CN112852649A - 一株耐高温的生产纤维素乙醇的酿酒酵母菌株及其发酵应用 - Google Patents

一株耐高温的生产纤维素乙醇的酿酒酵母菌株及其发酵应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物应用技术领域，公开了一株耐受高温的生产纤维素乙醇的酿酒酵母及其发酵应用。其分类命名为酿酒酵母Z100(Saccharomyces cerevisiae Z100)，保藏编号为CGMCCNo 17734，保藏日期为2019年05月08号，保藏地址为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。酿酒酵母Z100可以在50℃高温条件下进行生长以及纤维素乙醇发酵，发酵乙醇浓度接近玉米淀粉发酵指标。利用该菌株进行纤维素乙醇发酵，不仅可以提高发酵效率、降低冷却成本，而且可以实现同步糖化共发酵中发酵温度与糖化温度的匹配，进一步缩短发酵周期，具有良好的工业化应用价值。

Description

一株耐高温的生产纤维素乙醇的酿酒酵母菌株及其发酵应用
技术领域
本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及一株耐高温的生产纤维素乙醇的酿酒酵母菌株及其发酵应用。
背景技术
木质纤维素生物质具有价格低廉、来源广泛等优点，利用木质纤维素替代玉米淀粉等粮食作物用于生产燃料乙醇具有巨大优势。
木质纤维素生物质中的纤维素需要通过纤维素酶酶解糖化从而释放可发酵性糖，用于纤维素乙醇的生产。纤维素物料酶解糖化的最适温度为50℃，常规乙醇生产菌株的发酵温度仅为30℃。利用木质纤维素生产乙醇通常是采用同步糖化共发酵的方式，而发酵菌株较低的温度耐受性使得该操作只能在菌株能够耐受的较低温度下进行。较低温度下进行的同步糖化与发酵操作，不仅大幅度降低了纤维素酶的酶活和纤维素酶解效率，而且加大了工业乙醇生产过程中的冷却成本和发酵周期。另外，工业生产中的乙醇发酵罐发酵体积巨大(可达数千立方米)，发酵产生的热量经常不能及时释放，发酵罐内易出现局部过热的问题(局部温度高达50℃)，会造成大量菌体的死亡，从而降低了发酵过程中的乙醇生产速率，增加了生产成本。因此，获得一株可以耐受高温的纤维素乙醇发酵菌株，不仅可以提高发酵效率、降低冷却成本，而且可以实现同步糖化共发酵中发酵温度与糖化温度的匹配，进一步缩短发酵周期。
发明内容
本发明的目的在于提供一株耐高温的生产纤维素乙醇的酿酒酵母菌株及其发酵应用。
本发明技术方案：
本发明提供一株耐高温的生产纤维素乙醇的酿酒酵母菌株Saccharomycescerevisiae Z100，CGMCC No.17734；该酿酒酵母菌株的保藏单位是中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏日期为2019年5月8日，由华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室培养制得。
本发明还提供一种所述耐高温的生产纤维素乙醇的酿酒酵母菌株在纤维素乙醇生产上的应用。
本发明还提供一种所述耐高温的生产纤维素乙醇的酿酒酵母菌株的发酵应用方法，包括以下步骤：
(1)所述菌株的培养基包括碳源、氮源，pH 3.5-6.5；
(2)所述菌株的发酵温度为30-50℃；
(3)所述菌株在木质纤维素水解液中经过扩大培养后以1％-20％的接种量接入到发酵罐中进行50℃条件下的乙醇发酵。
进一步，在所述的步骤(1)中，碳源为固含量为5％-35％(干固)玉米秸秆、麦秆、水稻秸秆等木质纤维素生物质酶促水解后的生物质水解液。
更进一步，所述生物质水解液含有以质量百分比计0.5％-12％葡萄糖、0.2％-6％木糖以及0.02％-1％阿拉伯糖等多种单糖。
进一步，在所述的步骤(1)中，氮源为0.5％-3％(质量百分比)的玉米浆或者玉米干酒糟(DDGS)。
进一步，在所述的步骤(3)中，扩大培养的方法如下：将保藏于-80℃的冻存管接种至5-20mL YEPD培养基中，30-35℃，150-200rpm培养8-12h后得到一级种子液；以5％-10％(质量百分比)接种量接种至5％-10％固含量总液体20-50mL的预处理并脱毒后的麦秆中，加入10-15mg纤维素酶粗蛋白/g纤维素的纤维素酶，30℃，200rpm培养8-12h后得到二级种子液；再以5％-10％接种量接种至15％固含量总液体100-200mL的预处理并脱毒后的麦秆中，酶用量为10-15mg纤维素酶粗蛋白/g纤维素，30℃，200rpm培养20-24h后得到三级种子液。
