CN102230887A - 一种基于微孔板法的纤维素酶活测定方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于微孔板法的纤维素酶活测定方法，涉及生物化学领域，具体是基于微孔板法对纤维素酶的活性进行高通量测定的方法。步骤为：1）葡萄糖标准曲线的建立，2）样品酶活力测定，3）根据样品酶的吸光度，从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，根据生成的葡萄糖克数计算酶活值，适用于滤纸酶、纤维素内切酶、纤维素外切酶和β-葡萄糖苷酶等的活力测定，具有操作方便、快速、所需设备简单、易于推广等特点。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学领域，具体是基于微孔板法对纤维素酶的活性进行高通量测定的方法。
背景技术
纤维素是光合作用的初级产物，也是生物圈中最为丰富的可再生资源。随着生活水平的提高，以纤维素类物质为主的有机废弃物日益增多。合理开发和科学利用这一丰厚天然资源对于人类社会的可持续发展具有非常重要的意义，采用先进的技术手段将其转化为人类急需的能源、食物和化工原料是世界各国研究开发的重点领域。纤维素被彻底分解而又无污染的一条有效途径是利用纤维素酶的水解作用。利用纤维素酶将纤维素水解成葡萄糖的关键就是纤维素酶的生产。纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，纤维素的完全降解由内切葡聚酶(Endo-1，4-β-D-gulcanase，EC3.2.1.4)、外切葡聚糖纤维二糖水解酶(Exo-1，4-β-D-gulcanase，EC3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(β-1，4-β-D-gulcanase，EC3.2.1.21)协同作用而完成的。
纤维素酶的活性测定对于纤维素酶的定量分析和筛选具有十分重要的意义。经过对现有文献检索发现，国际理论与应用化学联合会于1987年在Pure andApplied Chemistry(理论与应用化学)59卷，第2期，257-268页发表了由GhoseTK撰写的“Measurement of cellulase activities”(纤维素酶活的测定方法)。该方法作为纤维素酶活力测定的标准方法，至今仍被广泛使用，但该方法的测定过程较为繁琐，而且难以实现高通量测定。随着自动化技术的发展，机械手也被用于纤维素酶活力的测定过程中，Decker SR等在Applied Biochemistry andBiotechnology(应用生化和生物科技)，2003年，105-108期，689-703页发表了“Automated filter paper assay for determination of cellulase activity”(自动化滤纸片分析法测定纤维素酶活性)。虽然这种自动化方法能够实现快速高通量的测定酶活，但需要较为昂贵的器械设备，难以在实际生产中大范围推广。因此，开发一种操作简便、结果可靠的高通量酶活测定方法对于纤维素酶的科研和生产具有非常重要的实际意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有方法的不足，提出一种高通量快速测定纤维素酶活力的方法，使其能够用于纤维素酶活的分析和纤维素酶的高通量筛选。
本发明通过以下技术方案实现：。
一种基于微孔板法的纤维素酶活测定方法，其对滤纸酶、纤维素内切酶、纤维素外切酶和β-葡萄糖苷酶活力测定步骤如下：
1)葡萄糖标准曲线的建立：取PCR微孔板，每孔内加缓冲液及不同浓度的葡萄糖标准溶液，然后在每孔中加入DNS溶液，90℃-100℃孵育5min-15min；而后从每孔中转移出部分孵育溶液置于96孔平底酶标板中，用酶标仪测定吸光度；以此得标准曲线；
2)样品酶活力测定：于PCR微孔板中，每孔内加缓冲液、酶液及底物，45℃-55℃于孵育30min-60min，然后在每孔中加入DNS溶液，90℃-100℃孵育5min-15min；而后从每孔中转移出部分孵育溶液置于96孔平底酶标板中，用酶标仪测定吸光度；
3)根据样品酶的吸光度，从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，根据生成的葡萄糖克数计算酶活值。
所述的DNS溶液，其配制方法为：3，5-二硝基水杨酸2.65g，氢氧化钠4.95g，四水酒石酸钾钠102.70g，重蒸酚1.9ml，焦亚硫酸钠2.08g，加水354ml溶解，置棕色瓶中保存，放置一周后使用。
所述的缓冲液为50mmol/l醋酸钠缓冲液，其配制方法为：无水醋酸钠2.05g，定溶至1000ml，调pH至4.8。
所述的底物分别为：滤纸片、羧甲基纤维素、微晶纤维素和水杨苷。
本发明所建立的微孔板法高通量测定纤维素酶活力的方法，稳定性、精密度高，重现性好，具有操作方便、快速、所需设备简单、易于推广等特点。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
