CN114807269B - 采用氧气处理方法的木质纤维素全细胞糖化技术 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了采用氧气处理方法的木质纤维素全细胞糖化技术，包括以下步骤：（1）对木质纤维素原料进行预处理得到木质纤维素底物，用水清洗至中性。（2）在厌氧条件下，将产纤维小体菌株接种于种子培养基中，一定温度和转速下培养至对数生长中期，得到种子液。（3）将木质纤维素底物转移至糖化培养基中，通入无氧空气置换空气后，灭菌。接入种子液，通入无菌空气，使气体层中的氧气含量达到0.2‑5%（v/v）。（4）将糖化体系在一定温度和转速预混合后，一定温度和转速下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。所述糖化技术不但消除了木质纤维素全细胞糖化技术对严格厌氧条件的需求，而且实现了糖化周期的显著缩短和糖得率的显著提高，产生了不可预料的技术效果。

Description

采用氧气处理方法的木质纤维素全细胞糖化技术
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种木质纤维素全细胞糖化的方法，具体涉及一种采用氧气处理方法的木质纤维素全细胞糖化技术。
背景技术
木质纤维素是自然界中储量最大的生物质原料，实现木质纤维素到生物基化学品和能源的高效生物转化，不仅能可持续性地缓解日益严峻的化石能源危机，还能有效地规避农林废弃物不当处理造成的环境污染，因此符合国家发展绿色循环经济的要求，是实现“双碳”目标的重要环节。然而，由于木质纤维素的结构和组成复杂，生物转化的难度较大；最大瓶颈莫过于纤维素结晶区难降解、导致酶解效率低，导致生物转化的成本一直居高不下。为了实现木质纤维素的高效利用，当务之急是实现木质纤维素底物的高效水解糖化。
整合生物糖化是一种木质纤维素生物转化的新策略，其采用热纤梭菌(Clostridium thermocellum或Acetivibrio thermocellus)等可实现原位产酶的微生物为高效全细胞催化剂，以低成本发酵糖为目标产物，通过偶联下游发酵工艺，极大的拓宽了木质纤维素生物转化产品的品类和市场。发明人前期的工作就是围绕整合生物糖化进行，如发明专利ZL201810939181.2、ZL201810939517.5、ZL201810939518.X、ZL201810939182.7、ZL201810939294.2、ZL201810939170.4和ZL201810939296.1等公开了利用整合生物糖化技术实现木质纤维素到葡萄糖酸钠、油脂类、色素类、生物燃料等产品的转化。
目前，木质纤维素全细胞糖化方案以热纤梭菌活细胞作为生物催化剂。热纤梭菌是严格厌氧菌，通过生产胞外的纤维小体实现木质纤维素底物的高效降解。由于热纤梭菌的生长条件要求，以及纤维小体对氧气的敏感性，本领域研究人员通常认为有氧气存在会导致糖化效率降低。例如，存在0.8％的氧气就会使基于纤维小体的糖化效率显著降低(Chen C,Qi K,Chi F,Song X,Feng Y,Cui Q,et al.Int J Biol Macromol 2022,207:784-790.)。因此，木质纤维素全细胞糖化需要采用严格厌氧的培养条件和糖化条件。然而，对于大规模的工业化生产来说，保证体系的严格厌氧通常存在非常大的挑战。为了实现严格的厌氧条件，往往需要在培养体系中加入半胱氨酸或硫化钠等还原性化合物，从而显著提高了成本。
因此，开发更加鲁棒、简单的木质纤维素全细胞糖化技术，在不降低糖化效率的同时，降低生产过程成本，对大规模工业化生产而言具有非常重要的意义。
发明内容
基于现有技术中对降低木质纤维素全细胞糖化过程中严格厌氧条件的技术需求，本发明提供了一种基于氧气胁迫的全细胞催化剂接种与糖化方法，不但消除了木质纤维素全细胞糖化技术对严格厌氧条件的需求，而且实现了糖化周期的显著缩短和糖得率的显著提高，产生了不可预料的技术效果。
本发明的技术方案：