进一步，在所述的步骤(3)中，乙醇发酵的步骤如下：预处理并脱毒的麦秆以25％-35％(质量百分比)的初始固含量进行预糖化，50℃，150rpm预糖化4h后以1％-20％(质量百分比)的接种量接入三级种子液以及营养盐，50℃高温条件下进行菌株生长以及乙醇发酵。
进一步，所述YEPD培养基包括10-20g/L葡萄糖、5-10g/L酵母提取物、5-10g/L蛋白胨。
进一步，营养盐为1-2g/L磷酸二氢钾、1-2g/L硫酸铵、0.5-1g/L硫酸镁以及5-30g/L玉米浆或者DDGS。
本发明所述的耐高温的生产纤维素乙醇的酿酒酵母菌株的发酵应用方法，预处理的方法是干酸预处理，预处理条件为：浓硫酸用量为木质纤维素原料干重的1％-8％，在150-200℃下处理1-15min。
本发明所述的耐高温的生产纤维素乙醇的酿酒酵母菌株的发酵应用方法，脱毒的方法为固态生物法移除抑制物，脱毒条件为：利用酸中和剂氢氧化钙或碳酸钙等将预处理物料pH调至4.0-7.0，接入树脂枝孢霉Amorphotheca resinae ZN1置在脱毒反应器内，温度控制为25-35℃，在0.5-1.5vvm的通气量条件下脱毒24-72h。
根据本发明所述耐高温的生产纤维素乙醇的酿酒酵母菌株的适应性进化方法，适应性进化方法如下：25％-30％(质量百分比)固含量的预处理并脱毒木质纤维素物料加入5-10mg纤维素酶粗蛋白/g纤维素的纤维素酶糖化8h-12h后，将酿酒酵母菌株以5％-10％(质量百分比)接入进行连续转接培养，培养温度为35-40℃，转速150-200rpm，培养时间为20h-24h。
发明详述：
本发明提供一株可以耐高温的生产纤维素乙醇的酿酒酵母及其发酵应用，包括以下步骤：
(1)该菌株分类命名为酿酒酵母Z100(S.cerevisiae Z100)，保藏日期为，保藏编号为CGMCCNo 17734。
(2)该菌株的培养基包括碳源(利用木质纤维素生物质制备的水解液)、氮源(廉价的玉米浆或者玉米干酒糟)，pH 3.5-6.5。
(3)该菌株的发酵温度为30-50℃。
(4)该菌株在木质纤维素水解液中经过扩大培养后以1％-20％的接种量接入到发酵罐中进行50℃条件下的乙醇发酵。
在上述的步骤(2)中，碳源为固含量为5％-35％(干固)玉米秸秆、麦秆、水稻秸秆等木质纤维素生物质酶促水解后的生物质水解液。氮源为0.5％-3％的玉米浆或者玉米干酒糟(DDGS)。
在上述的步骤(4)中，扩大培养的优选方法如下：将保藏于-80℃的冻存管接种至20mLYEPD培养基(优选为20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨)中，30℃，200rpm培养12h后得到一级种子液；以5％-10％接种量接种至5％固含量总液体50mL的预处理并脱毒后的麦秆中，加入10-15mg纤维素酶粗蛋白/g纤维素的纤维素酶，30℃，200rpm培养12h后得到二级种子液；再以5％-10％接种量接种至15％固含量总液体200mL的预处理并脱毒后的麦秆中，酶用量为10-15mg纤维素酶粗蛋白/g纤维素，30℃，200rpm培养24h后得到三级种子液。
乙醇发酵的步骤优选如下：预处理并脱毒的麦秆以30％的初始固含量进行预糖化，50℃，150rpm预糖化4h后接入三级种子液以及营养盐(优选为2g/L磷酸二氢钾、2g/L硫酸铵、1g/L硫酸镁以及10g/L玉米浆或者DDGS)，50℃高温条件下进行菌株生长以及乙醇发酵。
目前已有的利用酿酒酵母进行纤维素乙醇发酵大部分是在30℃左右进行的。通常情况下，预处理并脱毒的木质纤维素原料在发酵罐中要经过长达12h的预糖化，然后需要大量的冷却水将发酵罐冷却至30℃后接入发酵菌株，这个过程会造成大量的冷却成本，并且会延长发酵的周期。利用木质纤维素生产乙醇通常是采用同步糖化共发酵的方式，糖化温度与发酵温度的不匹配会严重影响纤维素酶的酶活和纤维素的酶解效率，进而影响最终的乙醇产量。另外，大型的纤维素乙醇发酵罐容量高达上千升，木质纤维素糖化液较黏稠，导致整个设备传热困难，很容易造成局部温度过热(局部温度高达50℃)，从而对发酵菌株的生长造成严重的干扰，影响工业化乙醇发酵的乙醇生产速率以及乙醇产量。因此，提高菌株的耐高温性能，不仅可以减少冷却成本、缩短发酵周期，而且可以避免局部温度过高对菌株造成伤害，并实现最终的糖化温度与发酵温度的相匹配，进一步加快乙醇生产速率。为了增强菌株的耐高温性能，我们通过长期的适应性进化策略对原始菌株在高温环境下进行适应性驯化，获得了一株能够在50℃高温下进行生长以及乙醇生产的酿酒酵母Z100。
