本发明公开了一种纤维二糖脱氢酶基因、载体、重组菌及它们的应用，以灰树花为纤维二糖脱氢酶基因供体，通过PCR法扩增得到灰树花纤维二糖脱氢酶基因。构建了重组表达载体。以黑曲霉C112为基因表达宿主，通过PEG介导的原生质体法，将重组表达载体导入黑曲霉并使纤维二糖脱氢酶基因在黑曲霉中成功表达，重组灰树花纤维二糖脱氢酶能够使黑曲霉C112的纤维素酶和锰过氧化物酶的活性提高。优化多酶协同降解杨木纤维体系中漆酶、纤维二糖脱氢酶、纤维二糖酶添加量，得出了纤维素酶、漆酶、纤维二糖脱氢酶、纤维二糖酶最佳酶解组合体系，与单纯纤维素酶酶解杨木纤维产糖浓度相比，此酶解组合体系酶解杨木纤维产糖浓度显著提高。

Description

纤维二糖脱氢酶基因、载体、重组菌及它们的应用

技术领域

本发明涉及生物转化领域，尤其涉及一种纤维二糖脱氢酶基因、载体、重组菌构建以及多酶协同降解杨木纤维产糖的应用。

背景技术

木质纤维素是世界上最丰富的可再生资源之一，具有环保、非食物竞争性、成本低廉、可持续性等优点，在开发清洁能源和生物基化学品方面具有巨大的潜力。然而，大量的木质纤维素资源以燃烧告终，造成资源的浪费，且产生环境污染。为了提高木质纤维素的使用价值，实现它的生物质高效转化是关键，但是由于木质纤维素的组成复杂，由纤维素、半纤维素和木质素这三种聚合物聚集而成以及它们之间存在丰富的分子间链接，导致木质纤维素的生物转化效率低下。同时，纤维素酶在木质纤维素的生物转化中占有重要的地位，但由于碳代谢抑制，天然纤维素酶的活性普遍较低。如何提高纤维素酶活性，实现木质纤维素的高效转化，是当今学者们的研究热点。目前，我国在高产菌株的选育上已经有了很大的进步，但由于所培育的菌种酶活性低、菌种易退化等问题，制约了其工业中的应用。基于这些结果，利用基因克隆和异源表达技术，对产纤维素酶菌株进行改造，得到性能更好的重组菌，为构建高效率的纤维素降解菌提供了新的思路。

杨树作为速生木材，是我国一种重要的人工林树种。我国在人工林和速生林方面有着悠久的历史，目前已拥有4666万公顷的人工林，在全球排名第一。然而，由于速生杨木自身的缺陷，如抗压能力不足、易弯曲变形等，使得其主要应用于包装、一次性筷子等领域。总的来说，杨树产业利用率低，能源消耗高，排污严重，产品附加值低，制约了其利用。然而，通过生物、物理或化学手段，将杨木木质纤维素转化还原糖，再以还原糖为原料生产高附加值产品，可提高杨木生物质的利用率，实现生物质利用的绿色化。

提高纤维素的催化水解效率是促进纤维素降解和转化的一个重要环节。纤维二糖脱氢酶等纤维素降解辅助蛋白有望成为提高纤维素酶解效率的辅助因子。但是，目前对这种酶的研究还停留在实验室的基础研究阶段，因此，如何将其高效、低廉地用于纤维素生物转化的工业化生产仍是一个很大的挑战。

发明内容：

本发明的首要目的是提供纤维二糖脱氢酶基因，该基因表达的纤维二糖脱氢酶能够提高纤维酶解产糖率，具有很好的应用前景。

纤维二糖脱氢酶基因，序列如SEQ NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供表达所述的纤维二糖脱氢酶基因的载体。

所述的载体，空白载体包括pUCm-T或pBARGPE1-Hygro。

所述的载体，gcdh(纤维二糖脱氢酶基因片段)与载体DNA摩尔比3:1。

本发明的第三个目的是提供纤维二糖脱氢酶重组菌，将表达所述的纤维二糖脱氢酶基因的载体导入黑曲霉中获得。

进一步地，通过原生质体法，在PEG-4000的介导下，将表达所述的纤维二糖脱氢酶基因的载体导入黑曲霉中获得。

本发明的第四个目的是提供所述的纤维二糖脱氢酶、所述的载体表达的纤维二糖脱氢酶，或者所述的纤维二糖脱氢酶重组菌产生的纤维二糖脱氢酶在降解木质纤维素中的应用。

进一步地，与漆酶和纤维二糖酶协同降解木质纤维素。更进一步地，降解木质纤维素的产糖条件：

木质纤维素预处理是将木屑与4％NaOH按料液比1：10，1.1MPa、121℃，处理90min，冷却后过滤除去预处理液，木渣用蒸馏水清洗至洗涤液呈中性；处理好的木屑烘干称重，粉碎至100目。

