CN115029399A - 用于木质纤维素全细胞糖化的原料处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了针对木质纤维素全细胞糖化技术的原料处理方法，包括以下步骤：（1）对木质纤维素原料进行预处理，得到木质素含量不高于15%，半纤维素含量不高于20%的木质纤维素底物，用水清洗至pH不高于8.0。（2）将木质纤维素底物用3‑10倍体积的水或pH=7.0‑8.0的缓冲液在一定的温度条件下浸泡12‑24小时；（3）按照固液重量体积比1:2‑1:10，将步骤（2）处理后的木质纤维素底物转移至糖化培养基中，在115‑126℃灭菌30‑60分钟，得到的体系用于下一阶段的木质纤维素全细胞糖化。本发明所述的原料处理方法，通过在预处理阶段增加前处理步骤，解决了困扰已久的“染菌”问题，对于整合生物糖化技术的产业化具有极其重要的意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种木质纤维素原料处理方法，具体涉及一种针对木质纤维素全细胞糖化技术的原料处理方法。
背景技术
木质纤维素是自然界中储量最大的生物质原料，实现木质纤维素到生物基化学品和能源的高效生物转化，不仅能可持续性地缓解日益严峻的化石能源危机，还能有效地规避农林废弃物不当处理造成的环境污染，因此符合国家发展绿色循环经济的要求。然而，由于木质纤维素的结构和组成复杂，生物转化的难度较大；最大瓶颈莫过于纤维素结晶区难降解、导致酶解效率低，导致生物转化的成本一直居高不下。
整合生物糖化技术是一种木质纤维素生物转化的新策略，其采用经济、高效的以热纤梭菌(Clostridium thermocellum或Acetivibrio thermocellus)等可实现原位产酶的微生物为高效全细胞催化剂，以低成本发酵糖为目标产物，通过偶联下游发酵工艺，极大的拓宽了木质纤维素生物转化产品的品类和市场。发明人前期的工作就是围绕整合生物糖化进行，如发明专利 ZL201810939181.2、ZL201810939517.5、ZL201810939518.X、ZL201810939182.7、 ZL201810939294.2、ZL201810939170.4和ZL201810939296.1公开了利用整合生物糖化技术实现木质纤维素到葡萄糖酸钠、油脂类、色素类、生物燃料等产品的转化。
综上可知，木质纤维素全细胞糖化是整合生物糖化技术的核心步骤，目的是将木质纤维素底物转化为可发酵糖。采用木质纤维素全细胞催化糖化的方案，以活细胞作为生物催化剂；因此，与基于酶制剂的酶解糖化过程不同，其在糖化过程中需要采取菌株可生长的条件。然而，研究人员发现，与纤维素降解菌天然共生的菌株，往往能够利用降解菌降解木质纤维素底物产生的可发酵糖为营养生长，从而降低了可发酵糖这一目标产物的产量。以热纤梭菌为例，据报道，其伴生菌包括Thermoanaerobacterium、Thermobrachium等高温厌氧菌(1.The Draft Genome Sequence of Thermophilic Thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum M5 Capable of Directly Producing Butanol fromHemicellulose.Curr Microbiol 2017,75(5):620-623；2. Biological cellulosesaccharification using a coculture of Clostridium thermocellum andThermobrachium celere strain A9.Appl Microbiol Biotechnol 2022,106:2133-2145.)；而前述伴生菌可以利用热纤梭菌降解木质纤维素底物产生的可发酵糖，进而得到气、酸和醇等产物。同理，如果全细胞糖化体系中混杂伴生微生物(包括伴生菌)，会消耗产生的目标产物——可发酵糖，造成糖化失败。因此，为了保证全细胞糖化的产糖率，需要对原料进行灭菌，以消除杂菌。
目前，整合生物糖化工艺一般采用对底物首先进行预处理，然后进行高温高压灭菌处理，最后接种热纤梭菌进行糖化。然而，现有技术中，即便采用灭菌处理后的底物，糖化步骤仍然经常出现糖化失败的情形。因此，这是木质纤维素全细胞糖化技术亟待解决的技术问题，也是制约整合生物糖化工艺的瓶颈之一。
发明内容
针对现有技术中木质纤维素全细胞糖化技术所存在的问题，本发明提供了针对木质纤维素全细胞糖化技术的原料处理方法，通过在原料处理方案中增加简单的预混浸泡步骤，产生了出人意料的技术效果，解决了困扰已久的“染菌”问题，对于整合生物糖化技术的产业化具有极其重要的意义。
