CN105823746B - 一种水溶肥料中壳聚糖含量的检测方法 - Google Patents

一种水溶肥料中壳聚糖含量的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种水溶肥料中壳聚糖含量的检测方法，其特点是：1）准确称取固体或液体试样备用；准确移取适量该溶液至透析袋中进行透析，透析结束后定容为Ⅰ液；准确移取适量Ⅰ液至具塞试管中，加酸水解，水解后中和，定容为Ⅱ液；2）以盐酸氨基葡萄糖溶液为标准溶液，绘制工作曲线；3）准确移取Ⅱ液，与乙酰丙酮和对二甲氨基苯甲醛进行显色反应生成红色化合物，在波长525nm下测定吸光值，根据吸光值计算壳聚糖含量。本发明确保了检测结果的真实可靠性，确定了壳聚糖的最佳水解条件，排除了肥料中一些物料如大量元素、微量元素及有机物对壳聚糖含量检测的干扰，同时，本发明方法选择性好，操作简单，成本低，普遍适用性高。

Description

一种水溶肥料中壳聚糖含量的检测方法
技术领域
本发明涉及水溶肥料检测技术领域，尤其涉及一种水溶肥料中壳聚糖含量的检测方法。
背景技术
壳聚糖(Chitosan,CTS)学名为β-1,4-2-氨基-2-脱氧-D-葡聚糖，是甲壳质经浓碱脱乙酰基后得到的衍生物。壳聚糖对植物病害有防治作用，其机理是诱导植物产生广谱抗菌性，增强自身的防卫能力，抑制多种病源微生物的生长。近年来，壳聚糖类水溶肥料发展迅速，已成为一种无毒、无公害、无污染、促进植物生长的新型肥料，并且广泛应用到农业生产中。
然而关于壳聚糖水溶肥料中壳聚糖的检测一直都没有适合的方法，在准确性上都达不到要求，因此，国家或行业内没有一个统一的标准方法。这就导致无法验证产品指标的真实性，也就无法控制产品质量，使得壳聚糖产品良莠不齐，不便于管理。因此基于这个缺陷，在2013年9月农业部肥料登记评审委员会肥料评审组七届二次会议上，对94个以海藻、虾蟹壳、腐植酸铵、腐植酸钾、糖蜜、有机酸等为原料的获证有机水溶肥料进行了重新审核，会议明确表示壳聚糖测定值作为登记评审的技术指标，暂不予以标注。这就表示生产壳聚糖类水溶肥料的厂家不能再在产品上标识壳聚糖含量指标，该类产品也不能再以壳聚糖名称来销售，只能以有机水溶肥料名称销售。这对生产企业和肥料行业都是一个很大的冲击，壳聚糖类肥料产品的优势无法体现出来，这对厂家和消费者都是一个损失。因此，目前迫切需要建立适合水溶肥料的壳聚糖含量检测方法。
另一方面目前现有的关于肥料中壳聚糖含量检测方法，能查阅到的文献仅是韩书霞、李德波等的《分光光度法测定肥料中壳聚糖含量》，文章中的方法存在缺陷：其一，未将某些大量元素、微量元素及有机物对壳聚糖检测的干扰考虑在内。而本申请人则针对添加各类原料对壳聚糖检测的干扰进行了大量组合试验，最终通过归纳总结大量实验数据可知：①为肥料提供大量元素氮源的物质中所包含的NH4 +、NO3 -、尿素对测定有严重干扰，其中NH4 +、尿素使测定结果偏高5%-28%，而NO3 -的存在则使测定无法正常进行，检测不到数值；②为肥料提供微量元素的物质中所包含的Cu2+、Fe2+、BO3 3-对测定有严重干扰，均使测定结果偏低11%-48%;③有机物类原料生化黄腐酸、糖蜜发酵液均对测定存在严重干扰，使测定结果偏高7%-130%。若不排除此类干扰，会严重影响测定数值的真实性；而提供大量元素磷源、大量元素钾源、中量元素（钙和镁）、其他微量元素（锌和锰）以及其他一些有机物质（甘露醇、蔗糖、葡萄糖）则对壳聚糖检测基本无影响。
