CN108676822A - 一锅法酶水解-氧化纤维素制备葡萄糖酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一锅法酶水解‑氧化纤维素制备葡萄糖酸的方法，在含有纤维素原料的酶解体系中，加入里氏木霉纤维素酶，草菇纤维二糖脱氢酶、黑曲霉葡萄糖氧化酶，进行协同酶解反应，一锅法制备出葡萄糖酸。本发明利用纤维二糖脱氢酶氧化纤维素酶解主要产物纤维二糖为新的切入点，可消除葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖为葡萄糖酸单一路径的诸多不足，极大地定向强化水解酶系‑氧化酶系相互协同作用，提高木质纤维素酶水解效率和葡萄糖酸得率。该方法相比目前纤维素酶/葡萄糖氧化酶法分步水解和氧化技术，采用一锅法技术实现纤维素高效同步酶水解和氧化，具有纤维素酶水解和氧化效率高，工艺和设备简单，成本更低等优点，在利用木质纤维素制备葡萄糖酸中具有良好的应用潜力。

Description

一锅法酶水解-氧化纤维素制备葡萄糖酸的方法
技术领域
本发明属于生物基化学品生物制造技术领域，具体涉及一种利用纤维二糖脱氢酶参与协同的新型多酶催化体系一锅法高效酶水解-氧化纤维素制备葡萄糖酸的方法。
背景技术
葡萄糖酸(Gluconic acid，五羟基己酸)是一种重要的大宗生物基平台化学品，作为一种无腐蚀性、不易挥发、无毒性的温和有机酸，葡萄糖酸及其衍生物在食品、饲料、纺织和制药等行业具有广泛应用，近年来，葡萄糖酸钠作为一种常用的水泥缓凝剂而广泛应用于建筑行业。随着葡萄糖酸这种大宗化学品越来越多的功能得到开发，应用将越来越广泛，需求量非常巨大，生产规模逐渐扩大，葡萄糖酸的生产越来越受到国内外广泛关注。
葡萄糖酸可以通过化学或电化学催化方法、生物方法(酶或微生物发酵)从葡萄糖氧化制备，相比于化学或电化学催化方法，生物催化法更为高效和环境友好，是目前工业化生产葡萄糖酸所采用的方法。该方法主要是以丝状真菌黑曲霉(Aspergillus niger)、细菌氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)等微生物为生产菌株，将玉米淀粉或者蔗糖作为原料获得的葡萄糖通过微生物发酵转化为葡萄糖酸。以淀粉为原料生产葡萄糖酸的技术已经相当成熟，葡萄糖酸的浓度和转化率都比较高，但是由于存在与人争粮的问题，加之淀粉来源的葡萄糖本身价格较高，限制商品葡萄糖酸生产规模的进一步提升和成本下降，影响葡萄糖酸及其衍生物在更广泛领域的应用。因此，找到一种价格低廉且储量丰富的可再生原料来代替传统的淀粉和蔗糖生产葡萄糖酸，从而避免与人争粮，实现葡萄糖酸产业的可持续性高效发展非常必要。
基于木质纤维原料来源非常广泛，而目前又未能得到有效利用，有望成为今后工业化葡萄糖酸生产极好的潜在替代原料，相关研究已成为该领域的热点。目前以木质纤维为原料通过生物催化法(酶或微生物发酵)生产葡萄糖酸须要两步组成，第一步，预处理木质纤维须用纤维素酶将纤维素水解为葡萄糖，第二步，葡萄糖再由微生物(主要为黑曲霉和氧化葡糖杆菌)发酵，或者通过葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase，GOD)将葡萄糖氧化为葡萄糖酸。但是，不管是采用微生物发酵法还是葡萄糖氧化酶法将葡萄糖氧化为葡萄糖酸，要实现以木质纤维为原料生产葡萄糖酸，预处理木质纤维素必须首先转化为可发酵性葡萄糖，从目前研究情况看，无论是利用商品纤维素酶或者自产的纤维素酶，由于木质纤维素的顽抗性，纤维素酶水解效率和成本仍然是关键制约因素。因此，利用木质纤维为原料生产葡萄糖酸，面临着和木质纤维生物炼制生产其它生物基化学品同样一个无法回避的瓶颈问题，即如何实现低成本、高效的木质纤维素酶解？同时这种分步水解、氧化的技术方案无疑增加了工艺和设备的复杂性，不利于进一步降低生产成本。所以从目前看，受制于诸多因素的影响，利用纤维素酶水解和葡萄糖氧化酶法将木质纤维素转化为葡萄糖酸的技术路径还存在诸多问题。
