CN114807098B - 用于生产胞外纤维素降解酶系的培养方法 - Google Patents

用于生产胞外纤维素降解酶系的培养方法 Download PDF

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Abstract

针对现有技术中热纤梭菌的纤维小体合成能力较低的问题，本发明提供了采用热纤梭菌生产胞外纤维素降解酶系的方法。所述方法包括种子液制备、活化液制备和产酶发酵三个步骤。所述方法针对热纤梭菌的生长特点，通过在培养体系中添加二氧化碳、碳酸氢铵等组分，同时采用减少还原性硫化物的方式优化培养基，诱导出菌株的鲁棒性，提高细胞生长活力，使细胞迅速生长，从而增加纤维小体合成水平。将前述方法获得的热纤梭菌发酵液用于木质纤维素糖化，可以在3‑4天内完成糖化，且得糖率超过90%，从而实现了糖化周期的极大缩短，从而极大的降低了时间成本，对于实际生产具有重要的意义。

Description

用于生产胞外纤维素降解酶系的培养方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种纤维素酶的培养方法，具体涉及一种采用热纤梭菌生产胞外纤维素酶的培养方法。
背景技术
木质纤维素是自然界中储量最大的生物质原料，实现木质纤维素到生物基化学品和能源的高效生物转化，不仅能可持续性地缓解日益严峻的化石能源危机，还能有效地规避农林废弃物不当处理造成的环境污染，因此符合国家发展绿色循环经济的要求。然而，由于木质纤维素的结构和组成复杂，生物转化的难度较大；最大瓶颈莫过于纤维素结晶区难降解、导致酶解效率低，导致生物转化的成本一直居高不下。
整合生物糖化技术是一种木质纤维素生物转化的新策略，其采用热纤梭菌(Clostridium thermocellum)等可实现原位产酶微生物为高效全细胞催化剂，以低成本发酵糖为目标产物，通过偶联下游发酵工艺，极大的拓宽了木质纤维素生物转化产品的品类和市场。发明人前期的工作就是围绕整合生物糖化进行，如发明专利ZL201810939181.2、ZL201810939517.5、 ZL201810939518.X、ZL201810939182.7、ZL201810939294.2、ZL201810939170.4、 ZL201810939296.1公开了利用整合生物糖化技术实现木质纤维素到葡萄糖酸钠、油脂类、色素类、生物燃料等产品的转化。综上可知，木质纤维素全细胞糖化是整合生物糖化技术的核心步骤，采用严格厌氧菌——热纤梭菌活细胞作为生物催化剂，通过生产胞外的纤维小体实现木质纤维素底物的高效降解，进而转化为可发酵糖。
现有技术中，用于提高纤维素酶生产水平的培养方法主要针对的是黑曲霉、木霉等游离酶生产菌株。例如，发明专利ZL201811115133.8公开了“一种提高微生物产纤维素酶的酶活的发酵培养基及其应用和产酶方法”，通过优化发酵培养基，提高黑曲霉和木霉发酵产纤维素酶的酶活，其培养基中包括葡萄糖、硫酸铵、尿素、蛋白胨、磷酸二氢钾、多种金属离子、 Tween和苎麻浸出液。发明专利201310653126.4公开了“一种提高纤维素酶生产水平的发酵工艺”，采用分段控制发酵过程参数的细致补料工艺，提高了里氏木霉纤维素酶的生产水平。专利201210449827.1公开了“分批补加氮源培养真菌生产纤维素酶的方法”，采用分批补加玉米浆或者硫酸铵的方式提高木霉菌丝生长水平，同时提高纤维素酶活。
与前述纤维素酶生产菌株为好氧真菌不同，热纤梭菌是厌氧菌，其生物量和蛋白合成能力相比较低。因此，通过优化热纤梭菌培养体系提高热纤梭菌胞外纤维小体合成水平和生产能力，对于大规模的工业化生产的成本要求来说，具备不可替代的价值。
发明内容
针对现有技术中热纤梭菌的纤维小体合成能力较低的问题，本发明提供了采用热纤梭菌生产胞外纤维素降解酶系的方法。所述方法通过提高细胞的生长活力，使细胞迅速生长，从而增加了纤维小体合成水平，进而实现了糖化周期的极大缩短，具有重要的实际应用价值。
本发明的技术方案：
采用热纤梭菌生产胞外纤维素降解酶系的方法，包括以下步骤：
(1)种子液制备：在厌氧条件下，将热纤梭菌菌株接种于种子培养基中，在50-60℃的温度条件和150-250rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到种子液。所述的种子培养基为：碳源5g/L，磷酸氢二钾2.9g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、碳酸氢铵1.4g/L、氯化钙0.1g/L、氯化镁0.5g/L、硫酸亚铁0.5mg/L、硫化钠0.5g/L、酵母提取物6g/L或玉米浆100ml/L、pH7.5。所述的碳源为预处理后的木质纤维素原料或微晶纤维素；所述的木质纤维素原料为玉米秸秆、麦秸、柳枝稷、牧草和木糖渣；所述的预处理为碱法、氨水法、或者磺化法。
现有技术中通常不采用碳酸氢铵做氮源。这是因为，碳酸氢铵预热就容易分解成氨和二氧化碳，如果提前加进去，碳酸氢铵会分解而损失掉；为了避免损失，必须在培养基灭好菌以后将碳酸氢铵单独过滤、灭菌，然后再加，导致步骤繁琐和成本的增加。而本申请采用密封的厌氧体系发酵，则避免了这种情况的发生。同时，采用碳酸氢铵做氮源的培养基，结合减少硫化物用量以及下述步骤中增加二氧化碳含量等条件，最终实现了纤维小体的合成水平的增加，产生了预料不到的技术效果。
