CN101358230B - 一种羧甲基纤维素酶活力的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种羧甲基纤维素酶活力的测定方法，先制备酸性或中性纤维素酶待测酶液：将液体酶用酸性或中性的缓冲液稀释；再往反应管中加入待测酶液，加入与等量体积羧甲基纤维素钠溶液底物，做酶的空白对照则加入3倍体积DNS(3，5-二硝基水杨酸)试剂，混匀，置于50℃反应；接着将所有反应管取出，样品管加入3倍体积DNS(3，5-二硝基水杨酸)试剂，对照管加入与等量体积羧甲基纤维素钠溶液底物；然后将所有反应管水浴加热5分钟，取出，冷却至室温终止反应；最后取反应后溶液于540nm波长下比色测定吸光度值，根据葡萄糖标准曲线计算还原糖含量。本发明与现有技术相比，同一样品多次测试变异系数小，测试结果重现性好，测试速度快，且适于同时测定大量样品。
Description
技术领域
本发明涉及纤维素酶活力测定方法，具体说是一种羧甲基纤维素酶活力(CMCNa-DNS)的测定方法。
背景技术
纤维素酶(Cellulase)是一种多组分的复合酶，不同来源的纤维素酶其组成及各组分比例有较大差异。一般来讲，纤维素酶包括外切β-1，4-葡聚糖酶(Exop-1，4-glucanase，E C3.2.1.91)、内切β-1，4-葡聚糖酶(Endop-1，4-glucanase，E C3.2.1.4)和纤维二糖酶(Cellobiase，E C3.2.1.21)。不同来源的纤维素酶制剂产品中三种酶组分含量的比例不同，因此其最终的表观酶活力会有差异。同时纤维素酶作用的底物也比较复杂，致使纤维素酶活力的测定方法很多，且方法复杂而不统一。常用的方法有：羧甲基纤维素糖化力法、羧甲基纤维素液化力法、滤纸糖化力法、滤纸崩溃法和棉花糖化力法等。上述测定方法中，羧甲基纤维素糖化力主要代表外切β-1，4葡聚糖苷酶和内切酶的活力总和，在研究和实际生产中应用比较普遍.。
国内外采用羧甲基纤维素糖化法测定纤维素酶活力的方法很多。目前，国际上有较公认的IPUAC推荐的纤维素酶测定方法(T.K.GHOSE，1987)，由表1看出，该方法分别对来自三个厂家(PrimfastCL购自杰能科公司，Cellusoft L购自诺维信公司，A5为本公司自主研发产品)纤维素酶进行多次检测，其变异系数达2％以上。造成较大误差的原因可能是加入的羧甲基纤维素钠浓度高和粘度大，容易在操作过程中带来较大误差，且该方法反应时间为30分钟，利用比色管显色后需稀释用分光光度计检测吸光度值，整个操作繁琐且耗时；另外，该方法DNS(3，5-二硝基水杨酸)试剂配制不经定容，从而造成批次间较大差异。
表1IPUAC推荐方法对不同厂家纤维素酶活力检测结果
备注：①检测总耗时约90分钟；②以还原糖物质的量接近0.5mg确定待测酶液最适稀释倍数。
国内有纤维素酶的行业标准QB2583-2003，由表2看出，该方法分别对来自三个厂家纤维素酶进行多次检测，其变异系数达2％，甚至于4％以上。国家行业标准检测方法建立在IPUAC方法基础之上，主要在底物、酶液稀释倍数的确立及葡萄糖标线制作方面做了较大改动，该方法检测样品所需时间与IPUAC推荐方法相似，且由于国产底物差异性，带来更大的误差。
表2国家行业标准QB2583-2003对不同厂家纤维素酶活力检测结果
备注：①检测总耗时约90分钟；②还原糖吸光度值须在0.30至0.35之间确定待测酶液最适稀释倍数。
发明内容
本发明的目的在于提供一种羧甲基纤维素酶活力的测定方法，以提高测定的精确性、重现性，且使测试方法简便、快速且能同时对更多样品检测。
为实现上述之目的，本发明采用如下技术方案：