发明内容
发明目的：针对目前以木质纤维为原料通过生物催化法(酶或微生物发酵)生产葡萄糖酸须要两步组成，存在纤维素酶水解效率和成本问题，以及技术工艺和设备复杂性等问题，本发明的目的是提供一锅法酶水解-氧化纤维素制备葡萄糖酸的方法，可消除葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖为葡萄糖酸单一路径的诸多不足，极大地定向强化水解酶系-氧化酶系相互协同作用，提高木质纤维素酶水解效率和葡萄糖酸得率。同时添加液体石蜡为氧载体，可以提高分子氧传递速度，进一步提高催化速度和葡萄糖酸产率。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一锅法酶水解-氧化纤维素制备葡萄糖酸的方法，在含有氏木霉纤维素酶的纤维素原料的酶解体系中，加入草菇纤维二糖脱氢酶、黑曲霉葡萄糖氧化酶，进行协同酶解反应，一锅法制备出葡萄糖酸。
所述的纤维素原料包括滤纸和碱法预处理后的植物秸秆。
所述的里氏木霉纤维素酶为里氏木霉D-86271纤维素酶。
在所述的酶解体系中加入Ampicillin和Zeocin。
所述的一锅法酶水解-氧化纤维素制备葡萄糖酸的方法，在45℃，180rpm通风条件下恒温摇床进行酶解反应48h以上。
在所述的酶解体系中添加4％液体石蜡。
所述的一锅法酶水解-氧化纤维素制备葡萄糖酸的方法，包括以下步骤：
1)里氏木霉纤维素酶制备：将保藏的Trichoderma reesei D-86271菌株接种到PDA培养基上，28℃培养5-7d，待长出一层菌丝体后，储存于4℃冰箱中备用；用接种环挑取少量Trichoderma reesei D-86271菌丝体接入50mL液态发酵培养基中，于28℃，180rpm恒温摇床培养3d；在固态发酵培养基中加入1mL Trichoderma reesei D-86271发酵液体培养液，混匀，静置于恒温控湿培养箱，30℃，湿度70％，发酵7d；离心收集酶液；
2)草菇纤维二糖脱氢酶制备：含VvCDH基因的工程菌接入4mL YPD液体培养基中，30℃，200rpm培养过夜后，取200μL菌液到50mL BMGY培养基中，30℃，200rpm条件下培养过夜至OD600达到2.0左右，4200rpm离心5min收集菌体，弃上清，菌体用25mL BMMY培养基重新悬浮，于28℃，200rpm条件下诱导产酶，每24h向培养基中加入终浓度为1％的过滤除菌后的甲醇；诱导7d后，5400rpm，离心10min，收集酶液。
3)一锅法酶水解-氧化纤维素产生还原糖和葡萄糖酸：酶解的反应体积为2.5mL，其中含有35mg 1×3.5cm Whatman 1号滤纸或0.05g碱预处理麦秆，0.5mg里氏木霉D-86271纤维素酶，以及VvCDH或/和GOD，在100mM，pH 4.8的柠檬酸钠缓冲液中进行酶解，体系中加入终浓度为100μg/mL的Ampicillin和Zeocin；体系中加入4％液体石蜡；在45℃，180rpm通风条件下恒温摇床进行酶解反应48h后，将所有样品在99℃煮沸5min灭活，10000rpm离心10min，取上清进行后续分析测定。
有益效果：与现有普遍采用的纤维素酶加葡萄糖氧化酶技术相比，本发明的一锅法酶水解-氧化纤维素制备葡萄糖酸的方法，具有以下优势：
