CN102041235A - 一株耐高温酿酒酵母菌及其应用 - Google Patents

一株耐高温酿酒酵母菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于纤维素发酵生产燃料乙醇的酿酒酵母菌菌及其应用。该菌株为酿酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae FE-B，于2008年11月10日保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC No.2735。本发明的酿酒酵母菌是从米酒酒曲中筛选出来的。该菌株耐受温度高达36～44℃、乙醇产率高、可发酵糖范围广，特别适用于木质纤维素SSF工艺制备燃料乙醇的过程中，能够有效降低纤维素酶的使用量，从而降低了纤维素乙醇的生产成本。

Description

一株耐高温酿酒酵母菌及其应用
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，具体的说涉及一株耐高温酿酒酵母菌及其发酵秸秆生产乙醇的应用方法。
背景技术
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)不仅可以用来酿造各种酒类，也被广泛应用于医药、化工、食品、农业及国防等工业用乙醇生产。特别是随着化石液体燃料石油的日益枯竭，燃料乙醇越来越受到世界各国的重视。燃料乙醇是清洁的高辛烷值燃料，可由再生能源生产。例如，最基本的是利用农作物如谷物等生产酒精；也可以利用木质纤维素来制备乙醇。
传统酿酒酵母的乙醇发酵温度为28～33℃，一般不超过36℃。这一限制因素增加了乙醇的生产成本。由于淀粉的糖化或纤维素的酶解步骤需要在较高的温度(40～60℃)进行，所以通常在乙醇发酵过程中淀粉的糖化或纤维素的酶解与乙醇发酵不能在同一个反应器中同时进行，传统的乙醇发酵工业是采用先在40-60℃的温度条件下糖化，再把温度降到28～33℃接种酵母菌进行乙醇发酵。这势必要延长乙醇发酵时间，浪费一部分热能，增加乙醇生产的成本。
使用耐热酵母不仅有利于降低生产水耗、电耗，缩短生产周期，而且可以改变传统的先糖化后发酵的工艺过程，采取原料不经预先糖化，直接进入发酵，糖化和发酵在一个反应器中同时进行的生产工艺(即同步糖化发酵工艺，SSF)。SSF过程使发酵液中可发酵性糖的含量始终保持在较低水平，发酵过程比较平稳。SSF过程既免去了糖化工序，又削减了水解产物对糖化酶的反馈抑制，也降低了高浓度糖底物对酵母菌的抑制作用，因而使得乙醇产率较高(刘振，王金鹏，张立峰，等.木薯干原料同步糖化发酵生产乙醇.过程工程学报，2005，5(3)：353-356)。已经有报道，啤酒酵母突变体能够耐受的最高温度为33-35℃(Morimura S，Ling Z L&Kida K.Ethanol production by repeated-batchfermentation at high temperature in a molasses medium containing a high concentrationof total sugar by a thermotolerant flocculatation yeast with improved salt-tolerance.JFerment Bioeng.1997，(83)：271-274)。刘畅等筛选到一株耐高温酵母菌B-2，其最适发酵温度为37℃(刘畅，王涛，石翠芳.耐高温酵母菌的筛选及特性研究.酿酒.34(2)：52-54)。
虽然已经筛选出很多耐高温酵母菌，他们的应用给企业带来了较大的经济效益，但是这些耐高温菌最适产乙醇的温度还不够高，用于SSF过程明显降低了糖化的速率，特别是在木质纤维素SSF工艺制备燃料乙醇过程中，降低糖化温度会大大增加纤维素酶的成本，因此筛选耐受温度更高的酿酒酵母意义重大。
随着我国燃料乙醇的逐步普及，2007年9月，国家发改委出台《关于促进玉米深加工业健康发展的指导意见》，要求不再建设新的以玉米为主要原料的燃料乙醇项目，并大力鼓励发展以非粮作物为原料开发燃料乙醇。为了能够进一步降低燃料乙醇，特别是纤维乙醇的生产成本，迫切需要一株能够耐受更高温度和乙醇产率的乙醇发酵菌株用于燃料乙醇SSF工艺过程。
发明内容
本发明的目的在于克服传统乙醇发酵菌株的缺点，提供一株从米酒酒曲中筛选出来的，最高能够耐受36～44℃生产乙醇，乙醇产率高，可发酵糖范围广的耐高温酿酒酵母菌株，以及该菌株在燃料乙醇生产中的应用。
本发明提供的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae FE-B是从米酒酒曲中筛选出来的，已于2008年11月10日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”(简称CGMCC)，其保藏号为CGMCC NO.2735。
