CN1654642A - 高活性纤维素酶及其制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高活性纤维素酶及其制造方法，尤指一种用担子菌制造得到的高活性纤维素酶及其制造方法，属微生物制造领域。以担子菌CGMCCNo.1294作为生产菌种，采用下述配比的培养基，经灭菌接入三角瓶液体菌种，进行液体深层发酵，培养基配方如下：碳源：0.8－2.5％，麸皮：0.8－2.0％，豆饼粉：0.5－1.0％，硫酸铵：0.2－0.4％，磷酸二氢钾：0.1％，硫酸镁：0.05％，Tween－80 0.1％；发酵罐液体培养基装入量为70％，培养基pH值为4.0－6.0，发酵温度为28－30℃，通气量为1∶0.04－1.0，发酵时间为96－120小时；发酵后发酵液经过滤、浓缩和喷雾干燥制成纤维素酶粉。本发明的优点是：方法生产稳定性好、不易染菌、便于大规模工业化生产。利用此方法生产的酶，经测定酶活力为40000u/g，高于目前国内纤维素酶产品生约1－2倍。
Description
技术领域
本发明涉及一种高活性纤维素酶及其制造方法，尤指一种用担子菌制造得到的高活性纤维素酶及其制造方法，属微生物制造领域。
背景技术
纤维素酶广泛应用于食品、饲料、酿酒、纺织等领域，按其来源可分为真菌源性纤维素酶和细菌源性纤维素酶两种。目前，用于生产纤维素酶的微生物菌种较多的是丝状真菌，其中酶活力较强的菌种为木霉属(Trichoderma)、曲霉属(As pergillus)和青霉属(Penicillium)，特别是绿色木霉(Trichoder mavirde)及其近缘菌株等较为典型，是目前公认的较好的纤维素酶生产菌。反刍动物依靠瘤胃微生物可消化纤维素，如瘤胃细菌(黄化瘤胃球菌、白色瘤胃球菌等)和热纤梭菌等，但产量和活性较低。
生产高活性纤维素酶的关键是选育高产菌株。目前工业化生产多采用木霉作为生产菌种，这些菌种易产生霉菌毒素，这些毒素被认为对人和动物可能存在着危害，因此采用木霉生产的纤维素酶，作为食品和饲料添加剂，需除去这些霉菌毒素，这样会大大增加生产成本。
国内外纤维素酶制造方法有固体和液体两种发酵方法。固体发酵设备投资少，但占地面积大、易染杂菌、生产稳定性较差，而且技术不易掌握，难以进行大规模工业化生产，我国目前多数企业仍采用固体发酵工艺生产纤维素酶。液体发酵具有生产稳定性高、技术易掌握、便于大规模工业化生产，但因纤维素酶为诱导酶，采用天然纤维素类物质如玉米秸、麦秸、稻草等作为诱导物，效果并不十分理想，因此在纤维素酶液体发酵中多数企业采用价格昂贵的纤维素为原料，这样大大地增加了生产的成本，影响了该技术的推广应用。
发明内容
本发明要解决的首要技术问题是克服已有技术的不足，提供一种以担子菌作为生产菌种、适于大规模工业化生产的制造高活性纤维素酶的液体发酵生产工艺。
本发明要进一步解决的技术问题是提供一种来源广泛、成本低廉的培养基碳源。
本发明要解决的第三个技术问题是提供一种生产高活性纤维素酶的担子菌。
本发明要解决的第四个技术问题是提供一种高活性的纤维素酶。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种高活性纤维素酶的制造方法，以担子菌CGMCCNo.1294作为生产菌种，采用下述配比的培养基，经灭菌接入三角瓶液体菌种，进行液体深层发酵，
培养基配方如下：
碳源：0.8-2.5％ 麸皮：0.8-2.0％ 豆饼粉：0.5-1.0％
硫酸铵：0.2-0.4％ 磷酸二氢钾：0.1％ 硫酸镁：0.05％ Tween-80 0.1％；
发酵罐液体培养基装入量为70％，培养基pH值为4.0-6.0，发酵温度为28-30℃，通气量为1∶0.04-1.0，发酵时间为96-120小时；