(2)活化液制备：在厌氧条件下，将步骤(1)制备的种子液按照0.1-1％(v/v)接种量，接种于活化培养基中，在50-60℃的温度条件和200-250rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到活化液。所述的活化培养基为：碳源5g/L，磷酸氢二钾2.9g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、碳酸氢铵2.8g/L、氯化钙0.1g/L、氯化镁0.5g/L、硫酸亚铁0.5mg/L、硫化钠0.2g/L、玉米浆50ml/L、pH 7.5。所述的碳源为预处理后的木质纤维素原料或微晶纤维素；所述的木质纤维素原料为玉米秸秆、麦秸、柳枝稷、牧草和木糖渣；所述的预处理为碱法、氨水法、或者磺化法。与种子液制备步骤相同，活化液培养基也采用碳酸氢铵做氮源，并减少了硫化物的用量。
(3)产酶发酵：配制产酶培养基，向体系气体层中吹氮气和二氧化碳的混合气体置换空气，然后在121℃条件下灭菌60分钟；所述的混合气体中二氧化碳的含量为0.1-10％(v/v)。按照0.1-1％(v/v)接种量接种，接种入步骤(2)得到的活化液，在55-65℃的温度条件和200-250 rpm的转速条件下，培养至平台期。测定发酵液中的蛋白含量和纤维素酶活，当蛋白含量不再增加时，发酵结束，得到热纤梭菌发酵液，即胞外纤维素降解酶系。所述的产酶培养基为：碳源1-5g/L，磷酸氢二钾0.6g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、碳酸氢铵2.8g/L、氯化钙0.1g/L、氯化镁0.5g/L、硫酸亚铁0.5mg/L、硫化钠0.2g/L、玉米浆25ml/L、pH 8.0。所述的碳源为预处理后的木质纤维素原料或微晶纤维素；所述的木质纤维素原料为玉米秸秆、麦秸、柳枝稷、牧草和木糖渣；所述的预处理为碱法、氨水法、或者磺化法。与前两个步骤相同，产酶培养基也采用碳酸氢铵做氮源，减少了硫化物用量；同时，增加了二氧化碳的含量。通过三个步骤的组合，逐步诱导出菌株的鲁棒性。
优选的是，步骤(2)所述的活化液制备重复1次，可以进一步提高种子的起始产酶活力。
优选的是，步骤(3)采用补料发酵的方法，具体为：将pH控制在7.0，每12小时补加初始浓度的碳源，并通过气体置换，将气体层中的二氧化碳浓度控制在初始水平或2％(v/v)。即，当二氧化碳的初始含量为0.1-2％(v/v)时保持初始水平，当二氧化碳的初始含量大于 2％(v/v)时保持2％(v/v)；至蛋白含量不再增加时，发酵结束。
前述获得的热纤梭菌发酵液可用于木质纤维素底物的糖化，具体步骤为：向灭菌后的含有5％(w/v)预处理后原料的糖化培养基中，按照1-100％(v/v)的接种量接入步骤(3)获得的热纤梭菌发酵液，在60℃的温度条件，采用螺带桨，在80-100rpm的转速条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。当糖化体系中每24小时的葡萄糖浓度增加程度小于10％时停止糖化。所述的糖化培养基为：磷酸氢二钾0.6g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、碳酸氢铵0.5g/L、氯化钙0.1g/L、氯化镁0.5g/L、硫酸亚铁0.5mg/L、硫化钠0.2g/L、玉米浆0-25ml/L、pH 7.0。
本发明的有益效果：
(1)本发明所述的生产胞外纤维素降解酶系的培养方法，针对热纤梭菌的生长特点，通过在培养体系中添加二氧化碳、碳酸氢铵等组分，同时采用减少还原性硫化物的方式，诱导菌株的鲁棒性，提高细胞生长活力，使细胞迅速生长，从而增加纤维小体合成水平。
(2)将本发明所述的生产胞外纤维素降解酶系的培养方法获得的热纤梭菌发酵液，用于木质纤维素糖化，可以在3-4天内完成糖化，且得糖率超过90％。与采取常规制种方式获得的发酵液需要7天左右完成糖化过程相比，实现了糖化周期的极大缩短，从而极大的降低了时间成本，对于实际生产具有重要的意义。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1：采用热纤梭菌生产胞外纤维素降解酶系进行木质纤维素糖化
(1)种子液制备：在厌氧条件下，将热纤梭菌菌株接种于种子培养基中，在50℃的温度条件和250rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到种子液。所述的种子培养基为：碳源5g/L，磷酸氢二钾2.9g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、碳酸氢铵1.4g/L、氯化钙0.1g/L、氯化镁0.5g/L、硫酸亚铁0.5mg/L、硫化钠0.5g/L、酵母提取物6g/L或玉米浆100ml/L、pH 7.5。所述的碳源为磺化法预处理后的麦秆。
(2)活化液制备：在厌氧条件下，将步骤(1)制备的种子液按照1％(v/v)接种量，接种于活化培养基中，在50℃的温度条件和250rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到活化液。所述的活化培养基为：碳源5g/L，磷酸氢二钾2.9g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、碳酸氢铵2.8g/L、氯化钙0.1g/L、氯化镁0.5g/L、硫酸亚铁0.5mg/L、硫化钠0.2g/L、玉米浆 50ml/L、pH 7.5。所述的碳源同步骤(1)。将前述步骤重复1次。