本发明的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae FE-B的主要形态特征如下：麦芽汁液体培养基中培养，25℃培养3d后，细胞呈球形、卵形至椭圆形，大小为(3.6～7.2)×(6.0～7.6)微米，有沉淀形成。麦芽汁琼脂斜面上培养，25℃培养一个月，菌落奶酪状，乳白包，表面平滑，反光，边缘整。玉米粉琼脂Dalmau平板培养物假菌丝产生。
本发明的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae FE-B的理化实验结果见表1(“+”代表可，“-”代表否)。
表1酿酒酵母FE-B的理化实验结果
本发明提供的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae FE-B培养液的OD值与菌体浓度(C，单位：g DCW/L)之间的关系，见图1，回归得方程：C＝0.4105×OD×N，N为测定OD时的稀释倍数。
本发明提供的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae FE-B可以在24～44℃条件下生长，能够在24～44℃条件下发酵葡萄糖生产乙醇。
本发明的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae FE-B可发酵乙醇的糖类包括葡萄糖，蔗糖，甘露糖，半乳糖，麦芽糖等等，其中木质纤维素水解单糖仅阿拉伯糖和木糖不能被发酵成乙醇。
本发明的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiaeFE-B可以用于任何淀粉和非淀粉多糖的水解单糖发酵生产乙醇的过程中，优选FE-B用于木质纤维素水解单糖的同步糖化与发酵过程。
本发明的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae FE-B菌株在温度为32℃～44℃，酶加入量5-10IU/g(秸秆干基)条件下进行同步糖化与发酵时能够连续生产乙醇，无葡萄糖的积累，乙醇产生速率随温度上升而递增。
利用本发明的FE-B菌株在温度为32℃～44℃条件进行同步糖化与发酵，相同时间内纤维素的水解率随温度上升呈递增趋势。
利用本发明的FE-B菌株进行同步糖化与发酵时间为48～96h，优选糖化发酵时间为72h，72h内纤维的水解率(RH)与温度(T)呈正比：RH＝3.04T-36.20(R平方值为0.9965)。
与现有技术相比较，本发明的有益效果是：
(1)本发明提供的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae FE-B菌株适产乙醇的温度大幅提高到36～44℃，而最适产乙醇的温度高达38～42℃。本发明菌株用于木质纤维素SSF工艺制备燃料乙醇过程中，糖化与发酵在同一反应器中同时进行，温度最高可提高到44℃，基本上没有葡萄糖和纤维二糖的积累，可以有效降低糖化过程中葡萄糖和纤维二糖等水解产物的积累对纤维素酶的抑制作用，大幅度降低纤维素酶的使用量，从而降低纤维素酶的使用成本，节省反应时间，减少设备投资成本，最终降低了纤维素乙醇的生产成本。
(2)本发明的菌株可以耐受高浓度的乙醇以及生物质原料预处理过程产生的抑制物，并且能够在较高的固含量下发酵生产乙醇，提高了发酵终止时发酵液的乙醇浓度，降低了下一步乙醇精馏的能耗，降低了生产成本，从而向着纤维素乙醇的工业化又迈进了一大步。
生物材料保藏说明
本发明提供的Saccharomyces cerevisiae FE-B菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMCC No.2735；保藏日期：2008年11月10日。
附图说明
图1为FE-B培养液OD值与菌体浓度关系曲线；
图2为FE-B在28℃、36℃和40℃条件下的生长曲线；
图3为FE-B利用葡萄糖为原料配制培养基，在28℃、36℃、42℃和48℃条件下发酵72h后，发酵液中葡萄糖、乙醇和乙酸浓度；
图4为同步糖化发酵简易反应器；
图5为32℃同步糖化发酵葡萄糖，木糖和乙醇浓度随时间趋势；
图6为32～36℃温度同步糖化与发酵过程乙醇随时间变化趋势；
图7为36～41℃同步糖化与发酵过程乙醇随时间变化趋势。
具体实施方式
本发明Saccharomyces cerevisiae FE-B菌株的筛选过程为：
取1g米酒酒曲，接种到50mL酵母膏胨葡萄糖培养基(YPD)中，32℃静置培养过夜；取过夜培养物100μL，涂布于YPD琼脂平板，32℃培养48h，挑选单菌落接种于YPD斜面。共挑选了10株单菌落，选取其中乙醇产率最高的菌落编号为FE-B，然后送CGMCC鉴定并保藏。
本发明的Saccharomyces cerevisiae FE-B菌株用于SSF工艺发酵秸秆生产乙醇的方法为：
(1)酵母菌株驯化：逐步提高培养温度进行培养，挑选在44℃条件生长良好，乙醇产率较高的单菌落接种YPD斜面，44℃培养1-3d后放置4℃冰箱备用。