发酵后发酵液经过滤、浓缩和喷雾干燥制成纤维素酶粉。
所述发酵后发酵液的过滤为经板框过滤或离心过滤。
所述发酵后发酵液的浓缩为用膜或真空浓缩方法将发酵液中酶的浓度浓缩为原液的8-10倍。
本发明所使用的碳源可以是目前用于纤维素酶生产的常用碳源，如纯纤维素、玉米秸、麦秸、稻草等。
为了进一步降低生产成本，提高生产效率，本发明同时提供另一种优质的碳源物质。利用筛选的担子菌LKY01菌种，以棉花作为特异性诱导碳源，与纯纤维素、玉米秸、麦秸、稻草等作为碳源相比可提高酶活5-10倍。所述碳源采用棉花、棉短绒或棉纺织品下脚料，发酵前需用化学或物理方法预处理：1)用物理方法，粉碎棉纤维长度小于1cm，可用于发酵；2)或采用化学方法，将棉花、棉短绒或棉纺织品下脚料用1-2％盐酸溶液，加热水解8-10小时，经中和至pH为6，可用于发酵。
一种生产高活性纤维素酶的担子菌LKY01，从河北棉花地土样中筛选和分离得到，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市海淀区中关村北一条13号，100080，电话：010-62542758)，保藏日为2005年1月18日，保藏号为CGMCCNo.1294，建议的分类命名为担子菌。该菌株经科院微生物所鉴定，具有以下特征：送检菌株在PDA平板上25℃培养7天直径5-6cm，菌落白色，絮状，无色素产生。菌丝宽2-3μm，有锁状联合，见图1。以棉子皮∶锯末∶麸皮(4∶4∶2)为培养料做栽培试验，10℃、20℃、30℃培养3个月均不产子实体。送检菌株不易产生产孢结构，难以确定分类地位。但据其菌丝具有锁状联合的特征，可初步将送检菌株归于担子菌类，为一担子菌菌株(a basidiomycetous fungus)。
一种高活性的纤维素酶，是按照下述方法制备得到的：
以担子菌CGMCCNo.1294作为生产菌种，采用下述配比的培养基，经灭菌接入三角瓶液体菌种，进行液体深层发酵，
培养基配方如下：
碳源：0.8-2.5％ 麸皮：0.8-2.0％ 豆饼粉：0.5-1.0％
硫酸铵：0.2-0.4％ 磷酸二氢钾：0.1％ 硫酸镁：0.05％ Tween-80 0.1％；
发酵罐液体培养基装入量为70％，培养基pH值为4.0-6.0，发酵温度为28-30℃，通气量为1∶0.04-1.0，发酵时间为96-120小时；发酵后发酵液经过滤、浓缩和喷雾干燥制成纤维素酶粉。过滤、浓缩和喷雾干燥的方法同上所述。
本发明的有益效果是：(1)采用担子菌LKY01作为生产菌种，可显著提高酶活，经测定酶活力为40000u/g，高于目前国内纤维素酶产品约1-2倍。(2)使用经过物理或化学处理的棉花、棉短绒或棉纺织品下脚料作为培养基碳源代替纤维素，不仅而且可以极大地降低生产成本，而且其来源广泛，实现了废物利用。(3)高活性纤维素酶制造方法生产稳定性好、不易染菌、便于大规模工业化生产，同时发酵产生的残渣还可用作饲料，利于环保。(4)生产的纤维素酶活性高，可广泛应用于食品和饲料行业，提高其所应用产品的品质和效能。
下面结合附图和具体实施方式作进一步说明，以使公众充分了解本发明的新颖性和创造性所在，并非对本发明的限定。凡依照本发明已公开内容所实施的任何技术特征的等同替换，均属于本发明的保护范围之内。
附图说明
图1为担子菌的形态特征图
具体实施方式
实施实例1.从河北棉花地土样中筛选和分离高活力纤维素酶生产菌
分离培养基：0.35％CMC(羧甲基纤维素)、0.05％MgSO4·7H2O、0.1％KH2PO4、1％Na2CO3(分开灭菌)、1％NaNO3、1％NaCl，为了固化加入1.8％琼脂。