其二，《分光光度法测定肥料中壳聚糖含量》文章中壳聚糖水解的酸类别及酸浓度不是最佳条件。而本申请人则采用不同种酸溶液及不同浓度酸溶液对壳聚糖进行水解，通过大量实验室数据可以看出：硫酸溶液整体上水解效果都优于盐酸溶液。
如何提供一种水溶肥料中壳聚糖含量的检测方法，确定最佳的水解条件以及排除大量元素、微量元素及有机物对壳聚糖含量检测的干扰，真实客观反映水溶肥料中壳聚糖含量，且方法符合普遍适用性，是壳聚糖类肥料行业内迫切需要的，这也是本发明面临的技术问题。
发明内容
本发明为解决现有存在的上述问题，提供了一种水溶肥料中壳聚糖含量的检测方法，确定最佳的水解条件，排除水溶肥料中添加的各种物料（大量元素、微量元素及有机物）对壳聚糖含量检测的干扰，真实客观反映水溶肥料中壳聚糖含量，且方法符合普遍适用性。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种水溶肥料中壳聚糖含量的检测方法，包括如下检测步骤：
1）试样溶液的制备：准确称取固体或液体试样，固体试样配制成溶液备用，液体试样直接备用；准确移取适量该溶液至透析袋中进行透析，透析结束后定容为Ⅰ液；准确移取适量Ⅰ液至具塞试管中，加酸水解，水解后中和，定容为Ⅱ液；
2）工作曲线的绘制：以盐酸氨基葡萄糖溶液为标准溶液，与乙酰丙酮和对二甲氨基苯甲醛进行显色反应生成红色化合物，在波长525nm下测定吸光值，以标准系列盐酸氨基葡萄糖质量为横坐标，对应的吸光值为纵坐标，绘制工作曲线；
3）试样的测定：若试样溶液Ⅱ液为无色透明液体，则准确移取Ⅱ液，与乙酰丙酮和对二甲氨基苯甲醛进行显色反应生成红色化合物，在波长525nm下测定吸光值，根据测得的吸光值，在工作曲线上查得对应的盐酸氨基葡萄糖的质量；若试样溶液Ⅱ液为有色或不透明液体，则准确移取Ⅱ液，与乙酰丙酮和对二甲氨基苯甲醛进行显色反应生成红色化合物，在波长525nm下测定吸光值，吸光值读数记为A1；另取1只比色管，加入与显色时相同体积的Ⅱ液，加入无醛乙醇，将溶液用水稀释定容，摇匀，在波长525nm下测定吸光值，吸光值读数记为A0；最终所得试样吸光值A=A1-A0。根据得到的吸光值，在工作曲线上查得对应的盐酸氨基葡萄糖的质量；
4）分析结果的表述
固体产品壳聚糖含量w以其质量分数（%）表示，按公式（1）计算：
………………………（1）
液体产品壳聚糖含量ρ以其质量浓度（g/L)表示，按公式（2）计算：
……………………………（2）
上述公式中，m1代表由工作曲线查得的盐酸氨基葡萄糖的质量，单位为微克（µg）；m代表固体试样的质量，单位为克（g）；V代表液体试样的体积，单位为毫升（mL）；V0代表固体试样溶解后的定容体积，单位为毫升（mL）；V1代表透析后定容的体积，单位为毫升（mL）；V2代表水解中和后定容的体积，单位为毫升（mL）；v1代表移取Ⅰ液水解的体积，单位为毫升（mL）；v2代表移取Ⅱ液至比色管中的体积，单位为毫升(mL)；0.8309代表盐酸氨基葡萄糖折算为氨基葡萄糖的系数。
对上述技术方案的改进：所述步骤1）中，试样溶液水解前需进行透析，将干扰因素NH4 +、NO3 -、尿素、Cu2+、Fe2+、BO3 3-以及小分子有机物（分子量＜500Da）排除，透析袋规格为MWCO:100-500、透析时间为24h~72h。