一种羧甲基纤维素酶活力的测定方法，由如下步骤组成：
(1)待测纤维素酶液制备：①待测酸性纤维素酶液制备：将液体酶(或固体酶)用0.05mol/LpH4.8的醋酸钠缓冲液稀释；②待测中性纤维素酶液制备：将液体酶(或固体酶)用0.05mol/LpH6.0的磷酸钠缓冲液稀释；
(2)往反应管中加入稀释的待测酶液100～300μL，再加入与酶液等量体积的1％羧甲基纤维素钠(Sigma，低粘)溶液底物，混匀，置于50℃反应10～30min；同时做酶的空白对照，往反应管中加入稀释的待测酶液100～300μL，再加入3倍酶液体积DNS(3，5-二硝基水杨酸)试剂，混匀，置于50℃反应10～30min；
(3)将所有反应管取出，样品管立即加入3倍酶液体积DNS(3，5-二硝基水杨酸)试剂，混匀，对照管加入与酶液等量体积的1％羧甲基纤维素钠(Sigma，低粘)溶液底物，混匀；
(4)所有反应管放入沸水浴中加热5分钟，取出，迅速冷却至室温终止反应；
(5)取反应后溶液200μL至96孔细胞板中于酶标仪540nm波长下比色测定吸光度值，根据葡萄糖标准曲线计算还原糖(以葡萄糖计)含量。
上述反应容器为2mL一次性塑料离心管。
上述待测酶液的稀释倍数是指使每毫升酶液反应后生成的还原糖的物质的量为2.5μmol。
上述1％羧甲基纤维素钠溶液的粘度为4％。
上述DNS(3，5-二硝基水杨酸)试剂的配制方法是将盛有约500mL蒸馏水的1L烧杯置于50℃水浴中预热，加入10.0g3，5-二硝基水杨酸，搅拌使其全部溶解，再缓慢加入150mL0.67％(质量百分浓度w/v)氢氧化钠(NaOH)溶液，搅拌直到溶液澄清透明为止，最后加入300.0g四水合酒石酸钾钠，待全部溶解并冷却后定容至1000mL，过滤，于棕色试剂瓶中保存，暗处放置7天后使用。
酶活定义：1mL液体或1g固体酶制剂在50℃，pH4.8(或pH6.0)条件下，每分钟催化生成1μmol葡萄糖定义为一个酶活单位，以U/mL或U/g。
本发明与现有技术相比，测试结果准确，误差小，重现性好，测试速度快，适于同时测定大量样品。
具体实施方式
下面结合具体实例(分别对来自不同厂家纤维素酶进行活力测定，其中Primfast CL购自杰能科公司，Cellusoft L购自诺维信公司，A5为本公司自主研发产品)对本发明作进一步的说明。
首先制备待测纤维素酶液：
①制备待测酸性纤维素酶液：将液体酶(或固体酶)用0.05mol/LpH4.8的醋酸钠缓冲液稀释到适当倍数，使每毫升酶液反应后生成的还原糖的物质的量为2.5μmol；
②制备待测中性纤维素酶液：将液体酶(或固体酶)用0.05mol/LpH6.0的磷酸钠缓冲液稀释到适当倍数，使每毫升酶液反应后生成的还原糖的物质的量为2.5μmol。
并配制DNS(3，5-二硝基水杨酸)试剂：将盛有500mL左右蒸馏水的1L烧杯置于50℃水浴中预热，加入10.0g3，5-二硝基水杨酸，搅拌使其全部溶解，再缓慢加入150mL0.67％氢氧化钠溶液，搅拌直到溶液澄清透明为止，最后加入300.0g四水合酒石酸钾钠，待全部溶解并冷却后定容至1000mL，过滤，于棕色试剂瓶中保存，暗处放置7天后使用。
实例1：
往2mL一次性塑料离心管中加入稀释到适当倍数的待测酶液200μL，再加入与酶液等量体积的1％羧甲基纤维素钠(Sigma，低粘)溶液底物，混匀，置于50℃反应10min；同时做酶的空白对照，往反应管中加入稀释到适当倍数的待测酶液200μL，再加入3倍酶液体积DNS(3，5-二硝基水杨酸)试剂，混匀，置于50℃反应10min；将所有反应管取出，样品管立即加入3倍酶液体积DNS(3，5-二硝基水杨酸)试剂，混匀，对照管加入与酶液等量体积的1％羧甲基纤维素钠(Sigma，低粘4％)溶液底物，混匀；所有反应管放入沸水浴中加热5分钟，取出，迅速冷却至室温终止反应；取反应后溶液200μL至96孔细胞板中于酶标仪540nm波长下比色测定吸光度值，根据葡萄糖标准曲线计算还原糖(以葡萄糖计)含量。检测结果见附表3。
