CN102174410A - 一株高产耐热耐酸纤维素酶的霉菌及发酵纤维乙醇新方法 - Google Patents

一株高产耐热耐酸纤维素酶的霉菌及发酵纤维乙醇新方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种微生物及其应用，特别涉及一株高产纤维素酶的土曲霉菌株M11，以及利用此菌综合生物工艺发酵纤维素产乙醇的新方法。本发明的技术包括：获得一株高产耐热耐酸纤维素酶的土曲霉M11，所产纤维素酶在pH2-3，温度60-65℃具有最高酶活；以及利用此菌将产酶、水解糖化与乙醇发酵在一个体系中完成。新的综合生物工艺发酵方法，直接将预处理过的木质纤维素一步发酵产乙醇，实现了综合生物工艺发酵，大大节省了生产成本。

Description

一株高产耐热耐酸纤维素酶的霉菌及发酵纤维乙醇新方法
技术领域
本发明属于微生物菌种分离与发酵技术，涉及分离获得一种新型嗜热酸土曲霉M11，可高产耐热、耐酸的纤维素素酶，以及以此菌为基础的新型一步综合生物工艺产纤维乙醇的新发酵方法。
背景技术
木质植物纤维素是自然界中最丰富、最廉价的可再生资源，约占植物组织平均干重的20％-45％。全世界每年通过光合作用产生的纤维素类物质高达1.55×1011吨，其中89％尚未被人类利用。含大量纤维素的秸杆、植物腐质物以及城市的生活垃圾主要通过焚烧和掩埋处理，不仅污染环境而且浪费大量资源。利用纤维素资源生产生物乙醇，被认为是解决能源危机的最为理想的办法之一。乙醇是人类饮料和食品中所用的主要化学物质，可作为工业化学物质和作为燃料或燃料组分如为汽车重新配置的汽油。
纤维素与木质素均为植物细胞壁的成分。植物细胞壁中，纤维素被半纤维素和木质素通过物理和化学作用所包裹，不利于纤维素酶对纤维素的进攻。要游离、纯化、水解纤维素，必须首先解除木质素对纤维素的覆盖、包裹状态，其中包括对木质素的降解。目前，纤维素分离的方法和途径可以分为化学法、物理法等。用高温、高压蒸煮及大量的酸、碱处理，使木质素游离、溶出。物理处理法是用液氨预处理、蒸汽爆破、低温氨爆破等方法使纤维素得以充分暴露，为期酶解创造条件。因此，在利用纤维素生产乙醇的过程中，都有一个与处理的过程，让纤维素物质暴露出来。
接下来纤维素的水解糖化，主要利用纤维素酶来完成。纤维素酶是一组能把纤维素分解成葡萄糖和其它化学物质的总称，已在食品，饲料等工业得到应用，尤其在纤维素转化燃料乙醇工业中显示出巨大的潜力。目前来说，纤维素酶价格较高，限制了它的广泛应用。纤维素酶的生产主要有固态发酵和液态发酵两种方式。固态发酵法具有设不备简单、投资少、成本低、见效快等优点已受到科学工作者的广泛青睐，是有效降低纤维素酶价格的途径之一。
纤维素糖化以后，接种酵母发酵。关于纤维素的发酵一般有下面几种发酵方式：分步水解发酵、同步糖化发酵、同步糖化共发酵和综合生物工艺。综合生物工艺与其它发酵模式不同之处，就是木质纤维素水解酶的生产与糖化和乙醇发酵在一个综合过程中。在木质纤维素水解糖化时，不需要额外添加单独生产的木质纤维素酶，水解酶和乙醇发酵组合在一个体系里，由一种微生物或一组微生物群体在一个体系里完成。由于综合生物工艺降低了产酶成本，又使整个发酵过程趋于集中和简化，因此发酵产纤维素乙醇的成本会大大降低。相关情况可见描述于例如，Lynd LR，van Zyl WH等人(2005)“Consolidated bioprocessing ofcellulosic biomass：an update”，Curr Opin Biotechnol 16(5)：577-583；和Lynd LR，LaserMS等人(2008)“How biotech can transform biofuels”，Nat Biotechnol 26(2)：169-172。