对上述技术方案的进一步改进：所述步骤1）中，酸水解中所用酸溶液为硫酸溶液，水解时溶液浓度为7-9mol/L，水解温度100℃~105℃，水解时间6h~8h。
对上述技术方案的进一步改进：所述步骤1）中，Ⅰ液酸水解后需要进行中和反应，所用中和试剂为氢氧化钠溶液，浓度为200g/L~400g/L。
对上述技术方案的进一步改进：所述步骤2）中，以盐酸氨基葡萄糖溶液为标准溶液，标准溶液浓度为10~50µg/mL。
本发明与现有技术相比具有如下优点和积极效果：
本发明方法从根本上确保了检测结果的真实可靠性，确定了壳聚糖的最佳水解条件，排除了肥料中一些物料如大量元素、微量元素及有机物对壳聚糖含量检测的干扰，同时该方法选择性好，操作简单，成本低，普遍适用性高，能完全满足现有壳聚糖类肥料市场上的产品检测，使产品质量能得到有效控制，从而使壳聚糖类肥料产品能名正言顺的生产销售，有效监督和制约生产企业，促使生产企业不断改革创新、提高生产技术，促进壳聚糖类肥料行业的发展。
附图说明
图1为本发明的实施例1中氨基葡萄糖标准曲线；
图2为本发明的实施例2中氨基葡萄糖标准曲线；
图3为本发明的实施例3中氨基葡萄糖标准曲线。
具体实施方式
实施例1：
本发明一种水溶肥料中壳聚糖含量的检测方法，测定固体产品，壳聚糖理论含量33.7%，检测步骤如下：
1）试样溶液的制备
固体产品称取2.5232g至100mL容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，备用。
移取1.0mL上述固体产品溶液至透析袋中进行透析。透析结束后，试样转移至25mL容量瓶中定容，称为Ⅰ液，备用。
准确移取Ⅰ液3.0mL至比色管中，加入2.0mL浓硫酸，100℃水浴水解6h。水解后用400g/L氢氧化钠溶液调至中性，然后定容至50mL容量瓶中，称为Ⅱ液，备用，Ⅱ液为接近无色透明液体。
2）工作曲线的绘制
准确移取盐酸氨基葡萄糖标准溶液0.0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL分别置于比色管中，用水稀释至5.0mL，各加入乙酰丙酮溶液1.0mL，摇匀，沸水浴中（1min后盖塞）放置25min，取出，用冷水迅速冷却后，加入对二甲氨基苯甲醛溶液1.0mL，再加入无醛乙醇3.0mL，用力振摇后，于60℃水浴中（15min后盖塞）放置1h，取出立即用冷水冷却至室温，在波长525nm处，用1cm比色皿，以试剂空白为参比液，测其吸光值。
以标准系列盐酸氨基葡萄糖质量为横坐标，对应的吸光值为纵坐标，绘制工作曲线,如图1所示；
3）试样的测定
准确移取Ⅱ液3.0mL置于比色管中，按步骤2）中“用水稀释至5.0mL”及以下步骤进行。
根据测得的吸光值，在工作曲线上查得对应的盐酸氨基葡萄糖的质量。
4）分析结果的表述
固体产品壳聚糖含量w以其质量分数（%）表示，按公式（1）计算：
………………………（1）
式中：
m1 —由工作曲线查得的盐酸氨基葡萄糖的质量，单位为微克（µg）；
m —固体试样的质量，单位为克（g）；
V0 —固体试样溶解后的定容体积，单位为毫升（mL），100mL；
V1 —透析后定容的体积，单位为毫升（mL），25mL；
V2 —水解中和后定容的体积，单位为毫升（mL），50mL；