降解木质纤维素的产糖条件：

反应体系为2.4mg/mL-2.6mg/mL NaF溶液，反应温度48-50℃、反应pH4.7-4.9、反应时间46h-50h、纤维素酶1-3mg/mL；漆酶添加量35-40U/g预处理的木质纤维素、纤维二糖脱氢酶添加量54-58U/g预处理的木质纤维素、纤维二糖酶添加量80 -90U/g预处理的木质纤维素。

优选，反应体系为2.5mg/mL NaF溶液、反应温度50℃、反应pH4.8、反应时间48h、纤维素酶2mg/mL；漆酶添加量38.558U/g预处理的木质纤维素、纤维二糖酶添加量89.679U/g预处理的木质纤维素、纤维二糖脱氢酶添加量55.485U/g预处理的木质纤维素。

进一步地，所述的木质纤维素来源于杨木。

本发明整体研究过程依次包括以下步骤：

(1)提取灰树花(Grifola frondose)DNA：灰树花菌块接种于PDA液体培养基中，28℃，静置培养14d，过滤收集菌丝体，除干水分，用基因组DNA提取试剂盒提取总DNA。

(2)灰树花纤维二糖脱氢酶基因扩增：以总DNA为模板，PCR扩增反应体系为20μL(2.5mM dNTP 2μL、2μM GR 1μL、2μM GF 1μL、5U/μL LATaq0.2μL、＜1μg/μL DNA1μL、10×PCR BufferⅡ(含Mg²⁺)2μL，ddH₂O补足至20μL)，反应结束后，取5μL PCR反应产物采用1％琼脂糖凝胶电泳检测；其中引物序列见表1。

表1纤维二糖脱氢酶(CDH)扩增引物序列

上述引物序列见SEQ NO.2-3所示。

(3)基因回收：通过琼脂糖凝胶电泳分离，120V，30min，切下目的条带，装入离心管中，通过普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的条带gcdh。

(4)克隆载体的构建：使用已经线性化的载体pUCm-T，利用T4DNA连接酶将目的基因于克隆载体连接，连接体系见表2；

表2DNA酶连接体系

该体系在PCR仪中16℃过夜连接。

(5)克隆载体转化大肠杆菌感受态细胞：从超低温冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞，插入冰盒，待其融化，加入上述全部连接产物，混匀后，冰浴30min。将上述感受态细胞于42℃中热激45s，然后再冰浴2min。向感受态细胞中加入700μL不含氨苄青霉素的LB液体培养基，混合均匀，37℃，190rpm培养1h。将13μL IPTG和40μL X-gal涂布于含有氨苄青霉素的LB平板中，室温放置半小时待液体全部吸收，取50μL培养好的大肠杆菌菌液涂布于该平板中，37℃，过夜培养。

(6)菌落PCR检验：利用含IPTG、X-gal、Amp的LB平板来筛选转化子，过夜培养后LB平板上长出的淡黄色菌落为含有重组质粒的大肠杆菌，而蓝色菌落为不含重组质粒的大肠杆菌，以此初步筛选阳性转化子。挑取淡黄色菌落，至含有20μLddH2O的离心管中，沸水浴10min，冷却至室温，12000rpm/min，离心1min，上清液作为PCR模板，按PCR扩增体系20μL(菌落上清液1μL，GF(2μM)1μL，GR(2μM)1μL，2×EasyTaq PCR SuperMix 10μL，ddH₂O补足至20μL)进行菌落PCR反应。

(7)双酶切检验

挑取菌落PCR阳性菌落，接种至含Amp的LB液体培养基，培养过夜。用质粒小提试剂盒提取质粒，按表3进行双酶切检测，37℃，过夜酶切，酶切产物采用1％琼脂糖凝胶电泳检测。

表3pUCm-T-gcdh双酶切反应体系

(8)表达载体线性化：将pBARGPE1-Hygro(购自湖南丰晖生物科技有限公司)转化至大肠杆菌中，方法见(5)，挑取单菌落接种于含有氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃，190rpm，过夜培养。利用质粒小提试剂盒提取表达载体质粒，按照pBARGPE1-Hygro单酶切反应体系进行载体pBARGPE1-Hygro线性化，37℃，过夜酶切。酶切产物利用1％琼脂糖凝胶电泳回收。

(9)表达载体pBARGPE1-Hygro-gcdh的构建与转化：配制gcdh扩增体系，PCR产物利用1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带，方法见(3)。利用EasyGeno单片段重组克隆试剂盒(购自天根生化科技有限公司)，配制同源重组体系，构建pBARGPE1-Hygro-gcdh。将反应液混合后置于50℃反应15min。反应结束后，转化至大肠杆菌感受态细胞中，37℃，过夜培养，挑选阳性转化子。

(10)表达载体阳性克隆转化子的筛选:菌落PCR检验方法见(6)和表达载体双酶切验证方法参考(7)。

(11)表达载体的回收：挑取阳性转化子，接种至含Amp的LB液体培养基，培养过夜。用质粒小提试剂盒提取质粒，质粒溶液-20℃保存。

(12)通过原生质体法，在PEG-4000的介导下将pBARGPE1-Hygro-gcdh导入黑曲霉并使纤维二糖脱氢酶基因在黑曲霉中表达。

(13)杨木纤维最佳产糖条件：2.5mg/mL NaF、纤维素酶2mg/mL、反应温度50℃、反应pH4.8、最佳酶添加量组合：漆酶添加量38.558U/g、纤维二糖酶添加量89.679U/g、纤维二糖脱氢酶添加量55.485U/g，与纤维素酶酶解产糖浓度相比提高了76.65％。

