CN103343156A - 一种纤维质原料固态发酵生产燃料乙醇的方法和装置 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种纤维质原料固态发酵生产燃料乙醇的方法及装置，本发明将混合菌固态发酵产酶和底物降解同步发酵产乙醇耦合在一起，充分利用固态发酵过程微生物及其新陈代谢作用合成的有效酶对底物的连续酶解作用，促使底物中纤维素和半纤维素获得有效降解；充分利用底物降解过程产生的高浓度糖及其未降解基质和发酵同步合成的复合酶混合物，将碳源基质同步糖化发酵转化为乙醇，乙醇产率达到理论转化率的37%以上，此过程避免了高成本商业纤维素酶的应用，可以大大降低燃料醇的生产成本；本发明提供的固态浅盘发酵装置，结构简单、制作容易，可克服单一菌株发酵产酶的缺陷及固态发酵反应器中基质温湿度分布不均一、易感染杂菌等问题。

Description

一种纤维质原料固态发酵生产燃料乙醇的方法和装置
技术领域：
本发明涉及微生物发酵的技术领域，具体涉及一种纤维质原料固态发酵生产燃料乙醇的方法和装置。
背景技术：
纤维素酶等生物酶的生产通常分为固态发酵和液态深层发酵两种方法。目前，市场上销售的生物酶大多是用液态深层发酵技术生产的，其发酵制备过程不仅有大量的废水产生、而且需要通气和搅拌等高动力能耗，生产成本相对较高。相对液态发酵，固态发酵技术是在体系没有或基本没有游离水条件下，微生物在固态基质上利用自然底物为碳源的发酵过程，具有节水、节能及清洁生产等优势，其发酵过程粗放，不需严格无菌条件，微生物在仿生态条件下易于生长，酶系丰富，且设备投资少、易操作。
自然界中，木质纤维生物质的降解是通过多种产酶微生物的相互协作、共同作用完成的。大量研究发现，目前公认的较好的纤维素酶生产菌里氏木霉及其近缘菌株，普遍存在产生的β-葡萄糖苷酶活性偏低的缺陷，采用单菌产纤维素酶在实践中已被证明有很大的局限性。虽然科研工作者们在提高纤维素酶活性及其发酵工艺和菌株选育等方面近年来已做了大量的研究工作，但进展甚微。而利用固态发酵微生态原理提高多菌协同产纤维素酶的能力，已被大量研究证实其能有效提高酶的活性并能抑制杂菌生长。
固态发酵过程微生物通过新陈代谢将底物降解为其他物质（纤维质原料主要降解为单糖和聚糖类物质），降解产物一部分作为碳源用于微生物自身生长并同时合成代谢产酶等，一部分被释放到外界环境。试验发现，混合固态发酵过程，复合酶合成的同时，固态基质中检测到有大量糖类物质的生成，高浓度的糖液可为后续酒精的发酵提供丰富的碳源。将未降解的底物和多糖混合物在发酵过程合成的高效复合酶和接种酵母的作用下，可同步糖化发酵直接转化为酒精。传统的共培养技术多为黑曲霉和里氏木霉混合发酵产复合酶，这些研究大多集中在高效纤维素酶的制备方面，以高产β-葡萄糖苷酶的青霉与里氏木霉固态发酵混合物进行酒精发酵，将多菌种固态发酵技术用于纤维质底物一步法降解产乙醇的研究还未见报道。
发明内容：
本发明的目的是提供一种纤维质原料固态发酵生产燃料乙醇的方法。
本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一种纤维质原料固态发酵生产燃料乙醇的方法，包括以下步骤：
a、原料碱法预处理：取粉碎过60目筛后的纤维质原料（干基），在固液质量比1:20的条件下与0.5mol/L的NaOH溶液混合，80℃水浴搅拌反应2h后，固液分离，固体经过滤洗涤至pH中性，50℃烘干至恒重（完全无水）保存；
b、固态发酵培养基配置：往经碱处理后的纤维质原料里添加麸皮，所述纤维质原料与麸皮的质量比为7:3，再加入配置好的Mandel营养盐溶液(Mandel and Medeiros,1981)，固液比为1:2.5，充分搅拌均匀得到底物；
c、固态浅盘发酵培养：在简易固态浅盘发酵装置的发酵浅盘中装入步骤b得到的底物，随后将浅盘置于发酵反应器，121℃高压灭菌20min，冷却后，按体积比为8%的接种量均匀接种孢子悬液，然后将发酵反应器放入恒温恒湿箱中，于28～30℃、接触空气条件下，连续发酵培养72h，发酵产物经无菌水浸提，测总糖含量和酶活力；