(2)发酵种子的制备：从4℃冰箱取出FE-B斜面，利用接种环刮取1-2环菌泥接种于摇瓶培养基(YPD)中，44℃静置培养1-3d备用。
(3)种子的扩大培养：取上述培养24h的摇瓶培养种子，转接到适当大小的发酵罐培养基(YPD)中，44℃，间歇搅拌培养1-3d备用。
(4)接种与发酵：往糖化与发酵反应器中依次加入预处理的木质纤维素，5-10IU/mL的纤维素酶，5％-20％的酵母种子，自来水，控制反应器的温度为36-44℃，pH值4.5-5.5反应2-4d。
YPD培养基组成：葡萄糖，2％；蛋白胨，2％；酵母膏，1％。
以下提供本发明的Saccharomyces cerevisiae FE-B菌株在发酵秸秆生产乙醇中的具体应用。
实施例1
取1L的双层玻璃反应器(见图4)，加入300mL柠檬酸缓冲液，50g蒸汽爆破预处理玉米秸秆，5g酵母粉，灭菌。同时配制50mL YPD培养基，接种FE-B酵母，过夜培养。
往灭菌的双层玻璃反应器中加入150mL纤维素酶液(滤纸酶活约2.3IU/mL，6.9IU/g秸秆干基)，接入过夜培养的50mL酵母菌。32℃，150rpm机械搅拌，结果见图5。在168h之前，体系中的乙醇浓度以比较恒定的速率增加(0.2264％/d，500mL的体系，所以每天体系中产生1.132g)，192h后体系中的乙醇浓度为1.96％。
实施例2
取3个1L的双层玻璃反应器(见图4)，分别加入150mL柠檬酸缓冲液，50g蒸汽爆破预处理玉米秸秆，2.5g酵母粉，灭菌。同时配制3瓶50mL YPD培养基于500mL三角瓶中，灭菌，接种FE-B酵母，过夜培养。
往灭菌的3个双层玻璃反应器中分别加入300mL纤维素酶液(滤纸酶活4.25IU/mL，7.5IU/g干物料)，接入过夜培养的50mL酵母菌。
3个双层玻璃反应器分别标号为A，B和C。A，B和C分别在32℃、34℃和36℃，150rpm机械搅拌培养，见图6。经过72h发酵，体系中的乙醇浓度分别为1.46％、1.68％和1.78％，纤维素水解率分别为60.6％，69.8％和73.9％。FE-B可以耐受36℃温度进行同步糖化与发酵，36℃条件产生乙醇的浓度比34℃条件提高6％，比32℃条件提高21.9％。
实施例3
取4个1L的双层玻璃反应器(见图4)，分别加入150mL柠檬酸缓冲液，50g蒸汽爆破预处理玉米秸秆，2.5g酵母粉，灭菌。同时配制4个50mL YPD培养基于500mL三角瓶中，灭菌，接种FE-B酵母，过夜培养。
往灭菌的3个双层玻璃反应器中分别加入300mL纤维素酶液(7.5IU/g干物料)，接入过夜培养的50mL酵母菌。
4个双层玻璃反应器分别标号为A，B，C和D。A，B，C和D分别在36℃，38℃和40℃和41℃；150rpm机械搅拌培养，见表图7。FE-B可以耐受41℃温度进行同步糖化与发酵，并且没有葡萄糖的积累。经过72h糖化与发酵，36℃，38℃和40℃和41℃中的乙醇浓度分别为1.79％，1.86％，2.07％和2.11％，纤维素水解率分别为73.9％，77.2％，86％和87.6％。41℃体系中的乙醇浓度较36℃条件乙醇的浓度增加17.9％，72h纤维酶解率达到87.6％。
实施例4
取1L的双层玻璃反应器(见图4)，加入150mL柠檬酸缓冲液，100g蒸汽爆破预处理玉米秸秆，2.5g酵母粉，灭菌。同时配制50mL YPD培养基于500mL三角瓶中，灭菌，接种FE-B酵母，过夜培养。
往灭菌的双层玻璃反应器中加入300mL纤维素酶液(7.5IU/g干物料)，接入过夜培养的50mL酵母菌。于42℃条件进行同步糖化与发酵，72h后体系中的乙醇浓度为4.3％。
实施例5
取1L的双层玻璃反应器(见图4)，加入150mL柠檬酸缓冲液，150g蒸汽爆破预处理玉米秸秆，2.5g酵母粉，灭菌。同时配制50mL YPD培养基于500mL三角瓶中，灭菌，接种FE-B酵母，过夜培养。
往灭菌的双层玻璃反应器中加入300mL纤维素酶液(7.5IU/g干物料)，接入过夜培养的50mL酵母菌。于42℃条件进行同步糖化与发酵，72h后体系中的乙醇浓度为6.5％。
实施例6
取1L的双层玻璃反应器(见图4)，加入150mL柠檬酸缓冲液，150g蒸汽爆破预处理玉米秸秆，2.5g酵母粉，灭菌。同时配制50mL YPD培养基于500mL三角瓶中，灭菌，接种FE-B酵母，过夜培养。
往灭菌的双层玻璃反应器中加入300mL纤维素酶液(7.5IU/g干物料)，接入过夜培养的50mL酵母菌。于42℃条件进行同步糖化与发酵。24h和48h分别补加蒸爆预处理玉米秸秆50g。72h后体系中的乙醇浓度为8.6％。
实施例7
往15L发酵罐中加入3L柠檬酸缓冲液，3kg蒸汽爆破预处理玉米秸秆，50g酵母粉，灭菌。同时配制1L YPD培养基于3L三角瓶中，灭菌，接种FE-B酵母，过夜培养。
往15L发酵罐中加入10IU/g秸秆干基的纤维素酶，接入过夜培养的1L酵母菌。于42℃条件进行同步糖化与发酵。24h和48h分别补加蒸爆预处理玉米秸秆1kg。72h后体系中的乙醇浓度为8.5％。
