CN103776779A

CN103776779A - 一种配合饲料中纤维素酶的检测方法

Info

Publication number: CN103776779A
Application number: CN201410039950.5A
Authority: CN
Inventors: 杨海锋; 赵志辉; 宋卫国; 姚春霞; 杨俊花; 林淼
Original assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2014-01-24
Filing date: 2014-01-24
Publication date: 2014-05-07

Abstract

本发明提供了一种配合饲料中纤维素酶的检测方法，是通过透析袋透析对配合饲料中纤维素酶进行浓缩从而实现测定的方法。本方法实现了对配合饲料种纤维素酶的准确控制。

Description

一种配合饲料中纤维素酶的检测方法

所属技术领域

本发明涉及一种配合饲料中纤维素酶酶活的检测技术，具体涉及利用透析袋对配合饲料中添加的纤维素酶进行浓缩然后利用分光光度计进行检测。

背景技术

纤维素酶是降解纤维素为葡萄糖的一类酶总称，其测定方法主要有还原糖测定法、粘度法和底物染色法等。还原糖测定法简便准确，且结果重复性好，是广泛使用的一种纤维素酶酶活测定方法。农业部在2004年颁布了饲料添加剂纤维素酶酶活测定方法《饲料添加剂纤维素酶活力的测定》(NY/T912-2004)。此标准适用于饲料添加剂用的饲料酶制剂产品，也适用于添加有纤维素酶的浓缩饲料和添加剂预混合饲料。

但该方法测定配合饲料中纤维素酶活力时存在着一些问题。首先配合饲料中的纤维素酶活力远低于饲料添加剂中的酶活力，因此需加大称样量增加酶液中的酶活力。同时配合饲料中含有多种碳水化合物，如淀粉、木聚糖、纤维素等。这些碳水化合物含有大量的还原性醛基，在煮沸条件下均可与DNS显色剂发生显色反应，导致测定过程中背景值过高(呈咖啡色)，检测误差较大。此外制粒、膨化等加工过程中，原料中的一些不可溶或溶解性较差的多糖也可能在高温高压的作用下裂解，增加酶液中碳水化合物的变异度。因此检测前就需要将酶液中的寡糖和单糖去除以减少检测误差。本文针对此问题，提出了用透析袋进行前处理，从而为还原糖法测定饲料中的纤维素酶活力提供参考。

发明内容

本发明的目的在于：针对配合饲料中的纤维素酶活力远低于饲料添加剂中的酶活力，故不能依据NY/T912-2004来测定配合饲料中纤维素酶存在的问题，提供一种饲料中的纤维素酶活快速检测方法。

为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种检测配合饲料中的纤维素酶活力的快速检测法，其特征是准确称取10g饲料试样后，加40mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液。磁力搅拌30min，再用缓冲溶液定容至100mL。3000r/min离心10min，取上清15mL放入透析袋中(透析袋MD34，USA，截留分子量25000)透析，透析袋放在乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，缓冲液每隔8h换一次。4℃条件下避光透析24h后待测，酶活力高于标准曲线范围(0.10mg/mL～0.70mg/mL葡萄糖标准溶液)时可用缓冲液做适当稀释，稀释后的待测酶液中纤维素酶活力控制在0.02U/mL～0.12U/mL之间。

本发明解决了配合饲料中纤维酶因为含量低难以检测的问题，摸索了一套适合于纤维素酶的检测体系，包括反应条件、试剂、仪器等；使配合饲料中纤维素酶的含量得以准确测定，本发明的特别之处在于利用透析袋对样品进行浓缩，此方法国内外文献中未见报道。

检测对象：本发明针对配合饲料中的纤维素酶酶活进行检测。

检测范围：本发明主要应用于配合饲料。

具体实施方式

取上海市饲料生产企业的3份样品，分别按下述操作过程进行分析检测。

准确称取10g饲料试样后，加40mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液(0.1mol/L，pH5.5)。磁力搅拌30min，再用缓冲溶液定容至100mL。3000r/min离心10min，取上清15mL(若有颗粒悬浮，可先将上清过滤)放入透析袋中(透析袋MD34，USA，截留分子量25000)透析，透析袋放在乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，缓冲液每隔8h换一次。4℃条件下避光透析24h后待测，酶活力高于标准曲线范围(0.10mg/mL～0.70mg/mL葡萄糖标准溶液)时可用缓冲液做适当稀释，稀释后的待测酶液中纤维素酶活力控制在0.02U/mL～0.12U/mL之间。