(3)产酶发酵：配制产酶培养基，向体系气体层中吹氮气和二氧化碳的混合气体置换空气，然后在121℃条件下灭菌60分钟；所述的混合气体中二氧化碳的含量为5％(v/v)。按照0.1％(v/v)接种量接种，接种入步骤(2)得到的活化液，在55℃的温度条件和250rpm的转速条件下进行发酵。采用补料发酵的方法补料3次，具体为：将pH控制在7.0，每12小时补加初始浓度的碳源，并通过气体置换，将气体层中的二氧化碳浓度控制在2％(v/v)。至蛋白含量不再增加时，发酵结束，得到热纤梭菌发酵液，即胞外纤维素降解酶系。所述的产酶培养基为：碳源1-5g/L，磷酸氢二钾0.6g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、碳酸氢铵2.8g/L、氯化钙0.1g/L、氯化镁0.5g/L、硫酸亚铁0.5mg/L、硫化钠0.2g/L、玉米浆25ml/L、pH 8.0。所述的碳源同步骤(1)。
(4)糖化：向灭菌后的含有5％(w/v)预处理后原料(同前述步骤的碳源)的糖化培养基中，按照100％(v/v)的接种量接入步骤(3)获得的热纤梭菌发酵液，在60℃的温度条件， 100rpm的转速搅拌条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。当糖化体系中每24小时的葡萄糖浓度增加程度小于10％时停止糖化。所述的糖化培养基为：磷酸氢二钾0.6g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、碳酸氢铵0.5g/L、氯化钙0.1g/L、氯化镁0.5g/L、硫酸亚铁0.5mg/L、硫化钠0.2g/L、pH 7.0。
实施例2：采用热纤梭菌生产胞外纤维素降解酶系进行木质纤维素糖化
与实施例1不同的是，
(1)种子液制备：在厌氧条件下，将热纤梭菌菌株接种于种子培养基中，在50℃的温度条件和250rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到种子液。所述的碳源为氨水法预处理后的玉米秸秆。
(2)活化液制备：在厌氧条件下，将步骤(1)制备的种子液按照1％(v/v)接种量，接种于活化培养基中，在50℃的温度条件和250rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到活化液。所述的碳源同步骤(1)。将前述步骤重复1次。
(3)产酶发酵：配制产酶培养基，向体系气体层中吹氮气和二氧化碳的混合气体置换空气，然后在121℃条件下灭菌60分钟；所述的混合气体中二氧化碳的含量为1％(v/v)。按照0.1％(v/v)接种量接种，接种入步骤(2)得到的活化液，在55℃的温度条件和250rpm的转速条件下进行发酵。采用补料发酵的方法补料1次，发酵结束，得到热纤梭菌发酵液，即胞外纤维素降解酶系。所述的碳源同步骤(1)。
(4)糖化：向灭菌后的含有5％(w/v)预处理后原料的糖化培养基中，按照5％(v/v)的接种量接入步骤(3)获得的热纤梭菌发酵液，在60℃的温度条件，100rpm的转速搅拌条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。当糖化体系中每24小时的葡萄糖浓度增加程度小于10％时停止糖化。所述的糖化培养基中玉米浆的含量为25mg/L。
实施例3：采用热纤梭菌生产胞外纤维素降解酶系进行木质纤维素糖化
与实施例1不同的是，
(1)种子液制备：在厌氧条件下，将热纤梭菌菌株接种于种子培养基中，在50℃的温度条件和250rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到种子液。所述的碳源为碱法预处理后的麦秆。
(2)活化液制备：在厌氧条件下，将步骤(1)制备的种子液按照1％(v/v)接种量，接种于活化培养基中，在50℃的温度条件和250rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到活化液。所述的碳源同步骤(1)。将前述步骤重复1次。
(3)产酶发酵：配制产酶培养基，向体系气体层中吹氮气和二氧化碳的混合气体置换空气，然后在121℃条件下灭菌60分钟；所述的混合气体中二氧化碳的含量为0.1％(v/v)。按照0.1％(v/v)接种量接种，接种入步骤(2)得到的活化液，在55℃的温度条件和250rpm 的转速条件下进行发酵。采用补料发酵的方法补料2次，发酵结束，得到热纤梭菌发酵液，即胞外纤维素降解酶系。所述的碳源同步骤(1)。
(4)糖化：向灭菌后的含有5％(w/v)预处理后原料的糖化培养基中，按照5％(v/v)的接种量接入步骤(3)获得的热纤梭菌发酵液，在60℃的温度条件，100rpm的转速搅拌条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。当糖化体系中每24小时的葡萄糖浓度增加程度小于10％时停止糖化。所述的糖化培养基中玉米浆的含量为25mg/L。
实施例4：采用热纤梭菌生产胞外纤维素降解酶系进行木质纤维素糖化
与实施例1不同的是，
(1)种子液制备：在厌氧条件下，将热纤梭菌菌株接种于种子培养基中，在55℃的温度条件和150rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到种子液。所述的碳源为磺化法预处理后的玉米秆。
(2)活化液制备：在厌氧条件下，将步骤(1)制备的种子液按照0.1％(v/v)接种量，接种于活化培养基中，在55℃的温度条件和150rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到活化液。所述的碳源同步骤(1)。将前述步骤重复1次。
(3)产酶发酵：配制产酶培养基，向体系气体层中吹氮气和二氧化碳的混合气体置换空气，然后在121℃条件下灭菌60分钟；所述的混合气体中二氧化碳的含量为5％(v/v)。按照0.5％(v/v)接种量接种，接种入步骤(2)得到的活化液，在60℃的温度条件和200rpm的转速条件下进行发酵。采用补料发酵的方法补料1次，发酵结束，得到热纤梭菌发酵液，即胞外纤维素降解酶系。所述的碳源同步骤(1)。