本发明通过基因工程的手段克隆出灰树花的纤维二糖脱氢酶基因，构建表达载体，并将其导入黑曲霉中表达，筛选出具有高效降解杨木纤维能力的重组黑曲霉；同时优化杨木纤维产糖酶组合，通过在纤维素降解体系中添加纤维二糖脱氢酶、漆酶、纤维二糖酶，提高杨木纤维及木质纤维素的产糖效率。

本发明灰树花纤维二糖脱氢酶基因序列如下：

ATGTTCGGACATCTACTGTTGGCCTTGCTTCCGCTTGTCGGCTCTGGTACGT

CATCCTAGAATTGCTGCACATATCCATGTTGATTTCGTTGTTCAAGCATTTGC

GCAGAGCGGCTCTATTTACACGGATCCCGGTAATGGCTTTACTTTTGACGGC

ATTACCGACCCAGTCTATGATGTTACGTACGGTGTTATCTTCCCGACTGATAC

AACAAGCACCGAATTCATCGGTGAGATTGTGGCGCCTGTGGCAGCCCAGT

GGATCGGCGTGGCCTTGGGCGGCGCAATGATCGACAACTTGCTTCTTGTTG

TGTGGACCAACGGCAATACTATTGTTAGTAGTACGCGTTACGCGACGTCAGT

AATTCTCAATGCATATTCGCGTCTGCGGCCCATTGACGCAATGCAAATTATT

TTGGCACTAATAGGGATTACATTCAGCCAGTGTGAGTCTCTGTTATGGACTT

GACAAGCATGAGCTAATCGGCGAGTATAGTCCTTACGCTGGTCCGACGCTC

ACTACTCTTCCTTCTTCGTCCGTCAACTCTACGCACTGGAAATTCGTCTTCC

GGTGCCAAAACTGCACAAGTGCGTTCTCACGTCAAGTTTAAGTGGCATTCA

TCATGATTCCATCAGGCTGGCTGGGCGGAGGCAGCATCCCCGTGAGTGGAT

CCGGGGTGCTCGCCTGGGCGTATTCATCCATTCCCGTCGACGACCCCGCCG

ATCCCAACAGCGACTTCTTGGAACATACAGACTGCAAGTGACACTTGTTCT

CTTTCAGTCTGAAATTGCCATTAATTTCTCAGCATAGTTGGTTTCTTCGGCAT

GAACTTTGCCGATGCCCACACTTCCAACTACAACAATTACCTCAACGGAAA

TGCTGGCACCAGCACACCGCCCACAGGATCGCCAACGACGACGACTACCA

GCCCGACCACTGGACCTACGACGCCGGTGAGTTTCGCACATATTTTGGTCG

ATCGTAAGGATTCTCATTGACTCTTCTGGTTCTCAGGCTACACCGTATGATT

ACGTTATCGTTGGCGCTGGCCCTGGCGGTATTATTGCTGCAGACCGGTTGTC

TGAGGCAGGCAAGAAGGTGCTTCTTCTCGAACGCGGTGGCCCTAGTACAG

GAGAGACTGGAGGCACGTATACTGCACCTTGGGCTGCGGGTACCAACGTT

AGTGCTCCAGCGCAGCACGATCTCGAAGAAGTACTGACTAGTCAACAGCT

GACAAAGTTCGATATTCCCGGTCTTTTCGAGTCCATGTTCACTGACAGCAA

CCCTTGGTACTGGTGCAAAGGTACGACAGGATTATTTAGACATGTCTATAAT

ATTCTCACGGCACAACACAGATATCAATTTCTTCGCCGGCTGTCTCCTTGGA

GGTGGAACTTCGGTCAACGGCGCGTACGTGCTATCACATAGTGACGTTATC

GCGAAAGGCTGATTTGGCGATCGTGACGACTAGCCTGTACTGGTACCCTAC

CGATTCCGACTTCTCCACAAATAATGGATGGCCGAACAGCTGGGGGTACCA

CCAACCATACACCAGTGCGATGCAGGCTCGACTTCCTAGTACCGATCATCCA

TCTACGGATGGTCAGCTCTACCTCGAACAATCCGCAAACGTTGTAATGCAG