1)该方法以纤维素酶解的主要产物---纤维二糖的氧化为新切入点，将纤维二糖氧化为纤维二糖酸，原有纤维素酶体系中β-葡萄糖苷酶可以进一步水解纤维二糖酸为葡萄糖和葡萄糖酸，葡萄糖(纤维素酶解和纤维二糖酸水解产生的)再由葡萄糖氧化酶氧化为葡萄糖酸，该体系充分利用并定向强化纤维二糖脱氢酶和糖苷水解酶之间，以及和葡萄糖氧化酶/裂解性多糖单加氧酶等氧化酶之间存在的多效协同性，因此该技术可消除葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖为葡萄糖酸单一路径的诸多不足，极大地定向强化水解酶系-氧化酶系相互协同作用，提高木质纤维素酶水解效率和葡萄糖酸得率。试验证实：10U VvCDH，10U GOD与0.5mg里氏木霉D-86271纤维素酶酶解滤纸48h后，可产生11.0g/L葡萄糖酸，而10U GOD与里氏木霉D-86271纤维素酶协同作用48h后只产生5.2g/L葡萄糖酸，10U VvCDH与里氏木霉D-86271纤维素酶协同作用48h后只产生4.8g/L葡萄糖酸，分别提高了112％和129％，与两者之和相比也提高了约10％，底物的多糖酶解解率达到了90％左右，葡萄糖酸得率为58％。10U VvCDH，10U GOD与0.5mg里氏木霉D-86271纤维素酶酶解碱预处理麦秆48h后，可得约10.1g/L葡萄糖酸，而10U GOD与里氏木霉D-86271纤维素酶协同作用48h后只产生4.5g/L葡萄糖酸，10U VvCDH与里氏木霉D-86271纤维素酶协同作用48h后只产生4.1g/L葡萄糖酸，分别提高了124％和146％，与两者之和相比分别提高了约17％，底物多糖水解得率为80％左右，葡萄糖酸得率为85％。
2)添加液体石蜡为氧载体，可以提高分子氧传递速度，进一步提高催化速度和葡萄糖酸产率。试验证实：在0.5mg里氏木霉D-86271纤维素酶，10U VvCDH与10U GOD酶解1.4％(w/v)浓度纤维素底物中，而单独加入液体石蜡可加速糖化进程，H2O2含量较对照提高了约11％类似地，酶解碱预处理麦秆，单独加入液体石蜡可加速酶解进程，同时H2O2含量也有所提高。
3)该技术采用一锅法技术实现纤维素高效同步酶水解和氧化，具有纤维素酶水解和氧化效率高，工艺和设备简单，成本更低等优点，具有很好的实用性。
附图说明
图1是纯化后的VvCDH电泳图；条带1、纯化后的VvCDH；条带M、标准分子量蛋白Marker；
图2是新型多酶催化体系(VvCDH/GOD/里氏木霉D-86271纤维素酶)一步法酶水解-氧化纤维素(滤纸)产生还原糖和葡萄糖酸；Cellobiose：纤维二糖；Glucose：葡萄糖；Gluconic acid：葡萄糖酸；Xylose：木糖；Arabinose：阿拉伯糖；
图3是新型多酶催化体系(VvCDH/GOD/里氏木霉D-86271纤维素酶)一步法酶水解-氧化纤维素(碱预处理麦秆)产生还原糖和葡萄糖酸；Cellobiose：纤维二糖；Glucose：葡萄糖；Gluconic acid：葡萄糖酸；Xylose：木糖；Arabinose：阿拉伯糖；
图4是不同氧载体对底物为滤纸时葡萄糖酸产量的影响结果图；Triton X-100：曲拉通X-100；Liquid paraffin：液体石蜡；n-dodecane：正十二烷；
图5是不同氧载体对底物为碱预处理麦秆时葡萄糖酸产量的影响结果图；TritonX-100：曲拉通X-100；Liquid paraffin：液体石蜡；n-dodecane：正十二烷；
图6是液体石蜡对一锅法转化滤纸为葡萄糖酸生成量的影响结果图；CK：对照；Liquid paraffin：液体石蜡；Catalase：过氧化氢酶；