采用氧气处理方法的木质纤维素全细胞糖化技术，包括以下步骤：
(1)预处理：对木质纤维素原料进行预处理，得到木质素含量不高于15％，半纤维素含量不高于20％的木质纤维素底物，然后用水清洗至pH＝7.0-8.0。所述的木质纤维素原料为玉米秸秆、麦秸、柳枝稷、牧草和木糖渣；所述预处理为碱法、氨水法、或者磺化法。
(2)制备种子液：在厌氧条件下，将产纤维小体菌株接种于种子培养基中，在55-65℃的温度条件和150-250rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到种子液。所述的产纤维小体菌株为表达葡萄糖苷酶的热纤梭菌重组菌株。所述的种子培养基为：磷酸氢二钾2.9g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、硫酸铵1.1g/L、氯化钙0.1g/L、氯化镁0.5g/L、硫酸亚铁0.5mg/L、硫化钠1g/L、玉米浆50ml/L、pH 7.5
(3)准备糖化体系：将步骤(1)得到的木质纤维素底物，按照固液重量体积比1:2-1:25转移至糖化培养基中，向体系气体层中通入无氧空气置换空气后，在115-126℃灭菌30-90分钟；所述的无氧空气中氧气浓度小于100ppm。然后按照0.2-1％(v/v)的低接种量接入步骤(2)获得的种子液，随后向体系中通入无菌空气，使气体层中的氧气含量达到0.2-5％(v/v)。所述的糖化培养基为：磷酸氢二钾0.6g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、硫酸铵1.1g/L、氯化钙0.1g/L、氯化镁0.5g/L、硫酸亚铁0.5mg/L、硫化钠0.2g/L、玉米浆50ml/L、pH 7.5。
本步骤是本申请所述的氧气处理方法的关键步骤之一。常规木质纤维素全细胞糖化技术与本申请的区别之处在于：(a)常规技术采用的糖化培养基与种子培养基相同；而本申请中的糖化培养基与种子培养基相比，硫化钠的用量从1g/L降低到0.2g/L，磷酸盐用量降低了80％，降低了种子培养的成本。(b)常规技术通常按照10％(v/v)的高接种量接入种子液；本申请按照0.2-1％(v/v)的低接种量接入种子液，降低了糖化体系的配制成本。
(4)糖化：将步骤(3)准备的糖化体系，在55-65℃的温度条件和80-100rpm转速下预混合0.5-24小时，预混合阶段不产生糖。通过有氧条件下的预混合步骤，改变体系中的氧化还原水平，使得种子液中的细胞的代谢水平趋同，即，实现了全菌催化剂生长状态的归一化。然后在55-65℃的温度条件和150-250rpm的转速条件下进行水解反应(糖化)，得到含有葡萄糖的糖液。当体系中连续两天的糖液浓度不再变化时，糖化结束。所述糖化包括延滞期阶段和快速糖化阶段。在延滞期阶段(1-3天)，细胞处于氧气胁迫下的准备状态，生长较为缓慢，故糖积累量较少。随着细胞的缓慢代谢并产气过程，体系中的残氧浓度逐渐降低；从而实现细胞迅速生长和高产酶，进而进入快速糖化阶段(3-4天)，实现了底物的迅速降解。综上可知，采用本申请所述的氧气处理方法的木质纤维素全细胞糖化技术，糖化阶段需要1-3天延滞期+3-4天加速糖化期；总体糖化周期与常规方案相比，略有缩短。
本步骤是本申请所述的氧气处理方法的关键步骤之二。常规木质纤维素全细胞糖化技术与本申请的区别之处在于：糖化步骤中不包括预混合步骤，而是直接在高转速下进行水解反应产生糖液；这是由于其在严格厌氧条件下进行糖化，糖化过程匀速进行。而本申请采用氧气胁迫和低接种量的策略，通过预混和步骤诱导菌株对低氧含量产生耐受性。与此同时，发明人意外发现，通过延滞期内菌株的缓慢代谢降低体系中的氧气含量，反而实现了后期木质纤维素底物的迅速降解，使得总体糖化周期与现有技术略有缩短。同时，由于菌体生物量相对较低消耗底物少，底物中纤维素转化为葡萄糖的比例高，得糖率超过90％。
优选的是，步骤(3)所述的无氧空气为纯氮气。
优选的是，步骤(4)采取并线糖化的策略，在水解反应的延滞阶段进行下批木质纤维素底物的预处理和种子液的制备；有效弥补了延滞期带来的延迟，整体上实现糖化周期的极大缩短。