本发明的技术方案：
用于木质纤维素全细胞糖化的原料处理方法，包括以下步骤：
(1)预处理：对木质纤维素原料进行预处理，得到木质素含量不高于15％，半纤维素含量不高于20％的木质纤维素底物，用水清洗至pH不高于8.0。所述的木质纤维素原料为玉米秸秆、小麦秸秆、牧草或柳枝稷，所述的预处理为碱法、氨水法或者磺化法。
(2)前处理：将步骤(1)得到的木质纤维素底物用3-10倍体积的水或pH＝7.0-8.0的缓冲液在一定的温度条件下浸泡12-24小时；所述的温度条件为室温或者梯度升温。其中，所述的梯度升温具体为：在1-12小时内匀速从室温升高到目标温度，然后维持2-12小时，所述的目标温度为25-65℃。所述的缓冲液为磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和氯化钙的混合水溶液。发明人意外发现，通过增加前述的浸泡步骤，竟然解决了染菌导致的糖化失败的问题。在此基础上发明人分析了采用灭菌处理后的底物仍然会导致糖化失败的原因，认为主要是以下两点：①杂菌广泛存在于生物质原料中，且通常具有产生芽胞抵御不利环境的生理特性，环境耐受力强，导致目前采用的灭菌方式难以完全去除杂菌产生的芽胞。而这就导致在糖化开始有糖的积累时，杂菌芽胞开始萌发从而消耗掉产生的糖，造成糖化失败。②整合糖化工艺存在底物固含量较高、自由水含量低的问题，同时还会产生底物吸水成块的情形，因此导致灭菌时热传递效率不足，灭菌效果差，从而出现糖化过程的染菌现象。而通过增加前述浸泡步骤，一方面实现了预处理后木质纤维素底物的内部润涨，更有利于热传递；同时，通过选取合适的条件对底物进行浸泡，使其中杂菌的芽胞提前萌发，从而有效杜绝染菌现象。
(3)灭菌：按照固液重量体积比1:2-1:10，将步骤(2)处理后的木质纤维素底物转移至糖化培养基中，在115-126℃灭菌30-60分钟，得到的体系用于下一阶段的木质纤维素全细胞糖化。所述的糖化培养基为：磷酸氢二钾2.9g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、硫酸铵1.1g/L、氯化钙0.1g/L、氯化镁0.5g/L、硫酸亚铁0.5mg/L、硫化钠1g/L、玉米浆50ml/L、pH 7.5。通过前处理步骤的梯度浸泡策略，提高了高温高压灭菌过程中的传热效率，确保了灭菌效果。
所述的木质纤维素全细胞糖化具体为：将纤维素酶制剂加入步骤(3)灭菌后的体系中，在55-65℃的温度条件、150-250rpm的转速条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。所述的纤维素酶制剂为表达有葡萄糖苷酶的热纤梭菌重组菌株。
优选的是，步骤(2)所述的缓冲液具体为：磷酸氢二钾0.6g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，氯化钙0.5g/L。
优选的是，步骤(3)中，当固液重量体积比1:2-1:5时，步骤(2)处理后的木质纤维素底物进行单独灭菌后，再转移至糖化培养基中。所述单独灭菌的条件为115-126℃、搅拌转速小于80rpm、灭菌30-60分钟。
本发明的有益效果：
(1)本申请所述的原料处理方法，通过在预处理阶段增加前处理步骤，解决了困扰已久的“染菌”问题，对于整合生物糖化技术的产业化具有极其重要的意义。
(2)本申请所述的原料处理方法，不需要改变木质纤维素全细胞糖化技术，操作简单、成本低，不需要额外配置昂贵的设备和特别的耗能步骤，适用于规模化的生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1：采用原料处理方法的木质纤维素全细胞糖化
(1)预处理：对木质纤维素原料进行预处理，得到木质素含量不高于15％，半纤维素含量不高于20％的木质纤维素底物，用水清洗至pH不高于8.0。所述的木质纤维素原料为玉米秸秆，所述的预处理为磺化法。
(2)前处理：将步骤(1)得到的木质纤维素底物用10倍体积pH＝7.0的缓冲液，在室温浸泡12小时。所述的缓冲液具体为：磷酸氢二钾0.6g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，氯化钙0.5g/L。