图7是液体石蜡对一锅法转化滤纸为葡萄糖酸过程中过氧化氢生成量的影响结果图；CK：对照；Liquid paraffin：液体石蜡；Catalase：过氧化氢酶；
图8是液体石蜡对一锅法转化碱预处理麦秆为葡萄糖酸生成量的影响结果图；CK：对照；Liquid paraffin：液体石蜡；Catalase：过氧化氢酶；
图9是液体石蜡对一锅法转化碱预处理麦秆为葡萄糖酸过程中过氧化氢生成量的影响结果图；CK：对照；Liquidparaffin：液体石蜡；Catalase：过氧化氢酶。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明
以下实施例所使用的材料、试剂以及测定方法如下：
菌株及载体：含有pPICZαA-VvCDH的GS115，本发明人采用常规方法依据市售材料自行构建，Trichoderma reesei D-86271(Rut C-30)购自芬兰菌种保藏中心(VTTCC)。
酶类及其它生化试剂：Somogyi Reagent：SolutionA：称取16g Na2CO3、12gC4O6H2KNa·4H2O，用250mL蒸馏水溶解，与40mL 10％(w/w)CuSO4·5H2O溶液混合均匀，后加入16g NaHCO3；SolutionB：称取180g Na2SO4溶于500mL蒸馏水中，煮沸后冷却。将SolutionA与Solution B混合均匀，蒸馏水定容至1L，棕色瓶避光37℃静置两天后过滤备用。
Nelson Reagent：Solution C：称取25g(NH4)6Mo24·4H2O溶于450mL蒸馏水中，加入21mL 98％浓H2SO4，混合均匀；Solution D：称取3g Na2HAsO4·7H2O溶于25mL蒸馏水中。将Solution C与Solution D混合，蒸馏水定容至500mL，棕色瓶避光37℃静置两天后备用。
隐色结晶紫(leuco crystal violet)溶液：称取0.037g leuco crystal violet溶于100mL 0.06M HCl溶液。
30％H2O2购自广东光华公司，辣根过氧化物酶(peroxidase)购自Solarbio，过氧化氢酶(catalase)购自Biotopped，葡萄糖氧化酶(glucose oxidase)购自Sigma。其余药品为进口或国产分析纯试剂。麦秆购自江苏连云港美味农家，滤纸购自Whatman。
YPD培养基(L-1)：称取Peptone 20g，Yeast extract 10g，Glucose 20g，用800mLH2O溶解后定容至1L，需配制固体平板时可在以上的基础上再加入20g Agar，必要时可以向其中加入一定浓度(100μg/mL)的抗生素溶液(Zeocin)，于115℃灭菌30min；用于菌种短期保存、活化培养及基因工程操作。
10×YNB(13.4％Yeast Nitrogen Base with Ammonium Sulfate without aminoAcids)：称取YNB 13.4g，用80mL H2O溶解后定容至100mL，过滤除菌后4℃冰箱保存备用。
1M，pH 6.0磷酸(KH2PO4-K2HPO4.3H2O)缓冲液：称取KH2PO413.609g，用80mL H2O溶解后定容至100mL，用22.822g/100mL的K2HPO4.3H2O调节pH至6.0。过滤除菌后4℃保存。
BMGY培养基：称取Peptone1g，Yeast extract0.5g，甘油0.5mL，用20mL H2O溶解后定容至40mL，121℃灭菌20min。冷却至室温后加入1M，pH 6.0的磷酸钾缓冲液和10×YNB溶液各5mL。