(4)糖化：向灭菌后的含有5％(w/v)预处理后原料的糖化培养基中，按照5％(v/v)的接种量接入步骤(3)获得的热纤梭菌发酵液，在60℃的温度条件，100rpm的转速搅拌条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。当糖化体系中每24小时的葡萄糖浓度增加程度小于10％时停止糖化。所述的糖化培养基中玉米浆的含量为25mg/L。
实施例5：采用热纤梭菌生产胞外纤维素降解酶系进行木质纤维素糖化
与实施例1不同的是，
(1)种子液制备：在厌氧条件下，将热纤梭菌菌株接种于种子培养基中，在55℃的温度条件和150rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到种子液。所述的碳源为氨水法预处理后的麦秆。
(2)活化液制备：在厌氧条件下，将步骤(1)制备的种子液按照0.1％(v/v)接种量，接种于活化培养基中，在55℃的温度条件和150rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到活化液。所述的碳源同步骤(1)。将前述步骤重复1次。
(3)产酶发酵：配制产酶培养基，向体系气体层中吹氮气和二氧化碳的混合气体置换空气，然后在121℃条件下灭菌60分钟；所述的混合气体中二氧化碳的含量为1％(v/v)。按照0.5％(v/v)接种量接种，接种入步骤(2)得到的活化液，在60℃的温度条件和200rpm的转速条件下进行发酵。采用补料发酵的方法补料2次，发酵结束，得到热纤梭菌发酵液，即胞外纤维素降解酶系。所述的碳源同步骤(1)。
(4)糖化：向灭菌后的含有5％(w/v)预处理后原料的糖化培养基中，按照100％(v/v) 的接种量接入步骤(3)获得的热纤梭菌发酵液，在60℃的温度条件，100rpm的转速搅拌条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。当糖化体系中每24小时的葡萄糖浓度增加程度小于10％时停止糖化。
实施例6：采用热纤梭菌生产胞外纤维素降解酶系进行木质纤维素糖化
与实施例1不同的是，
(1)种子液制备：在厌氧条件下，将热纤梭菌菌株接种于种子培养基中，在55℃的温度条件和150rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到种子液。所述的碳源为碱法预处理后的玉米秸秆。
(2)活化液制备：在厌氧条件下，将步骤(1)制备的种子液按照0.1％(v/v)接种量，接种于活化培养基中，在55℃的温度条件和150rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到活化液。所述的碳源同步骤(1)。将前述步骤重复1次。
(3)产酶发酵：配制产酶培养基，向体系气体层中吹氮气和二氧化碳的混合气体置换空气，然后在121℃条件下灭菌60分钟；所述的混合气体中二氧化碳的含量为2％(v/v)。按照0.5％(v/v)接种量接种，接种入步骤(2)得到的活化液，在60℃的温度条件和200rpm的转速条件下进行发酵。采用补料发酵的方法补料3次，发酵结束，得到热纤梭菌发酵液，即胞外纤维素降解酶系。所述的碳源同步骤(1)。
(4)糖化：向灭菌后的含有5％(w/v)预处理后原料的糖化培养基中，按照5％(v/v)的接种量接入步骤(3)获得的热纤梭菌发酵液，在60℃的温度条件，100rpm的转速搅拌条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。当糖化体系中每24小时的葡萄糖浓度增加程度小于10％时停止糖化。所述的糖化培养基中玉米浆的含量为25mg/L。
实施例7：采用热纤梭菌生产胞外纤维素降解酶系进行木质纤维素糖化
与实施例1不同的是，
(1)种子液制备：在厌氧条件下，将热纤梭菌菌株接种于种子培养基中，在60℃的温度条件和200rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到种子液。所述的碳源为磺化法预处理后的麦秆。
(2)活化液制备：在厌氧条件下，将步骤(1)制备的种子液按照0.5％(v/v)接种量，接种于活化培养基中，在60℃的温度条件和200rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到活化液。所述的碳源同步骤(1)。
(3)产酶发酵：配制产酶培养基，向体系气体层中吹氮气和二氧化碳的混合气体置换空气，然后在121℃条件下灭菌60分钟；所述的混合气体中二氧化碳的含量为10％(v/v)。按照1％(v/v)接种量接种，接种入步骤(2)得到的活化液，在60℃的温度条件和200rpm的转速条件下，培养至蛋白含量不再增加，发酵结束，得到热纤梭菌发酵液，即胞外纤维素降解酶系。所述的碳源同步骤(1)。
(4)糖化：向灭菌后的含有5％(w/v)预处理后原料的糖化培养基中，按照10％(v/v) 的接种量接入步骤(3)获得的热纤梭菌发酵液，在60℃的温度条件，100rpm的转速搅拌条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。当糖化体系中每24小时的葡萄糖浓度增加程度小于10％时停止糖化。所述的糖化培养基中玉米浆的含量为25mg/L。
实施例8：采用热纤梭菌生产胞外纤维素降解酶系进行木质纤维素糖化
与实施例1不同的是，