本发明的有益效果：
(1)本发明所述的木质纤维素全细胞糖化技术，针对以热纤梭菌为全细胞催化剂的技术特点，采用氧气胁迫和低接种量的策略，解决了现有技术对严格厌氧条件的需求，对产业化生产具有极其重要的意义。
(2)采用本发明所述的木质纤维素全细胞糖化技术，不但实现了大规模生产过程中体系中一定范围内初始氧气含量的容忍，而且实现了相对较短的糖化周期和更高的得糖率，产生了不可预料的技术效果。
(3)采用本发明所述的木质纤维素全细胞糖化技术，显著降低了体系中所需还原性物质和磷酸盐的浓度使得种子培养的成本大幅下降；同时由于采用低接种量，降低了糖化体系的配置成本。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1：采用氧气处理方法的木质纤维素全细胞糖化
(1)预处理：对木质纤维素原料进行预处理，得到木质素含量不高于15％，半纤维素含量不高于20％的木质纤维素底物，然后用水清洗至pH＝7.0-8.0。所述的木质纤维素原料为玉米秸秆，所述预处理为磺化法。
(2)制备种子液：在厌氧条件下，将产纤维小体菌株接种于种子培养基中，在55℃的温度条件和250rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到种子液。所述的产纤维小体菌株为表达葡萄糖苷酶的热纤梭菌重组菌株。所述的种子培养基为：磷酸氢二钾2.9g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、硫酸铵1.1g/L、氯化钙0.1g/L、氯化镁0.5g/L、硫酸亚铁0.5mg/L、硫化钠1g/L、玉米浆50ml/L、pH 7.5
(3)准备糖化体系：将步骤(1)得到的木质纤维素底物，按照固液重量体积比1:25转移至糖化培养基中，向体系气体层中通入无氧空气置换空气后，在126℃灭菌90分钟；所述的无氧空气中氧气浓度小于100ppm。然后按照0.2(v/v)的低接种量接入步骤(2)获得的种子液，随后向体系中通入无菌空气，使气体层中的氧气含量达到0.2％(v/v)。所述的糖化培养基为：磷酸氢二钾0.6g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、硫酸铵1.1g/L、氯化钙0.1g/L、氯化镁0.5g/L、硫酸亚铁0.5mg/L、硫化钠0.2g/L、玉米浆50ml/L、pH 7.5。
(4)糖化：将步骤(3)准备的糖化体系，在55℃的温度条件和80rpm转速下预混合4小时。然后在55℃的温度条件和250rpm的转速条件下进行水解反应(糖化)，得到含有葡萄糖的糖液。当体系中连续两天的糖液浓度不再变化时，糖化结束。
对比实施例1：采用常规木质纤维素全细胞糖化技术
与实施例1不同的是，步骤(3)准备糖化体系中，按照10％(v/v)的高接种量接入步骤(2)获得的种子液，采用的糖化培养基成分与种子培养基相同。步骤(4)不进行预混合，直接进行水解反应。
实施例2：采用氧气处理方法的木质纤维素全细胞糖化
与实施例1不同的是，
(1)预处理：所述的木质纤维素原料为玉米秸秆，所述预处理为氨水法。
(2)制备种子液：在厌氧条件下，将产纤维小体菌株接种于种子培养基中，在60℃的温度条件和200rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到种子液。
(3)准备糖化体系：将步骤(1)得到的木质纤维素底物，按照固液重量体积比1:10转移至糖化培养基中，向体系气体层中通入氮气置换空气后，在121℃灭菌60分钟。然后按照0.5％(v/v)的低接种量接入步骤(2)获得的种子液，随后向体系中通入无菌空气，使气体层中的氧气含量达到2％(v/v)。
(4)糖化：将步骤(3)准备的糖化体系，在60℃的温度条件和100rpm转速下预混合2小时。然后在65℃的温度条件和150rpm的转速条件下进行水解反应(糖化)，得到含有葡萄糖的糖液。当体系中连续两天的糖液浓度不再变化时，糖化结束。在水解反应的延滞阶段进行下批木质纤维素底物的预处理和种子液的制备。