BMMY培养基：称取Peptone 0.5g，Yeast extract 0.25g，用10mL H2O溶解后定容至20mL，121℃灭菌20min。冷却至室温后加入1M，pH 6.0的磷酸钾缓冲液和10×YNB溶液各2.5mL。
PDA(Potato Dextrose Agar)培养基：马铃薯(洗净去皮切碎)200g，加800mL蒸馏水煮沸30min，纱布过滤去除沉淀物，上清加20g葡萄糖溶解后定容至1000mL，分装后115℃高压灭菌30min。PDA固体培养基：按照PDA液体培养组分配制，后加入2％琼脂，115℃高压灭菌30min后倒制平板，或倒入试管倾斜放置制成斜面。
Mandels液体培养基(Mandels medium)：1×Mandels液态培养基：称取KH2PO42g，(NH4)2SO41.4g，Urea 0.3g，MgSO4·7H2O0.3g，CaCl20.3g，Yeast extract 0.3g，加入微量元素浓缩液1mL，蒸馏水定容至1L。
液态发酵培养基(种子培养基)：1×Mandels液态培养基分装为每瓶50mL，115℃高压灭菌30min后，加入2.5mL 20％葡萄糖。
固态培养基：称取麦麸1.5g，脱木素麦秆1.5g，加入5mL 10×Mandels液态培养基，115℃，灭菌30min。麦秆脱木素方法：100g麦杆中加入200mL 4％(w/v)NaOH溶液，搅拌均匀，121℃处理20min，后用流水去除褐色杂质，烘干粉碎后备用。
还原糖的测定：取适量反应后的酶解液，向其中加入0.5mL Somogyi Reagent，混匀，99℃煮沸15min，冷却至室温，加入0.5mL Nelson Reagent，静置20min，10000rpm离心10min后，取上清于520nm处测定其吸光值。还原糖标准曲线为y＝0.0104x-0.0154，其中x为还原糖含量(μg/mL)，y为520nm处的吸光值。
还原糖种类和葡萄糖酸生成量的测定：取反应后的酶解液，99℃煮沸5min，适当稀释后用HPLC分析其中各糖分的含量。HPLC系统装有Bio-Rad Aminex HPX-87H柱，在55℃下，以5mM H2SO4为流动相，流速为0.6mL/min。样品出峰后，根据出峰时间和标准曲线，计算酶解液中还原糖种类和含量。利用HPAEC测定酶解液中的葡萄糖酸含量，HPAEC系统装有PA-200分离柱，样品出峰后，根据标准曲线，计算葡萄糖酸含量。
酶解液中H2O2的测定：待酶解过程结束后，将酶解液99℃煮沸2min，依次加入辣根过氧化物酶(POD)，隐色结晶紫溶液，以及缓冲液，于592nm处测定吸光值，并根据H2O2标准曲线计算酶解液中H2O2的含量。
纤维素的酶解率和葡萄糖酸转化率的计算：根据上述所测得的还原糖和葡萄糖酸的量，利用如下酶解率和葡萄糖酸转化率公式，计算纤维素的酶解得率和葡萄糖酸得率。
式中，S-底物的量(mg)，G-葡萄糖的量(mg)，C-纤维二糖的量(mg)，GA-葡萄糖酸的量(mg)，X-木糖的量(mg)，A-阿拉伯糖的量(mg)，其中，FP为滤纸(filter paper)，DWS为碱预处理麦秆。
以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1
纤维素酶制备，步骤如下：
1)菌株的活化：将保藏的Trichoderma reesei D-86271菌株接种到PDA培养基上，28℃培养5-7d，待长出一层菌丝体后，储存于4℃冰箱中备用。
