CN101824395B - 一种以固体秸秆为碳源培养发酵种子液的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种以固体秸秆为碳源培养发酵种子液的方法，其具体步骤为，(1)发酵菌种的活化：从菌种保藏平板、保藏斜面或冷冻甘油保藏管保存的菌种接种于合成培养基；(2)培养基中添加预处理的固体秸秆进行同步糖化驯化培养种子；(3)种子液的多级扩大培养过程；(4)接种与发酵：将步骤(2)或(3)培养获得的含发酵菌种的浆液接种于高固含量的发酵罐进行同步糖化发酵制备乙醇或其他生物基产品。本发明的优点：消除了固液分离获得水解液清液过程中的染菌风险，提高了菌株对抑制物和固体基质的耐受性，过程成本降低，发酵周期缩短，具有很好的工业化应用前景。

Description

一种以固体秸秆为碳源培养发酵种子液的方法
【技术领域】
本发明涉及发酵与生物质能源技术领域，具体地说，是一种以固体秸秆为碳源培养发酵种子液的方法。
【背景技术】
农作物秸秆等纤维质原料是世界上最丰富的可再生资源，利用纤维质原料发酵生产酒精，用于车用燃料乙醇是一个极具前景的产业。秸秆作为一种丰富的农业副产物，成本低廉，分布广泛，以它作为原料能够降低生物乙醇的原料成本，扩大乙醇生产规模。
纤维质原料发酵生产乙醇一般包括原料的预处理、酶水解、发酵、提纯等步骤。现有主要的预处理方法包括稀酸预处理和蒸汽汽爆等技术，原料预处理能够破坏纤维质原料对酶解过程的抵抗性，有利于酶水解的进行，但是预处理过程会产生大量的抑制物，这些抑制物抑制了发酵微生物在纤维质原料水解液中的生长以及乙醇发酵。为了能够有效的进行秸秆乙醇发酵，研究者首先提出通过脱除水解液中抑制物的方式来提高发酵效率，包括碱中和、离子交换、溶剂萃取等方法，这些方法使得过程成本提高，操作复杂，也加大后续乙醇分离的难度。另一种途径即把发酵微生物培养在含纤维素水解液清液的培养基中，进行驯化培养，使菌种具备对抑制物的耐受性，再用于乙醇的同步糖化发酵。但是，无论水解液的脱毒处理或菌种的驯化培养，都需要液固分离设备，这不仅增加设备成本，在液固分离和脱毒过程都会导致可发酵糖的损失，此外也增大染菌的风险。这就需要一种能够实现低成本培养乙醇发酵种子液的方法，在工艺上简单可行，同时也能够起到驯化发酵微生物的目的。
【发明内容】
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种以固体秸秆为碳源培养发酵种子液的方法。
本发明的构思：以固体秸秆类物质为原料发酵生产燃料乙醇过程中种子培养液的低成本培养方法，适合于以固体秸秆类物质为原料进行乙醇发酵或其它生物基产品发酵的工业发酵菌种种子培养，菌种在多级培养过程中，向培养基中添加预处理后的固体秸秆作为碳源，同时加入纤维素酶和营养盐，使种子在培养阶段即采用同步糖化与发酵的方式生长。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种以固体秸秆为碳源培养发酵种子液的方法，其具体步骤为：
(1)发酵菌种的活化：
从菌种保藏平板、保藏斜面或冷冻甘油保藏管保存的菌种接种于合成培养基，培养温度25～45℃，优选温度为30℃；转速50～500rpm，优选转速为150rpm；培养12～36小时，OD600值达到4～16；
在合成培养基中，葡萄糖浓度10～100g/L，营养盐浓度是KH2PO4或K2HPO4 0.5～10g/l，MgSO4·7H2O 0.1～5g/l，(NH4)2SO4 0.5～10g/l，酵母萃取粉或玉米浆0.1～10g/l；