v1 —移取Ⅰ液水解的体积，单位为毫升（mL）；
v2 —移取Ⅱ液至比色管中的体积，单位为毫升(mL)；
0.8309 —盐酸氨基葡萄糖折算为氨基葡萄糖的系数。
所测得壳聚糖含量如表1所示。
表1
所述步骤1）中透析袋的规格为MWCO:100-500，透析时间为24h。
所述步骤2）中盐酸氨基葡萄糖标准溶液浓度为30µg/mL。
所述步骤2）中乙酰丙酮溶液配制步骤为：取乙酰丙酮3.5mL，加入碳酸钠溶液至50mL，置4℃冰箱中备用，应于使用前一日配制。碳酸钠溶液浓度为1.0mol/L。
所述步骤2）中对二甲氨基苯甲醛溶液配制步骤为：称取对二甲氨基苯甲醛0.8g，加无醛乙醇15.0mL及浓盐酸15.0mL，摇匀，现配现用。
所述步骤4）中，分析结果的表述使用固体产品表述方式，以其质量分数（%）表示。
实施例2：
本发明一种水溶肥料中壳聚糖含量的检测方法，测定液体产品，壳聚糖理论含量14.6g/L，检测步骤如下：
1）试样溶液的制备
准确移取1.0mL液体产品至透析袋中进行透析。透析结束后，试样转移至25mL容量瓶中定容，称为Ⅰ液，备用。
准确移取Ⅰ液2.5mL至具塞试管中，加入2.0mL浓硫酸，100℃水浴水解6h。水解后用400g/L氢氧化钠溶液调至中性，然后定容至50mL容量瓶中，称为Ⅱ液，备用，Ⅱ液为接近无色透明液体。
2）工作曲线的绘制
准确移取盐酸氨基葡萄糖标准溶液0.0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL分别置于比色管中，用水稀释至5.0mL，各加入乙酰丙酮溶液1.0mL，摇匀，沸水浴中（1min后盖塞）放置25min，取出，用冷水迅速冷却后，加入对二甲氨基苯甲醛溶液1.0mL，再加入无醛乙醇3.0mL，用力振摇后，于60℃水浴中（15min后盖塞）放置1h，取出立即用冷水冷却至室温，在波长525nm处，用1cm比色皿，以试剂空白为参比液，测其吸光值。
以标准系列盐酸氨基葡萄糖质量为横坐标，对应的吸光值为纵坐标，绘制工作曲线，如图2所示；
3）试样的测定
准确移取Ⅱ液3.0mL置于比色管中，按步骤2）中“用水稀释至5.0mL”及以下步骤进行。
根据测得的吸光值，在工作曲线上查得对应的盐酸氨基葡萄糖的质量。
4）分析结果的表述
液体产品壳聚糖含量ρ以其质量浓度（g/L)表示，按公式（2）计算：
……………………………（2）
式中：
m1 —由工作曲线查得的盐酸氨基葡萄糖的质量，单位为微克（µg）；
V —液体试样的体积，单位为毫升（mL）；
V1 —透析后定容的体积，单位为毫升（mL），25mL；
V2 —水解中和后定容的体积，单位为毫升（mL），50mL；
v1 —移取Ⅰ液水解的体积，单位为毫升（mL）；
v2 —移取Ⅱ液至比色管中的体积，单位为毫升(mL)；
0.8309－盐酸氨基葡萄糖折算为氨基葡萄糖的系数。
所测得壳聚糖含量如表2所示。
表2
所述步骤1）中透析袋的规格为MWCO:100-500，透析时间为48h。
所述步骤2）中盐酸氨基葡萄糖标准溶液浓度为30µg/mL。
所述步骤2）中乙酰丙酮溶液配制步骤为：取乙酰丙酮3.5mL，加入碳酸钠溶液至50mL，置4℃冰箱中备用，应于使用前一日配制。碳酸钠溶液浓度为1.0mol/L。
所述步骤2）中对二甲氨基苯甲醛溶液配制步骤为：称取对二甲氨基苯甲醛0.8g，加无醛乙醇15.0mL及浓盐酸15.0mL，摇匀，现配现用。