将土样悬浮于无菌0.85％的盐水溶液中，无菌条件下逐级稀释，然后将稀释的样品悬浮液涂在羟甲基纤维素(CMC)-琼脂培养基上，在30℃左右培养3天后进行菌种初步筛选，能生产纤维素酶的菌落范围产生水解圈，表现为清凉区，清凉区的直径是CMC酶活性的量度，选择直径大的作为粗筛菌种。
用于生产酶的复合培养基：麸皮1％、纤维素2％、硫铵0.3％、蛋白胨0.5％、MgSO40.05％、K2HPO4(0.3％)-KH2PO4(0.4％)、Tween-80 0.1％调pH4.5。
应用初筛方法中选出菌株用于逐渐生长并分离纤维素酶。在30℃左右250rpm的培养箱振荡器中，将菌落在250毫升摇瓶内的100毫升复合培养基中发酵72小时。按照CMCA-DNS测定方法QB2583-2003测定培养液中CMC酶活性以证实发酵液中纤维素酶的存在，并比较酶活力高低。
应用上述方法，分离生产纤维素酶的微生物，经中科院微生物所鉴定，结果如下：
形态特征：送检菌株在PDA平板上25℃培养7天直径5-6cm，菌落白色，絮状，无色素产生。菌丝宽2-3μm，有锁状联合，如附图。
以棉子皮∶锯末∶麸皮(4∶4∶2)为培养料做栽培试验，10℃、20℃、30℃培养3个月均不产子实体。
送检菌株不易产生产孢结构，难以确定分类地位。但据其菌丝具有锁状联合的特征，可初步将送检菌株归于担子菌类，为一担子菌菌株(a basidiomycetous fungus)。
该菌已于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日为2005年1月18日，保藏号为CGMCCNo.1294。
实施例2-6.制备高活性纤维素酶
以担子菌CGMCCNo.1294作为生产菌种，采用下述配比的培养基，经灭菌接入三角瓶液体菌种，进行液体深层发酵，培养基配方和反应条件见表1。
其中碳源采用棉花、棉短绒或棉纺织品下脚料粉碎棉纤维长度小于1cm，或采用1-2％盐酸溶液，80-90℃加热水解8-10小时，经中和至pH为6。
发酵罐液体培养基装入量为70％，培养基pH值为4.0-6.0，发酵温度为28-30℃，通气量为1∶0.04-1∶1.0，发酵时间为96-120小时；发酵后发酵液经过板框过滤除去菌丝，澄清发酵液经真空浓缩罐浓缩8-10倍，浓缩液经气流式喷雾干燥机(进风温度180℃)干燥制成纤维素酶粉。
表1 实施例2-7的培养基和反应条件
| 实施例 | 碳源(％) | 麸皮(％) | 豆饼粉(％) | 硫酸铵(％) | 磷酸二氢钾(％) | 硫酸镁(％) | Tween-80(％) | pH值 | 通气量 | 发酵温度(℃) | 发酵时间(h) |
| 2 | 0.8 | 0.8 | 0.5 | 0.2 | 0.1 | 0.05 | 0.1 | 4.0 | 1∶0.04 | 30 | 120 |
| 3 | 1.0 | 1.0 | 0.5 | 0.2 | 0.1 | 0.05 | 0.1 | 4.0 | 1∶0.06 | 28 | 120 |
| 4 | 1.5 | 1.0 | 1.0 | 0.4 | 0.1 | 0.05 | 0.1 | 4.5 | 1∶0.1 | 28 | 120 |
| 5 | 2.0 | 1.5 | 1.0 | 0.4 | 0.1 | 0.05 | 0.1 | 5.0 | 1∶0.1 | 28 | 110 |
| 6 | 2.5 | 1.5 | 1.0 | 0.4 | 0.1 | 0.05 | 0.1 | 5.5 | 1∶0.5 | 30 | 110 |
| 7 | 2.5 | 2.0 | 1.0 | 0.4 | 0.1 | 0.05 | 0.1 | 6.0 | 1∶1.0 | 30 | 96 |
实施例8.实施例2-7的产物酶活力测定
纤维素酶活性测定方法：CMCA-DNS测定方法QB2583-2003。