TTGTTGAATGGGCAAGGCTACCGCCAAGTCACGATCAACAATGACGTCAAT

TCGAAGGATCATGTATACGGATATAGTGCCTTTGATGTGAGTGAAGAAATAT

ACGAATGATCTAGCTATACTGAAAGAATGATGTAGTTCTTGAATGGCAAGC

GCGGTGGCCCAGTTGCGACTTACCTCCAGACAGCAAATGCTCGTTCCAATT

TCGTCTATAAGGACTACACCATGGTCAGCAACATTGTGCGTAATGGTTCTCA

GATCACCGGCGTGAAAACAAACGACACTTCGCTTGGGCCTAATGGGGTGG

TTCCCTTGACACCGAACGGTCGTGTGATCCTCTCCGCAGGCTCCTTTGGCT

CTCCGCGCATCCTATTCCAGAGCGGTATTGGTCCCACGGACATGCTCCAGA

CAGTGCAAGGCAACCCTGCCGCGGCACCAAACCTCCCTCCGCAGAGCGAA

TGGATCAACCTCCCCGTCGGCATGGCCGTGTCCGACAACCCGTCAATTAAC

GTAGGATACGTCAACCTATGACAACTAGGAGATTTTTTGAGCTTAATTTTTC

AATAGCTGGTTTTCACTCATCCGAGTATCGACGCGTATGACAACTGGGCCGA

TGTCTGGAGCGATCCTCGACCTGCCGATGCTGCCCAGTATCTGGCGAGCCA

GTCTGGTGTCTTTGCTGGTGCTTCCCCAAAGTTCGTCGATGCACGAAGGAC

TCAGATTGCGGTGACTAATGCAAGCTACATCTAGGTTGAACTTCTGGCGTG

CATATTCTGGAATTGATGCAAATCAGAGATGGGTACGTAGCCTCCTCTTTTT

CCTTTCCTTCTTGAGGTTTAACATTATCTTACGCAGGCACAAGGCACCGTCC

GTCCAGGCGCTGCATCTGTCAATACCACTTTGCCTTACAATGCAAGGTATAC

ATCCTGATACCATATTATGCATGAGCTCAATGTTGCTCTACAGTGAAATCTTC

ACCATAACTGTATATCTGTGCGTTTACGATCTATGTTCGATTTTCGAGTAATAT

TTACGGGCGCAAATAGGTCACAAGGAATAACTTCCCGCGGACGTATCGGCA

TCAATGCTGGGCTGGAAGCTACAGCATTGGTGAACCCTTGGTTGACTGACC

CTGTCGATAAGACCGTGTTGATCCAGGCTCTCAATGACGTTGTCTCCAATAT

GAATAGCAGTAAGTGATTTATTTACTTTAGGACGCCGCCTGGACCATCTCAA

CCTACTCAACCGGATATCAGTTTCCGGTTTGACCATGATCACTCCTGACTCG

GGTATGACTATTGAAGAATATGGTGAGCTTCTCTACGTGCGTCAAAATTTGT

TCGTGTCTCACCCTATCCGACGTGCAGTGGATCTATATGACCCTGTGAGTTG

ATTCATCACGCTTCTCGTATCGTCCAATCAGCATACCGATGCACTCGGACTT

CGCGCTTTAGGGTACTATGTGTTCCAACCATTGGGTAGGTTCCAACAAGAT

GGGCACGAACTCATCAACTGCGGTCGTTGACGAAAACGCTAAAGTTTTCA

ATACGAACAATCTGGTAAGTTAAGCTCGGCGTTTTCCTCATCTGCAGCGTAC

TGAGATAGTCTCGGCTTCAGTTCGTCGTCGATGCTTCTATCATACCAGCGCT

ACCCGTGGGCAATCCCCACGGGATGCTCATGTCTGCTGCGGAGCAAGCGG

TGGCGAACATCCTGGCTTTGGCAGGGGGACCGTGA

本发明的黑曲霉Aspergillus niger C112，2012年4月23日保藏于《中国典型培养物保藏中心》，其保藏号为CCTCC NO:M 2012129，地址是中国武汉大学。