表3本发明方法(实例1)对不同厂家纤维素酶活力检测结果
备注：①检测总耗时约55分钟；②以反应后生成还原糖的物质的量为0.450～0.550μmol确定待测酶液最适稀释倍数。
实例2：
往2mL一次性塑料离心管中加入稀释到适当倍数的待测酶液100μL，再加入与酶液等量体积的1％羧甲基纤维素钠(Sigma，低粘)溶液底物，混匀，置于50℃反应10min；同时做酶的空白对照，往反应管中加入稀释到适当倍数的待测酶液100μL，再加入3倍酶液体积DNS(3，5-二硝基水杨酸)试剂，混匀，置于50℃反应10min；将所有反应管取出，样品管立即加入3倍酶液体积DNS(3，5-二硝基水杨酸)试剂，混匀，对照管加入与酶液等量体积的1％羧甲基纤维素钠(Sigma，低粘)溶液底物，混匀；所有反应管放入沸水浴中加热5分钟，取出，迅速冷却至室温终止反应；取反应后溶液200μL至96孔细胞板中于酶标仪540nm波长下比色测定吸光度值，根据葡萄糖标准曲线计算还原糖(以葡萄糖计)含量。检测结果见附表4。
表4本发明方法(实例2)对不同厂家纤维素酶活力检测结果
备注：①检测总耗时约55分钟；②以反应后生成还原糖的物质的量为0.225～0.275μmol确定待测酶液最适稀释倍数。
实例3：
往2mL一次性塑料离心管中加入稀释到适当倍数的待测酶液300μL，再加入与酶液等量体积的1％羧甲基纤维素钠(Sigma，低粘)溶液底物，混匀，置于50℃反应10min；同时做酶的空白对照，往反应管中加入稀释到适当倍数的待测酶液300μL，再加入3倍酶液体积DNS(3，5-二硝基水杨酸)试剂，混匀，置于50℃反应10min；将所有反应管取出，样品管立即加入3倍酶液体积DNS(3，5-二硝基水杨酸)试剂，混匀，对照管加入与酶液等量体积的1％羧甲基纤维素钠(Sigma，低粘)溶液底物，混匀；所有反应管放入沸水浴中加热5分钟，取出，迅速冷却至室温终止反应；取反应后溶液200μL至96孔细胞板中于酶标仪540nm波长下比色测定吸光度值，根据葡萄糖标准曲线计算还原糖(以葡萄糖计)含量。检测结果见附表5。
表5本发明方法(实例3)对不同厂家纤维素酶活力检测结果
备注：①检测总耗时约55分钟；②以反应后生成还原糖的物质的量为0.675～0.825μmol确定待测酶液最适稀释倍数。
实例4：
往2mL一次性塑料离心管中加入稀释到适当倍数的待测酶液200μL，再加入与酶液等量体积的1％羧甲基纤维素钠(Sigma，低粘)溶液底物，混匀，置于50℃反应30min；同时做酶的空白对照，往反应管中加入稀释到适当倍数的待测酶液200μL，再加入3倍酶液体积DNS(3，5-二硝基水杨酸)试剂，混匀，置于50℃反应30min；将所有反应管取出，样品管立即加入3倍酶液体积DNS(3，5-二硝基水杨酸)试剂，混匀，对照管加入与酶液等量体积的1％羧甲基纤维素钠(Sigma，低粘)溶液底物，混匀；所有反应管放入沸水浴中加热5分钟，取出，迅速冷却至室温终止反应；取反应后溶液200μL至96孔细胞板中于酶标仪540nm波长下比色测定吸光度值，根据葡萄糖标准曲线计算还原糖(以葡萄糖计)含量。检测结果见附表6。
表6本发明方法(实例4)对不同厂家纤维素酶活力检测结果