(3)灭菌：按照固液重量体积比1:10，将步骤(2)处理后的木质纤维素底物转移至糖化培养基中，在115℃灭菌30分钟，得到用于木质纤维素全细胞糖化的体系。所述的糖化培养基为：磷酸氢二钾2.9g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、硫酸铵1.1g/L、氯化钙0.1g/L、氯化镁0.5g/L、硫酸亚铁0.5mg/L、硫化钠1g/L、玉米浆50ml/L、pH 7.5。
(4)糖化：将纤维素酶制剂加入步骤(3)灭菌后的体系中，在60℃的温度条件、150rpm 的转速条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。所述的纤维素酶制剂为表达有葡萄糖苷酶的热纤梭菌重组菌株。
实施例2：采用原料处理方法的木质纤维素全细胞糖化
与实施例1不同的是，
(1)预处理：所述的木质纤维素原料为玉米秸秆，所述的预处理为氨水法。
(2)前处理：将步骤(1)得到的木质纤维素底物用8倍体积pH＝8.0的缓冲液，在室温浸泡16小时。所述的缓冲液具体为：磷酸氢二钾0.6g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，氯化钙0.5g/L。
(3)灭菌：对步骤(2)处理后的木质纤维素底物在126℃、搅拌转速小于80rpm的条件下单独灭菌60分钟，然后按照固液重量体积比1:2转移至糖化培养基中，在115℃灭菌60分钟，得到用于木质纤维素全细胞糖化的体系。
(4)糖化：将纤维素酶制剂加入步骤(3)灭菌后的体系中，在65℃的温度条件、200rpm 的转速条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。
实施例3：采用原料处理方法的木质纤维素全细胞糖化
与实施例1不同的是，
(1)预处理：所述的木质纤维素原料为玉米秸秆，所述的预处理为碱法。
(2)前处理：将步骤(1)得到的木质纤维素底物用10倍体积的pH＝7.0的缓冲液，梯度升温的条件下浸泡12小时。其中，所述的梯度升温具体为：在1小时内匀速从室温升高到目标温度，然后维持11小时，所述的目标温度为25℃。
(3)灭菌：按照固液重量体积比1:10，将步骤(2)处理后的木质纤维素底物转移至糖化培养基中，在126℃灭菌60分钟，得到用于木质纤维素全细胞糖化的体系。
(4)糖化：将纤维素酶制剂加入步骤(3)灭菌后的体系中，在55℃的温度条件、250rpm 的转速条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。
实施例4：采用原料处理方法的木质纤维素全细胞糖化
与实施例1不同的是，
(1)预处理：所述的木质纤维素原料为玉米秸秆，所述的预处理为碱法。
(2)前处理：将步骤(1)得到的木质纤维素底物用8倍体积的pH＝8.0的缓冲液，梯度升温的条件下浸泡12小时。其中，所述的梯度升温具体为：在4小时内匀速从室温升高到目标温度，然后维持8小时，所述的目标温度为65℃。
(3)灭菌：对步骤(2)处理后的木质纤维素底物在126℃、搅拌转速小于80rpm的条件下单独灭菌30分钟，然后按照固液重量体积比1:2转移至糖化培养基中，在126℃灭菌60分钟，得到用于木质纤维素全细胞糖化的体系。
(4)糖化：将纤维素酶制剂加入步骤(3)灭菌后的体系中，在60℃的温度条件、250rpm 的转速条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。
实施例5：采用原料处理方法的木质纤维素全细胞糖化
与实施例1不同的是，
(1)预处理：所述的木质纤维素原料为小麦秸秆，所述的预处理为磺化法。
(2)前处理：将步骤(1)得到的木质纤维素底物用5倍体积的水在室温浸泡20小时。
(3)灭菌：按照固液重量体积比1:10，将步骤(2)处理后的木质纤维素底物转移至糖化培养基中，在121℃灭菌30分钟，得到用于木质纤维素全细胞糖化的体系。
(4)糖化：将纤维素酶制剂加入步骤(3)灭菌后的体系中，在60℃的温度条件、200rpm 的转速条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。
实施例6：采用原料处理方法的木质纤维素全细胞糖化
与实施例1不同的是，
(1)预处理：所述的木质纤维素原料为小麦秸秆，所述的预处理为氨水法。
(2)前处理：将步骤(1)得到的木质纤维素底物用3倍体积的pH＝7.5的缓冲液，室温条件下浸泡24小时。
(3)灭菌：对步骤(2)处理后的木质纤维素底物在121℃、搅拌转速小于80rpm的条件下单独灭菌60分钟，然后按照固液重量体积比1:2转移至糖化培养基中，在121℃灭菌60分钟，得到用于木质纤维素全细胞糖化的体系。