所述步骤4）中，分析结果的表述使用液体产品表述方式，以其质量浓度（g/L）表示。
实施例3：
本发明一种水溶肥料中壳聚糖含量的检测方法，测定液体产品，壳聚糖理论含量20.5g/L，检测步骤如下：
1）试样溶液的制备
准确移取1.0mL液体产品至透析袋中进行透析。透析结束后，试样转移至25mL容量瓶中定容，称为Ⅰ液，备用。
准确移取Ⅰ液2.5mL至具塞试管中，加入2.0mL浓硫酸，100℃水浴水解6h。水解后用400g/L氢氧化钠溶液调至中性，然后定容至50mL容量瓶中，称为Ⅱ液，备用，Ⅱ液为褐色溶液。
2）工作曲线的绘制
准确移取盐酸氨基葡萄糖标准溶液0.0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL分别置于比色管中，用水稀释至5.0mL，各加入乙酰丙酮溶液1.0mL，摇匀，沸水浴中（1min后盖塞）放置25min，取出，用冷水迅速冷却后，加入对二甲氨基苯甲醛溶液1.0mL，再加入无醛乙醇3.0mL，用力振摇后，于60℃水浴中（15min后盖塞）放置1h，取出立即用冷水冷却至室温，在波长525nm处，用1cm比色皿，以试剂空白为参比液，测其吸光值。
以标准系列盐酸氨基葡萄糖质量为横坐标，对应的吸光值为纵坐标，绘制工作曲线，如图2所示；
3）试样的测定
准确移取Ⅱ液3.0mL置于比色管中，用水稀释至5.0mL，加入乙酰丙酮溶液1.0mL，摇匀，沸水浴中（1min后盖塞）放置25min，取出，用冷水迅速冷却后，加入对二甲氨基苯甲醛溶液1.0mL，再加入无醛乙醇3.0mL，用力振摇后，于60℃水浴中（15min后盖塞）放置1h，取出立即用冷水冷却至室温，在波长525nm处，用1cm比色皿，以试剂空白为参比液，测其吸光值，吸光值读数记为A1;另取1只比色管，准确移取Ⅱ液3.0mL置于比色管中，用水稀释至7.0mL，摇匀，沸水浴中（1min后盖塞）放置25min，取出，用冷水迅速冷却后，再加入无醛乙醇3.0mL，用力振摇后，于60℃水浴中（15min后盖塞）放置1h，取出立即用冷水冷却至室温，在波长525nm处，用1cm比色皿，以试剂空白为参比液，测其吸光值，吸光值读数记为A0；最终试样溶液吸光值A=A1-A0。根据得到的吸光值，在工作曲线上查得对应的盐酸氨基葡萄糖的质量；
根据所得的吸光值，在工作曲线上查得对应的盐酸氨基葡萄糖的质量。
4）分析结果的表述
液体产品壳聚糖含量ρ以其质量浓度（g/L)表示，按公式（2）计算：
……………………………（2）
式中：
m1 —由工作曲线查得的盐酸氨基葡萄糖的质量，单位为微克（µg）；
V —液体试样的体积，单位为毫升（mL）；
V1 —透析后定容的体积，单位为毫升（mL），25mL；
V2 —水解中和后定容的体积，单位为毫升（mL），50mL；
v1 —移取Ⅰ液水解的体积，单位为毫升（mL）；
v2 —移取Ⅱ液至比色管中的体积，单位为毫升(mL)；
0.8309－盐酸氨基葡萄糖折算为氨基葡萄糖的系数。
所测得壳聚糖含量如表3所示。
表3
所述步骤1）中透析袋的规格为MWCO:100-500，透析时间为48h。
所述步骤2）中盐酸氨基葡萄糖标准溶液浓度为30µg/mL。
所述步骤2）中乙酰丙酮溶液配制步骤为：取乙酰丙酮3.5mL，加入碳酸钠溶液至50mL，置4℃冰箱中备用，应于使用前一日配制。碳酸钠溶液浓度为1.0mol/L。