2)Trichoderma reesei D-86271的液态培养：用接种环挑取少量菌丝体接入50mL液态发酵培养基中，于28℃，180rpm恒温摇床培养3d。
3)Trichoderma reesei D-86271的固态发酵产酶：在固态发酵培养基中加入1mL液体培养液，混匀，静置于恒温控湿培养箱，30℃，湿度70％，发酵7d。
4)Trichoderma reesei D-86271纤维素酶的提取：固态发酵结束后，将30mL0.1％Tween 80溶液加入三角瓶中，搅拌混合均匀，于水浴摇床28℃，120rpm，震荡2h。将固液混合物倒入离心管中，6000rpm离心10min后，取上清液于无菌的50mL离心管中，并加入1％NaN3防止微生物污染，4℃冰箱保存备用。
实施例2
重组草菇纤维二糖脱氢酶(VvCDH)的表达及纯化，步骤如下：
1)从YPDZ平板上挑取乳白色含VvCDH基因的毕赤酵母GS115单菌落，接入4mL YPD液体培养基中，30℃，200rpm培养过夜后，取200μL菌液到50mL BMGY培养基中，30℃，200rpm条件下培养过夜至OD600达到2.0左右，4200rpm离心5min收集菌体，弃上清，菌体用25mLBMMY培养基重新悬浮，于28℃，200rpm条件下诱导产酶，每24h向培养基中加入终浓度为1％(v/v)的过滤除菌后的甲醇。诱导7d后，5400rpm，离心10min，收集酶液。
2)重组蛋白的纯化：在基因合成的过程中，重组蛋白的C端加上了6个组氨酸标签(6×His)，可以利用Ni-NTA亲和柱对蛋白进行纯化。纯化后的重组草菇纤维二糖脱氢酶的10％的SDS-PAGE如图1所示。
实施例3
新型多酶催化体系一步法酶水解-氧化制备葡萄糖酸，步骤如下：
1)配制酶催化反应体系：酶解的反应体积为2.5mL，其中含有1×3.5cm Whatman 1号滤纸(约35mg，纤维素含量为98％)或0.05g碱预处理麦秆，分别添加10U VvCDH(实施例2制备)/0.5mg里氏木霉D-86271纤维素酶(实施例1制备)，或10U GOD(购自Sigma)/0.5mg里氏木霉D-86271纤维素酶，或10U VvCDH/10U GOD/0.5mg里氏木霉D-86271纤维素酶，在100mM，pH 4.8的柠檬酸钠缓冲液中进行酶解，为了防止微生物对体系中糖分的影响，体系中加入了终浓度为100μg/mL的Ampicillin和Zeocin。
2)催化过程：在45℃，180rpm通风条件下恒温摇床进行酶解反应48h后，将所有样品在99℃煮沸5min灭活，10000rpm离心10min，取上清进行后续分析测定。以99℃灭活10min的酶液在相同的条件下反应后作为对照。
结果如图1和图2所示，10U VvCDH，10U GOD与0.5mg里氏木霉D-86271纤维素酶酶解滤纸48h后，可产生11.0g/L葡萄糖酸，而10U GOD与里氏木霉D-86271纤维素酶协同作用48h后只产生5.2g/L葡萄糖酸，10U VvCDH与里氏木霉D-86271纤维素酶协同作用48h后只产生4.8g/L葡萄糖酸，分别提高了112％和129％，与两者之和相比也提高了约10％，底物的多糖酶解解率达到了90％左右，葡萄糖酸得率为58％。10U VvCDH，10U GOD与0.5mg里氏木霉D-86271纤维素酶酶解碱预处理麦秆48h后，可得约10.1g/L葡萄糖酸，而10U GOD与里氏木霉D-86271纤维素酶协同作用48h后只产生4.5g/L葡萄糖酸，10U VvCDH与里氏木霉D-86271纤维素酶协同作用48h后只产生4.1g/L葡萄糖酸，分别提高了124％和146％，与两者之和相比分别提高了约17％，底物多糖水解得率为80％左右，葡萄糖酸得率为85％。从结果可以看出，本发明将VvCDH，GOD与里氏木霉D-86271纤维素酶协同降解滤纸和碱预处理麦秆，与目前使用的葡萄糖氧化酶/里氏木霉D-86271纤维素酶体系相比，可以极大地提高产物葡萄糖酸的得率和纤维素酶解效率，实现一锅法同步高效酶水解-氧化纤维素制备葡萄糖酸。
