CN103695391A - 一种利用树干毕赤酵母固态发酵生产木聚糖酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用树干毕赤酵母固体发酵生产木聚糖酶的方法，属于发酵工程领域；本发明的目的是实现利用农业废弃物和小麦加工副产物固体发酵低成本生产木聚糖酶；本发明的特征为以树干毕赤酵母（Pichiastipitis）作为固态发酵菌种，以玉米芯和小麦麸皮作为固态发酵基质；固态发酵培养基中玉米芯与麸皮质量比1:6~6:1，培养基含水量74%~80%，按5%体积比例接种树干毕赤酵母种子发酵液，并在5~10厘米厚度的固体条件下28℃发酵9天；经后续工序可以得到液态和固态木聚糖酶；固态发酵具有耗能少、产物浓度高，因而成本较低；该木聚糖酶可以广泛应用于饲料工业、食品工业和生物转化等行业。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用树干毕赤酵母固态发酵生产木聚糖酶的方法，属于发酵工程领域。
背景技术
木聚糖酶是木聚糖水解酶系中最关键的水解酶，主要以内切方式作用于木聚糖分子中的β-1,4糖苷键，水解产物为木二糖和木寡糖等低聚木糖以及少量木糖和阿拉伯糖；木聚糖酶广泛应用于饲料工业、食品工业、造纸工业和生物转化等领域。
固态发酵是以低成本的农业废弃物（如小麦秸秆、麦麸、豆粕和玉米芯等）为发酵基质，在没有或几乎没有自由水的条件下进行发酵的技术，在食品加工、饲料生产、生物降解工农业残渣、生物解毒、生物转化等方面都取得了很好的效果；工业用酶大部分是用液态深层发酵生产，成本较高，而固态发酵直接利用低成本的农业废弃物，不但增加了经济可行性，而且减少了环境污染；研究表明，固态发酵过程与微生物自然生存环境相似，在生产包括木聚糖酶在内的一些降解酶和代谢产物方面具有显著优势。
木聚糖酶产生菌有很多，包括细菌、霉菌和酵母菌等，但到目前为止，没有见到有关利用树干毕赤酵母（Pichia stipitis）进行固态发酵产木聚糖酶的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种直接利用小麦加工副产物和农业废弃物等原料生产木聚糖酶的方法。
本发明的内容为一种利用树干毕赤酵母固态发酵生产木聚糖酶的方法，其特征在于： (1) 以树干毕赤酵母（Pichia stipitis）作为固态发酵菌种； (2) 以玉米芯和小麦麸皮作为固态发酵基质。
本发明所述的固态发酵生产木聚糖酶的方法，其步骤如下：(1) 将玉米芯和小麦麸皮粉碎过筛，以玉米芯与麸皮质量比1:6~6:1配制固态发酵培养基，添加少量水至培养基含水量74%~80%；(2) 将配制好的固态培养基于121℃灭菌30min，冷却；(3) 将采用YEPX液体培养基在28℃、120 rpm条件下培养3天的树干毕赤酵母种子培养液，按5%体积比例的接种量接种于固态培养基中，搅拌混合，轻轻压实，使得培养基厚度达到3~10厘米，在28℃下培养9天； (4) 发酵完成的固态培养物加入6~10倍体积的Tris-HCl缓冲液中，搅拌混合振荡均匀，离心后去除沉淀；上清液经超滤浓缩后添加稳定剂和防腐剂后包装，即为液态木聚糖酶。(5) 发酵完成的固态培养物经过真空低温干燥、粉碎和包装即为固态木聚糖酶。
本发明所采用的玉米芯和小麦麸皮，为玉米芯和小麦麸皮分别粉碎后，分别过20目筛，取筛下物；本发明所采用的的Tris-HCl缓冲液浓度为0.05 mol/L, pH值为8.0；本发明所采用YEPX液体培养基，其配方为（每升）：酵母膏10克，蛋白胨20克，木糖20克，去离子水970克。