目前研究较多的综合发酵方式，是利用代谢途径工程方法，在一种微生物中引进补充途径，完成整个代谢发酵过程。如在嗜纤维素细菌中，引进或完善乙醇代谢途径；或在产乙醇酵母中引进分泌产生木质纤维素酶的途径。相关研究文献如，Kotaka A，Bando H等人(2008)“Direct ethanol production from barley beta-glucan by sake yeast displayingAspergillus oryzae beta-glucosidase and endoglucanase”，J Biosci Bioeng.105(6)：622-627；Shaw AJ，Podkaminer KK等人(2008)“Metabolic engineering of athermophilic bacterium to produce ethanol at high yield”，Proc Natl Acad Sci USA.105(37)：13769-13774。由于微生物代谢过程十分复杂，目前的研究还需要进一步的完善才能够发挥更大的作用。另一种，利用群体发酵的综合生物工艺发酵方式，涉及到两个以上的微生物的共生，非预期因素很多，到目前为止，并没有很大的突破。
这些领域的研究进展为本发明提供了坚实基础。
我们基于此，分离得到一株高产耐热耐酸纤维素酶的土曲霉M11，并且利用它提出了新型综合生物方法发酵纤维乙醇的技术。该技术可以完全节省额外的酶生产和分步发酵过程，大大降低了乙醇的生产成本。
发明内容
本发明涉及一种微生物及其应用，特别涉及一株分离获得的可高产耐热耐酸纤维素酶的土曲霉菌株M11；以及一种改进型综合生物方法产纤维乙醇的技术，具体技术内容是利用高产耐热耐酸纤维素酶的土曲霉M11，将产酶、水解糖化、乙醇发酵等步骤整合到一个综合的发酵过程中。本专利将详细介绍此高产耐热耐酸菌株，及利用此菌株开发的新型发酵方法、技术细节等，还将介绍与一般的同步糖化发酵的差异及其技术优势。
发明的技术流程及可行性：
本发明首先涉及高产耐热耐酸木质纤维素酶的霉菌-土曲霉M11(Aspergillus terreusM11)。通过长期筛选，我们获得一株高产耐热耐酸纤维素酶的霉菌，菌落在PDA平板培养基上培养2天后以白色絮状向四周扩散，培养4天后变为沙褐色。镜检表明菌丝无隔膜，分生孢子球形，分生孢子梗微弯曲，光滑无色，顶囊球形，无菌核。结合其16S rDNA和23S rDNA基因间隔序列(ITS)鉴定结果(GenBank登录号：EF432562)，确定为土曲霉，命名为土曲霉M11。此菌株发酵产纤维素酶的酶学性质及发酵技术指标，我们已发表相关论文，如：Gao J，WengH等人(2008)“ Production and characterization of cellulolytic enzymes from thethermoacidophilic fungal Aspergillu
利用此高产耐热耐酸纤维素酶的土曲霉M11开发的综合生物技术发酵产乙醇方法，发明内容如下：将曲霉M11孢子直接接种到酸碱预处理过的木质纤维素中，进行固态发酵的培养。随着土曲霉M11在木质纤维素底物中的生长，产木质纤维素酶的量迅速增高。当其产木质纤维素酶量达到可有效糖化剩余木质纤维素底物时，快速升温和降低pH值，继续培养使土曲霉M11菌丝停止生长并逐渐死亡。这个过程中，纤维素酶在热酸环境实现了高效糖化，可检测还原糖浓度急剧升高。采用的升温和降低pH值条件，对其所产耐热耐酸木质纤维素酶破坏很小，可继续用于后续的发酵过程。
杀菌处理后，加水并调整温度与pH值，在无菌的条件下接种酿酒酵母，进入液体同步糖化发酵。起初，由于酶活较高，底物浓度较大，糖化过程产生的还原糖量大大高于酿酒酵母利用还原糖量的程度，随着酿酒酵母的大量生长，把还原糖转化为乙醇，还原糖量迅速下降，乙醇含量迅速上升。体系中的大量木质纤维素酶存在于酵母发酵环境中，又可实现同步糖化与发酵。