对比实施例2：采用常规木质纤维素全细胞糖化技术
与实施例2不同的是，步骤(3)准备糖化体系中，按照10％(v/v)的高接种量接入步骤(2)获得的种子液，采用的糖化培养基成分与种子培养基相同。步骤(4)不进行预混合，直接进行水解反应。
实施例3：采用氧气处理方法的木质纤维素全细胞糖化
与实施例1不同的是，
(1)预处理：所述的木质纤维素原料为玉米秸秆，所述预处理为碱法。
(2)制备种子液：在厌氧条件下，将产纤维小体菌株接种于种子培养基中，在55℃的温度条件和250rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到种子液。
(3)准备糖化体系：将步骤(1)得到的木质纤维素底物，按照固液重量体积比1:10转移至糖化培养基中，向体系气体层中通入氮气置换空气后，在126℃灭菌30分钟。然后按照0.8％(v/v)的低接种量接入步骤(2)获得的种子液，随后向体系中通入无菌空气，使气体层中的氧气含量达到4％(v/v)。
(4)糖化：将步骤(3)准备的糖化体系，在55℃的温度条件和80rpm转速下预混合0.5小时。然后在55℃的温度条件和150rpm的转速条件下进行水解反应(糖化)，得到含有葡萄糖的糖液。当体系中连续两天的糖液浓度不再变化时，糖化结束。
对比实施例3：采用常规木质纤维素全细胞糖化技术
与实施例3不同的是，步骤(3)准备糖化体系中，按照10％(v/v)的高接种量接入步骤(2)获得的种子液，采用的糖化培养基成分与种子培养基相同。步骤(4)不进行预混合，直接进行水解反应。
实施例4：采用氧气处理方法的木质纤维素全细胞糖化
与实施例1不同的是，
(1)预处理：所述的木质纤维素原料为小麦秸秆，所述预处理为磺化法。
(2)制备种子液：在厌氧条件下，将产纤维小体菌株接种于种子培养基中，在55℃的温度条件和250rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到种子液。
(3)准备糖化体系：将步骤(1)得到的木质纤维素底物，按照固液重量体积比1:25转移至糖化培养基中，向体系气体层中通入无氧空气置换空气后，在126℃灭菌90分钟；所述的无氧空气中氧气浓度小于100ppm。然后按照0.2％(v/v)的低接种量接入步骤(2)获得的种子液，随后向体系中通入无菌空气，使气体层中的氧气含量达到0.2％(v/v)。
(4)糖化：将步骤(3)准备的糖化体系，在55℃的温度条件和100rpm转速下预混合12小时。然后在60℃的温度条件和250rpm的转速条件下进行水解反应(糖化)，得到含有葡萄糖的糖液。当体系中连续两天的糖液浓度不再变化时，糖化结束。在水解反应的延滞阶段进行下批木质纤维素底物的预处理和种子液的制备。
对比实施例4：采用常规木质纤维素全细胞糖化技术
与实施例4不同的是，步骤(3)准备糖化体系中，按照10％(v/v)的高接种量接入步骤(2)获得的种子液，采用的糖化培养基成分与种子培养基相同。步骤(4)不进行预混合，直接进行水解反应。
实施例5：采用氧气处理方法的木质纤维素全细胞糖化
与实施例1不同的是，
(1)预处理：所述的木质纤维素原料为小麦秸秆，所述预处理为氨水法。
(2)制备种子液：在厌氧条件下，将产纤维小体菌株接种于种子培养基中，在60℃的温度条件和200rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到种子液。
(3)准备糖化体系：将步骤(1)得到的木质纤维素底物，按照固液重量体积比1:10转移至糖化培养基中，向体系气体层中通入无氧空气置换空气后，在121℃灭菌60分钟；所述的无氧空气中氧气浓度小于100ppm。然后按照0.5％(v/v)的低接种量接入步骤(2)获得的种子液，随后向体系中通入无菌空气，使气体层中的氧气含量达到2％(v/v)。
(4)糖化：将步骤(3)准备的糖化体系，在60℃的温度条件和80rpm转速下预混合1小时。然后在55℃的温度条件和250rpm的转速条件下进行水解反应(糖化)，得到含有葡萄糖的糖液。当体系中连续两天的糖液浓度不再变化时，糖化结束。