采用本发明的固态发酵方法，利用树干树干毕赤酵母发酵木聚糖酶的实验如下：采用菌种为树干毕赤酵母，为本实验室筛选鉴定后的保藏菌种，木聚糖酶活力测定采用DNS法（参考Bailey M J，Biely P，Poutanen K. Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity[J]. Journal Biotechnology, 1992, 23: 257-270）。酶活力定义：在规定条件，每分钟分解木聚糖产生1μmol 木糖所需要的木聚糖酶量为1个单位酶活力（U）；实验结果见下表1。
表1 培养基配比对固体发酵产木聚糖酶的影响
| 玉米芯/麦麸 | 木聚糖酶活力U/g |
| 0:1 | 421 |
| 1:8 | 2405 |
| 1:2 | 4105 |
| 1:1 | 4326 |
| 2:1 | 3688 |
| 8:1 | 1425 |
| 1:0 | 1134 |
注：本发明中木聚糖酶活力均为每克干固体基质中的酶活力
可以看出，本发明的利用树干毕赤酵母固态发酵生产木聚糖酶的方法可以生产较高活力木聚糖酶，最高酶活达到4326 U/g；该法生产的木聚糖酶可以用于面粉和面制品行业改进面制品品质，也可以用于动物饲料以提高饲料利用率等方面。
具体实施方式
实施例一
将玉米芯和小麦麸皮粉碎过筛，以玉米芯与麸皮质量比1:1配制固态发酵培养基，添加少量水至培养基含水量80%；将配制好的固态培养基于121℃灭菌30min，冷却；将采用YEPX液体培养基在28℃、120 rpm条件下培养3天的树干毕赤酵母种子培养液，按5%体积比例的接种量接种于固态培养基中，搅拌混合，轻轻压实，使得培养基厚度达到5厘米，在28℃下培养9天； (4) 发酵完成的固态培养物加入8倍体积的0.05 mol/L, pH 8.0Tris-HCl缓冲液中，搅拌混合振荡均匀，离心后去除沉淀；上清液经超滤浓缩后添加稳定剂和防腐剂后包装，即为液态木聚糖酶；(5) 发酵完成的固态培养物经过真空低温干燥、粉碎和包装即为固态木聚糖酶。
实施例二
将玉米芯和小麦麸皮粉碎过筛，以玉米芯与麸皮质量比1:2配制固态发酵培养基，添加少量水至培养基含水量77%；将配制好的固态培养基于121℃灭菌30min，冷却；将采用YEPX液体培养基在28℃、120 rpm条件下培养3天的树干毕赤酵母种子培养液，按5%体积比例的接种量接种于固态培养基中，搅拌混合，轻轻压实，使得培养基厚度达到8厘米，在28℃下培养9天； (4) 发酵完成的固态培养物加入10倍体积的0.05 mol/L, pH 8.0Tris-HCl缓冲液中，搅拌混合振荡均匀，离心后去除沉淀；上清液经超滤浓缩后添加稳定剂和防腐剂后包装，即为液态木聚糖酶；(5) 发酵完成的固态培养物经过真空低温干燥、粉碎和包装即为固态木聚糖酶。
实施例三
将玉米芯和小麦麸皮粉碎过筛，以玉米芯与麸皮质量比2:1配制固态发酵培养基，添加少量水至培养基含水量74%；将配制好的固态培养基于121℃灭菌30min，冷却；将采用YEPX液体培养基在28℃、120 rpm条件下培养3天的树干毕赤酵母种子培养液，按5%体积比例的接种量接种于固态培养基中，搅拌混合，轻轻压实，使得培养基厚度达到10厘米，在28℃下培养9天； (4) 发酵完成的固态培养物加入6倍体积的0.05 mol/L, pH 8.0Tris-HCl缓冲液中，搅拌混合振荡均匀，离心后去除沉淀；上清液经超滤浓缩后添加稳定剂和防腐剂后包装，即为液态木聚糖酶；(5) 发酵完成的固态培养物经过真空低温干燥、粉碎和包装即为固态木聚糖酶。