1)标准曲线的建立
取96孔PCR板，每孔内加40μl缓冲液及20μl浓度分别为0mg/ml、2.0mg/ml、3.3mg/ml、5.0mg/ml、6.7mg/ml和10mg/ml的葡萄糖溶液，随后每孔加入120μl DNS溶液，95℃于基因扩增仪中孵育5min。最后从每孔中转移出40μl置于含160μl水的酶标板中，用酶标仪于540nm处测定吸光度。
以葡萄糖浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，得回归方程Y＝0.208X+0.0006，标准曲线在0mg/ml-10mg/ml的浓度范围内线性较好，线性相关系数为r＝0.99975。
2)样品中滤纸酶活力的测定
于96孔PCR板中，每孔内加40μl pH4.8的醋酸钠缓冲液、20μl稀释2倍的酶液及4mm×6mm滤纸片。50℃于孵育60min，随后每孔加入120μl DNS溶液，95℃孵育5min，上述孵育分别在基因扩增仪和烘箱中进行。而后从每孔中转移出40μl置于含160μl蒸馏水的酶标板中，用酶标仪于540nm处测定吸光度。
从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，根据生成的葡萄糖克数计算出酶活值。滤纸酶活按下面公式(1)计算。
公式(1)
其中FPU/ml为每毫升酶液中滤纸酶的活力；A540样品是样品用微孔板DNS测定法测得的酶活力值；A540/mg标准品是在葡萄糖标准曲线中，1mg的葡萄糖的吸光值；5.55μmol/mg为1mg溶液中葡萄糖的毫摩尔数，60min为测定中的孵育时间，X为稀释后酶液的体积(20μl)。
3)稳定性、精密度和重现性实验
样品显色后，分别在不同的时间测定三份样品的吸光度，每隔20min测定3次并记录数据，以表征测定方法的稳定性。在测定过程中，每个浓度平行测定3个复孔，每个样品同时用三块板子进行孵育和测定，计算测定方法的精密度。对同一份样品分别吸取3份等量酶液进行测定，以验证其重现性。
为验证微孔板法酶活测定方法的精密度及重复性，将所得酶液进行稀释，在不同时间进行精密度和重复性试验(见表1)。结果表明，孔间和板间酶活力值的变异系数均在5％以下，也就是说酶活力测定方法的精密度及重复性均较好。
表1微孔板法测定滤纸酶活力的精密度
微孔板法测定滤纸酶活的重现性见表2，通过测定表明其重现性较好，RSD为2.30％。
表2微孔板法测定滤纸酶活力的重现性
微孔板法测定滤纸酶活的稳定性实验结果见表3，通过不同时间对酶活力的测定表明其稳定性性较好，RSD为4.38％。但测定的结果随着时间的延长，酶活力的测定值逐渐下降，提示样品的测定应尽早尽快进行，这主要与DNS法的显色随着时间的延长会逐渐变淡有关。
表3微孔板法测定滤纸酶活力的稳定性
4)比对实验
在用微孔板法进行测定的同时，与国际通用的国际理论与应用化学联合会的标准方法进行比对，并验证该方法的可靠性。结果显示二者无显著差异(P＞0.05)，其对30份样品测定的RSD为4.5％，稍大于国际标准方法RSD为2.3％，但其较国际标准测定方法具有快速、简便和样品测定的高通量等明显优势。
实施例2
1)标准曲线的建立
基本过程同实施例1，加入DNS溶液后在90℃孵育15min，回归方程为Y＝0.203X+0.0008，标准曲线在0mg/ml-10mg/ml的浓度范围内线性较好，线性相关系数为r＝0.99935。
2)样品中纤维素内切酶活力的测定
基本过程同实施例1，酶液及底物在55℃孵育30min，然后加入DNS溶液，在100℃孵育5min，所用底物为2％羧甲基纤维素水溶液，纤维素内切酶活按下面公式(2)计算。
公式(2)
其中IU/ml为每毫升酶液中滤纸酶的活力；A540样品是样品用微孔板DNS测定法测得的酶活力值；A540/mg标准品是在葡萄糖标准曲线中，1mg的葡萄糖的吸光值；5.55μmol/mg为1mg溶液中葡萄糖的毫摩尔数，30min：为测定中的孵育时间，X为稀释后酶液的体积(20μl)。
3)稳定性、精密度和重现性实验
基本过程同实施例1，为验证微孔板法酶活测定方法的精密度及重复性，将所得酶液进行稀释，在不同时间进行精密度和重复性试验(见表4)。结果表明，精密度及重复性均较好，孔间和板间酶活力值的变异系数均在5％以下。
表4微孔板法测定滤纸酶活力的精密度
微孔板法测定滤纸酶活的重现性见表5，通过测定表明其重现性较好，RSD为4.00％。
表5微孔板法测定滤纸酶活力的重现性
微孔板法测定纤维素内切酶酶活的稳定性实验结果见表6，通过不同时间对酶活力的测定表明其稳定性性较好，RSD为4.62％。
表6微孔板法测定滤纸酶活力的稳定性
4)比对实验
与国际通用的国际理论与应用化学联合会的标准方法进行比对结果显示二者无显著差异(P＞0.05)，其对30份样品测定的RSD为3.7％，稍大于国际标准方法RSD为2.9％。
实施例3
1)标准曲线的建立