酶活力单位定义：1g固体酶，在50±0.1℃，pH4.8条件下，1h水解羧甲基纤维素钠底物，产生出相当于1mg葡萄糖的还原糖量，为1个酶活力单位，以u/g表示。
结果见表2
表2 实施例2-7的酶活力测定结果
| 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 | 实施例6 | 实施例7 | |
| 酶活力(u/g) | 35600 | 37400 | 40000 | 39100 | 38400 | 37800 |
Claims (10)
1.一种高活性纤维素酶的制造方法，其特征在于：
以担子菌CGMCCNo.1294作为生产菌种，采用下述配比的培养基，经灭菌接入三角瓶液体菌种，进行液体深层发酵，培养基配方如下：
碳源：0.8-2.5％ 麸皮：0.8-2.0％ 豆饼粉：0.5-1.0％
硫酸铵：0.2-0.4％ 磷酸二氢钾：0.1％ 硫酸镁：0.05％ Tween-80 0.1％；
发酵罐液体培养基装入量为70％，培养基pH值为4.0-6.0，发酵温度为28-30℃，通气量为1∶0.04-1.0，发酵时间为96-120小时；发酵后发酵液经过滤、浓缩和喷雾干燥制成纤维素酶粉。
2.根据权利要求1所述的一种高活性纤维素酶的制造方法，其特征在于：
所述碳源采用棉花、棉短绒或棉纺织品下脚料，发酵前用物理或化学方法预处理：采用物理方法，粉碎棉纤维长度小于1cm，用于发酵；或采用化学方法，将棉花、棉短绒或棉纺织品下脚料用1-2％盐酸溶液，加热水解8-10小时，经中和至pH为6，用于发酵。
3.根据权利要求1所述的一种高活性纤维素酶的制造方法，其特征在于：
所述过滤为经板框过滤或离心过滤。
4.根据权利要求1所述的一种高活性纤维素酶的制造方法，其特征在于：
所述浓缩为用膜或真空浓缩方法将发酵液浓度浓缩为原液的8-10倍。
5.根据权利要求1所述的一种高活性纤维素酶的制造方法，其特征在于：
所述喷雾干燥是指将浓缩后的发酵液经气流式喷雾干燥机干燥制成纤维素酶粉。
6.一种制造高活性纤维素酶的碳源，其特征在于：
采用棉花、棉短绒或棉纺织品下脚料，发酵前用物理或化学方法预处理：采用物理方法，粉碎棉纤维长度小于1cm，用于发酵；或采用化学方法，将棉花、棉短绒或棉纺织品下脚料用1-2％盐酸溶液，加热水解8-10小时，经中和至pH为6，用于发酵。
7.一种生产高活性纤维素酶的担子菌LKY01，保藏号为CGMCCNo.1294。
8.一种高活性的纤维素酶，其特征在于：是按照下述方法制备得到的：
以担子菌CGMCCNo.1294作为生产菌种，采用下述配比的培养基，经灭菌接入三角瓶液体菌种，进行液体深层发酵，
培养基配方如下：
碳源：0.8-2.5％ 麸皮：0.8-2.0％ 豆饼粉：0.5-1.0％
硫酸铵：0.2-0.4％ 磷酸二氢钾：0.1％ 硫酸镁：0.05％ Tween-80 0.1％；
发酵罐液体培养基装入量为70％，培养基pH值为4.0-6.0，发酵温度为28-30℃，通气量为1∶0.04-1.0，发酵时间为96-120小时；发酵后发酵液经过滤、浓缩和喷雾干燥制成纤维素酶粉。
9.根据权利要求8所述的一种高活性的纤维素酶，其特征在于：
所述碳源采用棉花、棉短绒或棉纺织品下脚料，发酵前用物理或化学方法预处理：采用物理方法，粉碎棉纤维长度小于1cm，用于发酵；或采用化学方法，将棉花、棉短绒或棉纺织品下脚料用1-2％盐酸溶液，加热水解8-10小时，经中和至pH为6，用于发酵。
10.根据权利要求8所述的一种高活性的纤维素酶，其特征在于：
所述浓缩为用膜或真空浓缩方法将发酵液浓度浓缩为原液的8-10倍。
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