(1)种子液制备：在厌氧条件下，将热纤梭菌菌株接种于种子培养基中，在60℃的温度条件和200rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到种子液。所述的碳源为氨水法预处理后的玉米秸秆。
(2)活化液制备：在厌氧条件下，将步骤(1)制备的种子液按照0.5％(v/v)接种量，接种于活化培养基中，在60℃的温度条件和200rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到活化液。所述的碳源同步骤(1)。
(3)产酶发酵：配制产酶培养基，向体系气体层中吹氮气和二氧化碳的混合气体置换空气，然后在121℃条件下灭菌60分钟；所述的混合气体中二氧化碳的含量为5％(v/v)。按照1％(v/v)接种量接种，接种入步骤(2)得到的活化液，在60℃的温度条件和200rpm的转速条件下，培养至蛋白含量不再增加，发酵结束，得到热纤梭菌发酵液，即胞外纤维素降解酶系。所述的碳源同步骤(1)。
(4)糖化：向灭菌后的含有5％(w/v)预处理后原料的糖化培养基中，按照10％(v/v) 的接种量接入步骤(3)获得的热纤梭菌发酵液，在60℃的温度条件，100rpm的转速搅拌条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。当糖化体系中每24小时的葡萄糖浓度增加程度小于10％时停止糖化。所述的糖化培养基中玉米浆的含量为25mg/L。
实施例9：采用热纤梭菌生产胞外纤维素降解酶系进行木质纤维素糖化
与实施例1不同的是，
(1)种子液制备：在厌氧条件下，将热纤梭菌菌株接种于种子培养基中，在60℃的温度条件和200rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到种子液。所述的碳源为碱法预处理后的麦秆。
(2)活化液制备：在厌氧条件下，将步骤(1)制备的种子液按照0.5％(v/v)接种量，接种于活化培养基中，在60℃的温度条件和200rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到活化液。所述的碳源同步骤(1)。
(3)产酶发酵：配制产酶培养基，向体系气体层中吹氮气和二氧化碳的混合气体置换空气，然后在121℃条件下灭菌60分钟；所述的混合气体中二氧化碳的含量为5％(v/v)。按照1％(v/v)接种量接种，接种入步骤(2)得到的活化液，在60℃的温度条件和200rpm的转速条件下，培养至蛋白含量不再增加，发酵结束，得到热纤梭菌发酵液，即胞外纤维素降解酶系。所述的碳源同步骤(1)。
(4)糖化：向灭菌后的含有5％(w/v)预处理后原料的糖化培养基中，按照5％(v/v)的接种量接入步骤(3)获得的热纤梭菌发酵液，在60℃的温度条件，100rpm的转速搅拌条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。当糖化体系中每24小时的葡萄糖浓度增加程度小于10％时停止糖化。所述的糖化培养基中玉米浆的含量为25mg/L。
实施例10：采用热纤梭菌生产胞外纤维素降解酶系进行木质纤维素糖化
与实施例1不同的是，
(1)种子液制备：在厌氧条件下，将热纤梭菌菌株接种于种子培养基中，在60℃的温度条件和250rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到种子液。所述的碳源为磺化法预处理后的木糖渣。
(2)活化液制备：在厌氧条件下，将步骤(1)制备的种子液按照0.1％(v/v)接种量，接种于活化培养基中，在60℃的温度条件和250rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到活化液。所述的碳源同步骤(1)。将前述步骤重复1次。
(3)产酶发酵：配制产酶培养基，向体系气体层中吹氮气和二氧化碳的混合气体置换空气，然后在121℃条件下灭菌60分钟；所述的混合气体中二氧化碳的含量为2％(v/v)。按照0.5％(v/v)接种量接种，接种入步骤(2)得到的活化液，在60℃的温度条件和200rpm的转速条件进行发酵。采用补料发酵的方法补料1次，发酵结束，得到热纤梭菌发酵液，即胞外纤维素降解酶系。所述的碳源同步骤(1)。
(4)糖化：向灭菌后的含有5％(w/v)预处理后原料的糖化培养基中，按照5％(v/v)的接种量接入步骤(3)获得的热纤梭菌发酵液，在60℃的温度条件，80rpm的转速搅拌条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。当糖化体系中每24小时的葡萄糖浓度增加程度小于10％时停止糖化。
实施例11：采用热纤梭菌生产胞外纤维素降解酶系进行木质纤维素糖化
与实施例1不同的是，
(1)种子液制备：在厌氧条件下，将热纤梭菌菌株接种于种子培养基中，60℃的温度条件和250rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到种子液。所述的碳源为氨水法预处理后的木糖渣。
(2)活化液制备：在厌氧条件下，将步骤(1)制备的种子液按照0.1％(v/v)接种量，接种于活化培养基中，在60℃的温度条件和250rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到活化液。所述的碳源同步骤(1)。将前述步骤重复1次。
(3)产酶发酵：配制产酶培养基，向体系气体层中吹氮气和二氧化碳的混合气体置换空气，然后在121℃条件下灭菌60分钟；所述的混合气体中二氧化碳的含量为2％(v/v)。按照0.5％(v/v)接种量接种，接种入步骤(2)得到的活化液，在60℃的温度条件和250rpm的转速条件进行发酵。采用补料发酵的方法补料2次，发酵结束，得到热纤梭菌发酵液，即胞外纤维素降解酶系。所述的碳源同步骤(1)。