利用该菌株进行纤维素乙醇生产有如下优点：
(1)该菌株具有良好的耐高温性能，在50℃的高温下能够生长并生产乙醇；
(2)该菌株对于酸预处理后的木质纤维素生物质体系具有良好的适应能力，利用预处理并脱毒的玉米秸秆或者麦秆等木质纤维素生物质，在30％高固含量下进行发酵，发酵乙醇浓度接近玉米淀粉发酵指标。
生物保藏说明：
酿酒酵母菌株，其分类命名为酿酒酵母Z100(Saccharomyces cerevisiae Z100)，保藏编号为CGMCC No 17734，保藏日期为2019年05月08号，保藏地址为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。
附图说明
图1高温同步糖化共发酵案例一。
图2高温同步糖化共发酵案例二。
图3高温同步糖化共发酵案例三。
具体实施方式
以下实施例以便更好地理解本发明，并不限定本发明。下述实施方法中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的。
本发明所述耐高温的生产纤维素乙醇的酿酒酵母菌株的适应性进化方法如下：25％(质量百分比)固含量的预处理并脱毒木质纤维素物料加入5mg纤维素酶粗蛋白/g纤维素的纤维素酶糖化12h后，将酿酒酵母菌株以10％(质量百分比)接入进行连续转接培养，培养温度为35℃，转速200rpm，培养时间为24h。
实施例1高温同步糖化共发酵案例一
酿酒酵母Z100在5L发酵罐中进行50℃同步糖化共发酵12h，考察该菌株的耐高温性能。原料为麦秆，经过酸预处理后，Ca(OH)2调节物料pH至5.0-5.5之间，接入树脂枝孢霉Amorphotheca resinae ZN1在脱毒反应器内进行抑制物的脱除，脱毒两天后的物料作为原料用于乙醇发酵。同步糖化共发酵在5L生物反应器中进行，以脱毒后的麦秆为原料，固含量为30％，酶用量为10mg纤维素酶粗蛋白/g纤维素，在50℃，150rpm预糖化4h后，以20％的接种量接入培养好的三级种子液以及营养盐(2g/L磷酸二氢钾、2g/L硫酸铵、1g/L硫酸镁以及10g/L DDGS)开始同步糖化共发酵，用4M NaOH控制pH为5.5；50℃同步糖化共发酵12h后不再控制温度，发酵体系温度自然降温至30℃。结果如附图1所示，其中CFU(Colony-FormingUnits)表示在单位体积中的酿酒酵母的菌落总数；在整个的同步糖化共发酵期间，该菌株能够保持较高的生物活性以及乙醇生产能力，最终的乙醇产量可以达到玉米淀粉的发酵指标。
实施例2高温同步糖化共发酵案例二
酿酒酵母Z100在5L发酵罐中进行50℃同步糖化共发酵24h，考察该菌株的耐高温性能。同步糖化共发酵在5L生物反应器中进行，以经过酸预处理并生物脱毒两天后的麦秆作为原料用于乙醇发酵，固含量为30％，酶用量为10mg酶蛋白/g纤维素，在50℃，150rpm预糖化4h后以20％的接种量接入培养好的三级种子液以及营养盐(2g/L磷酸二氢钾、2g/L硫酸铵、1g/L硫酸镁以及10g/L DDGS)开始同步糖化共发酵，用4M NaOH控制pH为5.5；50℃同步糖化共发酵24h后不再控制温度，发酵体系温度自然降温至30℃。结果如附图2所示，在整个的同步糖化共发酵期间，菌株能够维持较高的生物活性以及乙醇生产能力，最终的乙醇产量可以达到玉米淀粉的发酵指标。
实施例3高温同步糖化共发酵案例三
酿酒酵母Z100在5L发酵罐中进行50℃同步糖化共发酵48h，考察该菌株的耐高温性能。同步糖化发酵在5L生物反应器中进行，以经过酸预处理并生物脱毒两天后的麦秆作为原料用于乙醇发酵，固含量为30％，酶用量为10mg纤维素酶粗蛋白/g纤维素，在50℃，150rpm预糖化4h后，以20％的接种量接入培养好的三级种子液以及营养盐(2g/L磷酸二氢钾、2g/L硫酸铵、1g/L硫酸镁以及10g/L DDGS)开始同步糖化共发酵，用4M NaOH控制pH为5.5；50℃同步糖化共发酵48h后不再控制温度，发酵体系温度自然降温至30℃。结果如附图3所示，在整个的同步糖化共发酵期间，菌株能够保持较高的生物活性以及乙醇生产，最终的乙醇产量可以达到玉米淀粉的发酵指标。