附图说明

图1重组克隆菌落PCR产物琼脂糖电泳结果；

M：DNAmarker DL 5000；1～3：gcdh重组克隆

图2pUCm-T-gcdh克隆质粒双酶切产物琼脂糖电泳结果；

M：DNA marker DL 5000；1：完整质粒pUCm-T-gcdh；2：双酶切的pUCm-T-gcdh

图3pBARGPE1-Hygro-gcdh表达载体转化子菌落PCR产物琼脂糖电泳结果；

M：DNA marker DL 5000；1：阳性对照2：gcdh菌落PCR阴性；3：gcdh菌落PCR阳性

图4表达载体pBARGPE1-Hygro-gcdh双酶切产物琼脂糖凝胶电泳结果；

M：DNA marker DL 5000；1：完整质粒pBARGPE1-Hygro-gcdh；2：表达载体pBARGPE1-Hygro-gcdh的酶切产物

图5重组黑曲霉PCR验证琼脂糖凝胶电泳结果；

M：DNA marker DL 5000；1：GF/GR的空白对照；2：黑曲霉C112-gcdh图6为RT-PCR扩增产物；

M：DNA marker DL5000；1：GF/GR的空白对照(未加模板)；2～4：黑曲霉C112-gcdh

图7黑曲霉C112、黑曲霉C112-gcdh的滤纸酶活比较；

图8黑曲霉C112、黑曲霉C112-gcdh的锰依赖过氧化物酶活性的比较；

图9漆酶添加量对杨木纤维酶解产糖的影响；

注：图中的字母表示ɑ＝0.05时的多重比较，字母相同为差异不显著，字母不同为差异显著；

图10纤维二糖脱氢酶对杨木纤维酶解产糖的影响；注：图中的字母表示ɑ＝0.05时的多重比较，字母相同为差异不显著，字母不同为差异显著；

图11纤维二糖酶对杨木纤维酶解产糖的影响；注：图中的字母表示ɑ＝0.05时的多重比较，字母相同为差异不显著，字母不同为差异显著；

图12纤维素酶酶解产糖与纤维素酶、漆酶、纤维二糖酶和纤维二糖脱氢酶联合酶解产糖的还原糖浓度比较。

具体实施方式：

以下实施例，可以帮助更好地理解本发明。此外，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：

(1)灰树花DNA提取：灰树花菌块若干分别接种于PDA液体培养基中，28℃，静置培养14d，过滤收集菌丝体，除干水分，液氮研磨，取适量研磨得到的粉末加入装有700μL GP1(天根生化科技有限公司DNA提取试剂盒))的离心管中，GP1需要在65℃中预热，混合均匀后置于65℃水浴锅中孵育20min。向离心管中加入700μL氯仿，12000rpm，离心5min，将上层水相转移至另一个干净的离心管中，加入700μL GP2(天根生化科技有限公司DNA提取试剂盒)，充分混匀。再转移至吸附柱CB3中，12000rpm，离心1min，弃去废液。向吸附柱中加入500μL GD(天根生化科技有限公司DNA提取试剂盒)，12000rpm，离心1min，弃去废液。向吸附柱中加入600μL PW(天根生化科技有限公司DNA提取试剂盒)，12000rpm，离心1min，弃去废液，重复一次此操作，再空管离心2min，12000rpm，室温放置10min以使PW漂洗液充分挥发。将吸附柱放入干净离心管中，向中间吸附膜中间滴加50μL洗脱液ET，室温放置2min，12000rpm，离心2min，得到总DNA溶液。

(2)以灰树花总DNA为模板，PCR扩增反应体系为20μL(2.5mM dNTP 2μL、2μM GR(GR为下游引物)1μL、2μM GF(GF为上游引物)1μL、5U/μL LA Taq(DNA聚合酶TaKaRa LA，购自宝日医生物技术(北京)有限公司)0.2μL、＜1μg/μL DNA 1μL，10×PCR BufferⅡ(含Mg²⁺)(购自宝日医生物技术(北京)有限公司，Mg²⁺浓度25mM)2μL，ddH₂O补足至20μL)。PCR反应条件：95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸3min，30个循环，最后72℃延伸5min以补齐末端。反应结束后，取5μL PCR反应产物采用1％琼脂糖凝胶电泳检测。

(3)PCR得到的产物，通过琼脂糖凝胶电泳分离，120V，30min，切下目的条带，装入离心管中，通过普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化科技有限公司)回收目的条带gcdh。

(4)使用已经线性化的载体pUCm-T(上海联迈生物工程有限公司)，10μL连接体系(T4连接酶(购自生工生物工程股份有限公司)1μL，10×T4 DNA Ligase Buffer购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)2μL，20-100ng pUCm-T，回收目的条带gcdh纤维二糖脱氢酶基因片段与载体DNA摩尔比3:1，ddH₂O补足至10μL)，利用T4DNA连接酶将目的基因于克隆载体连接；该体系在PCR仪中16℃过夜连接。

(5)从超低温冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞，插入冰盒，待其融化，加入上述全部连接产物，混匀后，冰浴30min。将上述感受态细胞于42℃中热激45s，然后再冰浴2min。向感受态细胞中加入700μL不含氨苄青霉素的LB液体培养基，混合均匀，37℃，190rpm培养1h。将13μL IPTG和40μL X-gal涂布于含有氨苄青霉素的LB平板中，室温放置半小时待液体全部吸收，取50μL培养好的大肠杆菌菌液涂布于该平板中，37℃，过夜培养。

(6)利用含IPTG、X-gal、Amp的LB平板来筛选转化子，过夜培养后LB平板上长出的淡黄色菌落为含有重组质粒的大肠杆菌，而蓝色菌落为不含重组质粒的大肠杆菌，以筛选阳性转化子。挑取淡黄色菌落，至含有20μL ddH2O的离心管中，沸水浴10min，冷却至室温，12000rpm/min，离心1min，上清液作为PCR模板，按PCR扩增体系20μL(菌落上清液1μL，GF(2μM)1μL，GR(2μM)1μL，2×EasyTaq PCR SuperMix(购自北京全式金生物)10μL，ddH₂O补足至20μL)进行菌落PCR反应，PCR反应条件见(2)。重组克隆菌落PCR产物琼脂糖电泳结果见图1。

(7)挑取菌落PCR阳性菌落，接种至含Amp的LB液体培养基，培养过夜。用质粒小提试剂盒提取质粒(天根生化科技有限公司)：提取好的质粒按照按pUCm-T-gcdh双酶切反应体系(质粒1μL，Sma I 1μL，10×Buffer Y 2μL，ddH2O补足至10μL)进行双酶切检测，37℃，过夜酶切，酶切产物采用1％琼脂糖凝胶电泳检测，见图2。(SmaⅠ和10×Buffer Y均购自生工生物工程股份有限公司)