所述的菌种包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、管囊酵母(Pachysolen tannophilus)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)菌株，以及通过诱变、基因工程等操作改造上述菌株以及上述菌株的两种或数种的混合发酵；优选为酿酒酵母；其中：诱变筛选的菌株是指通过化学、物理以及射线等诱变改造的菌株；基因工程操作的菌株是指通过转入质粒、同源重组及改善代谢路径后的可用于代谢六碳糖或五碳糖发酵生产乙醇的菌株；
OD600值是指含有菌体的溶液在600nm波长处的吸光值；
(2)培养基中添加预处理的固体秸秆进行同步糖化驯化培养种子：
活化的种子液的体积百分数为5～20％接种于固体秸秆的混合培养基中，在混合培养基中固体秸秆的质量百分数为3～30％，加入纤维素酶和营养盐，转速50～500rpm，温度25～45℃，培养12～36小时；优选条件为转速150rpm，温度37℃，培养18小时；得到发酵菌种的浆液；
混合培养基是指以0.1～50g/L葡萄糖溶液调整固体秸秆固含量的培养基，其pH为2.0～8.0，优选pH为5.0；
所述的纤维素酶选自纤维素酶或者纤维二糖酶中的一种或两者的混合酶液，加酶量为1～30FPU/g DM，FPU指纤维素酶液中的纤维素酶滤纸酶活，DM是指秸秆类物质干重；其中，纤维素酶液包括商品化纤维素酶液以及用霉菌等微生物培养获得的具有纤维素酶活的培养液；调整pH的溶液选自硫酸、氢氧化钙溶液、氢氧化钠溶液、氨水中的一种或者两种以上混合溶液；
所述的营养盐为KH2PO4或K2HPO4 0.5～10g/L，MgSO4·7H2O 0.1～5g/L，(NH4)2SO4 0.5～10g/l，酵母萃取粉或玉米浆0.1～10g/L；
所述的固体秸秆选自固体秸秆原料或者固体秸秆处理物；其中：
所述的固体秸秆原料选自玉米秸秆、麦秸、稻草、木屑、能源植物或者林业废弃物中的一种，优选玉米秸秆；
所述的固体秸秆处理物选自采用稀酸、蒸汽爆破、氨气爆破、生物法方式预处理后的玉米秸秆、麦秸、稻草、木屑、能源植物、林业废弃物中的一种，优选蒸汽汽爆预处理的玉米秸秆；
(3)种子液的多级扩大培养过程：
菌种在多级培养过程中，直接向培养基中添加预处理后的固体秸秆作为碳源，根据发酵罐的装液量大小，扩大培养种子液的体积，将步骤(2)获得的种子液接种于含固体秸秆的培养基，在培养基中固体秸秆的质量百分数为3～30％，加入纤维素酶和营养盐，在摇瓶或种子罐中扩大培养种子，培养转速100～500rpm，温度25～45℃，培养12～36小时，获得种子培养液；种子液多级培养过程中培养级数涵盖1级到6级，各培养级间接种量的体积百分比为5～20％，接种于发酵罐的种子液包括从1级到6级培养种子获得的任一级的培养液；得到含发酵菌种的浆液；
(4)接种与发酵：
将步骤(2)或(3)培养获得的含发酵菌种的浆液接种于高固含量的发酵罐进行同步糖化发酵制备乙醇或其他生物基产品。
与现有技术相比，本发明的积极效果是：
(1)本发明基于低固体含量同步糖化培养种子，在种子多级培养过程中，向培养基中添加预处理后的玉米秸秆作为碳源，提高了种子在纤维乙醇发酵过程中的耐受性，适合于高固体含量乙醇同步糖化发酵过程接种，发酵周期缩短，提高了乙醇产率和得率，适合于工业应用；
(2)本发明基于低固体含量同步糖化培养种子，与采用合成培养基或与采用秸秆水解液清液获得的种子培养液相比，避免了固液分离过程可发酵糖的损失，消除了固液分离获得水解液清液过程中的染菌风险，提高了原料的利用率，能够实现纤维质原料发酵生产乙醇过程的可行性；
(3)同现有技术相比，本发明没有液固分离和水解液脱毒过程，减少了固定设备投资，同时采用低成本营养盐以及易于操作的工艺过程，充分利用水解液资源，降低了生产成本，适合于大规模和工业化生产。
【具体实施方式】
以下提供本发明一种以固体秸秆为碳源培养发酵种子液的方法的具体实施方式。
实施例1