(4)糖化：向灭菌后的含有5％(w/v)预处理后原料的糖化培养基中，按照5％(v/v)的接种量接入步骤(3)获得的热纤梭菌发酵液，在60℃的温度条件，80rpm的转速搅拌条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。当糖化体系中每24小时的葡萄糖浓度增加程度小于10％时停止糖化。
实施例12：采用热纤梭菌生产胞外纤维素降解酶系进行木质纤维素糖化
与实施例1不同的是，
(1)种子液制备：在厌氧条件下，将热纤梭菌菌株接种于种子培养基中，在60℃的温度条件和250rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到种子液。所述的碳源为碱法预处理后的木糖渣。
(2)活化液制备：在厌氧条件下，将步骤(1)制备的种子液按照1％(v/v)接种量，接种于活化培养基中，在60℃的温度条件和250rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到活化液。所述的碳源同步骤(1)。将前述步骤重复1次。
(3)产酶发酵：配制产酶培养基，向体系气体层中吹氮气和二氧化碳的混合气体置换空气，然后在121℃条件下灭菌60分钟；所述的混合气体中二氧化碳的含量为2％(v/v)。按照0.5％(v/v)接种量接种，接种入步骤(2)得到的活化液，在60℃的温度条件和250rpm的转速条件进行发酵。采用补料发酵的方法补料3次，发酵结束，得到热纤梭菌发酵液，即胞外纤维素降解酶系。所述的碳源同步骤(1)。
(4)糖化：向灭菌后的含有5％(w/v)预处理后原料的糖化培养基中，按照1％(v/v)的接种量接入步骤(3)获得的热纤梭菌发酵液，在60℃的温度条件，80rpm的转速搅拌条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。当糖化体系中每24小时的葡萄糖浓度增加程度小于10％时停止糖化。
实施例13：采用热纤梭菌生产胞外纤维素降解酶系进行木质纤维素糖化
与实施例1不同的是，
(1)种子液制备：在厌氧条件下，将热纤梭菌菌株接种于种子培养基中，在60℃的温度条件和200rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到种子液。所述的碳源为磺化法预处理后的木糖渣。
(2)活化液制备：在厌氧条件下，将步骤(1)制备的种子液按照0.5％(v/v)接种量，接种于活化培养基中，在60℃的温度条件和200rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到活化液。所述的碳源同步骤(1)。
(3)产酶发酵：配制产酶培养基，向体系气体层中吹氮气和二氧化碳的混合气体置换空气，然后在121℃条件下灭菌60分钟；所述的混合气体中二氧化碳的含量为5％(v/v)。按照1％(v/v)接种量接种，接种入步骤(2)得到的活化液，在60℃的温度条件和200rpm的转速条件下，培养至蛋白含量不再增加，发酵结束，得到热纤梭菌发酵液，即胞外纤维素降解酶系。所述的碳源同步骤(1)。
(4)糖化：向灭菌后的含有5％(w/v)预处理后原料的糖化培养基中，按照10％(v/v) 的接种量接入步骤(3)获得的热纤梭菌发酵液，在60℃的温度条件，80rpm的转速搅拌条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。当糖化体系中每24小时的葡萄糖浓度增加程度小于10％时停止糖化。所述的糖化培养基中玉米浆的含量为25mg/L。
实施例14：采用热纤梭菌生产胞外纤维素降解酶系进行木质纤维素糖化
与实施例1不同的是，
(1)种子液制备：在厌氧条件下，将热纤梭菌菌株接种于种子培养基中，在60℃的温度条件和200rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到种子液。所述的碳源为氨水法预处理后的木糖渣。
(2)活化液制备：在厌氧条件下，将步骤(1)制备的种子液按照0.5％(v/v)接种量，接种于活化培养基中，在60℃的温度条件和200rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到活化液。所述的碳源同步骤(1)。
(3)产酶发酵：配制产酶培养基，向体系气体层中吹氮气和二氧化碳的混合气体置换空气，然后在121℃条件下灭菌60分钟；所述的混合气体中二氧化碳的含量为5％(v/v)。按照1％(v/v)接种量接种，接种入步骤(2)得到的活化液，在60℃的温度条件和200rpm的转速条件下，培养至蛋白含量不再增加，发酵结束，得到热纤梭菌发酵液，即胞外纤维素降解酶系。所述的碳源同步骤(1)。
(4)糖化：向灭菌后的含有5％(w/v)预处理后原料的糖化培养基中，按照10％(v/v) 的接种量接入步骤(3)获得的热纤梭菌发酵液，在60℃的温度条件，80rpm的转速搅拌条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。当糖化体系中每24小时的葡萄糖浓度增加程度小于10％时停止糖化。所述的糖化培养基中玉米浆的含量为25mg/L。
实施例15：采用热纤梭菌生产胞外纤维素降解酶系进行木质纤维素糖化
与实施例1不同的是，
(1)种子液制备：在厌氧条件下，将热纤梭菌菌株接种于种子培养基中，在60℃的温度条件和200rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到种子液。所述的碳源为碱法预处理后的木糖渣。