所述孢子悬液的制备过程为：将里氏木霉CICC40359、斜卧青霉LSM-1或CICC40361菌株分别在PDA（1L：200g马铃薯，20g葡萄糖，20g琼脂）培养基上30℃恒温培养6～7d，待孢子成熟后，将孢子接入PDA液体种子培养基中（1L：200g马铃薯，20g葡萄糖），在30℃好氧条件下培养48h，使菌丝量干重达6～8g/L，按照试验要求用量接种（混合菌接种比例按照体积接种比CICC40359:LSM-1为1:3；CICC40359:CICC40361则为1:2）；
d、乙醇发酵：将步骤c发酵72h后的混和底物平行样从浅盘移至三角瓶中，加入0.2M,pH5.0的HAc-NaAc缓冲液，充分搅拌后接入酿酒酵母进行乙醇发酵，定时取样检测乙醇含量和底物中残余糖含量。
步骤1所述纤维质原料包括甘蔗渣、稻草粉等木质纤维素原料。
所述Mandel营养盐溶液，每100mL营养盐溶液中含有（NH4）2SO40.6g，KH2PO40.43g，MgSO4·7H2O 0.03g，CaCl2·2H2O 0.03g，微量元素：FeSO4·7H2O 0.5mg，MnSO4·H2O 0.16mg，ZnSO4·7H2O 0.14mg，CoCl20.2mg。
作为本发明的改进，将步骤d发酵结束固液分离后的固态发酵残余物资源化再利用加工成有机肥料或饲料。
本发明固态发酵产糖生产乙醇的方法，其核心在于利用混合菌固态发酵降解转化底物生产糖步骤。
本发明还提供了实现步骤c的简易固态浅盘发酵装置，该装置为圆柱形玻璃罐体，内设发酵单元，所述罐体外壁设有无菌透气孔，罐体顶部设有上盖，所述上盖设有接种区域，所述接种区域设有接种孔；所述发酵单元由圆形浅盘构成，所述圆形浅盘通过玻璃罐体内壁上对应设有的挡板进行固定。
作为本装置的一种改进，所述玻璃罐体外壁设的无菌透气孔距罐底留有一定距离，罐体底部可盛放无菌水，便于调节固态发酵基质的温度、湿度和通气；微生物在外壁设有无菌透气孔的玻璃罐体内相对密闭的环境中静止发酵，有效防止杂菌进入，又能与外界发生气体交换（通气、通湿），保证菌体生长所需的氧气使发酵单元处于最佳的发酵状态。
作为本发明的一种改进，所述接种区域均匀分布多个接种孔，能够满足多菌种接种和接种分布均匀的要求。
所述发酵浅盘为圆形，以尽量减少微生物的生长死角。浅盘采用不锈钢筛网制作而成，直径为10cm，网孔直径（大小）介于0.1～0.5mm，微生物可在浅盘上下表面生长，具有增大基质可利用表面、防菌、防水、透气等性能，便于传质传热。
作为本发明的进一步说明，上述发酵单元的圆形浅盘通过罐体内壁上对应设有的挡板进行固定，挡板长度介于1.0～1.5cm，当然，欲将发酵浅盘固设于罐体还有很多其他方式，在这不再详述。
作为本发明的进一步说明，把装载有发酵单元的上述玻璃罐体放置于一个大环境中，需通过通风、加湿装置及其它控制装置对其进行控温、控湿、通气，对其整个大环境的温湿度无严格要求。
本发明的有益效果：
本发明将混合菌固态发酵产酶和底物降解同步发酵产乙醇耦合在一起，充分利用固态发酵过程微生物及其新陈代谢作用合成的有效酶对底物的连续酶解作用，促使底物中纤维素和半纤维素获得有效降解；充分利用底物降解过程产生的高浓度糖及其未降解基质和发酵同步合成的复合酶混合物，将碳源基质同步糖化发酵转化为乙醇，乙醇的产率可以达到理论转化率的37%以上，此过程避免了高成本商业纤维素酶的应用，大大降低了纤维乙醇的生产成本。
本发明提供的实现步骤c的简易固态浅盘发酵装置，结构简单、制作容易，可克服单一菌种发酵产酶的缺陷及固态发酵反应器中基质温湿度分布不均一、易感染杂菌等问题，其中发酵单元厚度可根据微生物特性及物料性质进行调节，适用于各种固体物料进行真菌、细菌等微生物混合固态发酵。
附图说明：
图1是本发明的工艺过程示意图；