实施例四
将玉米芯和小麦麸皮粉碎过筛，以玉米芯与麸皮质量比1:4配制固态发酵培养基，添加少量水至培养基含水量77%；将配制好的固态培养基于121℃灭菌30min，冷却；将采用YEPX液体培养基在28℃、120 rpm条件下培养3天的树干毕赤酵母种子培养液，按5%体积比例的接种量接种于固态培养基中，搅拌混合，轻轻压实，使得培养基厚度达到4厘米，在28℃下培养9天； (4) 发酵完成的固态培养物加入8倍体积的0.05 mol/L, pH 8.0Tris-HCl缓冲液中，搅拌混合振荡均匀，离心后去除沉淀。上清液经超滤浓缩后添加稳定剂和防腐剂后包装，即为液态木聚糖酶；(5) 发酵完成的固态培养物经过真空低温干燥、粉碎和包装即为固态木聚糖酶。
实施例五
将玉米芯和小麦麸皮粉碎过筛，以玉米芯与麸皮质量比4:1配制固态发酵培养基，添加少量水至培养基含水量77%；将配制好的固态培养基于121℃灭菌30min，冷却；将采用YEPX液体培养基在28℃、120 rpm条件下培养3天的树干毕赤酵母种子培养液，按5%体积比例的接种量接种于固态培养基中，搅拌混合，轻轻压实，使得培养基厚度达到9厘米，在28℃下培养9天； (4) 发酵完成的固态培养物加入7倍体积的0.05 mol/L, pH 8.0Tris-HCl缓冲液中，搅拌混合振荡均匀，离心后去除沉淀。上清液经超滤浓缩后添加稳定剂和防腐剂后包装，即为液态木聚糖酶；(5) 发酵完成的固态培养物经过真空低温干燥、粉碎和包装即为固态木聚糖酶。
Claims (5)
1.一种利用树干毕赤酵母固态发酵生产木聚糖酶的方法，其特征在于：
(1) 以树干毕赤酵母（Pichia stipitis）作为固态发酵菌种；
(2) 以玉米芯和小麦麸皮作为固态发酵基质；
2.权利要求1所述的一种利用树干毕赤酵母固态发酵生产木聚糖酶的方法，其步骤如下：
(1) 将玉米芯和小麦麸皮粉碎过筛，以玉米芯与麸皮质量比1:6~6:1配制固态发酵培养基，添加少量水至培养基含水量74%~80%；
(2) 将配制好的固态培养基于121℃灭菌30min，冷却；
(3) 将采用YEPX液体培养基在28℃、100 rpm条件下培养3天的树干毕赤酵母种子培养液，按5%体积比例的接种量接种于固态培养基中，搅拌混合，轻轻压实，使得培养基厚度达到5~10厘米，在28℃下培养9天；
(4) 发酵完成的固态培养物加入6~10倍体积的Tris-HCl缓冲液中，搅拌混合振荡均匀，离心后去除沉淀。上清液经超滤浓缩后添加稳定剂和防腐剂后包装，即为液态木聚糖酶；
(5) 发酵完成的固态培养物经过真空低温干燥、粉碎和包装即为固态木聚糖酶。
3.根据权利要求2所述的玉米芯和小麦麸皮，其特征在于玉米芯和小麦麸皮分别粉碎后，分别过20目筛，取筛下物。
4.根据权利要求2所述的Tris-HCl缓冲液，其特征在于Tris-HCl缓冲液的浓度为0.05 mol/L, pH值为8.0。
5.根据权利要求2所述的YEPX液体培养基，其配方为（每升）：酵母膏10克，蛋白胨20克，木糖20克，去离子水970克。
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