(2)活化液制备：在厌氧条件下，将步骤(1)制备的种子液按照1％(v/v)接种量，接种于活化培养基中，在60℃的温度条件和200rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到活化液。所述的碳源同步骤(1)。
(3)产酶发酵：配制产酶培养基，向体系气体层中吹氮气和二氧化碳的混合气体置换空气，然后在121℃条件下灭菌60分钟；所述的混合气体中二氧化碳的含量为5％(v/v)。按照1％(v/v)接种量接种，接种入步骤(2)得到的活化液，在55-65℃的温度条件和200rpm的转速条件下，培养至蛋白含量不再增加，发酵结束，得到热纤梭菌发酵液，即胞外纤维素降解酶系。所述的碳源同步骤(1)。
(4)糖化：向灭菌后的含有5％(w/v)预处理后原料的糖化培养基中，按照5％(v/v)的接种量接入步骤(3)获得的热纤梭菌发酵液，在60℃的温度条件，80rpm的转速搅拌条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。当糖化体系中每24小时的葡萄糖浓度增加程度小于10％时停止糖化。所述的糖化培养基中玉米浆的含量为25mg/L。
对比实施例1：常规木质纤维素糖化技术
(1)种子液制备：在厌氧条件下，将热纤梭菌菌株从保存于-80℃的甘油管中，接种于含有5g/L微晶纤维素为碳源的GS-2培养基中，在60℃的温度条件和200rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到种子液。所述的GS-2培养基为：磷酸氢二钾2.9g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、尿素2.1g/L、氯化钙0.1g/L、氯化镁1.5g/L、硫酸亚铁0.5mg/L、半胱氨酸2g/L、酵母提取物6g/L、pH 7.4。
(2)二级种子液制备：在(1)同样培养基和培养条件下，转接2次，获得二级种子液。
(3)糖化：向灭菌后的含有5％(w/v)磺化法预处理后的秸秆的糖化培养基中，按照10％(v/v)的接种量接入步骤(2)获得的二级种子液，在60℃的温度条件，100rpm的转速搅拌条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。当糖化体系中每24小时的葡萄糖浓度增加程度小于10％时停止糖化。所述的糖化培养基为：磷酸氢二钾0.6g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、碳酸氢铵0.5g/L、氯化钙0.1g/L、氯化镁0.5g/L、硫酸亚铁0.5mg/L、硫化钠0.2g/L、玉米浆25ml/L、pH 7.0。
对比实施例2：常规木质纤维素糖化技术
与对比实施例1不同的是，
(1)种子液制备：同对比实施例1。
(2)二级种子液制备：同对比实施例1。
(3)糖化：向灭菌后的含有5％(w/v)氨水法预处理后的秸秆的糖化培养基中，按照10％(v/v)的接种量接入步骤(2)获得的二级种子液，在60℃的温度条件，100rpm的转速搅拌条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。当糖化体系中每24小时的葡萄糖浓度增加程度小于10％时停止糖化。
对比实施例3：常规木质纤维素糖化技术
(1)种子液制备：同对比实施例1。
(2)二级种子液制备：同对比实施例1。
(3)糖化：向灭菌后的含有5％(w/v)碱法预处理后的秸秆的糖化培养基中，按照5％(v/v) 的接种量接入步骤(2)获得的二级种子液，在60℃的温度条件，100rpm的转速搅拌条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。当糖化体系中每24小时的葡萄糖浓度增加程度小于 10％时停止糖化。
对比实施例4：常规木质纤维素糖化技术
(1)种子液制备：同对比实施例1。
(2)二级种子液制备：同对比实施例1。
(3)糖化：向灭菌后的含有5％(w/v)磺化法预处理后的木糖渣的糖化培养基中，按照 10％(v/v)的接种量接入步骤(2)获得的二级种子液，在60℃的温度条件，80rpm的转速搅拌条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。当糖化体系中每24小时的葡萄糖浓度增加程度小于10％时停止糖化。
对比实施例5：常规木质纤维素糖化技术
(1)种子液制备：同对比实施例1。
(2)二级种子液制备：同对比实施例1。
(3)糖化：向灭菌后的含有5％(w/v)氨水法预处理后的木糖渣的糖化培养基中，按照 10％(v/v)的接种量接入步骤(2)获得的二级种子液，在60℃的温度条件，80rpm的转速搅拌条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。当糖化体系中每24小时的葡萄糖浓度增加程度小于10％时停止糖化。
对比实施例6：常规木质纤维素糖化技术
(1)种子液制备：同对比实施例1。
(2)二级种子液制备：同对比实施例1。
(3)糖化：向灭菌后的含有5％(w/v)碱法预处理后的木糖渣的糖化培养基中，按照5％(v/v)的接种量接入步骤(2)获得的二级种子液，在60℃的温度条件，80rpm的转速搅拌条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。当糖化体系中每24小时的葡萄糖浓度增加程度小于10％时停止糖化。
表1.实施例1-15和对比实施例1-6的产酶发酵指标和得糖率