(8)表达载体线性化：将pBARGPE1-Hygro转化至大肠杆菌中，方法见(5)，挑取单菌落接种于含有氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃，190rpm，过夜培养。利用质粒小提试剂盒提取表达载体质粒，载体pBARGPE1-Hygro按照pBARGPE1-Hygro单酶切反应体系(pBARGPE1-Hygro 1μg，Sma I 1μL，10×Buffer Y2μL，ddH₂O补足至10μL)进行线性化，37℃，过夜酶切。酶切产物利用1％琼脂糖凝胶电泳回收。

(9)表达载体pBARGPE1-Hygro-gcdh的构建：配制gcdh扩增体系(G.f DNA(＜1μg/μL)1μL,GF(2μM)1μL,GR(2μM)1μL,dNTP(2.5mM)2μL,10×PCR BufferⅡ(含Mg²⁺)2μL,LA Taq(5U/μL)0.2μL,ddH2O补足至20μL)，PCR产物利用1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带，方法见(3)。利用EasyGeno单片段重组克隆试剂盒(购自天根生化科技有限公司)，配制同源重组体系(线性化pBARGPE1-Hygro 50～100ng,gcdh与载体DNA摩尔比3:1,2×EasyGeno SingleAssembly Mix 5μL,ddH2O补足到10μL)，构建pBARGPE1-Hygro-gcdh。将反应液混合后置于50℃反应15min。反应结束后，转化至大肠杆菌感受态细胞中，37℃，过夜培养，挑选阳性转化子。

(10)表达载体阳性克隆转化子的筛选:菌落PCR检验方法见(6)，pBARGPE1-Hygro-gcdh表达载体转化子菌落PCR产物琼脂糖电泳结果如图3。表达载体双酶切验证方法见(7)，pBARGPE1-Hygro-gcdh酶切反应体系为pBARGPE1-Hygro-gcdh 1μg，Sma I 1μL，10×BufferY 2μL，ddH2O补足至10μL。如图4，泳道2中的两条条带，一条在6000bp左右，另一条在3000bp左右，与质粒pBARGPE1-Hygro和gcdh大小相符合，载体pBARGPE1-Hygro-gcdh构建成功。

(12)将-80℃保存的黑曲霉菌株C112(保藏编号CCTCC NO：M 2012129)在PDA试管培养基上活化，28℃培养7d，取该试管加入10mL孢子洗脱液，用接种钩将孢子轻轻刮下，用适量棉花过滤孢子液以去除菌丝，所得滤液即为黑曲霉孢子悬液，调节孢子浓度为10⁷个/mL。

接种1mL的孢子悬液于100mLPDB培养基中，28℃，160rpm/min摇床培养16h后在超净台中过滤收集菌丝。过滤得到的菌丝装入50mL离心管中，加入30mL溶液I(溶液I：5mmol/LK₂HPO₄，5mmol/L KH₂PO₄，0.8mol/L MgSO₄，pH5.5，0.22μm滤膜过滤除菌的溶液)洗涤菌丝，4000rpm，离心5min，去上清，重复三次。然后将洗涤好的湿润的菌丝与溶液Ⅳ(溶液Ⅳ原生质体制备混合酶液：2g/L溶壁酶，2g/L纤维素酶，2g/L蜗牛酶，按照溶壁酶：纤维素酶：蜗牛酶＝1：1：2配制混合酶溶液，0.22μm滤膜过滤除菌的溶液)按照体积比1：4的比例加入50mL三角瓶中，30℃，150rpm/min摇床消化3h。酶解后用四层擦镜纸过滤酶解液，弃去菌丝，滤液加入30mL溶液Ⅱ(溶液Ⅱ：10mmol/LTris-HCl，50mmol/L CaCl₂，1.2mol/L山梨醇，pH7.5，0.22μm滤膜过滤除菌的溶液)，4000rpm/min，4℃，离心10min，弃掉上清，再用30mL溶液Ⅱ洗涤沉淀两次，沉淀重悬至溶液Ⅱ中。

取100μL原生质体悬液(即上述步骤沉淀重悬至溶液Ⅱ中所得)，加入10μg的表达质粒，再加入25μL溶液III(溶液III：50％(W/V)PEG-4000、1mmol/LCaCl₂，10mmol/L Tris-HCl，pH7.5，0.22μm滤膜过滤除菌的溶液)，轻轻颠倒混匀，冰浴20min，取出后缓缓加入1mL溶液III，2mL溶液II，轻轻颠倒混匀，将其与含有100μg/mL潮霉素的上层原生质体再生培养基(0.6g/L NaNO₃，3.4g/L CsCl，0.52g/L KCl，1.52g/L KH₂PO₄，1.2M D-山梨醇，1mL/L微量元素(微量元素溶液：1g/L FeSO₄·7H₂O，8.8g/L ZnSO₄·7H₂O，0.4g/L CuSO₄·5H₂O，0.15g/L MnSO₄·4H₂O，0.1g/L Na₂B₄O₇·10H₂O，50mg/L(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，0.2mL/L HCl)，10g/L葡萄糖，0.5g/L MgSO₄，8g/L琼脂配制的溶液)混匀后，平铺于下层原生质体再生培养基(0.6g/L NaNO₃，3.4g/L CsCl，0.52g/L KCl，1.52g/L KH₂PO₄，1.2M D-山梨醇，1mL/L微量元素，10g/L葡萄糖，0.5g/LMgSO4，20g/L琼脂)上，28℃培养5～7d。