吸取2.00mL酶液(37℃平衡10min)，加入到刻度试管中，再加入5mL DNS试剂，电磁振荡3s。加入2mLβ-葡聚糖溶液(37℃平衡20min)，37℃保温30min，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，加水定容至25mL，电磁振荡3s。以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度AB。

吸取2.00mL酶液(37℃平衡10min)到刻度试管中，加入2mLβ-葡聚糖溶液(37℃平衡20min)，电磁振荡3s。37℃精确保温30min(秒表计时)。加入5mL DNS试剂，电磁振荡3s，以终止酶解反应。沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，加水定容至25mL，电磁振荡3s。以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度A_E。

试样酶活力按式(1)、式(2)计算

X_{D} = \frac{[(A_{E} - A_{B}) \times K + Co]}{M \times t} \times 1000 . . . (1)

式中：

X_D——试样稀释液的β-葡聚糖酶活力，单位为酶活力单位每毫升(U/mL)；

A_E——酶反应液的吸光度；

A_B——酶空白样的吸光度；

K——标准曲线的斜率；

Co——标准曲线的截距；

M——葡萄糖的摩尔质量M＝180.2g/mol；

t——酶解反应时间，单位为分钟(min)；

1000——转化因子，1mmol＝1000μmol。

X_D值应在0.02U/mL～0.13U/mL之间。不在范围内时，应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测定。

X＝X_D×D_f……………………(2)

式中：

X——试样中β-葡聚糖酶活力，单位为酶活力单位每克(U/g)；

D_f——试样的稀释倍数。

该检测方法定量限为0.2U/g、精密度小于10％。该方法能满足饲料中β-葡聚糖酶活力检测的要求，可以用来测定配合饲料中纤维素酶的活力。

Claims

1.一种配合饲料中纤维素酶的检测方法，其特征在于：依次包括如下步骤，准确称取10g饲料试样后，加40mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液；磁力搅拌30min，再用缓冲溶液定容至100mL。3000r/min离心10min，取上清15mL放入透析袋中透析，透析袋放在乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，缓冲液每隔8h换一次。4℃条件下避光透析24h后待测，酶活力高于标准曲线范围(0.10mg/mL～0.70mg/mL葡萄糖标准溶液)时可用缓冲液做适当稀释，稀释后的待测酶液中纤维素酶活力控制在0.02U/mL～0.12U/mL之间；

吸取2.00mL酶液(37℃平衡10min)，加入到刻度试管中，再加入5mL DNS试剂，电磁振荡3s。加入2mLβ-葡聚糖溶液(37℃平衡20min)，37℃保温30min，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，加水定容至25mL，电磁振荡3s。以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度A_B。

试样酶活力按式(1)、式(2)计算

X_{D} = \frac{[(A_{E} - A_{B}) \times K + Co]}{M \times t} \times 1000 . . . (1)

式中：

A_E——酶反应液的吸光度；

A_B——酶空白样的吸光度；

K——标准曲线的斜率；

Co——标准曲线的截距；

M——葡萄糖的摩尔质量M＝180.2g/mol；

t——酶解反应时间，单位为分钟(min)；

1000——转化因子，1mmol＝1000μmol；

X_D值应在0.02U/mL～0.13U/mL之间；不在范围内时，应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测定。

X＝X_D×D_f……………………(2)

式中：

X——试样中β-葡聚糖酶活力，单位为酶活力单位每克(U/g)；

D_f——试样的稀释倍数；

该检测方法定量限为0.2U/g、精密度小于10％。

2.根据权利要求1所述的配合饲料中纤维素酶的检测方法，其特征在于：使用透析袋对配合饲料进行浓缩，所用透析袋为MD34，USA，截留分子量25000。