CN103740675A - 一种纤维素酶的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种纤维素酶的生产方法，属于生物技术领域。其特征是采用乳酸菌和复合霉菌两段发酵金针菇菌糠生产纤维素酶，此法制酶原料来源广泛，成本低廉，酶系完全，稳定性好，效率高，不仅便于进行大规模工业化生产，而且可以缓解环境污染问题。由此法制得的酶平均酶活572U／g，不仅可用于燃料乙醇生产，还可用于纺织、食品、饲料和化工等各个方面。

Description

一种纤维素酶的生产方法
技术领域
本发明涉及一种纤维素酶的生产方法，属于生物技术领域。
背景技术
随着石化燃料由短缺变枯竭，能源是人类面临的共同问题。寻找新的能源关系到经济的可持续发展乃至人类的生存问题。纤维素与石化燃料不同，它是一种可再生的资源。地球上每年光合作用可产生大于100亿吨的植物干物质，其中一半以上是纤维素和半纤维素。纤维素是一种多糖，在纤维素酶的催化条件下可分解产生二糖或葡萄糖，再发酵产生乙醇等能源物质。
可惜的是纤维素的利用目前尚未完全开发，造成资源的巨大浪费。为了更好地利用纤维素，愈来愈多的国外学者开始关注纤维素酶的研究，然而，纤维素酶降解纤维素机理复杂，对酶的活性要求较高，因此致使燃料乙醇生产成本非常高，还不能广泛应用。纤维素乙醇发酵领域的十几个中国专利的内容都集中在糖化环节的开发方面，没有酶方面的专利，因此在实现纤维素乙醇产业化生产时，需要引进由国外专利控制的酶。因此，开发具有我国独立的自主知识产权的技术，是促进我国燃料乙醇工业快速发展的关键。
目前，纤维素酶的生产有固体发酵和液体发酵两种方法。固体发酵法是以玉米等农作物秸秆为主要原料，以单一菌种作为发酵菌种，其投资少、工艺简单、产品价格低廉，目前国内绝大多数纤维素酶生产厂家均采用该技术生产纤维素酶。然而传统的固体发酵法存在根本上的缺陷：(1)玉米等农作物秸秆这些天然纤维素原料是水不溶性的，在培养过程中不能直接被发酵菌种细胞吸收而进入细胞内诱导纤维素酶的合成；(2)纤维素酶诱导物只能由发酵菌株本身适应环境后发酵产生，产酶效率低下；(3)菌种发酵基质的营养成分主要靠外来添加，操作复杂，成本较高；(4)单一菌种发酵，产酶效率低，酶系不完全。
发明内容
本发明提供了一种旨在克服传统的固体发酵产纤维素酶的缺点，利用细菌和霉菌两段发酵金针菇菌糠生产纤维素酶的方法。
本发明是通过如下方式来实现的：
一种纤维素酶的生产方法，其特征是采用乳酸菌和复合霉菌两段发酵金针菇菌糠生产纤维素酶，其中第一段首先接种乳酸菌，乳酸菌发酵金针菇菌糠作为第二段复合霉菌发酵产纤维素酶的营养成分和纤维素酶诱导物来源；第二段在乳酸菌发酵过的底物上再接种复合霉菌，乳酸菌和复合霉菌共培养，两种霉菌协同互补，从而最终高效率地制得低成本、高活性、酶系完全的纤维素酶。
一种纤维素酶的生产方法，其具体的步骤如下：
(1)分别将乳酸菌，绿色木霉和黑曲霉各自进行活化、逐级扩大培养，制备成菌液，其中两种霉菌制备成复合霉菌制剂；
(2)将金针菇采收后的无污染的新鲜金针菇菌糠，加入麸皮，充分混合均匀，调整水分含量最终为40-50％；
(3)在(2)处理过的金针菇菌糠中接种(1)制备的乳酸菌液，接种量为混合物干重的0.1-0.3％，充分搅拌，使微生物和金针菇菌糠充分接触；
(4)将(3)获得的混合物放于水泥筑成的发酵池或简易发酵池中，发酵池深度为45-65cm，以塑料薄膜密封发酵池，在25-32℃保温，厌氧发酵3-5d；
(5)向(4)制得的基质中加入(1)制备的复合霉菌制剂，接种量为混合物干重的1-2％，在25-35℃保温，每天翻转发酵物一次，好氧发酵3-5d，烘干，粉碎至3目。
纤维素酶的具体生产步骤(2)，其特征是以金针菇菌糠作为最初的底物，这使得生产成本显著降低。
纤维素酶的具体生产步骤(3)(4)，其特征是首先由乳酸菌发酵金针菇菌糠，这样不仅积累了丰富的营养成分而且将大分子的不溶于水的纤维素降解为了小分子的水溶性的纤维二糖等，使金针菇菌糠成为一种富含营养成分和纤维素酶诱导物的优质的产纤维素酶的培养基。
纤维素酶的具体生产步骤(5)，其特征是复合霉菌制剂由绿色木霉和黑曲霉组成，按照绿色木霉：黑曲霉=0.8-1.5的比例复配培养，协同互补，这样可以避免产酶过程中的反馈抑制作用，诱导纤维素酶大量产生，得到酶系完全、酶活性高的纤维素酶。
纤维素酶的具体生产步骤(5)，其特征是乳酸菌和复合霉菌共培养，乳酸菌只负责营养成分和纤维素诱导物的供应，复合霉菌只负责产纤维素酶，两者分工进行，从而使纤维素酶的生产效率大大提高。
按照纤维素酶的生产步骤制得的纤维素酶为淡黄色固体粉末，活力达到平均572U/g，气味为醇香和酸味。
本发明中使用的金针菇菌糠是可再生资源，来源广泛，价格低廉；本发明中第一段是利用乳酸菌对金针菇菌糠进行厌氧固体发酵，为第二段霉菌发酵产纤维素酶提供了丰富的营养成分和纤维素酶诱导物，达到了节能效果，产酶成本降低；第二段采用复合霉菌发酵，多菌合作，酶系互补，制得的纤维素酶酶系完全；接种复合霉菌后，乳酸菌和复合霉菌共培养，乳酸菌负责营养成分和纤维素酶诱导物的供应，复合霉菌负责产纤维素酶，两者分工进行，效率大大提高；此纤维素酶生产法不仅便于进行大规模工业化生产，而且可以缓解环境污染问题。
本发明实施成功后可显著降低燃料乙醇的生产成本，实现可再生资源循环利用，对解决全球能源危机可起到促进作用。
具体实施方式
本发明通过以下具体实施例进一步详述，但不限于本实施例。
采取的发酵原料为含有麸皮、玉米芯、棉籽壳的金针菇菌糠，乳酸菌菌液培养至细胞生物量为3-5万亿。
实施例1：
(1)复合霉菌菌液中绿色木霉：黑曲霉=1.5。
(2)食用菌菌糠中乳酸菌菌液接种量为干物质的0.1％，厌氧发酵5d后，复合霉菌菌液按干物质的1％接种，通风培养，30℃条件下发酵7d。
实施例2：
(1)复合霉菌菌液中绿色木霉：黑曲霉=1。
(2)食用菌菌糠中乳酸菌菌液接种量为干物质的0.2％，厌氧发酵4d后，复合霉菌菌液按干物质的1.5％接种，通风培养，30℃条件下发酵6d。
实施例3：
(1)复合霉菌菌液中绿色木霉：黑曲霉=0.8。
(2)食用菌菌糠中乳酸菌菌液接种量为干物质的0.3％，厌氧发酵3d后，复合霉菌菌液按干物质的2％接种，通风培养，30℃条件下发酵5d。
实施例4：
对实施例1、2、3生产的纤维素酶制剂进行主要理化指标检测，结果如下：
有效活菌数 纤维素酶活 pH 气味 颜色和状态
≥10亿CFU／g ≥572U／g 5.0-6.2 醇味和酸味 淡黄色固体粉末