实施例4
不同氧载体对葡萄糖酸产量的影响，步骤如下：
1)配制催化体系：在10U VvCDH/0.5mg里氏木霉D-86271纤维素酶体系，和10UGOD/0.5mg里氏木霉D-86271纤维素酶体系中，分别加入不同氧载体4％(v/v)Triton X-100，液体石蜡和正十二烷提高分子氧传递效率，分析对葡萄糖酸产量的影响。为了防止微生物对体系中糖分的影响，体系中加入了终浓度为100μg/mL的Ampicillin和Zeocin。
2)催化反应：在45℃，180rpm通风条件下恒温摇床进行酶解反应48h后，将所有样品在99℃煮沸5min灭活，10000rpm离心10min，取上清进行后续分析测定。以99℃灭活10min的酶液在相同的条件下反应后作为对照。
3)还原糖种类和葡萄糖酸生成量的测定：取反应后的酶解液，99℃煮沸5min，适当稀释后用HPLC分析其中各糖分的含量。HPLC系统装有Bio-Rad Aminex HPX-87H柱，在55℃下，以5mM H2SO4为流动相，流速为0.6mL/min。样品出峰后，根据出峰时间和标准曲线，计算酶解液中还原糖种类和含量。利用HPAEC测定酶解液中的葡萄糖酸含量，HPAEC系统装有PA-200分离柱，样品出峰后，根据标准曲线，计算葡萄糖酸含量。
4)酶解液中H2O2的测定：待酶解过程结束后，将酶解液99℃煮沸2min，依次加入辣根过氧化物酶(POD)，隐色结晶紫溶液，以及缓冲液，于592nm处测定吸光值，并根据H2O2标准曲线计算酶解液中H2O2的含量。
结果如图3和图4所示，可以看出，在里氏木霉D-86271纤维素酶与VvCDH酶解体系和里氏木霉D-86271纤维素酶与GOD酶解体系中酶解体系中分别加入4％(v/v)Triton X-100，液体石蜡和正十二烷作为氧载体，与对照相比，Triton X-100对葡萄糖酸产量基本无影响，正十二烷可将葡萄糖酸产量提高约10％。液体石蜡对葡萄糖酸产量有明显的提高作用：就里氏木霉D-86271纤维素酶与VvCDH酶系酶解而言，葡萄糖酸产量由25.8mM增加至32.6mM，提高了约26％；就里氏木霉D-86271纤维素酶与GOD酶系酶解而言，葡萄糖酸产量由28.5mM增加至36.7mM，提高了约29％。酶解碱预处理麦秆，与酶解滤纸情况类似，液体石蜡对葡萄糖酸产量有提高作用，增加了约30％。结果表明，液体石蜡对于葡萄糖酸产量的提高有很好的促进作用。
实施例5
液体石蜡提高多酶催化体系一步法酶水解-氧化制备葡萄糖酸，步骤如下：
1)配制酶催化反应体系：同时加入10U VvCDH，10U GOD和0.5mg里氏木霉D-86271纤维素酶，三者协同催化Whatman 1号滤纸(约35mg，纤维素含量为98％)或0.05g碱预处理麦秆纤维素，以制备大量葡萄糖酸。在10U VvCDH，10U GOD和0.5mg里氏木霉D-86271纤维素酶体系中分别加入液体石蜡，过氧化氢酶，以及两者同时加入。
2)催化过程：在45℃，180rpm通风条件下恒温摇床进行酶解反应48h后，将所有样品在99℃煮沸5min灭活，10000rpm离心10min，取上清进行进行后续分析测定。以99℃灭活10min的酶液在相同的条件下反应后作为对照。
分别测定还原糖种类和生产量，葡萄糖酸生产量，酶解液中H2O2含量，以及纤维素的酶解率和葡萄糖酸转化率。