所述步骤2）中对二甲氨基苯甲醛溶液配制步骤为：称取对二甲氨基苯甲醛0.8g，加无醛乙醇15.0mL及浓盐酸15.0mL，摇匀，现配现用。
所述步骤4）中，分析结果的表述使用液体产品表述方式，以其质量浓度（g/L）表示。
以上所述的实施例对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种水溶肥料中壳聚糖含量的检测方法，其特征在于，包括如下检测步骤：
1）试样溶液的制备：准确称取固体或液体试样，固体试样配制成溶液备用，液体试样直接备用；准确移取适量该溶液至透析袋中进行透析，透析结束后定容为Ⅰ液；准确移取适量Ⅰ液至具塞试管中，加酸水解，水解后中和，定容为Ⅱ液；
2）工作曲线的绘制：以盐酸氨基葡萄糖溶液为标准溶液，与乙酰丙酮和对二甲氨基苯甲醛进行显色反应生成红色化合物，在波长525nm下测定吸光值，以标准系列盐酸氨基葡萄糖质量为横坐标，对应的吸光值为纵坐标，绘制工作曲线；
3）试样的测定：若试样溶液Ⅱ液为无色透明液体，则准确移取Ⅱ液，与乙酰丙酮和对二甲氨基苯甲醛进行显色反应生成红色化合物，在波长525nm下测定吸光值，根据测得的吸光值，在工作曲线上查得对应的盐酸氨基葡萄糖的质量；若试样溶液Ⅱ液为有色或不透明液体，则准确移取Ⅱ液，与乙酰丙酮和对二甲氨基苯甲醛进行显色反应生成红色化合物，在波长525nm下测定吸光值，吸光值读数记为A1；另取1只比色管，加入与显色时相同体积的Ⅱ液，加入无醛乙醇，将溶液用水稀释定容，摇匀，在波长525nm下测定吸光值，吸光值读数记为A0；最终所得试样吸光值A=A1-A0；根据得到的吸光值，在工作曲线上查得对应的盐酸氨基葡萄糖的质量；
4）分析结果的表述
固体产品壳聚糖含量w以其质量分数百分比表示，按公式（1）计算：
………………………（1）
液体产品壳聚糖含量ρ以其质量浓度表示，单位为g/L，按公式（2）计算：
……………………………（2）
上述公式中，m1代表由工作曲线查得的盐酸氨基葡萄糖的质量，单位为微克；m代表固体试样的质量，单位为克；V代表液体试样的体积，单位为毫升；V0代表固体试样溶解后的定容体积，单位为毫升；V1代表透析后定容的体积，单位为毫升；V2代表水解中和后定容的体积，单位为毫升；v1代表移取Ⅰ液水解的体积，单位为毫升；v2代表移取Ⅱ液至比色管中的体积，单位为毫升；0.8309代表盐酸氨基葡萄糖折算为氨基葡萄糖的系数；所述步骤1）中，试样溶液水解前需进行透析，将干扰因素NH4 +、NO3 -、尿素、Cu2+、Fe2+、BO3 3-以及小分子有机物排除，透析袋规格为MWCO:100-500、透析时间为24h～72h；所述步骤1）中，酸水解所用酸溶液为硫酸溶液，水解时硫酸溶液浓度为7-9mol/L,水解温度为100℃～105℃，水解时间为6h～8h。
2.按照权利要求1所述的水溶肥料中壳聚糖含量的检测方法，其特征在于，所述步骤1）中，Ⅰ液酸水解后需要进行中和反应，所用中和试
剂为氢氧化钠溶液，浓度为200g/L～400g/L。
3.按照权利要求1或2所述的水溶肥料中壳聚糖含量的检测方法，其特征在于，所述步骤2）中，以盐酸氨基葡萄糖溶液为标准溶液，标准溶液浓度为10～50µg/mL。
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