对比实施例5：采用常规木质纤维素全细胞糖化技术
与实施例5不同的是，步骤(3)准备糖化体系中，按照10％(v/v)的高接种量接入步骤(2)获得的种子液，采用的糖化培养基成分与种子培养基相同。步骤(4)不进行预混合，直接进行水解反应。
实施例6：采用氧气处理方法的木质纤维素全细胞糖化
与实施例1不同的是，
(1)预处理：所述的木质纤维素原料为小麦秸秆，所述预处理为碱法。
(2)制备种子液：在厌氧条件下，将产纤维小体菌株接种于种子培养基中，在60℃的温度条件和200rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到种子液。
(3)准备糖化体系：将步骤(1)得到的木质纤维素底物，按照固液重量体积比1:4转移至糖化培养基中，向体系气体层中通入氮气置换空气后，在126℃灭菌30分钟。然后按照0.5％(v/v)的低接种量接入步骤(2)获得的种子液，随后向体系中通入无菌空气，使气体层中的氧气含量达到2％(v/v)。
(4)糖化：将步骤(3)准备的糖化体系，在60℃的温度条件和100rpm转速下预混合12小时。然后在65℃的温度条件和150rpm的转速条件下进行水解反应(糖化)，得到含有葡萄糖的糖液。当体系中连续两天的糖液浓度不再变化时，糖化结束。在水解反应的延滞阶段进行下批木质纤维素底物的预处理和种子液的制备。
对比实施例6：采用常规木质纤维素全细胞糖化技术
与实施例6不同的是，步骤(3)准备糖化体系中，按照10％(v/v)的高接种量接入步骤(2)获得的种子液，采用的糖化培养基成分与种子培养基相同。步骤(4)不进行预混合，直接进行水解反应。
实施例7：采用氧气处理方法的木质纤维素全细胞糖化
与实施例1不同的是，
(1)预处理：所述的木质纤维素原料为柳枝稷，所述预处理为磺化法。
(2)制备种子液：在厌氧条件下，将产纤维小体菌株接种于种子培养基中，在60℃的温度条件和200rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到种子液。
(3)准备糖化体系：将步骤(1)得到的木质纤维素底物，按照固液重量体积比1:25转移至糖化培养基中，向体系气体层中通入无氧空气置换空气后，在126℃灭菌90分钟；所述的无氧空气中氧气浓度小于100ppm。然后按照0.2％(v/v)的低接种量接入步骤(2)获得的种子液，随后向体系中通入无菌空气，使气体层中的氧气含量达到1％(v/v)。
(4)糖化：将步骤(3)准备的糖化体系，在60℃的温度条件和100rpm转速下预混合12小时。然后在60℃的温度条件和200pm的转速条件下进行水解反应(糖化)，得到含有葡萄糖的糖液。当体系中连续两天的糖液浓度不再变化时，糖化结束。在水解反应的延滞阶段进行下批木质纤维素底物的预处理和种子液的制备。
对比实施例7：采用常规木质纤维素全细胞糖化技术
与实施例7不同的是，步骤(3)准备糖化体系中，按照10％(v/v)的高接种量接入步骤(2)获得的种子液，采用的糖化培养基成分与种子培养基相同。步骤(4)不进行预混合，直接进行水解反应。
实施例8：采用氧气处理方法的木质纤维素全细胞糖化
与实施例1不同的是，
(1)预处理：所述的木质纤维素原料为牧草(芒草)，所述预处理为氨水法。
(2)制备种子液：在厌氧条件下，将产纤维小体菌株接种于种子培养基中，在65℃的温度条件和150rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到种子液。
(3)准备糖化体系：将步骤(1)得到的木质纤维素底物，按照固液重量体积比1:10转移至糖化培养基中，向体系气体层中通入无氧空气置换空气后，在121℃灭菌60分钟；所述的无氧空气中氧气浓度小于100ppm。然后按照0.5％(v/v)的低接种量接入步骤(2)获得的种子液，随后向体系中通入无菌空气，使气体层中的氧气含量达到2％(v/v)。