基本过程同实施例1，加入DNS溶液后在100℃孵育5min，回归方程为Y＝0.189X+0.0003，标准曲线在0mg/ml-10mg/ml的浓度范围内线性较好，线性相关系数为r＝0.99968。
2)样品中β-葡萄糖苷酶活力的测定
基本过程同实施例1，酶液及底物在45℃孵育60min，然后加入DNS溶液，在90℃孵育15min，所用底物为0.5％水杨酸苷的水溶液，纤维素内切酶活按公式(2)计算。
3)稳定性、精密度和重现性实验
基本过程同实施例1，结果表明见表7，精密度及重复性均较好，孔间和板间酶活力值的变异系数均在5％以下。
表7微孔板法测定滤纸酶活力的精密度
微孔板法测定滤纸酶活的重现性见表8，通过测定表明其重现性较好，RSD为1.03％。
表8微孔板法测定滤纸酶活力的重现性
微孔板法测定纤维素内切酶酶活的稳定性实验结果见表9，通过不同时间对酶活力的测定表明其稳定性较好，RSD为1.82％。
表9微孔板法测定滤纸酶活力的稳定性
4)比对实验
与国际通用的国际理论与应用化学联合会的标准方法进行比对结果显示二者无显著差异(P＞0.05)，其对30份样品测定的RSD为2.8％，稍大于国际标准方法RSD为1.6％。
实施例4
1)标准曲线的建立
基本过程同实施例1，加入DNS溶液后在93℃孵育12min，回归方程为Y＝0.183X+0.0005，标准曲线在0mg/ml-10mg/ml的浓度范围内线性较好，线性相关系数为r＝0.99908。
2)样品中纤维素外切酶活力的测定
基本过程同实施例1，酶液及底物在47℃孵育45min，然后加入DNS溶液，在97℃孵育10min，所用底物为2％微晶纤维素水溶液，孵育时间为120min，纤维素外切酶活按公式(3)计算。
公式(3)
其中IU/ml为每毫升酶液中滤纸酶的活力；A540样品是样品用微孔板DNS测定法测得的酶活力值；A540/mg标准品是在葡萄糖标准曲线中，1mg的葡萄糖的吸光值；5.55μmol/mg为1mg溶液中葡萄糖的毫摩尔数，120min：为测定中的孵育时间，X为稀释后酶液的体积(20μl)。
3)稳定性、精密度和重现性实验
基本过程同实施例1，结果表明见表10，精密度及重复性均较好，孔间和板间酶活力值的变异系数均在5％以下。
表10微孔板法测定滤纸酶活力的精密度
微孔板法测定滤纸酶活的重现性见表11，通过测定表明其重现性较好，RSD为4.00％。
表11微孔板法测定滤纸酶活力的重现性
微孔板法测定纤维素内切酶酶活的稳定性实验结果见表12，通过不同时间对酶活力的测定表明其稳定性较好，RSD为4.62％。
表12微孔板法测定滤纸酶活力的稳定性
4)比对实验
与国际通用的国际理论与应用化学联合会的标准方法进行比对结果显示二者无显著差异(P＞0.05)，其对30份样品测定的RSD为3.2％，稍大于国际标准方法RSD为2.3％。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种基于微孔板法的纤维素酶活测定方法，其特征是，步骤如下：
1）葡萄糖标准曲线的建立：取PCR微孔板，每孔内加缓冲液及不同浓度的葡萄糖标准溶液，然后在每孔中加入DNS溶液，90 ℃-100 ℃孵育5 min-15 min；而后从每孔中转移出部分孵育溶液置于平底酶标板中，用酶标仪测定吸光度；以此得标准曲线；
2）样品酶活力测定：于PCR微孔板中，每孔内加缓冲液、酶液及底物，45 ℃-55 ℃孵育30 min-60 min，然后在每孔中加入DNS溶液，90 ℃-100 ℃孵育5 min-15 min；而后从每孔中转移出部分孵育溶液置于平底酶标板中，用酶标仪测定吸光度；
3）根据样品酶的吸光度，从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，根据生成的葡萄糖克数计算酶活值。
2.根据权利要求1所述的基于微孔板法的纤维素酶活测定方法，其特征是，步骤1）所述的每孔内加缓冲液的量为40 ??l。
3.根据权利要求1所述的基于微孔板法的纤维素酶活测定方法，其特征是，步骤1）所述的葡萄糖溶液的浓度依次为0、2.0 mg/ml、3.3 mg/ml、5.0 mg/ml、6.7 mg/ml和10 mg/ml。
4.根据权利要求1所述的基于微孔板法的纤维素酶活测定方法，其特征是，步骤1）所述的DNS溶液的加入量为120 ??l。
5.根据权利要求1所述的基于微孔板法的纤维素酶活测定方法，其特征是，步骤1）和2）所述的每孔中转移出溶液量为40 ??l，置于含160 ??l水的96孔平底酶标板。
6.根据权利要求1所述的基于微孔板法的纤维素酶活测定方法，其特征是，步骤2）所述的缓冲液为50 mmol/l醋酸钠缓冲液，pH值为4.8。
7.根据权利要求1所述的基于微孔板法的纤维素酶活测定方法，其特征是，步骤2）所述的底物分别为：滤纸片、羧甲基纤维素、微晶纤维素和水杨苷。
8.根据权利要求1所述的基于微孔板法的纤维素酶活测定方法，其特征是，步骤1）和2）所述的酶标仪测定波长为540nm。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20111102 |