综上所述，将土曲霉M11固体发酵产耐热耐酸木质纤维素酶的步骤、木质纤维素糖化步骤与液体乙醇发酵步骤，整合成一步完成的新型综合生物方法，为更高效、经济的产纤维乙醇方法。此种方法是有效并且可行的。
发明的经济性及优越性：
本发明涉及到一株可产耐热耐酸纤维素酶的霉菌-土曲霉M11，其纤维素酶将具有广泛的应用价值。利用此株的综合生物发酵产乙醇的技术，在发酵培养基中加入土曲毒M11孢子产生纤维素酶进行后续进程的糖化和发酵，土曲霉M11孢子极其容易得到，因此生产成本很低。在预处理的木质纤维底物中，加入少量孢子，即可避免再加入价格昂贵的纤维素酶。从工业方面考虑可以大大提高生产效率，降低生产成本，是极其经济有效的。
与一般同步糖化发酵的差异和优点：
现在传统的乙醇生产方法都是以碳水化合物发酵为基础。在最典型的方法中，把来自谷类的碳水化合物水解得到其组分糖并且用酵母发酵产生乙醇。当前工业生产过程中，使用的是一般的同步糖化发酵，即首先把预处理好的纤维素底物(秸秆粉、废纸、木质植物纤维素粉)放入发酵罐后，利用高温蒸汽进行灭菌后。然后在无菌条件下加入纤维素酶和酵母、水，调整温度和pH值进行糖化发酵产生乙醇，通过过滤滤除物料渣，收集滤液。滤液通过蒸馏后，得到低浓度乙醇。
另一种连续同步糖化发酵，即用第一次发酵完成后，把含纤维素酶和酵母的液体菌种从发酵完成物中提出，在第二次发酵底物中加入从第一次提出的含纤维素酶和酵母的液体菌种进行发酵，发酵完成后处理方法同第一次发酵完成后的一样。连续同步糖化发酵好多次以后，当酶液的活性降到一定程度时，就必须添加新的酶液和新的菌种。
本发明在继承了以前的发酵技术基础上，做了一个重大的改良，即在纤维素糖化发酵生产乙醇的过程中不再添加价格昂贵的纤维素酶，这样就极大的降低了成本，取而代之是在纤维素糖化发酵生产乙醇的过程中，加入土曲霉M11进行菌体发酵生产纤维素酶，由于酶的产量高、活性高，完全可以满足纤维素糖化所需酶量。在纤维素酶产量达到最高时，通过降低pH值、升高温度。在这种热酸环境下，杀死土曲霉M11菌丝体。由于土曲霉M11发酵产生的纤维素酶具非常高的稳定性，热酸环境对其酶活性影响非常小。保证纤维素酶在进一步加入酵母后，用于后续的同步糖化与乙醇发酵的过程，而不至于因为纤维素酶活降低而影响发酵效率。
发明过程及其利用的关键技术和实施方法：
1.通过长期筛选工作，获得高产耐热耐酸纤维素酶的土曲霉M11，菌株保存编号CCTCC M209212。所产纤维素酶最适反应温度和酸碱度为60-65℃和pH 2-3，并且具有较高的热稳定性。最佳产酶发酵的固体发酵条件是：以普通高压蒸汽灭菌后的麸皮和0.8％的酵母提取物作为碳氮源，初始pH 3，加入基础盐溶液[(NH1)2SO4 3.5克/升，KH2PO4 3克/升，MgSO4.7H2O0.5克/升，CaCl2 0.5克/升]湿度保持在80％左右，接种106-107个孢子/公斤培养，培养温度为45℃。培养大约90小时后，产酶量达到最大值，最高产滤纸酶活可达240U左右。
2.综合生物技术发酵产乙醇技术：
(1)固体发酵培养：将预处理的木质纤维素或纸浆等物放灭菌，混入基础盐液体培养液，无菌下放在固体发酵床上。在向灭菌好的底物中接入土曲霉M11孢子溶液，接入孢子浓度约为106-107个孢子/公斤，保持40-45℃，初始pH3-4，湿度为90％，发酵时间为3天左右。
(2)杀真菌与预糖化：产酶发酵完成后，加入两倍体机水溶液至发酵罐，升高温度至60℃到65℃之间，同时降低pH值至2.0，处理20-24小时，可有效杀死土曲霉M11。这个温度使耐高温耐酸的纤维素酶活性很高，高效水解糖化木质纤维素底物。由于死亡的土曲霉不再利用水解产物，使还原糖浓度急剧升高，此步还原糖产率可达50％。