(4)糖化：将步骤(3)准备的糖化体系，在65℃的温度条件和100rpm转速下预混合12小时。然后在60℃的温度条件和200rpm的转速条件下进行水解反应(糖化)，得到含有葡萄糖的糖液。当体系中连续两天的糖液浓度不再变化时，糖化结束。
对比实施例8：采用常规木质纤维素全细胞糖化技术
与实施例8不同的是，步骤(3)准备糖化体系中，按照10％(v/v)的高接种量接入步骤(2)获得的种子液，采用的糖化培养基成分与种子培养基相同。步骤(4)不进行预混合，直接进行水解反应。
实施例9：采用氧气处理方法的木质纤维素全细胞糖化
与实施例1不同的是，
(1)预处理：所述的木质纤维素原料为柳枝稷，所述预处理为碱法。
(2)制备种子液：在厌氧条件下，将产纤维小体菌株接种于种子培养基中，在60℃的温度条件和200rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到种子液。
(3)准备糖化体系：将步骤(1)得到的木质纤维素底物，按照固液重量体积比1:10转移至糖化培养基中，向体系气体层中通入氮气置换空气后，在121℃灭菌60分钟。然后按照0.5％(v/v)的低接种量接入步骤(2)获得的种子液，随后向体系中通入无菌空气，使气体层中的氧气含量达到0.2％(v/v)。
(4)糖化：将步骤(3)准备的糖化体系，在60℃的温度条件和100rpm转速下预混合12小时。然后在60℃的温度条件和200rpm的转速条件下进行水解反应(糖化)，得到含有葡萄糖的糖液。当体系中连续两天的糖液浓度不再变化时，糖化结束。
对比实施例9：采用常规木质纤维素全细胞糖化技术
与实施例9不同的是，步骤(3)准备糖化体系中，按照10％(v/v)的高接种量接入步骤(2)获得的种子液，采用的糖化培养基成分与种子培养基相同。步骤(4)不进行预混合，直接进行水解反应。
实施例10：采用氧气处理方法的木质纤维素全细胞糖化
与实施例1不同的是，
(1)预处理：所述的木质纤维素原料为木糖渣，所述预处理为磺化法。
(2)制备种子液：在厌氧条件下，将产纤维小体菌株接种于种子培养基中，在55℃的温度条件和250rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到种子液。
(3)准备糖化体系：将步骤(1)得到的木质纤维素底物，按照固液重量体积比1:25转移至糖化培养基中，向体系气体层中通入氮气置换空气后，在115℃灭菌60分钟。然后按照0.2％(v/v)的低接种量接入步骤(2)获得的种子液，随后向体系中通入无菌空气，使气体层中的氧气含量达到2％(v/v)。
(4)糖化：将步骤(3)准备的糖化体系，在55℃的温度条件和100rpm转速下预混合24小时。然后在60℃的温度条件和200rpm的转速条件下进行水解反应(糖化)，得到含有葡萄糖的糖液。当体系中连续两天的糖液浓度不再变化时，糖化结束。在水解反应的延滞阶段进行下批木质纤维素底物的预处理和种子液的制备。
对比实施例10：采用常规木质纤维素全细胞糖化技术
与实施例10不同的是，步骤(3)准备糖化体系中，按照10％(v/v)的高接种量接入步骤(2)获得的种子液，采用的糖化培养基成分与种子培养基相同。步骤(4)不进行预混合，直接进行水解反应。
实施例11：采用氧气处理方法的木质纤维素全细胞糖化
与实施例1不同的是，
(1)预处理：所述的木质纤维素原料为木糖渣，所述预处理为磺化法。
(2)制备种子液：在厌氧条件下，将产纤维小体菌株接种于种子培养基中，在60℃的温度条件和200rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到种子液。
(3)准备糖化体系：将步骤(1)得到的木质纤维素底物，按照固液重量体积比1:2转移至糖化培养基中，向体系气体层中通入无氧空气置换空气后，在115℃灭菌60分钟；所述的无氧空气中氧气浓度小于100ppm。然后按照1％(v/v)的低接种量接入步骤(2)获得的种子液，随后向体系中通入无菌空气，使气体层中的氧气含量达到4％(v/v)。