(4)糖化：将纤维素酶制剂加入步骤(3)灭菌后的体系中，在55℃的温度条件、200rpm 的转速条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。
实施例7：采用原料处理方法的木质纤维素全细胞糖化
与实施例1不同的是，
(1)预处理：所述的木质纤维素原料为小麦秸秆，所述的预处理为碱法。
(2)前处理：将步骤(1)得到的木质纤维素底物用5倍体积的水，梯度升温的条件下浸泡12小时。其中，所述的梯度升温具体为：在8小时内匀速从室温升高到目标温度，然后维持4小时，所述的目标温度为60℃。
(3)灭菌：对步骤(2)处理后的木质纤维素底物在121℃、搅拌转速小于80rpm的条件下单独灭菌60分钟，然后按照固液重量体积比1:5转移至糖化培养基中，在121℃灭菌60分钟，得到用于木质纤维素全细胞糖化的体系。
(4)糖化：将纤维素酶制剂加入步骤(3)灭菌后的体系中，在60℃的温度条件、200rpm 的转速条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。
实施例8：采用原料处理方法的木质纤维素全细胞糖化
与实施例1不同的是，
(1)预处理：所述的木质纤维素原料为小麦秸秆，所述的预处理为碱法。
(2)前处理：将步骤(1)得到的木质纤维素底物用3倍体积的pH＝7.5的缓冲液，梯度升温的条件下浸泡14小时。其中，所述的梯度升温具体为：在12小时内匀速从室温升高到目标温度，然后维持2小时，所述的目标温度为60℃。
(3)灭菌：按照固液重量体积比1:8，将步骤(2)处理后的木质纤维素底物转移至糖化培养基中，在126℃灭菌30分钟，得到用于木质纤维素全细胞糖化的体系。
(4)糖化：将纤维素酶制剂加入步骤(3)灭菌后的体系中，在65℃的温度条件、200rpm 的转速条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。
实施例9：采用原料处理方法的木质纤维素全细胞糖化
与实施例1不同的是，
(1)预处理：所述的木质纤维素原料为柳枝稷，所述的预处理为氨水法。
(2)前处理：将步骤(1)得到的木质纤维素底物用10倍体积的水在室温浸泡12小时。
(3)灭菌：对步骤(2)处理后的木质纤维素底物在121℃、搅拌转速小于80rpm的条件下单独灭菌60分钟，然后按照固液重量体积比1:5转移至糖化培养基中，在121℃灭菌30分钟，得到用于木质纤维素全细胞糖化的体系。
(4)糖化：将纤维素酶制剂加入步骤(3)灭菌后的体系中，在60℃的温度条件、250rpm 的转速条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。
实施例10：采用原料处理方法的木质纤维素全细胞糖化
与实施例1不同的是，
(1)预处理：所述的木质纤维素原料为柳枝稷，所述的预处理为氨水法。
(2)前处理：将步骤(1)得到的木质纤维素底物用8倍体积的pH＝8.0的缓冲液，室温条件下浸泡24小时。
(3)灭菌：按照固液重量体积比1:8，将步骤(2)处理后的木质纤维素底物转移至糖化培养基中，在115℃灭菌60分钟，得到用于木质纤维素全细胞糖化的体系。
(4)糖化：将纤维素酶制剂加入步骤(3)灭菌后的体系中，在60℃的温度条件、250rpm 的转速条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。
实施例11：采用原料处理方法的木质纤维素全细胞糖化
与实施例1不同的是，
(1)预处理：所述的木质纤维素原料为柳枝稷，所述的预处理为氨水法。
(2)前处理：将步骤(1)得到的木质纤维素底物用10倍体积的pH＝7.0的缓冲液，梯度升温的条件下浸泡12小时。其中，所述的梯度升温具体为：在4小时内匀速从室温升高到目标温度，然后维持8小时，所述的目标温度为50℃。
(3)灭菌：对步骤(2)处理后的木质纤维素底物在115℃、搅拌转速小于80rpm的条件下单独灭菌30分钟，然后按照固液重量体积比1:5转移至糖化培养基中，在115℃灭菌60分钟，得到用于木质纤维素全细胞糖化的体系。
(4)糖化：将纤维素酶制剂加入步骤(3)灭菌后的体系中，在55℃的温度条件、200rpm 的转速条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。
实施例12：采用原料处理方法的木质纤维素全细胞糖化
与实施例1不同的是，
(1)预处理：所述的木质纤维素原料为柳枝稷，所述的预处理为氨水法。
(2)前处理：将步骤(1)得到的木质纤维素底物用8倍体积的pH＝8.0的缓冲液，梯度升温的条件下浸泡12小时。其中，所述的梯度升温具体为：在10小时内匀速从室温升高到目标温度，然后维持2小时，所述的目标温度为55℃。