实施例8
利用10m3发酵罐进行同步糖化与发酵，往发酵罐中加入1.5m3柠檬酸缓冲液，1.5吨蒸汽爆破预处理玉米秸秆，25kg酵母粉，灭菌。同时于1m3发酵罐中配制500L YPD培养基，灭菌，接种FE-B酵母，过夜培养。
往灭菌的10m3发酵罐中加入10IU/g秸秆干基的纤维素酶，接入过夜培养的500L酵母菌，于42℃条件进行同步糖化与发酵；24h和48h分别补加蒸爆预处理玉米秸秆0.5吨，72h后体系中的乙醇浓度为8％。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110>中国石油化工股份有限公司
     中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院
<120>一株耐高温酿酒酵母菌及其应用
<130>新专利申请
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>577
<212>DNA
<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400>1
acatgctttg cagcatcctt gacttacgtc gcagtcctca gtcccagctg gcagtattcc    60
cacaggctat aatacttacc gaggcaagct acattcctat ggatttatcc tgccaccaaa    120
actgatgctg gcccagtgaa atgcgagatt cccctaccca caaggagcag agggcacaaa    180
acaccatgtc tgatcaaatg cccttccctt tcaacaattt cacgtacttt ttcactctct    240
tttcaaagtt cttttcatct ttccatcact gtacttgttc gctatcggtc tctcgccaat    300
atttagcttt agatggaatt taccacccac ttagagctgc attcccaaac aactcgactc    360
ttcgaaggca ctttacaaag aaccgcactc ctcgccacac gggattctca ccctctatga    420
cgtcctgttc caaggaacat agacaaggaa cggccccaaa gttgccctct ccaaattaca    480
actcgggcac cgaaggtacc agatttcaaa tttgagcttt tgccgcttca ctcgccgtta    540
ctaaggcaat cccggttggt ttcttttcct ccgcttt                             577

Claims (5)

1.一株酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)FE-B，CGMCC NO.2735。
2.按照权利要求1所述的酿酒酵母菌，其特征在于该酿酒酵母菌的26SrDNA D1/D2的基因序列为：
ACATGCTTTGCAGCATCCTTGACTTACGTCGCAGTCCTCAGTCCCAGCTGGCAGTATTCCCACAGGCTATAATACTTACCGAGGCAAGCTACATTCCTATGGATTTATCCTGCCACCAAAACTGATGCTGGCCCAGTGAAATGCGAGATTCCCCTACCCACAAGGAGCAGAGGGCACAAAACACCATGTCTGATCAAATGCCCTTCCCTTTCAACAATTTCACGTACTTTTTCACTCTCTTTTCAAAGTTCTTTTCATCTTTCCATCACTGTACTTGTTCGCTATCGGTCTCTCGCCAATATTTAGCTTTAGATGGAATTTACCACCCACTTAGAGCTGCATTCCCAAACAACTCGACTCTTCGAAGGCACTTTACAAAGAACCGCACTCCTCGCCACACGGGATTCTCACCCTCTATGACGTCCTGTTCCAAGGAACATAGACAAGGAACGGCCCCAAAGTTGCCCTCTCCAAATTACAACTCGGGCACCGAAGGTACCAGATTTCAAATTTGAGCTTTTGCCGCTTCACTCGCCGTTACTAAGGCAATCCCGGTTGGTTTCTTTTCCTCCGCTTT。
3.权利要求1所述的酿酒酵母菌在淀粉和非淀粉多糖的水解单糖发酵生产乙醇过程中的应用。
4.权利要求1所述的酿酒酵母菌在木质纤维素发酵生产乙醇过程中的应用。
5.权利要求1所述的酿酒酵母菌在秸秆发酵生产乙醇过程中的应用。
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