(4)糖化：将步骤(3)准备的糖化体系，在60℃的温度条件和80rpm转速下预混合5小时。然后在60℃的温度条件和200rpm的转速条件下进行水解反应(糖化)，得到含有葡萄糖的糖液。当体系中连续两天的糖液浓度不再变化时，糖化结束。在水解反应的延滞阶段进行下批木质纤维素底物的预处理和种子液的制备。
对比实施例11：采用常规木质纤维素全细胞糖化技术
与实施例11不同的是，步骤(3)准备糖化体系中，按照10％(v/v)的高接种量接入步骤(2)获得的种子液，采用的糖化培养基成分与种子培养基相同。步骤(4)不进行预混合，直接进行水解反应。
实施例12：采用氧气处理方法的木质纤维素全细胞糖化
与实施例1不同的是，
(1)预处理：所述的木质纤维素原料为木糖渣，所述预处理为氨水法。
(2)制备种子液：在厌氧条件下，将产纤维小体菌株接种于种子培养基中，在55℃的温度条件和250rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到种子液。
(3)准备糖化体系：将步骤(1)得到的木质纤维素底物，按照固液重量体积比1:5转移至糖化培养基中，向体系气体层中通入无氧空气置换空气后，在115℃灭菌60分钟；所述的无氧空气中氧气浓度小于100ppm。然后按照1％(v/v)的低接种量接入步骤(2)获得的种子液，随后向体系中通入无菌空气，使气体层中的氧气含量达到5％(v/v)。
(4)糖化：将步骤(3)准备的糖化体系，在55℃的温度条件和80rpm转速下预混合1小时。然后在60℃的温度条件和200rpm的转速条件下进行水解反应(糖化)，得到含有葡萄糖的糖液。当体系中连续两天的糖液浓度不再变化时，糖化结束。
对比实施例12：采用常规木质纤维素全细胞糖化技术
与实施例12不同的是，步骤(3)准备糖化体系中，按照10％(v/v)的高接种量接入步骤(2)获得的种子液，采用的糖化培养基成分与种子培养基相同。步骤(4)不进行预混合，直接进行水解反应。
实施例13：采用氧气处理方法的木质纤维素全细胞糖化
与实施例1不同的是，
(1)预处理：所述的木质纤维素原料为木糖渣，所述预处理为碱法。
(2)制备种子液：在厌氧条件下，将产纤维小体菌株接种于种子培养基中，在60℃的温度条件和200rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到种子液。
(3)准备糖化体系：将步骤(1)得到的木质纤维素底物，按照固液重量体积比1:10转移至糖化培养基中，向体系气体层中通入氮气置换空气后，在115℃灭菌60分钟。然后按照0.5％(v/v)的低接种量接入步骤(2)获得的种子液，随后向体系中通入无菌空气，使气体层中的氧气含量达到1％(v/v)。
(4)糖化：将步骤(3)准备的糖化体系，在60℃的温度条件和100rpm转速下预混合12小时。然后在60℃的温度条件和200rpm的转速条件下进行水解反应(糖化)，得到含有葡萄糖的糖液。当体系中连续两天的糖液浓度不再变化时，糖化结束。
对比实施例13：采用常规木质纤维素全细胞糖化技术
与实施例13不同的是，步骤(3)准备糖化体系中，按照10％(v/v)的高接种量接入步骤(2)获得的种子液，采用的糖化培养基成分与种子培养基相同。步骤(4)不进行预混合，直接进行水解反应。
实施例1-13及对比实施例的得糖率和糖化周期
实施例 延滞期/天 糖化期/天 糖化阶段/天 得糖率 对比例 糖化阶段/天 得糖率
实施例1 1 4 5 93.0％ 对比例1 7 82.0％
实施例2 1 4 5 90.2％ 对比例2 8 84.3％
实施例3 3 4 7 97.0％ 对比例3 8 82.8％
实施例4 1 4 5 90.8％ 对比例4 8 80.3％
实施例5 3 3 6 92.7％ 对比例5 8 85.3％
实施例6 2 4 6 93.0％ 对比例6 9 82.0％
实施例7 1 3 4 96.0％ 对比例7 8 87.9％
实施例8 1 4 5 99.1％ 对比例8 8 80.4％
实施例9 1 3.5 4.5 92.5％ 对比例9 8 85.3％
实施例10 1 3 4 97.4％ 对比例10 7 84.9％