结果如图5-8所示，可以看出，液体石蜡可以进一步提高对VvCDH，GOD和里氏木霉D-86271纤维素酶的协同酶解作用，提高催化速度。液体石蜡可增加体系中的溶氧量，在0.5mg里氏木霉D-86271纤维素酶，10U VvCDH与10UGOD酶解1.4％(w/v)浓度纤维素底物中，单独加入液体石蜡H2O2含量较对照提高了约11％，可加速糖化进程，提高葡萄糖酸得率。类似地，酶解碱预处理麦秆，单独加入液体石蜡H2O2含量也有所提高，表明可加速酶解进程。

Claims (7)

1.一锅法酶水解-氧化纤维素制备葡萄糖酸的方法，其特征在于，在含有纤维素原料的酶解体系中，加入里氏木霉纤维素酶，草菇纤维二糖脱氢酶、黑曲霉葡萄糖氧化酶，进行协同酶解反应，一锅法制备出葡萄糖酸。
2.根据权利要求1所述的一锅法酶水解-氧化纤维素制备葡萄糖酸的方法，其特征在于：所述的纤维素原料包括滤纸和碱法预处理后的植物秸秆。
3.根据权利要求1所述的一锅法酶水解-氧化纤维素制备葡萄糖酸的方法，其特征在于：所述的里氏木霉纤维素酶为里氏木霉D-86271纤维素酶。
4.根据权利要求1所述的一锅法酶水解-氧化纤维素制备葡萄糖酸的方法，其特征在于：在所述的酶解体系中加入Ampicillin和Zeocin。
5.根据权利要求1所述的一锅法酶水解-氧化纤维素制备葡萄糖酸的方法，其特征在于：在45℃，180rpm通风条件下恒温摇床进行酶解反应48h以上。
6.根据权利要求1所述的一锅法酶水解-氧化纤维素制备葡萄糖酸的方法，其特征在于：在所述的酶解体系中添加4％液体石蜡。
7.根据权利要求1-6任一项所述的一锅法酶水解-氧化纤维素制备葡萄糖酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)里氏木霉纤维素酶制备：将保藏的Trichoderma reesei D-86271菌株接种到PDA培养基上，28℃培养5-7d，待长出一层菌丝体后，储存于4℃冰箱中备用；用接种环挑取少量Trichoderma reesei D-86271菌丝体接入50mL液态发酵培养基中，于28℃，180rpm恒温摇床培养3d；在固态发酵培养基中加入1mL Trichoderma reesei D-86271发酵液体培养液，混匀，静置于恒温控湿培养箱，30℃，湿度70％，发酵7d；离心收集酶液；
2)草菇纤维二糖脱氢酶制备：含VvCDH基因的工程菌接入4mL YPD液体培养基中，30℃，200rpm培养过夜后，取200μL菌液到50mL BMGY培养基中，30℃，200rpm条件下培养过夜至OD600达到2.0左右，4200rpm离心5min收集菌体，弃上清，菌体用25mL BMMY培养基重新悬浮，于28℃，200rpm条件下诱导产酶，每24h向培养基中加入终浓度为1％的过滤除菌后的甲醇；诱导7d后，5400rpm，离心10min，收集酶液。
3)一锅法酶水解-氧化纤维素产生还原糖和葡萄糖酸：酶解的反应体积为2.5mL，其中含有35mg 1×3.5cm Whatman 1号滤纸或0.05g碱预处理麦秆，0.5mg里氏木霉D-86271纤维素酶，以及VvCDH或/和GOD，在100mM，pH 4.8的柠檬酸钠缓冲液中进行酶解，体系中加入终浓度为100μg/mL的Ampicillin和Zeocin；体系中加入4％液体石蜡；在45℃，180rpm通风条件下恒温摇床进行酶解反应48h后，将所有样品在99℃煮沸5min灭活，10000rpm离心10min，取上清进行后续分析测定。
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