Claims (7)

1.一种纤维素酶的生产方法，其特征是采用乳酸菌和复合霉菌两段发酵金针菇菌糠生产纤维素酶，其中第一段首先接种乳酸菌，乳酸菌发酵金针菇菌糠作为第二段复合霉菌发酵产纤维素酶的营养成分和纤维素酶诱导物的来源；第二段在乳酸菌发酵过的底物上再接种复合霉菌，乳酸菌和复合霉菌共培养，两种霉菌协同互补，从而最终高效率地制得低成本、高活性、酶系完全的纤维素酶。
2.如权利要求1所述的一种纤维素酶的生产方法，其具体的步骤如下：
(1)分别将乳酸菌，绿色木霉和黑曲霉各自进行活化、逐级扩大培养，制备成菌液，其中两种霉菌制备成复合霉菌制剂；
(2)将金针菇采收后的无污染的新鲜金针菇菌糠，加入麸皮，充分混合均匀，调整水分含量最终为40-50％；
(3)在(2)处理过的金针菇菌糠中接种(1)制备的乳酸菌液，接种量为混合物干重的0.1-0.3％，充分搅拌，使微生物和金针菇菌糠充分接触；
(4)将(3)获得的混合物放于水泥筑成的发酵池或简易发酵池中，发酵池深度为45-65cm，以塑料薄膜密封发酵池，在25-32℃保温，厌氧发酵3-5d；
(5)向(4)制得的基质中加入(1)制备的复合霉菌制剂，接种量为混合物干重的1-2％，在25-35℃保温，每天翻转发酵物一次，好氧发酵3-5d，烘干，粉碎至3目。
3.如权利要求2(2)所述的步骤，其特征是以金针菇菌糠作为最初的底物，这使得生产成本显著降低。
4.如权利要求2(3)(4)所述的步骤，其特征是首先由乳酸菌发酵金针菇菌糠，这样不仅积累了丰富的营养成分而且将大分子的不溶于水的纤维素降解为了小分子的水溶性的纤维二糖等，使金针菇菌糠成为一种富含营养成分和纤维素酶诱导物的优质的产纤维素酶的培养基。
5.如权利要求2(5)所述的步骤，其特征是复合霉菌制剂由绿色木霉和黑曲霉组成，按照绿色木霉：黑曲霉=0.8-1.5的比例复配培养，协同互补，这样可以避免产酶过程中的反馈抑制作用，诱导纤维素酶大量产生，得到酶系完全、酶活性高的纤维素酶。
6.如权利要求2(5)所述的步骤，其特征是乳酸菌和复合霉菌共培养，乳酸菌只负责营养成分和纤维素诱导物的供应，复合霉菌只负责产纤维素酶，两者分工进行，从而使纤维素酶的生产效率大大提高。
7.如权利要求2所述的步骤制得的纤维素酶为淡黄色固体粉末，活力达到平均572U／g，气味为醇香和酸味。
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