(3)同步糖化发酵产乙醇：发酵液降低温度至30度左右，调整pH值至4-5左右，接种活性为50-60亿/g的普通酿酒酵母，同步糖化与发酵，发酵时间为3天左右。
(4)蒸馏：发酵完成后，通入高温高压蒸汽蒸馏发酵物，蒸汽温度为121℃-128℃，压力为0.121Mpa-0.130Mpa，蒸馏时间为2.5小时，使乙醇蒸出，乙醇包含在蒸出的水蒸气中，用冷却器冷却，即可得到低浓度的乙醇，乙醇产率可达70％左右。
(5)排渣：从发酵罐中排出蒸馏过的废渣。
(6)废渣的再利用：继续进行下一次发酵，排出的废渣经高温干燥处理后可以用于制造饲料。
综合生物技术发酵流程：见说明书附图1。

Claims (9)

1.一株高产耐热酸纤维素酶的曲霉及纤维素乙醇的新综合生物发酵方法，包括以下几个方面：
(1)在长年高温秸秆堆肥中分离得到一株高产纤维素酶的土曲霉，菌株编号M11。利用木质纤维素固体发酵，45℃、pH3、90％的湿度情况下，玉米秆和0.8％酵母提取物分别为碳、氮源时，每克碳源可产生581U的内切葡聚糖酶活性，243U的滤纸酶活性，128U的β-葡萄糖苷酶活性。所产纤维素酶在pH2-3，温度60-65℃具有最高酶活性。
(2)利用此菌进行纤维素乙醇发酵的新方法
①固体发酵底物产酶培养：将预处理的木质纤维素或纸浆等高温灭菌处理，混入基础盐培养液，无菌下放在固体发酵床上。在向灭菌好的底物中接入土曲霉M11孢子悬液，接入孢子浓度约为106-107个孢子/公斤，保持40-45℃，初始pH3-4，湿度为90％，发酵时间为3天左右。
②抑菌与预糖化：产酶发酵完成后，加入两倍体机水溶液至发酵罐，升高温度至60℃到65℃之间，同时降低pH值至2.0，处理20-24小时，有效杀死产酶真菌土曲霉M11。耐热耐酸纤维素酶可以同时高效水解糖化木质纤维素底物，使还原糖浓度急剧升高。
③同步糖化发酵产乙醇：发酵液降低温度至30度左右，调整pH值至4-5左右，接种活活性为50-60亿/g的普通酿酒酵母，接入量为纤维底物量的0.6-0.7％进行发酵，发酵时间为3天。
2.根据权利要求1所述，获得高产耐热耐酸纤维素酶的土曲霉M11，其特征在于：土曲霉M11是保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO：M 209212。
3.根据权利要求1所述，获得高产耐热耐酸纤维素酶的土曲霉M11，其特征在于：菌株所产纤维素酶在pH2-5有较高酶活性，70℃具有最高酶活性。
4.根据权力要求1所述，纤维素乙醇新发酵方法，其特征在于：使用高产耐热耐酸的纤维素酶菌株-土曲霉M11作为产酶发酵菌株来生产纤维乙醇。
5.根据权利要求1所述，纤维素乙醇新发酵方法，其特征在于：利用产纤维素酶真菌在固体纤维底物上直接发酵产酶，然后进行糖化，此过程是通过添加微生物孢子来实现对纤维底物的糖化。
6.根据权利要求1所述，纤维素乙醇新发酵方法，其特征在于：土曲霉M11固体发酵，接入孢子浓度约为106-107个孢子/公斤，保持40-45℃，初始pH3-4，湿度为90％，发酵3天。
7.根据权利要求1所述，纤维素乙醇新发酵方法，其特征在于：固体产酶发酵产酶完成后，利用变温方法杀死或抑制产酶真菌的生长，升高温度至60℃到65℃之间，处理12-24小时。
8.根据权利要求1所述，纤维素乙醇新发酵方法，其特征在于：发酵液降低温度至30度左右，调整pH值至4-5左右，接种酵母继续发酵。
9.根据权利要求1所述，纤维素乙醇新发酵方法，其特征在于：接种活活性为50-60亿/g的普通酿酒酵母，接入量为纤维底物量的0.6-0.7％进行发酵产乙醇。
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