实施例11 3 3 6 91.7％ 对比例11 8 80.4％
实施例12 3 3 6 97.4％ 对比例12 8 82.9％
实施例13 1 4 5 90.9％ 对比例13 7 87.1％
由表1可知，本申请采用氧气处理方法的木质纤维素全细胞糖化的实施例1-13，糖化阶段为4-7天，包括延滞期1-3天和快速糖化阶段3-4天，糖得率为90.2％-99.1％。而采用常规木质纤维素全细胞糖化技术的对比实施例1-13，糖化阶段为7-9天，糖得率为80.3％-87.9％。由此可知，与常规木质纤维素全细胞糖化技术相比，本申请所述的采用氧气处理方法的木质纤维素全细胞糖化技术，糖化周期从7-9天缩短到4-7天，略有缩短；糖得率从80.3％-87.9％提升到了90.2％-99.1％，提升显著。综上，本申请所述的技术方案，不但实现了大规模生产过程中体系中一定范围内初始氧气含量的容忍，解决了现有技术对克服严格厌氧条件的需求，对产业化生产具有极其重要的意义，而且实现了相对较短的糖化周期和更高的得糖率，产生了不可预料的技术效果，是实现“双碳”目标的利器。

Claims (7)

1.采用氧气处理方法的木质纤维素全细胞糖化方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）预处理：对木质纤维素原料进行预处理，得到木质素含量不高于15%，半纤维素含量不高于20%的木质纤维素底物，然后用水清洗至pH =7.0-8.0；所述的预处理为碱法、氨水法、或者磺化法；
（2）制备种子液：在厌氧条件下，将产纤维小体菌株接种于种子培养基中，在55-65℃的温度条件和150-250 rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到种子液；所述的产纤维小体菌株为表达葡萄糖苷酶的热纤梭菌重组菌株；
（3）准备糖化体系：将步骤（1）得到的木质纤维素底物，按照固液重量体积比1:2-1:25转移至糖化培养基中，向体系气体层中通入无氧空气置换空气后，进行灭菌；然后按照0.2-1% (v/v)的低接种量接入步骤（2）获得的种子液，随后向体系中通入无菌空气，使气体层中的氧气含量达到0.2-5%（v/v）；
（4）糖化：将步骤（3）准备的糖化体系，在55-65℃的温度条件和80-100rpm转速下预混合0.5-24小时，然后在55-65℃的温度条件和150-250 rpm的转速条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液，直至糖化结束。
2.根据权利要求1所述的木质纤维素全细胞糖化方法，其特征在于：步骤（3）所述的无氧空气中氧气浓度小于100 ppm；所述灭菌的条件为115-126℃，30-90分钟。
3.根据权利要求2所述的木质纤维素全细胞糖化方法，其特征在于：所述的无氧空气是纯氮气。
4.根据权利要求3所述的木质纤维素全细胞糖化方法，其特征在于：步骤（2）所述的种子培养基为：磷酸氢二钾2.9 g/L、磷酸二氢钾1.5 g/L、硫酸铵1.1 g/L、氯化钙0.1 g/L、氯化镁0.5g/L、硫酸亚铁0.5 mg/L、硫化钠1 g/L、玉米浆50 ml/L、pH 7.5。
5.根据权利要求3所述的木质纤维素全细胞糖化方法，其特征在于：步骤（3）所述的糖化培养基为：磷酸氢二钾0.6 g/L、磷酸二氢钾0.3 g/L、硫酸铵1.1 g/L、氯化钙0.1 g/L、氯化镁0.5g/L、硫酸亚铁0.5 mg/L、硫化钠0.2 g/L、玉米浆50 ml/L、pH 7.5。
6.根据权利要求3所述的木质纤维素全细胞糖化方法，其特征在于：步骤（1）中所述的木质纤维素原料为玉米秸秆、麦秸、柳枝稷、牧草和木糖渣。
7.根据权利要求3所述的木质纤维素全细胞糖化方法，其特征在于：步骤（4）采取并线糖化的策略，在水解反应的延滞阶段进行下批木质纤维素底物的预处理和种子液的制备。
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