在100mL摇瓶中加入20mL合成培养基做菌种的活化，菌种为酿酒酵母；种子培养第二步，在250mL摇瓶中用20g/L的葡萄糖溶液调整汽爆预处理秸秆含量为15％，培养温度30℃，150rpm；加酶量5 FPU/g DM，培养18小时。同步糖化发酵在发酵罐中进行，固体含量为25％，加酶量7 FPU/g DM，营养盐浓度分别为KH2PO4 2g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，(NH4)2SO4 1g/L，酵母萃取粉1g/L，50℃温度预糖化8小时；接种量10％，接种后调整发酵温度到37℃，发酵48小时，乙醇浓度46g/L，得率62％。
实施例2
在100mL摇瓶中加入20mL合成培养基做菌种的活化，菌种为管囊酵母菌种；种子培养第二步，在250mL摇瓶中用20g/L的葡萄糖溶液调整汽爆预处理秸秆含量为10％，培养温度37℃，150rpm；加酶量15 FPU/g DM；营养盐浓度分别为KH2PO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，(NH4)2SO4 1g/L，酵母萃取粉2g/L；同步糖化发酵在发酵罐中进行，固体含量为27％，加酶量30 FPU/gDM，预糖化温度为50℃，8小时，接种后调整温度到37℃，发酵72小时，乙醇浓度55g/L，得率60％。
实施例3
在100mL摇瓶中加入20mL合成培养基做菌种的活化，菌种为树干毕赤酵母菌；种子培养第二步，在250mL摇瓶中用20g/L的葡萄糖溶液调整汽爆预处理秸秆含量为5％，培养温度37℃，150rpm；加酶量15 FPU/g DM；营养盐浓度分别为KH2PO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，(NH4)2SO4 1g/L，玉米浆0.5g/L；种子培养第三步，在250mL摇瓶中用水调整汽爆秸秆含量为10％，加酶量15FPU/g DM；同步糖化发酵在发酵罐中固体含量为29.6％，加酶量7FPU/g DM，预糖化温度50℃，12小时，接种量10％，接种后调整温度到30℃，发酵72小时，乙醇浓度53g/L，得率59.1％。
实施例4
在100mL摇瓶中加入20mL合成培养基进行菌种的活化，菌种为运动发酵单胞菌；种子培养第二步，用10g/L的葡萄糖溶液调整汽爆预处理秸秆含量为10％，加酶量15FPU/g DM；种子培养第三步，在250mL摇瓶中用水调整汽爆预处理秸秆固含量为10％，培养温度37℃，转速250rpm；加酶量30FPU/gDM；同步糖化发酵在发酵罐中进行，加酶量30FPU/g DM，营养盐浓度分别为KH2PO4 2g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，(NH4)2SO4 1g/L，酵母萃取粉1g/L，固体含量为28.9％，调整温度到35℃，发酵72小时，乙醇得率75％。
此外，本发明所涉及的菌种不限于实施例所提供的菌种，还可以为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、管囊酵母(Pachysolen tannophilus)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)菌株，以及通过诱变、基因工程等操作改造上述菌株以及上述菌株的两种或数种的混合发酵；其中：诱变筛选的菌株是指通过化学、物理以及射线等诱变改造的菌株；基因工程操作的菌株是指通过转入质粒、同源重组及改善代谢路径后的可用于代谢六碳糖或五碳糖发酵生产乙醇的菌株；
此外，本发明所涉及的固体秸秆不限于玉米秸秆，还可以为麦秸、稻草、木屑、能源植物或者林业废弃物中的一种；固体秸秆处理物选自采用稀酸、蒸汽爆破、氨气爆破、生物法方式预处理后的麦秸、稻草、木屑、能源植物、林业废弃物中的一种。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种以固体秸秆为碳源培养发酵种子液的方法，其特征在于，其具体步骤为：