备注：①检测总耗时约75分钟；②以反应后生成还原糖的物质的量为0.450～0.550μmol确定待测酶液最适稀释倍数。
实例5：
往2mL一次性塑料离心管中加入稀释到适当倍数的待测酶液100μL，再加入与酶液等量体积的1％羧甲基纤维素钠(Sigma，低粘)溶液底物，混匀，置于50℃反应30min；同时做酶的空白对照，往反应管中加入稀释到适当倍数的待测酶液100μL，再加入3倍酶液体积DNS(3，5-二硝基水杨酸)试剂，混匀，置于50℃反应30min；将所有反应管取出，样品管立即加入3倍酶液体积DNS(3，5-二硝基水杨酸)试剂，混匀，对照管加入与酶液等量体积的1％羧甲基纤维素钠(Sigma，低粘)溶液底物，混匀；所有反应管放入沸水浴中加热5分钟，取出，迅速冷却至室温终止反应；取反应后溶液200μL至96孔细胞板中于酶标仪540nm波长下比色测定吸光度值，根据葡萄糖标准曲线计算还原糖(以葡萄糖计)含量。检测结果见附表7。
表7本发明方法(实例5)对不同厂家纤维素酶活力检测结果
备注：①检测总耗时约75分钟；②以反应后生成还原糖的物质的量为0.225～0.275μmol确定待测酶液最适稀释倍数。
实例6：
往2mL一次性塑料离心管中加入稀释到适当倍数的待测酶液300μL，再加入与酶液等量体积的1％羧甲基纤维素钠(Sigma，低粘)溶液底物，混匀，置于50℃反应30min；同时做酶的空白对照，往反应管中加入稀释到适当倍数的待测酶液300μL，再加入3倍酶液体积DNS(3，5-二硝基水杨酸)试剂，混匀，置于50℃反应30min；将所有反应管取出，样品管立即加入3倍酶液体积DNS(3，5-二硝基水杨酸)试剂，混匀，对照管加入与酶液等量体积的1％羧甲基纤维素钠(Sigma，低粘)溶液底物，混匀；所有反应管放入沸水浴中加热5分钟，取出，迅速冷却至室温终止反应；取反应后溶液200μL至96孔细胞板中于酶标仪540nm波长下比色测定吸光度值，根据葡萄糖标准曲线计算还原糖(以葡萄糖计)含量。检测结果见附表8。
表8本发明方法(实例6)对不同厂家纤维素酶活力检测结果
备注：①检测总耗时约75分钟；②以反应后生成还原糖的物质的量为0.675～0.825μmol确定待测酶液最适稀释倍数。
实例7：
往2mL一次性塑料离心管中加入稀释到适当倍数的待测酶液200μL，再加入与酶液等量体积的1％羧甲基纤维素钠(Sigma，低粘)溶液底物，混匀，置于50℃反应20min；同时做酶的空白对照，往反应管中加入稀释到适当倍数的待测酶液200μL，再加入3倍酶液体积DNS(3，5-二硝基水杨酸)试剂，混匀，置于50℃反应20min；将所有反应管取出，样品管立即加入3倍酶液体积DNS(3，5-二硝基水杨酸)试剂，混匀，对照管加入与酶液等量体积的1％羧甲基纤维素钠(Sigma，低粘)溶液底物，混匀；所有反应管放入沸水浴中加热5分钟，取出，迅速冷却至室温终止反应；取反应后溶液200μL至96孔细胞板中于酶标仪540nm波长下比色测定吸光度值，根据葡萄糖标准曲线计算还原糖(以葡萄糖计)含量。检测结果见附表9。
表9本发明方法(实例7)对不同厂家纤维素酶活力检测结果
备注：①检测总耗时约65分钟；②以反应后生成还原糖的物质的量为0.450～0.550μmol确定待测酶液最适稀释倍数。
实例8：
往2mL一次性塑料离心管中加入稀释到适当倍数的待测酶液100μL，再加入与酶液等量体积的1％羧甲基纤维素钠(Sigma，低粘)溶液底物，混匀，置于50℃反应20min；同时做酶的空白对照，往反应管中加入稀释到适当倍数的待测酶液100μL，再加入3倍酶液体积DNS(3，5-二硝基水杨酸)试剂，混匀，置于50℃反应20min；将所有反应管取出，样品管立即加入3倍酶液体积DNS(3，5-二硝基水杨酸)试剂，混匀，对照管加入与酶液等量体积的1％羧甲基纤维素钠(Sigma，低粘)溶液底物，混匀；所有反应管放入沸水浴中加热5分钟，取出，迅速冷却至室温终止反应；取反应后溶液200μL至96孔细胞板中于酶标仪540nm波长下比色测定吸光度值，根据葡萄糖标准曲线计算还原糖(以葡萄糖计)含量。检测结果见附表10。