图2是本发明装置的主视图；
图3是本发明装置的俯视图；
图4是本方明装置的剖视图；
其中，1、接种孔，2、无菌透气孔，3、挡板，4、罐体，5、接种区域，6、圆形浅盘，7、上盖。
具体实施方式：
以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
如图2，3和4所示，本实施例装置简易固态浅盘发酵装置（多菌混合固态发酵反应装置）为圆柱形玻璃罐体，内设发酵单元，所述罐体4外壁设有6个无菌透气孔2，罐体4顶部设有上盖7，所述上盖7设有接种区域5，所述接种区域5设有7个接种孔1；所述发酵单元由圆形浅盘6构成，所述圆形浅盘6通过玻璃罐体4内壁上对应设有的挡板3（用于放置浅盘，共3个）进行固定。圆形浅盘6用于盛放发酵基质，其间的发酵物料处于一种小环境，发酵实质是在一个独立而相对封闭的固态发酵空间完成。所述玻璃罐体4外壁设的无菌透气孔2距罐底留有一定距离，使装置底部可盛放一定高度的无菌水，用以维持固态发酵基质湿度和空气湿度。
实施例1：
工艺过程示意图如图1所示，蔗渣经粉碎、过筛收集粒径60目原料，进行低温碱法预处理，以大部分去除原料中对纤维素和半纤维素降解有阻碍作用的木质素成分，对微生物生长代谢转化底物提供有利条件，碱法预处理具体过程为：称取粉碎过筛后的蔗渣原料（干基）100g，在固液质量比1:20条件下与0.5mol/L的NaOH溶液混合，80℃水浴搅拌反应2h，反应结束后，固液分离，固体洗济至pH中性，于50℃烘干至恒重（完全无水）保存，用作发酵原料；在碱处理后的蔗渣原料中添加麸皮，蔗渣与麸皮二者质量比为7:3，同时添加配置好的Mandel营养盐溶液(Mandel and Medeiros,1981)（100mL营养盐溶液：（NH4）2SO40.6g，KH2PO40.43g，MgSO4·7H2O 0.03g，CaCl2·2H2O 0.03g，微量元素：FeSO4·7H2O 0.5mg，MnSO4·H2O 0.16mg，ZnSO4·7H2O 0.14mg，CoCl20.2mg），调整固液（W:V）比为1:2.5，充分混合，搅拌均匀；将上述混合底物按照10g湿料（3g绝干混合料）/每盘均匀分装至D10×2cm的简易固态浅盘发酵装置的圆形浅盘6，使载有发酵底物的浅盘均匀厚度为2cm；将上述圆形浅盘6通过内置于发酵罐体4内壁的挡板3进行固定，加罐体上盖7；随后载有发酵圆形浅盘6的玻璃罐体在121℃灭菌20min，按照8%（混合菌接种体积比例根据前期试验优化里氏木霉CICC40359:斜卧青霉LSM-1为1:3）（V/V）接种量通过罐体上盖7接种区域5设置的接种孔1均匀接入事先活化3d的孢子悬液，同时在发酵罐体底部装入一定高度无菌水，以维持固态发酵基质湿度；接种后的发酵反应器置于恒温恒湿箱中，控制发酵温度为30℃，空气湿度为92%；发酵72h后固态基质中糖含量有最大值，取样加入30mL无菌水在30℃，150rpm稀释溶解1h，离心后检测总糖浓度，同时将发酵3d的平行样混合底物（包括未降解底物、发酵生成的糖及微生物在降解底物过程合成的有效复合酶）从浅盘移至50mL三角烧瓶中，加入30mL0.2M pH5.0的HAC-NaAC缓冲液，搅拌均匀后接入10%（V/V）已经活化好的酵母种子液，在30℃，150rpm酒精发酵72h，定时取样。经检测，混合菌发酵3d后底物中葡萄糖和木糖含量分别为10.291g/L和6.834g/L，总糖浓度达到21.303g/L；发酵24h酒精浓度最高达到5.825g/L，为理论酒精转化率的40.84%。发酵结束后，固液分离，固体残渣可资源化再利用作为有机肥料或饲料的加工原料等。
实施例2：