(1)发酵菌种的活化：
从菌种保藏平板、保藏斜面或冷冻甘油保藏管保存的菌种接种于合成培养基，培养温度25～45℃；转速50～500rpm；培养12～36小时，OD600值达到4～16；
在合成培养基中，葡萄糖浓度10～100g/L，营养盐浓度是KH2PO4或K2HPO4 0.5～10g/l，MgSO4·7H2O 0.1～5g/l，(NH4)2SO4 0.5～10g/l，酵母萃取粉或玉米浆0.1～10g/l；
所述的菌种为酿酒酵母、管囊酵母、树干毕赤酵母或者运动发酵单胞菌菌株；
OD600值是指含有菌体的溶液在600nm波长处的吸光值；
(2)培养基中添加固体秸秆进行同步糖化驯化培养种子：
活化的种子液的体积百分数为5～20％接种于固体秸秆的混合培养基中，在混合培养基中固体秸秆的质量百分数为3～30％，加入纤维素酶和营养盐，转速50～500rpm，温度25～45℃，培养12～36小时，得到发酵菌种的浆液；
混合培养基是指以0.1～50g/L葡萄糖溶液调整固体秸秆固含量的培养基，其pH为2.0～8.0；
所述的纤维素酶的加酶量为1～30FPU/g DM，FPU指纤维素酶液中的纤维素酶滤纸酶活，DM是指秸秆类物质干重；其中，纤维素酶液为商品化纤维素酶液；调整pH的溶液选自硫酸、氢氧化钙溶液、氢氧化钠溶液或者氨水中的一种或者两种以上混合溶液；
所述的营养盐为KH2PO4或K2HPO4 0.5～10g/L，MgSO4·7H2O 0.1～ 5g/L，(NH4)2SO4 0.5～10g/l，酵母萃取粉或玉米浆0.1～10g/L；
所述的固体秸秆选自固体秸秆原料或者固体秸秆处理物；
(3)种子液的多级扩大培养过程：
将步骤(2)获得的种子液接种于含固体秸秆的培养基，在培养基中固体秸秆的质量百分数为3～30％，加入纤维素酶和营养盐，在摇瓶或种子罐中扩大培养种子，培养转速100～500rpm，温度25～45℃，培养12～36小时，获得种子培养液；种子液多级培养过程中培养级数涵盖1级到6级，各培养级间接种量的体积百分比为5～20％，接种于发酵罐的种子液包括从1级到6级培养种子获得的任一级的培养液，得到含发酵菌种的浆液。
2.如权利要求1所述的一种以固体秸秆为碳源培养发酵种子液的方法，其特征在于，在所述的步骤(1)中，菌种接种于合成培养基，培养温度为30℃，转速为150rpm。
3.如权利要求1所述的一种以固体秸秆为碳源培养发酵种子液的方法，其特征在于，在所述的步骤(1)中，所述的菌种为酿酒酵母。
4.如权利要求1所述的一种以固体秸秆为碳源培养发酵种子液的方法其特征在于，在所述的步骤(2)中，转速为150rpm，温度为37℃，培养为18小时。
5.如权利要求1所述的一种以固体秸秆为碳源培养发酵种子液的方法，其特征在于，在所述的步骤(2)中，混合培养基的pH为5.0。
6.如权利要求1所述的一种以固体秸秆为碳源培养发酵种子液的方法，其特征在于，在所述的步骤(2)中，所述的固体秸秆原料选自玉米秸秆、麦秸、稻草中的一种。
7.如权利要求6所述的一种以固体秸秆为碳源培养发酵种子液的方法， 其特征在于，所述的固体秸秆原料选自玉米秸秆。
8.如权利要求1所述的一种以固体秸秆为碳源培养发酵种子液的方法，其特征在于，在所述的步骤(2)中，所述的固体秸秆处理物选自采用稀酸、蒸汽爆破、氨气爆破、生物法预处理后的玉米秸秆、麦秸、稻草中的一种。
9.如权利要求8所述的一种以固体秸秆为碳源培养发酵种子液的方法，其特征在于，所述的固体秸秆处理物选自蒸汽汽爆预处理的玉米秸秆。 
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