(3)灭菌：按照固液重量体积比1:8，将步骤(2)处理后的木质纤维素底物转移至糖化培养基中，在126℃灭菌30分钟，得到用于木质纤维素全细胞糖化的体系。
(4)糖化：将纤维素酶制剂加入步骤(3)灭菌后的体系中，在65℃的温度条件、250rpm 的转速条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。
实施例13：采用原料处理方法的木质纤维素全细胞糖化
与实施例1不同的是，
(1)预处理：所述的木质纤维素原料为木糖渣，所述的预处理为氨水法。
(2)前处理：将步骤(1)得到的木质纤维素底物用3倍体积的水在室温浸泡12小时。
(3)灭菌：对步骤(2)处理后的木质纤维素底物在121℃、搅拌转速小于80rpm的条件下单独灭菌60分钟，然后按照固液重量体积比1:5转移至糖化培养基中，在121℃灭菌30分钟，得到用于木质纤维素全细胞糖化的体系。
(4)糖化：将纤维素酶制剂加入步骤(3)灭菌后的体系中，在60℃的温度条件、250rpm 的转速条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。
实施例14：采用原料处理方法的木质纤维素全细胞糖化
与实施例1不同的是，
(1)预处理：所述的木质纤维素原料为木糖渣，所述的预处理为碱法。
(2)前处理：将步骤(1)得到的木质纤维素底物用3倍体积的pH＝7.0的缓冲液，室温条件下浸泡12小时。
(3)灭菌：按照固液重量体积比1:8，将步骤(2)处理后的木质纤维素底物转移至糖化培养基中，在115℃灭菌60分钟，得到用于木质纤维素全细胞糖化的体系。
(4)糖化：将纤维素酶制剂加入步骤(3)灭菌后的体系中，在60℃的温度条件、250rpm 的转速条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。
对照实施例1、2、3：常规木质纤维素全细胞糖化
与实施例1不同的是，
(1)预处理：所述的木质纤维素原料为玉米秸秆，所述的预处理为磺化法。
(2)灭菌：对木质纤维素底物在126℃、搅拌转速小于80rpm的条件下单独灭菌60分钟后，转移至糖化培养基中，在121℃灭菌60分钟，得到用于木质纤维素全细胞糖化的体系。
(3)糖化：将纤维素酶制剂加入步骤(3)灭菌后的体系中，在60℃的温度条件、150rpm 的转速条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。
对照实施例4、5、6：常规木质纤维素全细胞糖化
与实施例1不同的是，
(1)预处理：所述的木质纤维素原料为小麦秸秆，所述的预处理为氨水法。
(2)灭菌：对木质纤维素底物在126℃、搅拌转速小于80rpm的条件下单独灭菌60分钟后，转移至糖化培养基中，在121℃灭菌60分钟，得到用于木质纤维素全细胞糖化的体系。
(3)糖化：将纤维素酶制剂加入步骤(3)灭菌后的体系中，在55℃的温度条件、200rpm 的转速条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。
对照实施例7、8、9：常规木质纤维素全细胞糖化
与实施例1不同的是，
(1)预处理：所述的木质纤维素原料为柳枝稷，所述的预处理为氨水法。
(2)灭菌：对木质纤维素底物在126℃、搅拌转速小于80rpm的条件下单独灭菌60分钟后，转移至糖化培养基中，在121℃灭菌60分钟，得到用于木质纤维素全细胞糖化的体系。
(3)糖化：将纤维素酶制剂加入步骤(3)灭菌后的体系中，在60℃的温度条件、250rpm 的转速条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。
对照实施例10、11、12：常规木质纤维素全细胞糖化
与实施例1不同的是，
(1)预处理：所述的木质纤维素原料为木糖渣，所述的预处理为碱法。
(2)灭菌：对木质纤维素底物在126℃、搅拌转速小于80rpm的条件下单独灭菌60分钟后，转移至糖化培养基中，在121℃灭菌60分钟，得到用于木质纤维素全细胞糖化的体系。
(3)糖化：将纤维素酶制剂加入步骤(3)灭菌后的体系中，在60℃的温度条件、250rpm 的转速条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。
表1.实施例1-14及对比实施例1-12的得糖率