Figure BDA0003684078600000141
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Figure BDA0003684078600000151
由表1可知，实施例1-15采用热纤梭菌生产胞外纤维素降解酶系进行木质纤维素糖化。其中，胞外蛋白含量为0.39-2.73mg/ml，单位酶活为22.9-40.8U/mg，由此计算得到纤维素酶产量为13.22-96.64U/ml；得糖率为81.78-93.22％。对比实施例1-6采用常规木质纤维素糖化技术，胞外蛋白含量为0.11-0.23mg/ml，单位酶活为21.9-26.5U/mg，由此计算得到产量为 2.87-5.59U/ml；得糖率为43.72-57.1％。
与对比实施例相比，实施例1-15采用本申请所述的培养方法得到的纤维素降解酶系，其胞外蛋白含量增加了0.69-23.8倍，说明热纤梭菌生产胞外蛋白的能力提高，即“量”的提升；单位酶活略有提升，表明有利于提高胞外蛋白中纤维小体的丰度或优化了纤维小体的组分，即“质”的提升；二者相乘得到的纤维素酶产量增加了1.36-32.67倍，说明采用本申请所述的培养方法，显著提升了热纤梭菌生产胞外纤维素酶(纤维小体)的能力。基于此，将实施例1-15得到的热纤梭菌发酵液用于木质纤维素糖化，不但缩短了糖化周期(可以在3-4天内完成糖化)，而且得糖率最高超过90％。与采取常规制种方式获得的发酵液需要7天左右完成糖化过程相比，实现了糖化周期的极大缩短，从而极大的降低了时间成本，对于实际生产具有重要的意义。

Claims (10)

1.采用热纤梭菌生产胞外纤维素降解酶系的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）种子液制备：在厌氧条件下，将热纤梭菌菌株接种于种子培养基中，在50-60℃的温度条件和150-250 rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到种子液；所述的种子培养基为：碳源5g/L，磷酸氢二钾2.9 g/L、磷酸二氢钾1.5 g/L、碳酸氢铵1.4 g/L、氯化钙0.1g/L、氯化镁0.5g/L、硫酸亚铁0.5 mg/L、硫化钠0.5 g/L、酵母提取物6g/L或玉米浆100 ml/L、pH 7.5；
（2）活化液制备：在厌氧条件下，将步骤（1）制备的种子液按照0.1-1%（v/v）接种量，接种于活化培养基中，在50-60℃的温度条件和200-250 rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到活化液；所述的活化培养基为：碳源5g/L，磷酸氢二钾2.9 g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、碳酸氢铵2.8 g/L、氯化钙0.1 g/L、氯化镁0.5g/L、硫酸亚铁0.5 mg/L、硫化钠0.2 g/L、玉米浆50 ml/L、pH 7.5；
（3）产酶发酵：配制产酶培养基，向体系气体层中吹氮气和二氧化碳的混合气体置换空气，高温高压灭菌；按照0.1-1%(v/v)接种量接种，接种入步骤（2）得到的活化液，在55-65℃的温度条件和200-250 rpm的转速条件下，培养至蛋白含量不再增加，发酵结束，得到热纤梭菌发酵液，即胞外纤维素降解酶系；所述的产酶培养基为：碳源1-5g/L，磷酸氢二钾0.6g/L、磷酸二氢钾0.3 g/L、碳酸氢铵2.8 g/L、氯化钙0.1 g/L、氯化镁0.5g/L、硫酸亚铁0.5mg/L、硫化钠0.2 g/L、玉米浆25 ml/L、pH 8.0。
2.根据权利要求1所述的生产胞外纤维素降解酶系的方法，其特征在于：步骤（1）所述的种子培养基采用的碳源为预处理后的木质纤维素原料或微晶纤维素。
3.根据权利要求1所述的生产胞外纤维素降解酶系的方法，其特征在于：步骤（2）所述的活化培养基采用的碳源为预处理后的木质纤维素原料或微晶纤维素。
4.根据权利要求1所述的生产胞外纤维素降解酶系的方法，其特征在于：步骤（3）所述的产酶培养基采用的碳源为预处理后的木质纤维素原料或微晶纤维素。
5.根据权利要求2-4中任意一项所述的生产胞外纤维素降解酶系的方法，其特征在于：步骤（3）所述的混合气体中，二氧化碳的含量为0.1-10%（v/v）。
6.根据权利要求5所述的生产胞外纤维素降解酶系的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的木质纤维素原料为玉米秸秆、麦秸、柳枝稷、牧草和木糖渣。
7.根据权利要求5所述的生产胞外纤维素降解酶系的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的预处理为碱法、氨水法、或者磺化法。
8.根据权利要求5所述的生产胞外纤维素降解酶系的方法，其特征在于：步骤（2）所述的活化液制备重复1次。
9.根据权利要求5所述的生产胞外纤维素降解酶系的方法，其特征在于：步骤（3）采用补料发酵的方法，具体为：将pH控制在7.0，每12小时补加初始浓度的碳源，并通过气体置换，将气体层中的二氧化碳浓度控制在初始水平或2%（v/v），即，当二氧化碳的初始含量为0.1-2%（v/v）时保持初始水平，当二氧化碳的初始含量大于2%（v/v）时保持2%（v/v），至蛋白含量不再增加，发酵结束。
10.根据权利要求5所述的生产胞外纤维素降解酶系的方法，其特征在于：步骤（3）所述的高温高压灭菌为121℃灭菌60分钟。
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