上述实施例中，预处理的方法是干酸预处理，预处理条件为：浓硫酸用量为木质纤维素原料干重的4％，在175℃下处理5min。脱毒的方法为固态生物法移除抑制物，脱毒条件为：利用酸中和剂氢氧化钙将预处理物料pH调至5.5，接入树脂枝孢霉Amorphothecaresinae ZN1置于脱毒反应器内，温度控制为28℃，在1.0vvm的通气量条件下脱毒24h。
所述的树脂枝孢霉Amorphotheca resinae ZN1，为本实验室自主筛选的生物脱毒菌株，用于干酸预处理后木质纤维素原料的生物脱毒，详细内容参见中国发明专利CN102191279 A。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一株耐高温的生产纤维素乙醇的酿酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiae Z100，保藏编号：CGMCC No.17734；该酿酒酵母菌株的保藏单位是中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏日期为2019年5月8日。
2.一种权利要求1所述耐高温的生产纤维素乙醇的酿酒酵母菌株在纤维素乙醇生产上的应用。
3.一种权利要求1所述耐高温的生产纤维素乙醇的酿酒酵母菌株的发酵应用方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)所述菌株的培养基包括碳源、氮源，pH 3.5-6.5；
(2)所述菌株的发酵温度为30-50℃；
(3)所述菌株在木质纤维素水解液中经过扩大培养后以1％-20％的接种量接入到发酵罐中进行50℃条件下的乙醇发酵。
4.根据权利要求1所述的耐高温的生产纤维素乙醇的酿酒酵母菌株的发酵应用方法，其特征在于，在所述的步骤(1)中，碳源为固含量为5％-35％(干固)玉米秸秆、麦秆、水稻秸秆等木质纤维素生物质酶促水解后的生物质水解液。
5.根据权利要求4所述的耐高温的生产纤维素乙醇的酿酒酵母菌株的发酵应用方法，其特征在于，所述生物质水解液含有以质量百分比计0.5％-12％葡萄糖、0.2％-6％木糖以及0.02％-1％阿拉伯糖等多种单糖。
6.根据权利要求1所述的耐高温的生产纤维素乙醇的酿酒酵母菌株的发酵应用方法，其特征在于，在所述的步骤(1)中，氮源为0.5％-3％(质量百分比)的玉米浆或者玉米干酒糟(DDGS)。
7.根据权利要求1所述的耐高温的生产纤维素乙醇的酿酒酵母菌株的发酵应用方法，其特征在于，在所述的步骤(3)中，扩大培养的方法如下：将保藏于-80℃的冻存管接种至5-20mLYEPD培养基中，30-35℃，150-200rpm培养8-12h后得到一级种子液；以5％-10％(质量百分比)接种量接种至5％-10％固含量总液体20-50mL的预处理并脱毒后的麦秆中，加入10-15mg纤维素酶粗蛋白/g纤维素的纤维素酶，30℃，200rpm培养8-12h后得到二级种子液；再以5％-10％接种量接种至15％固含量总液体100-200mL的预处理并脱毒后的麦秆中，酶用量为10-15mg纤维素酶粗蛋白/g纤维素，30℃，200rpm培养20-24h后得到三级种子液。
8.根据权利要求1所述的耐高温的生产纤维素乙醇的酿酒酵母菌株的发酵应用方法，其特征在于，在所述的步骤(3)中，乙醇发酵的步骤如下：预处理并脱毒的麦秆以25％-35％(质量百分比)的初始固含量进行预糖化，50℃，150rpm预糖化4h后以1％-20％(质量百分比)的接种量接入三级种子液以及营养盐，50℃高温条件下进行菌株生长以及乙醇发酵。
9.根据权利要求7所述的耐高温的生产纤维素乙醇的酿酒酵母菌株的发酵应用方法，其特征在于，所述YEPD培养基包括10-20g/L葡萄糖、5-10g/L酵母提取物、5-10g/L蛋白胨。
10.根据权利要求7所述的耐高温的生产纤维素乙醇的酿酒酵母菌株的发酵应用方法，其特征在于，营养盐为1-2g/L磷酸二氢钾、1-2g/L硫酸铵、0.5-1g/L硫酸镁以及5-30g/L玉米浆或者DDGS。
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