由表1可知，实施例1-14采用本申请所述的原料处理方法的木质纤维素全细胞糖化技术，糖得率均为80.9％-97.4％，没有发生染菌导致的得糖率显著降低的情形，证明本申请所述的方法解决了易染菌的问题。而对比实施例1-12共计为四组实验，每组实验均在同样条件下进行了三次重复实验(如对比实施例1-3为一组)，每一组重复实验的得糖率差异均较大。其中，对比实施例1-3的得糖率分别为32.0％、89.1％和80.1％；对比实施例4-6的得糖率分别为18.9％、18.3％和78.3％；对比实施例7-9的得糖率分别为28.0％、5.9％和80.7％；对比实施例10-12的得糖率分别为42.0％、25.3％和48.3％。说明，常规木质纤维素全细胞糖化技术，由于染菌而导致得糖率显著降低的情形不可避免，由此也限制了该技术的产业化应用前景。
综上可知，与常规木质纤维素全细胞糖化技术相比，本申请所述的采用原料处理方法的木质纤维素全细胞糖化技术，通过增加简单的前处理步骤，避免了染菌导致的糖化失败，在不同条件下均确保了糖率稳定在80.9％-97.4％，因此，糖化效果得到了显著提升，产生了预料不到的技术效果。此外，本申请所述的技术方案，还具备操作简单、成本低，无需额外配置昂贵的设备和特别的耗能步骤的优势，适用于规模化的生产，这对于整合生物糖化技术的产业化具有极其重要的意义。
Claims (10)
1.用于木质纤维素全细胞糖化的原料处理方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）预处理：对木质纤维素原料进行预处理，得到木质素含量不高于15%，半纤维素含量不高于20%的木质纤维素底物，用水清洗至pH不高于8.0；
（2）前处理：将步骤（1）得到的木质纤维素底物用3-10倍体积的水或pH=7.0-8.0的缓冲液，在一定的温度条件下浸泡12-24小时；所述的温度条件为室温或者梯度升温；
（3）灭菌：按照固液重量体积比1:2-1:10，将步骤（2）处理后的木质纤维素底物转移至糖化培养基中，在115-126℃灭菌30-60分钟，即得到用于木质纤维素全细胞糖化的体系。
2.根据权利要求1所述的原料处理方法，其特征在于：所述的梯度升温具体为：在1-12小时内匀速从室温升高到目标温度，然后维持2-12小时，所述的目标温度为25-65℃。
3.根据权利要求2所述的原料处理方法，其特征在于：步骤（2）所述的缓冲液为磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和氯化钙的混合水溶液。
4.根据权利要求3所述的原料处理方法，其特征在于：步骤（2）所述的缓冲液具体为：磷酸氢二钾0.6 g/L，磷酸二氢钾0.3 g/L，氯化钙0.5g/L。
5.根据权利要求1所述的原料处理方法，其特征在于：步骤（3）中，当固液重量体积比1:2-1:5时，步骤（2）处理后的木质纤维素底物进行单独灭菌后，再转移至糖化培养基中；所述单独灭菌的条件为115-126℃、搅拌转速小于80 rpm、灭菌30-60分钟。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的原料处理方法，其特征在于：步骤（3）所述的糖化培养基为：磷酸氢二钾2.9 g/L、磷酸二氢钾1.5 g/L、硫酸铵1.1 g/L、氯化钙0.1 g/L、氯化镁0.5g/L、硫酸亚铁0.5 mg/L、硫化钠1 g/L、玉米浆50 ml/L、pH 7.5。
7.根据权利要求6所述的原料处理方法，其特征在于：步骤（1）所述的木质纤维素原料为玉米秸秆、小麦秸秆、木糖渣、牧草或柳枝稷。
8.根据权利要求6所述的原料处理方法，其特征在于：步骤（1）所述的预处理为碱法、氨水法或者磺化法。
9.根据权利要求6所述的原料处理方法，其特征在于：所述的木质纤维素全细胞糖化，具体为：将纤维素酶制剂加入步骤（3）所述的灭菌后的体系中，在55-65℃的温度条件、150-250 rpm的转速条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。
10.根据权利要求9所述的原料处理方法，其特征在于：所述的纤维素酶制剂为表达有葡萄糖苷酶的热纤梭菌重组菌株。
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| CN115521957A (zh) * | 2022-09-28 | 2022-12-27 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 木质纤维素全细胞静置糖化技术 |
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2022
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