在PEG-4000的介导下将pBARGPE1-Hygro-gcdh导入黑曲霉并使纤维二糖脱氢酶基因在黑曲霉中表达。

提取黑曲霉阳性转化子：黑曲霉阳性转化子的筛选：将在含有100μg/mL潮霉素再生培养基上长出的单菌落，接种于含有200μg/mL潮霉素的培养基中，28℃培养5～7d，能够再次生长的基本确定为阳性转化子。能够正常生长的菌落接种于PDA平板中，28℃培养5～7d，待其菌丝长满整个平板，收集菌丝，取总DNA，方法见(1)，以黑曲霉C112-gcdh的总DNA为PCR扩增模板，进行反应，反应体系如表4，出发菌株黑曲霉C112为空白对照。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析见图5，泳道条带大小大致分别为3400bp，与gcdh大小一致，表达载体pBARGPE1-Hygro-gcdh转化成功。

表4黑曲霉C112-gcdh的PCR体系

发酵过程(制备阳性黑曲霉的孢子悬液，详见(8)，接种1×10⁷个孢子于产酶培养基(产酶培养基：10g/L葡萄糖，10g/L蛋白胨，4g/L KH₂PO₄，1.0g/L MgSO₄，0.5g/L CaCl₂，0.04％吐温-80，1mL/L微量元素溶液(配方同前)中，28℃，160rpm，培养7d后，收集菌丝体液氮研磨成粉末，通过真菌总RNA分离试剂盒提取总RNA(柱式真菌总RNA抽提纯化试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司)，将所得到的RNA溶液置于-70℃保存。将阳性转化子的总RNA，反转录为cDNA，以其作为PCR模板进行扩增，扩增产物如图6，泳道2、3、4、均出现条带，大小在2000bp到3000bp之间，与NCBI中已经公布的灰树花纤维二糖脱氢酶RNA序列(AB083245.1)大小相似，说明gcdh基因成功转录。

重组灰树花纤维二糖脱氢酶能够使黑曲霉C112的纤维素酶和锰过氧化物酶的活性提高：以杨木纤维为诱导物，在相同条件下，培养黑曲霉C112和黑曲霉C112-gcdh，经过酶活性测定发现黑曲霉C112-gcdh的纤维素酶、锰过氧化物酶活性有明显的提高，分别提高了28.57％、121.69％。说明重组灰树花纤维二糖脱氢酶能够使黑曲霉C112的纤维素酶和锰过氧化物酶的活性提高。见图7和图8。

纤维素酶活性以滤纸酶活性表示，采用DNS比色法法测定。酶活性的定义：在50℃，pH 4.8的条件下，1mL纤维素酶溶液每分钟催化生成1mg还原糖作为一个酶活性单位(U/mL)。

紫外分光光度法测锰过氧化物酶活性：在含乳酸缓冲液(0.2M，pH 5.0)(乳酸缓冲液：称取3.735g乳酸钠，加水定容至100mL，再加入乳酸调节pH至5.0)、0.4M MnSO₄、粗酶溶液和20mM过氧化氢的反应体系中测定锰过氧化物酶活性。在240nm波长处测定3min范围内OD值的变化。酶活性的定义：一个活性单位(U/L)为1L酶溶液每分钟催化氧化1μmol MnSO₄。

从黑曲酶发酵液中提取纤维二糖脱氢酶(在目的基因两端添加了组氨酸纯化标签，目的蛋白可以和Ni柱中的氯化镍或者硫酸镍亲和吸附)步骤如下：

A:加入适量的Ni-NTA树脂(购自生工生物工程股份有限公司)到离心管中，离心管在3000rpm，离心2min，去除上清。加入两倍柱体积的Binding/Wash Buffer将缓冲液和树脂完全混匀平衡柱料。

B:再将离心管在3000rpm，离心2min，去除上清。

C:将浓缩粗酶液(浓缩粗酶液获得过程：制备黑曲霉C112-gcdh的孢子悬液，接种1×10⁷个孢子于PDB培养基中，28℃，160rpm，培养2d，接种于50mL产酶培养中，接种量为5％，28℃，160rpm，培养7d，取发酵上清液，利用冷冻干燥机得到粗酶粉，重新溶解于ddH2O中，得到浓缩粗酶液。)与Binding/Wash Buffer 1:1混匀，使混合液总体积相当于两倍树脂体积。混合液加入树脂中，再旋转振荡混匀30min，使混合液与树脂充分混匀。