表10本发明方法(实例8)对不同厂家纤维素酶活力检测结果
备注：①检测总耗时约65分钟；②以反应后生成还原糖的物质的量为0.225～0.275μmol确定待测酶液最适稀释倍数。
实例9：
往2mL一次性塑料离心管中加入稀释到适当倍数的待测酶液300μL，再加入与酶液等量体积的1％羧甲基纤维素钠(Sigma，低粘)溶液底物，混匀，置于50℃反应20min；同时做酶的空白对照，往反应管中加入稀释到适当倍数的待测酶液300μL，再加入3倍酶液体积DNS(3，5-二硝基水杨酸)试剂，混匀，置于50℃反应20min；将所有反应管取出，样品管立即加入3倍酶液体积DNS(3，5-二硝基水杨酸)试剂，混匀，对照管加入与酶液等量体积的1％羧甲基纤维素钠(Sigma，低粘)溶液底物，混匀；所有反应管放入沸水浴中加热5分钟，取出，迅速冷却至室温终止反应；取反应后溶液200μL至96孔细胞板中于酶标仪540nm波长下比色测定吸光度值，根据葡萄糖标准曲线计算还原糖(以葡萄糖计)含量。检测结果见附表11。
表11本发明方法(实例9)对不同厂家纤维素酶活力检测结果
备注：①检测总耗时约65分钟；②以反应后生成还原糖的物质的量为0.675～0.825μmol确定待测酶液最适稀释倍数。
结论：
本发明与现有技术相比，同一样品多次测试变异系数小，测试结果重现性好，测试速度快，且适于同时测定大量样品。
Claims (2)
1.一种羧甲基纤维素酶活力的测定方法，其特征在于由如下步骤组成：
(1)待测纤维素酶液制备：将液体酶或固体酶用0.05mol/L缓冲液稀释；0.05mol/L缓冲液是0.05mol/L pH4.8的醋酸钠缓冲液或是0.05mol/L pH6.0的磷酸钠缓冲液稀释；
(2)往反应管中加入待测酶液100～300μL，再加入与酶液等量体积的1％羧甲基纤维素钠低粘溶液底物，混匀，置于50℃反应10～30min；同时做酶的空白对照，往反应管中加入待测酶液100～300μL，再加入3倍酶液体积DNS(3，5-二硝基水杨酸)试剂，混匀，置于50℃反应10～30min，所述的羧甲基纤维素钠低粘溶液底物是购自于Sigma公司的低粘羧甲基纤维素钠；
DNS(3，5-二硝基水杨酸)试剂的配制方法是将盛有约500mL蒸馏水的1L烧杯置于50℃水浴中预热，加入10.0g3，5-二硝基水杨酸，搅拌使其全部溶解，再缓慢加入150mL0.67％氢氧化钠溶液，搅拌直到溶液澄清透明为止，最后加入300.0g四水合酒石酸钾钠，待全部溶解并冷却后定容至1000mL，过滤，于棕色试剂瓶中保存，暗处放置7天后使用；
(3)将所有反应管取出，样品管立即加入3倍酶液体积DNS(3，5-二硝基水杨酸)试剂，混匀，对照管加入与酶液等量体积的1％羧甲基纤维素钠低粘溶液底物，混匀；
(4)所有反应管放入沸水浴中加热5分钟，取出，迅速冷却至室温终止反应；
(5)取反应后溶液200μL至96孔细胞板中于酶标仪540nm波长下比色测定吸光度值，根据葡萄糖标准曲线计算还原糖含量。
2.如权利要求1所述一种羧甲基纤维素酶活力的测定方法，其特征在于：上述反应管为2mL一次性塑料离心管。
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