参考实施例1，不同的是孢子悬液中混合菌为里氏木霉CICC40359与斜卧青霉CICC40361，且两者接种的体积比为1:2，接种后的发酵反应器放置于恒温恒湿箱中，控制发酵温度为28℃，空气湿度为92%，发酵72h后基质中糖含量有最大值，取样加入30mL无菌水在30℃，150rpm稀释溶解1h，离心后检测总糖浓度，同时将发酵3d的平行样混合底物（包括未降解底物、发酵生成的糖及微生物在降解底物过程合成的有效复合酶）从浅盘移至50mL三角烧瓶中，加入30mL0.2M pH5.0的HAC-NaAC缓冲液，搅拌均匀后接入10%（V/V）已经活化好的酵母种子液，在30℃，150rpm酒精发酵72h，定时取样。经检测，混合菌发酵3d后底物中葡萄糖和木糖含量分别为9.183g/L和5.721g/L，总糖浓度达到19.538g/L；发酵24h酒精浓度最高达到5.341g/L，为理论酒精转化率的37.45%。发酵结束后，固液分离，发酵固体残渣可资源化再利用加工为有机肥料或饲料等。
实施例3
参照实施例1，不同的是发酵纤维质原料为稻草粉，其经与实施例1相同的固态发酵培养基配置过程后，按照8%（里氏木霉CICC40359:斜卧青霉LSM-1为1:3）（V/V）接种量接种，并经相同过程发酵，经检测，混合菌发酵3d后底物中葡萄糖和木糖含量分别为10.035g/L和6.928g/L，总糖浓度达到20.209g/L；发酵24h酒精浓度最高达到5.675g/L，为理论酒精转化率的39.79%。发酵结束后，固液分离，固体残渣可资源化再利用加工为有机肥料或饲料等。
以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变通。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变通，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种纤维质原料固态发酵生产燃料乙醇的方法，包括以下步骤：
a、原料碱法预处理：取粉碎过60目筛后的纤维质原料，在固液质量比1:20的条件下与0.5mol/L的NaOH溶液混合，80℃水浴搅拌反应2h后，固液分离，固体经过滤洗涤至pH中性，50℃烘干至恒重保存；
b、固态发酵培养基配置：往经碱处理的纤维质原料里添加麸皮，所述纤维质原料与麸皮的质量比为7:3，再加入配置好的Mandel营养盐溶液，固液比为1:2.5，充分搅拌均匀得到底物；
c、固态浅盘发酵培养：在简易固态浅盘发酵装置的发酵浅盘中装入步骤b得到的底物，随后将浅盘置于发酵反应器，121℃高压灭菌20min，冷却后，按体积比为8%的接种量均匀接种孢子悬液，然后将发酵反应器放入恒温恒湿箱中，于28～30℃、接触空气条件下，连续发酵培养72h，发酵产物经无菌水浸提，测总糖含量和酶活力；
所述孢子悬液的制备过程为：将里氏木霉CICC40359、斜卧青霉LSM-1或CICC40361菌株分别在PDA培养基上30℃恒温培养6～7d，待孢子成熟后，将孢子接入PDA液体种子培养基中，在30℃好氧条件下培养48h，使菌丝量干重达6～8g/L，按照体积接种比CICC40359:LSM-1为1:3或CICC40359:CICC40361为1:2接种；
d、乙醇发酵：将步骤c发酵72h后的混和底物平行样从浅盘移至三角瓶中，加入0.2M,pH5.0的HAc-NaAc缓冲液，充分搅拌后接入酿酒酵母进行乙醇发酵，定时取样检测乙醇含量和底物中残余糖含量。
2.一种权利要求1方法使用的简易固态浅盘发酵装置，其特征在于该装置为圆柱形玻璃罐体，内设发酵单元，所述罐体外壁设有无菌透气孔，罐体顶部设有上盖，所述上盖设有接种区域，所述接种区域设有接种孔；所述发酵单元由圆形浅盘构成，所述圆形浅盘通过玻璃罐体内壁上对应设有的挡板进行固定。
3.根据权利要求2所述的简易固态浅盘发酵装置，其特征在于所述玻璃罐体外壁设的无菌透气孔距罐底留有距离。.
4.根据权利要求2所述的简易固态浅盘发酵装置，其特征在于所述接种区域均匀分布多个接种孔。
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