D:将离心管在3000rpm，离心2min，吸出上清，用两倍树脂体积的Binding/WashBuffer清洗，再将离心管在3000rpm，离心2min吸出上清，如需要可将上清留存进行下游分析。重复清洗步骤，测量在280nm吸光度，直到洗出液值达到基线值。

E:用一倍树脂体积的Elution Buffer洗脱树脂上的组氨酸标签蛋白，将离心管在3000rpm，离心2min，然后小心的吸出并保存上清。此步骤重复两次，将每次的洗脱液分别保存。

F:通过测量在280nm处吸光度确定洗脱液中蛋白浓度，洗脱的蛋白可用于SDS-PAGE分析。

(13)酶系优化前，只由纤维素酶酶解，酶系优化后由纤维素酶、漆酶、纤维二糖酶和纤维二糖脱氢酶联合酶解，酶系优化过程，分别对漆酶、纤维二糖酶和纤维二糖脱氢酶进行单因素变量试验，当一种酶添加量改变时，另外三种酶添加量固定。初始添加量分别为：漆酶20U/g、纤维二糖酶40U/g和纤维二糖脱氢酶40U/g；纤维素酶2mg/mL(采用QB2583-3003测得滤纸酶活约为1500U/g)。酶系优化后由漆酶、纤维二糖酶和纤维二糖脱氢酶最优联合纤维素酶酶解。其它反应条件固定不变：NaF添加浓度为2.5mg/mL，让NaF溶液能够完全浸渍预处理的木质纤维素；料液比1：10，可以完全浸没，反应温度为50℃，pH4.8，反应时间为48h，木质纤维素预处理用4％NaOH，液料比10：1，121℃，处理90min，洗涤至中性，烘干，粉碎，100目。

纤维素酶作为对照，添加量为2mg/mL。

酶系优化前后产糖浓度对比如图12所示：漆酶、纤维二糖酶和纤维二糖脱氢酶联合纤维素酶酶解产糖浓度相比单独纤维素酶(2mg/mL)酶解产糖浓度提高了76.65％。

漆酶添加量对杨木纤维酶解产糖的影响见图9。在漆酶添加量为0～40U/g时，体系中的还原糖浓度随着漆酶添加量的增加而增加，漆酶破坏了木质纤维素的结构使之变得松散蓬松，使得其它酶与底物的解除面积增大，酶解效率增加，导致还原糖浓度上升；在漆酶添加量为40～100U/g时，体系中的还原糖浓度随着漆酶添加量的增加而减少。随着漆酶添加量增加，酚氧自由基与酶之间形成偶联反应对杨木纤维酶解的影响越来越大，导致降解效率降低，产糖减少。综合考虑，选择漆酶添加量为40U/g，进行后续酶解反应研究。

纤维二糖脱氢酶添加量对杨木纤维酶解产糖的影响见图10。在纤维二糖脱氢酶的添加量为35～55U/g时，还原糖浓度随着纤维二糖脱氢酶的添加量增加而增加，在55U/g时还原糖浓度达到最大值；而当纤维二糖脱氢酶的添加量为55～75U/g时，还原糖浓度随着纤维二糖脱氢酶的添加量增加而减少。而当纤维二糖脱氢酶添加持续增多，纤维二糖脱氢酶催化纤维二糖生成醛糖酸增多，纤维二糖酶催化纤维二糖水解为葡萄糖减少，导致产糖下降。综合考虑，选择纤维二糖脱氢酶添加量为55U/g，进行后续酶解反应研究。

纤维二糖酶添加量对杨木纤维酶解产糖的影响见图11。在纤维二糖酶的添加量为0～80U/g时，还原糖浓度随着纤维二糖酶的添加量增加而增加，纤维二糖酶的添加量大于80U/g时，酶解体系内还原糖浓度基本保持不变，还原糖产量趋于平稳，这可能是因为酶解体系内还原糖浓度过高造成对纤维二糖酶的抑制，继续添加纤维二糖酶产糖量并不会继续增加。综合考虑，选择纤维二糖酶添加量为80U/g，进行后续酶解优化反应研究。

继续通过响应面分析，得出杨木纤维最佳产糖条件：2.5mg/mL NaF、反应温度50℃、反应pH4.8、纤维素酶2mg/mL、最佳酶添加量组合：漆酶添加量38.558U/g、纤维二糖酶添加量89.679U/g、纤维二糖脱氢酶添加量55.485U/g，与纤维素酶酶解产糖浓度相比提高了76.65％。

上述除了纤维素酶，其他酶的添加均是以预处理的木质纤维素质量为基准添加。

因此，本方法构建了纤维二糖脱氢酶重组菌以及多酶协同降解杨木纤维产糖的方法。该方法提高杨木纤维酶解产糖率其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明权利要求范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.纤维二糖脱氢酶重组菌，其特征在于，将纤维二糖脱氢酶基因通过载体导入黑曲霉C112中获得；所述的纤维二糖脱氢酶基因序列如SEQ NO.1所示，所述的黑曲霉C112保藏编号为CCTCC NO:M 2012129。